DIEGO PULZATTO CURY
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DIEGO PULZATTO CURY
Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de
ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico
eletrônico de varredura e de transmissão
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Mestre em Ciências
Departamento:
Cirurgia
Área de concentração:
Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres
Orientador:
Prof. Dr. Ii-sei Watanabe
São Paulo
2013
Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.
DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO
(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)
T.2909 Cury, Diego Pulzatto FMVZ Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos
Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de varredura e de transmissão / Diego Pulzatto Cury. -- 2013.
108 f. : il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Cirurgia, São Paulo, 2013.
Programa de Pós-Graduação: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres. Área de concentração: Anatomia dos Animais Domésticos e Silvestres.
Orientador: Prof. Dr. Ii-sei Watanabe. 1. Junção osteotendínea. 2. Ultraestrutura. 3. Fibras colágenas. 4. Envelhecimento.
5. Ratos. I. Título.
FOLHA DE AVALIAÇÃO
Autor: CURY, Diego Pulzatto
Título: Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps
sural de ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz,
microscópico eletrônico de varredura e de transmissão
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Anatomia dos Animais
Domésticos e Silvestres da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo para obtenção
do título de Mestre em Ciências
Data: ____/____/_____
Banca Examinadora
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ______________________________ Julgamento: _________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ______________________________ Julgamento: _________________
Prof. Dr.: ___________________________________________________________
Instituição: ______________________________ Julgamento: _________________
Ao meu avô Severino Pulzatto in memoriam.
Meus pais, minha avó e minha irmã.
Vocês são minha base, a força que me conduz na realização dos meus sonhos.
Amo vocês!
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ter me dado uma perfeita saúde para que mais uma etapa
de minha vida pudesse ser concluída.
Aos meus pais José Mariano Cury Junior e Ivanda Pulzatto Cury pela
compreensão, por todo o apoio, conselhos e incentivos, pelo imensurável amor e
carinho. A minha irmã Nathália Pulzatto Cury que sempre me apoiou, a minha amada
avó Conceição Alves Pulzatto pelo amor e carinho, que mesmo pedindo (sempre) para
eu voltar, soube entender a importância da minha ida para São Paulo, ao meu avô
Severino Pulzatto, onde quer que ele possa estar acredito que deve estar orgulhoso
neste momento.
A minha tia Roseli Aparecida Pulzatto de Oliveira que me incentivou, ajudou e
aconselhou, sou incapaz de demonstrar como sou grato.
Ao mestre e amigo Prof. Dr. Ii-sei Watanabe, agradeço pela oportunidade e
confiança em mim depositado, por ter me dado a honra de ser seu orientando, por
estar comigo na bancada ensinando as minúcias das trabalhosas técnicas de
microscopias eletrônicas, por todos os incentivos, pelo respeito, pelo exemplo de
conduta moral e pelo profissionalismo com o qual exerce a profissão.
Ao eterno mestre, amigo e maior incentivador para que eu embarcasse nessa
aventura de pós-graduação stricto sensu, Prof. Dr. Miguel Carlos Madeira, agradeço
por todos os incentivos, conselhos, pela oportunidade de trabalharmos juntos em
aulas teóricas e práticas, pelos feedbacks após as aulas, pelo exemplo de paixão a
profissão, por me ajudar e ainda continuar contribuindo para que eu me torne um
profissional de excelência.
Ao Prof. Dr. Jackson Cioni Bittencourt por me autorizar utilizar seu laboratório
para a obtenção das imagens de microscopia de luz.
Ao programa de pós-graduação em Anatomia dos Animais Domésticos e
Silvestres, em nome de sua coordenadora Profa. Dra. Maria Angélica Miglino e a cada
um dos professores.
Ao Prof. Dr. Richard Halti Cabral e a Profa. Dra. Renata Frazão pela supervisão
e oportunidade de participar do Programa de Aperfeiçoamento de Ensino nos cursos
de medicina e odontologia da USP, respectivamente, contribuindo em minha formação
como docente.
A Profa. Dra. Maria Inês Nogueira por toda ajuda, atenção e pela amizade.
Ao amigo José Ari Gualberto Junqueira, por todos os ensinamentos teóricos e
práticos de anatomia, pelo incentivo, pela amizade, as imagens anatômicas que me
envia por e-mail e que deixa outros profissionais de boca aberta e me perguntando
onde as consigo, pelo exemplo de profissionalismo, respeito aos cadáveres e ética na
profissão.
Aos técnicos e amigos do Laboratório Multiusuário de Histologia e Microscopia
Eletrônica do Instituto de Ciências Biomédicas III da USP, Marta Maria da Silva
Righetti, Sônia Regina Yokomizo de Almeida, Kelly Patrícia Nery Borges e Sebastião
Aparecido Boleta, pela amizade, competência e disponibilidade demonstrados
durante o desenvolvimento deste trabalho.
Ao técnico de microscopia eletrônica de transmissão Edson Rocha de Oliveira
do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do ICB I/USP e o técnico
de microscopia eletrônica de varredura Alfredo Duarte da Central Analítica do Instituto
de Química da USP.
Ao meu primo Thiago Pulzatto de Oliveira que me deu um teto para morar assim
que cheguei em São Paulo, por toda a ajuda, por me apresentar os amigos Clayton
Pereira de Oliveira e Júlio César Feltrim Câmara com os quais divido apartamento,
por todos os momentos, por se tornarem minha família aqui em São Paulo.
Aos amigos do laboratório de Ultraestrutura das Células e Tecidos, Fernando
José Dias, Carlos Alexandre Haemmerle e Adriano Polican Ciena pela parceria, pelas
ajudas, pelos momentos de divertimento e por contribuírem com a execução deste
trabalho, sem vocês isso seria muito mais difícil.
Aos amigos do laboratório de neuroanatomia química, em especial a Joelcimar
Silva e a Daniella Batagello, conterrânea de Birigui, a primeira pessoa que encontrei
no departamento de anatomia do ICB III/USP, agradeço por toda ajuda, pela amizade
sincera, pelos conselhos.
Aos amigos do departamento de anatomia do ICB III/USP: Silvia Honda, Leila
Campos, Mike Hamasaki, Vitor Lee, Vanessa Lima, Miguel Lima, Ivson da Silva, e aos
amigos do departamento de cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia da USP: Cristiane Cagnoni, Eduardo Malavasi, Mariana Póvoa, Bárbara
Schäfer e Maria Brito que de uma forma ou de outra contribuíram para a conclusão
deste trabalho.
As instituições de fomento, CAPES e especialmente a FAPESP, por terem
concedido auxílio financeiro, o qual permitiu o desenvolvimento deste estudo.
Sabendo que a pratica de exercício é indispensável para benefícios tanto
físicos quanto mentais, agradeço aos amigos do time de futebol americano São Paulo
Saints, esporte que escolhi praticar em São Paulo e que tanto gosto, pela
compreensão por todas as vezes que precisei faltar aos treinos e jogos, pela amizade
e pela oportunidade de poder fazer parte deste time.
“A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho
original”.
Albert Einstein
“Estudo com paixão a anatomia, porque o homem é o modelo do mundo”.
Leonardo da Vinci
RESUMO
CURY, D. P. Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de varredura e de transmissão. [Structural characteristics of the bone-tendon junction of triceps surae muscle of the adult and old Wistar rats: light microscope, scanning electron microscope and transmission electron microscope study]. 2013. 108f. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2013.
Os tendões são tecidos de transição das forças contráteis geradas pelos músculos e
as transferindo para os ossos, podendo assim gerar movimento. A região em que o
tecido tendíneo se insere ao ósseo é chamada de junção osteotendínea ou entese.
Estas junções podem ser classificadas como fibrosas ou fibrocartilaginosas, as
fibrosas são aquelas em que os tendões e/ou ligamentos se inserem no eixo (diáfise)
dos ossos longos e as fibrocartilaginosas a inserção ocorre nas epífises dos ossos
longos ou nos ossos curtos. Este estudo tem como propósito analisar as fibras
colágenas e as células presentes na junção osteotendínea, utilizando microscopia de
luz com as colorações de Hematoxilina-eosina, Azocarmim, Picro-sírius e Tricromo de
Masson e os aspectos ultraestruturais empregando os métodos de microscopia
eletrônica de varredura e de transmissão. Foram utilizados 30 ratos Wistar machos,
sendo 15 adultos com idade de 4 meses (grupo A) e 15 idosos com idade de 18 meses
(grupo B), sendo utilizados 5 ratos de cada grupo para microscopia de luz, 5 para
microscopia eletrônica de varredura e 5 para microscopia eletrônica de transmissão.
Os membros posteriores dos ratos foram retirados, dissecados e desmineralizados
com EDTA a 7% para microscopia de luz e EDTA 0,15M pH 7,4 para microscopia
eletrônica de transmissão durante 4 semanas, não foi necessário desmineralizar as
amostras para microscopia eletrônica de varredura. Cortes de 6 µm foram realizados
e montados em lâminas histológicas para análise em microscópio de luz, a técnica de
criofratura em nitrogênio líquido foi realizada para análises em microscópio eletrônico
de varredura e cortes de 60 nm foram realizados, montados em telas de cobre de 200
“mesh” (EMS) para análises em microscópio eletrônico de transmissão. O processo
de envelhecimento mostrou alterações das fibrilas colágenas, em que o tipo I
predomina no grupo adulto e o tipo III no idoso, diminuição na quantidade de células
de fibrocartilagem, processos citoplasmáticos destas células curtos e em número
reduzido e uma diminuída capacidade de síntese devido a aparelhos de Golgi
menores, poucas cisternas de retículo endoplasmático granular e escassas
mitocôndrias.
Palavras-chave: Junção Osteotendínea. Ultraestrutura. Fibras Colágenas.
Envelhecimento. Ratos.
ABSTRACT
CURY, D. P. Structural characteristics of the bone-tendon junction of triceps
surae muscle of the adult and old Wistar rats: Light microscope, scanning
electron microscope and transmission electron microscope study.
[Características estruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural de ratos
Wistar adultos e idosos: estudo aos microscópicos de luz, microscópico eletrônico de
varredura e de transmissão]. 2013. 108f. Dissertação (Mestrado em Ciências) –
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São
Paulo, 2013.
Tendons are transition tissues of contractile forces generated by muscles and
transferring to bone, generating this way move. The region where tendon attach to
bone is called bone-tendon junction or enthesis. These junctions can be classified as
fibrous or fibrocartilaginous, the fibrous are those in which tendons/ligaments are
attached in the shaft (diaphysis) of the long bones and fibrocartilaginous attachment
occur in the epiphyses of the long bones or short bones. This study aims to analyze
collagen fibers and the cells present in the bone-tendon junction, using light
microscope with Hematoxylin–eosin, Azocarmine, Picrosirius red and Masson's
trichrome staining and ultrastructural aspects using scanning electron microscope,
transmission electron microscope methods. Thirty male Wistar rats were using, 15
adults rats at 4 months-old (A group) and 15 old rats at 18 months-old (B group), were
used 5 rats of each group to light microscopy, 5 rats to scanning electron microscopy
and 5 rats to transmission electron microscopy. The hind limbs of the rats were
removed, dissected and demineralized using 7% EDTA solution to light microscopy
and 0,15M pH 7,4 EDTA solution to transmission electron microscopy for 4 weeks, was
not necessary demineralize the samples to scanning electron microscopy. Cut in slices
6 µm thickness were made and mounted on histological slides to analyze in light
microscope, freeze-fracture technique with liquid nitrogen was performed to analysis
in scanning electron microscope and cuts in slices 60 nm thickness were made,
mounted on copper grids (200-mesh - EMS) to analysis in transmission electron
microscope. The aging process showed changes of the collagen fibrils, in which type I
predominates on adult groups and the type III on the old group, decrease in the amount
of the fibrocartilage cells, few and short cytoplasmic processes of this cells and a
decreased synthesis capacity due a small Golgi apparatus, a few cisternae of rough
endoplasmatic reticulum and few mitochondria.
Keywords: Bone-tendon Junction. Ultrastructure. Collagen Fibers. Aging. Rats.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm Micrômetro
FM Fibrocartilagem Mineralizada
FnM Fibrocartilagem não Mineralizada
GPa Gigapascal - Pascal é a unidade padrão de pressão e tensão no
Sistema Internacional de Unidades, equivale a força de 1 Newton
aplicada uniformemente sobre uma superfície de 1 m2, gigapascal
corresponde a 109
ME Microscopia Eletrônica / Microscópio Eletrônico
MEC Matriz Extracelular
MET Microscopia Eletrônica de Transmissão
MEV Microscopia Eletrônica de Varredura
min Minutos
ML Microscopia de Luz
ml Mililitros
mm Milímetros
MPa Megapascal (corresponde a 106)
nm Nanômetros
wt% Porcentagem por peso (weight %)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 18
2 REVISÃO DE LITERATURA .............................................................................. 21
2.1 SISTEMA LOCOMOTOR: MÚSCULO ......................................................... 21
2.2 MÚSCULO TRÍCEPS SURAL ...................................................................... 21
2.3 TENDÃO CALCÂNEO .................................................................................. 22
2.4 JUNÇÃO OSTEOTENDÍNEA – ENTESE ..................................................... 24
2.5 TECIDO ÓSSEO .......................................................................................... 25
2.6 ENVELHECIMENTO .................................................................................... 27
3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................... 30
4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................. 32
4.1 MICROSCOPIA DE LUZ .............................................................................. 32
4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA....................................... 33
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO ................................... 34
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ......................................................................... 35
5 RESULTADOS ................................................................................................... 40
5.1 MICROSCOPIA DE LUZ DOS GRUPOS ADULTO E IDOSO ..................... 40
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO ADULTO ... 55
5.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO IDOSO ...... 64
5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO ADULTO
74
5.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO IDOSO .. 80
5.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ......................................................................... 87
6 DISCUSSÃO ...................................................................................................... 93
7 CONCLUSÃO ..................................................................................................... 99
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 101
INTRODUÇÃO
18
1 INTRODUÇÃO
Tendões são tipicamente descritos como tecido conjuntivo fibroso denso que
inserem os músculos aos ossos. Eles possuem relativamente poucas células, mas
grande número de fibras colágenas que dão a eles forças tensíveis extremamente
altas (BENJAMIN; RALPHS, 2000).
Os tendões são revestidos externamente por tecido conjuntivo areolar frouxo
denominado paratendão, este tecido é forrado em sua superfície interior por células
sinoviais. Abaixo ao paratendão, todo o tendão é revestido por um delgado tecido
conjuntivo chamado de epitendão (KANNUS, 2000; MAZZONE; MCCUE, 2002).
Revestindo o fascículo de fibras colágenas encontra-se o endotendão, uma delgada
rede reticular com espessura variada e que atua como importante conduíte para vasos
sanguíneos e nervos e permite aos fascículos alguma independência de movimento
(BENJAMIN; RALPHS, 2000).
Sua principal função é servir como tecido de transição das forças contráteis
geradas pelos músculos e as transferir para os ossos podendo assim gerar
movimentos. A região de inserção do tendão ao tecido ósseo é chamada de junção
osteotendínea ou entese (BENJAMIN; RALPHS, 1998; THOMOPOULOS; GENIN;
GALATZ, 2010).
Enteses podem ser classificadas como fibrosas ou fibrocartilaginosas
(BENJAMIN et al., 2002), as fibrosas são aquelas em que os tendões e/ou ligamentos
se inserem no eixo (diáfise) dos ossos longos e as fibrocartilaginosas a inserção
ocorre nas epífises dos ossos longos ou nos ossos curtos (BENJAMIN; RALPHS,
2000).
Na maioria das vezes esta inserção não ocorre diretamente no tecido ósseo e
sim ao periósteo (RIZZOLO; MADEIRA, 2012), mas no caso da inserção do tendão
calcâneo em que ocorre através de uma região de fibrocartilagem, esta zona de
transição não apresenta periósteo e o tendão insere-se diretamente ao osso
(BENJAMIN et al., 2006).
O tecido ósseo se desenvolve por meio da substituição do tecido conjuntivo
preexistente e existem três processos de osteogênese: ossificação intramembranosa,
pericondral e endocondral (FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).
19
Revestindo externamente o osso, encontra-se o periósteo, uma delgada
membrana conjuntiva que não se depara nas superfícies articulares
(SCHMAEDECKE, 2004) e internamente este revestimento é realizado por uma
membrana denominada endósteo, constituído por uma camada de células
osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do osso esponjoso, o canal medular,
os canais centrais e os perfurantes (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2011).
A senilidade é o maior fator de risco para distúrbios do tendão, a idade
relacionada a mudanças das propriedades estruturais e mecânicas podem predispor
os tendões a lesões (ZHOU et al., 2010).
Em termos ósseos a idade é um preditor de osteoartrite, perda óssea,
desenvolvimento de osteoporose e fratura (WOOLF; PFLEGER, 2003).
Sabendo das complicações causadas pelo envelhecimento no tendão e no
tecido ósseo e pela falta de informações específicas deste processo natural da vida
na região de junção osteotendínea, o objetivo deste trabalho foi analisar
estruturalmente e ultraestruturalmente a inserção do tendão calcâneo ao osso e as
alterações decorrentes do processo de envelhecimento.
20
REVISÃO DE LITERATURA
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 SISTEMA LOCOMOTOR: MÚSCULO
O sistema locomotor é composto pelos músculos esqueléticos, tendões,
aponeuroses, ligamentos, fáscias e pelos ossos. O músculo é constituído basicamente
de ventre e tendão, o ventre muscular é a porção central formado por feixes de fibras
musculares contráteis, que em repouso apresentam certo grau de contração reflexa,
que corresponde ao tônus muscular. O tendão é a parte que se insere ao osso, não
contrátil e muito resistente (RIZZOLO; MADEIRA, 2012).
Além disso, histologicamente e ultraestruturamente a fibra muscular
esquelética possui uma estrutura alongada e multinucleada, com diâmetros que
variam de 10 a 100 µm em diferentes músculos e com o citoplasma contendo feixes
de miofibrilas dispostos longitudinalmente. As fibras musculares estão organizadas
em fascículos paralelos e são envoltos por feixes de fibras de colágeno. A disposição
dos feixes de colágeno permite certo grau de mudança do comprimento das fibras
durante a contração e relaxamento muscular (ISHIKAWA et al., 1982).
A organização muscular ocorre em disposições longitudinais, transversais ou
oblíquas. Cada fibra muscular apresenta a forma alongada contendo feixes de
miofilamentos e organelas. Histologicamente, uma fibra muscular está envolta por
uma camada de tecido conjuntivo, denominado endomísio, o conjunto de fibras se
agrupam em fascículos, que também são envoltos por tecido conjuntivo, denominado
perimísio. Além disso, estas fibras equivalentes encontram-se agrupadas como um
todo, envolvidas por uma camada espessa de tecido conjuntivo, denominada epímisio
(NISHIMURA; HATTORI; TAKASHI, 1994; OKITA et al., 2008).
2.2 MÚSCULO TRÍCEPS SURAL
Um conjunto de músculos posteriores da perna formado pelo músculo
gastrocnêmio e o músculo sóleo que juntos constituem o músculo tríceps sural.
22
Possuindo diversas características específicas na compreensão dos padrões
fundamentais da marcha, equilíbrio, entre outros. Estes músculos são os principais
agonistas do movimento de flexão plantar, mas possuem diferentes propriedades
arquitetônicas, como o comprimento do músculo e o comprimento do fascículo
(KAWAKAMI; ICHINOSE; FUKUNAGA, 1998; PEIXINHO, 2010).
O músculo gastrocnêmio é o mais superficial e forma a maior parte do tríceps
sural. Origina-se por duas porções inseridas aos côndilos do fêmur por tendões
achatados e resistentes. A porção medial e maior origina-se em uma depressão nas
partes proximal e posterior do côndilo medial e da parte adjacente do fêmur. A porção
lateral origina-se de uma impressão no lado do côndilo lateral e da superfície posterior
do fêmur, imediatamente proximal à parte lateral do côndilo. As fibras se unem
formando um ângulo na linha média do músculo em uma rafe tendínea que se
expande numa vasta aponeurose na superfície anterior do músculo, e nesta inserem-
se as fibras remanescentes. A aponeurose restringe-se gradualmente e une-se com
o tendão do sóleo, formando com este o tendão calcâneo (GOSS, 1988; BLITZ;
ELIOT, 2007; HÉBERT-LOSIER et al., 2011).
O sóleo é um vasto músculo plano fusiforme, localizado imediatamente abaixo
do gastrocnêmio. Origina-se por fibras tendíneas da superfície posterior da cabeça da
fíbula e do terço proximal da superfície posterior do corpo do osso; da linha poplítea e
do terço médio da borda medial da tíbia. Algumas fibras também se originam de um
arco tendíneo colocado entre as origens tibial e fibular do músculo, sob o qual
caminham os vasos poplíteos e o nervo tibial. As fibras terminam em uma aponeurose
que reveste a superfície posterior do músculo, e gradualmente tornam-se mais
espessas e mais estreitas, reúnem-se à inserção do gastrocnêmio, formando com este
o tendão calcâneo (GOSS, 1988; BLITZ; ELIOT, 2007; HÉBERT-LOSIER et al., 2011).
2.3 TENDÃO CALCÂNEO
O termo tendão deriva-se do Latim tendere e significa esticar (FERNANDES,
1999), este nome é controverso já que a função básica do tendão é transmitir as forças
contráteis geradas pelo ventre muscular para o tecido ósseo e assim gerar movimento
(BENJAMIN; RALPHS, 1998; BENJAMIN et al., 2002; VOLETI, BUCKLEY;
23
SOSLOWSKY, 2012) também são fundamentais para a estabilidade ligamentar
(NOURISSAT et al., 2010). O tendão calcâneo é constituído pela adjeção dos
músculos gastrocnêmio e sóleo, sendo o mais espesso e forte do corpo humano (DEL
SOL; JUNGE; VÁSQUEZ, 2011).
Os eventos morfológicos da formação dos tendões foram descritos inicialmente
por Wortham (1948), podemos explicar este processo resumindo-o em três etapas: 1)
fibroblastos sintetizam pequenas fibrilas colágenas intermediárias em distintos
componentes extracelulares. 2) estas fibrilas intermediárias agrupam-se
longitudinalmente ao longo de delgadas estruturas colágenas. 3) essas cadeias se
fundem lateralmente para constituir espessas fibrilas visto no tecido totalmente
desenvolvido (VOLETI, BUCKLEY e SOSLOWSKY, 2012).
O tendão consiste de 55-70% água, uma parte substancial está associada a
proteoglicanos na matriz extracelular (MEC), o peso do tendão seco corresponde a
60-85% de colágenos, destes aproximadamente 60% é do tipo I, organizados em
fibras resistentes a tração e compostos de duas cadeias α1 e uma α2 (KJAER, 2004).
Menos de 10% é colágeno tipo III (AMIEL et al., 1991; CHANG et al., 2012), sendo
que o tipo I está organizado em fibrilas agrupadas paralelamente formando
organizados feixes, enquanto o tipo III é quase completamente restrito ao endotendão
que rodeia os feixes (CHANG et al., 2012).
Os elementos da MEC são produzidos por tenoblastos e tenócitos, que são
fibroblastos e fibrócitos alongados que se encontram entre as fibras de colágeno,
estão organizados em um complexo esquema hierárquico para formar o tendão
(KANNUS, 2000). Os fibroblastos produzem grande quantidade da MEC, resultando
em uma estrutura densa e hipocelular (TOZER; DUPREZ, 2005).
A grande maioria dos trabalhos considera o tendão pouco vascularizado ou
relativamente avascular (CALVE et al., 2004), porém outros estudos demonstram que
o tendão calcâneo é vascularizado lateralmente pela artéria fibular e medialmente pela
artéria tibial posterior (CHEN et al., 2009), além destas duas os ramos terminais da
artéria poplítea também são responsáveis pela vascularização (WOLFF et al., 2012).
O paratendão mostra ser uma bainha tendinosa vascular que envolve o tendão
de tal maneira que sua remoção retiraria todo o suprimento vascular do tecido
tendíneo (CHEN et al., 2009).
24
2.4 JUNÇÃO OSTEOTENDÍNEA – ENTESE
A interface de contato do tendão com o tecido ósseo é chamada de “entese”,
este termo é derivado do Grego antigo énthesis, sendo que esta expressão também
é utilizada para ligamentos e cápsula articular que inserem-se ao tecido ósseo, são
classificadas como fibrosa (exemplo: ligamento colateral medial) ou fibrocartilaginosa
(exemplo: tendão supraespinal, tendão calcâneo) (DE PALMA et al., 2004;
CLAUDEPIERRE; VOISIN, 2005; SCHWARTZ et al., 2012). As enteses fibrosas
tipicamente ocorrem sob grandes áreas e as fibrocartilaginosas em pequenas áreas
(THOMOPOULOS et al., 2006).
Enteses fibrosas são formadas através de processos de ossificação
intramembranosa e possuem suas calcificações amparadas via fibras de colágeno
perfurante (fibras de Sharpey), estas fibras se estendem a partir do tecido profundo
do tendão/ligamento para o interior do osso (FAN et al., 2009). As enteses
fibrocartilaginosas originam-se através da ossificação endocondral e possuem uma
linha de cimento descontínua separando a fibrocartilagem mineralizada e o osso
lamelar (DOSCHAK; ZERNICKE, 2005).
A transição de tecido mole para tecido duro é de aproximadamente 1 mm e é
uma área complexa (O'BRIEN, 1997). Esta região tipicamente consiste de quatro
zonas: A primeira zona consiste do próprio tendão e é composta por fibras colágenas
tipo I bem alinhadas com pequenas quantidades de proteoglicano decorina. A
segunda zona consiste de fibrocartilagem não mineralizada e é composta por
colágeno tipo II e III, com pequenas quantidades de colágenos tipo I, IX e X e
pequenas quantidades de proteoglicanos, agrecanos e decorina. A terceira zona
consiste de fibrocartilagem mineralizada e é constituída predominantemente por
colágeno tipo II com significante quantidade de colágeno tipo X, bem como agrecanos.
E finalmente a quarta zona, constituída pelo tecido ósseo, composta principalmente
por colágeno tipo I com um elevado teor de minerais (THOMOPOULOS et al., 2006).
Enteses normais são avasculares em ambas regiões de fibrocartilagem (BENJAMIN;
MCGONAGLE, 2009).
A fibrocartilagem não mineralizada e a fibrocartilagem mineralizada, juntas
formam uma zona de transição. O arranjo da zona de transição entre tendão e osso
garante uma transição gradual da rigidez e outras propriedades do material entre o
25
tendão, um tecido mole e osso, um tecido duro (WONG et al., 2009). A fibrocartilagem
mineralizada encontra-se próxima ao tecido ósseo e a fibrocartilagem não
mineralizada propínqua ao tendão (WONG et al., 2004).
O tendão e o osso apresentam comportamentos mecânicos muito diferente, a
nível hierárquico de tecido, o tendão possui um módulo tênsil na ordem de 200 MPa
em direção a força muscular, por outro lado o tecido ósseo possui um módulo de 20
GPa em ambas as forças de tensão e compressão e é relativamente rígido e
quebradiço em relação ao tendão (THOMOPOULOS; GENIN; GALATZ, 2010).
Na maioria das vezes esta inserção não ocorre diretamente no tecido ósseo e
sim ao periósteo, sendo que a tração é feita neste último tecido que a transmite ao
osso, em alguns casos fibras tendíneas chegam a ultrapassar o periósteo para se
inserirem em pequenas fóveas ósseas. (RIZZOLO; MADEIRA, 2004), mas no caso da
inserção do tendão calcâneo em que ocorre através de uma região de fibrocartilagem,
esta zona de transição não apresenta periósteo e o tendão insere-se diretamente ao
osso (BENJAMIN et al., 2006).
Esta junção é uma estrutura forte protegida pela zona de transição, falhas
traumáticas perto da junção osteotendínea normalmente ocorrem com uma avulsão
do osso ou uma falha do tendão/ligamento, mas não na junção (NOYES; DE LUCAS;
TORVIK, 1974; CROWNINSHIELD; POPE, 1976; WOO et al., 1990).
2.5 TECIDO ÓSSEO
O tecido ósseo se desenvolve por meio da substituição do tecido conjuntivo
preexistente e existem três processos de osteogênese: ossificação intramembranosa,
pericondral e endocondral (FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).
A ossificação intramembranosa é um tipo de formação óssea que ocorre no
mesênquima, que constitui uma bainha membranosa, o mesênquima condensa-se e
se torna altamente vascular, algumas células se diferenciam em osteoblastos
(MOORE; PERSAUD, 2008).
Osteoblastos são células de origem mesenquimal responsáveis pela criação e
manutenção da arquitetura esquelética, essas células produzem matriz extracelular,
proteínas e reguladores da mineralização da matriz durante a formação óssea inicial
26
e mais tarde são responsáveis pelo remodelamento ósseo (NEVE; CORRADO;
CANTATORE, 2011).
Os osteoblastos depositam uma matriz não-mineralizada chamada de tecido
osteóide, o fosfato de cálcio é depositado no tecido osteóide à medida que este é
organizado em osso, os osteoblastos ficam embebidos nesta matriz e tornam-se
osteócitos (MOORE; PERSAUD, 2008).
Os osteócitos são o tipo de célula mais abundante no osso e compõem cerca
de 90-95% da população de células no osso adulto (SCHAFFLER et al., 2013, no
prelo)1, o que corresponde entre 20,000 e 80,000 células por mm3 de tecido ósseo
(FRANZ-ODENDAAL; HALL; WITTEN, 2006).
No início o osso recém-formado não possui um padrão organizado, as
espículas ósseas logo se tornam organizadas e coalescem em lamelas que
desenvolvem-se ao redor de vasos sanguíneos formando os canais haversianos
(ósteons). Além disso, alguns osteoblastos permanecem na periferia do tecido ósseo
formando placas de osso compacto na superfície. Entre as placas ósseas da
superfície, o osso interposto permanece espiculado ou esponjoso, esse aspecto é
acentuado pela ação de células com uma origem diferente – os osteoclastos
(MOORE; PERSAUD, 2008), as principais células responsáveis pela reabsorção
óssea (LI; KONG; QI, 2006).
A ossificação pericondral é o modo mais comum de formação óssea se um
precursor cartilaginoso está presente. Este tipo de ossificação normalmente inicia-se
com a transformação de um pericôndrio em periósteo (FRANZ-ODENDAAL; HALL;
WITTEN, 2006).
Já a ossificação endocondral é o principal processo responsável pela formação
da maioria dos ossos de mamíferos, gerando osso via cartilagem intermediária
(LONG; ORNITZ, 2013).
Uma vez formado os modelos cartilaginosos estes são invadidos primeiramente
pelo centro por condrócitos hipertrofiados e por invasão vascular e mais tarde em cada
extremidade estabelecendo os centros de ossificação primário e secundário
(respectivamente). O centro secundário formado é separado do centro primário pela
placa de crescimento que é responsável pelo crescimento longitudinal (MACKIE et al.,
2008).
1 SCHAFFLER, M. B.; CHEUNG, W. Y.; MAJESKA, R.; KENNEDY, O. Osteocytes: Master Orchestrators of Bone. Calcified Tissue International, 2013.
27
A hipertrofia desses condrócitos está associada com apoptoses, calcificação
da matriz e invasão vascular. Os vasos sanguíneos trazem com eles células-tronco
de diferentes linhagens que dão origem a osteoblastos que depositam osso e os
osteoclastos que reabsorvem o tecido ósseo (WHITE; WALLIS, 2001).
Um terço da composição do osso do indivíduo adulto é formado por uma matriz
orgânica fibrosa com 90% de colágeno e uma substância fundamental amorfa
contendo proteínas. Tanto as fibras colágenas quanto as proteínas não-colagenosas
tem funções na mineralização e mostram grande tendência de agregação, em
particular ao íon cálcio. Os outros dois terços são inorgânicos: cristais de hidroxiapatita
de 10 nm de comprimento aproximadamente, que contêm principalmente cálcio,
fósforo e íons hidroxila. Os sais inorgânicos também são compostos por carbonato,
citrato de sódio, magnésio e flúor (RIZZOLO; MADEIRA, 2004).
Revestindo externamente o osso, encontra-se o periósteo, uma delgada
membrana conjuntiva que não se depara nas superfícies articulares
(SCHMAEDECKE, 2004).
A camada mais superficial do periósteo contém principalmente fibras colágenas
e fibroblastos. A lâmina interna apresenta células osteoprogenitoras,
morfologicamente parecidas com os fibroblastos. As células osteoprogenitoras se
multiplicam por mitose e se diferenciam em osteoblastos, desempenhando papel
importante no crescimento dos ossos. O endósteo é constituído por uma camada de
células osteogênicas achatadas revestindo as cavidades do osso esponjoso, o canal
medular, os canais centrais e os perfurantes, por onde apresentam estruturas
sensitivas, linfáticas e vasculares (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2011).
2.6 ENVELHECIMENTO
A senilidade é o maior fator de risco para distúrbios do tendão. A idade
relacionada a mudanças das propriedades estruturais e mecânicas podem predispor
os tendões a lesões (ZHOU et al., 2010). A habilidade de realizar seu papel funcional
é comprometida com o envelhecimento, contribuindo para a alta incidência de
fragilidade e deficiência na locomoção, observada na população idosa (WOOD et al.,
2011). Os tenoblastos e os tenócitos, os maiores elementos celulares do tendão
28
produzem e organizam a matriz extracelular que também sofrem com as mudanças
do envelhecimento em número e atividade (IPPOLITO et al., 1980; NAKAGAWA et al.,
1994).
A incidência de degeneração e ruptura do tendão no envelhecimento devido as
mudanças morfológicas, tal como, a diminuição da densidade celular, diminuição da
densidade das fibras colágenas e a perda da ondulação das fibras, predispõe a lesões
nos tendões (MAZZONE; MCCUE, 2002). Apesar de mudanças dramáticas nas
propriedades mecânicas no envelhecimento, a morfologia das fibras colágenas e a
fração de disposição permanecem relativamente constantes em todo o tendão
(WOOD et al., 2011).
A massa óssea aumenta durante a infância e adolescência e atinge um pico na
terceira ou quarta década de vida e então diminui com o avanço da idade (WASNICH,
1998). É amplamente reconhecido que a idade está associada com a diminuição da
massa e da densidade mineral óssea e ocasiona uma alta taxa de fraturas em pessoas
idosas (RUSSO et al., 2003; RITCHIE et al., 2006).
O envelhecimento ocasiona eventos agudos e de curta duração, podendo
evoluir para doenças ao longo da vida, incluindo osteoartrite, artrite reumatoide,
osteoporose e dor lombar (WOOLF; PFLEGER, 2003).
29
PROPOSIÇÃO
30
3 PROPOSIÇÃO
O presente estudo teve como objetivo analisar as alterações estruturais e
ultraestruturais da junção osteotendínea do músculo tríceps sural em ratos Wistar
adultos e idosos.
Tendo como objetivos específicos:
- Descrever e quantificar as alterações do tecido conjuntivo, das células de
fibrocartilagem e a morfologia da região através de microscopia de luz com as
colorações de Hematoxilina-eosina, Azocarmim, Picro-sírius e Tricromo de Masson.
- Descrever as alterações estruturais através de microscopia eletrônica de
varredura e ultraestruturais, descrevendo as alterações celulares através da
microscopia eletrônica de transmissão.
31
MATERIAIS E MÉTODOS
32
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados 30 ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, sendo 15 adultos
com idade de 4 meses (grupo A) e 15 idosos com idade de 18 meses (grupo B), 5
animais de cada grupo foram utilizados para ML, 5 para MEV e 5 para MET,
provenientes do Biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo. Os animais foram alojados em gaiolas de contenção de polipropileno,
agrupados em números de cinco, com água e ração “ad libitum”, mantidos em
períodos claro/escuro de 12 horas, à temperatura média de 22 ± 2°C, e não foram
submetidos a qualquer regime especial de exercício. Foram anestesiados e
eutanásiados com overdose de Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg) (DIAS et
al., 2012). Todos os procedimentos adotados foram aprovados pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade de São Paulo, protocolado sob número 2536/2012 e do Instituto de
Ciências Biomédicas (ICB-USP), registrado sob número 120 nas folhas 133 do livro
02.
4.1 MICROSCOPIA DE LUZ
Foram utilizados 5 animais de cada grupo (n=5), eutanasiados com overdose
de Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg). Após a remoção de vinte amostras,
estas foram imediatamente imersas em solução fixadora de paraformoldeído 4%
durante 48 horas a temperatura ambiente no Laboratório Multiusuário de Histologia e
Microscopia Eletrônica do Departamento de Anatomia do Instituto de Ciências
Biomédicas III da Universidade de São Paulo. Continuamente, as amostras foram
lavadas em água corrente e dissecadas, em seguida imersas em solução de EDTA –
ácido etilenodiamino tetra-acético, sal dissódico na concentração de 7% até completa
desmineralização.
Para verificar o processo de desmineralização, foram realizados testes a cada
72 horas com solução de oxalato de amônia 5% até que a solução descalcificadora
não se apresentou turva durante o teste.
33
A desidratação dos tecidos foi realizada utilizando série crescente de álcoois
do 70% ao absoluto, sendo 30 min em cada álcool até o absoluto II e uma hora no
absoluto III. Em seguida os tecidos foram diafanizadas com Xilol I, II e III por imersões
consecutivas de 30 min em cada solução.
A embebição das amostras em parafina foi efetuada na estufa a fim de se retirar
o Xilol e substituir gradativamente desde a parafina I, seguida por parafina II e III (30
min cada), desta forma, prontas para serem emblocadas com parafina pura.
As amostras foram incluídas em blocos de parafina de forma retangular de 4
cm (C) x 2,5 cm (L) x 3 cm (A) a fim de se obter cortes parassagitais da área de
inserção do tendão calcâneo para que se evidenciem as interfaces osteotendíneas.
Cortes de 6 µm foram montados em lâminas histológicas e corados pelos
métodos de Hematoxilina-eosina para examinar as características dos feixes de fibras
colágenas, tecido ósseo e núcleos, Azocarmim para evidenciar a distribuição do tecido
conjuntivo na área de inserção e o Tricromo de Masson para melhor evidenciar as
fibras colágenas na região mineralizada (BEHMER et al., 1976). Picro-sírius para a
disposição do tecido conjuntivo e sob luz polarizada para a identificação do tecido
conjuntivo tipo I e III segundo método descrito por Junqueira et al. (1979). As lâminas
foram analisadas em microscópio de luz Leica DMR equipado com câmera Nikon DS-
Ri1 do Laboratório de Neuroanatomia Química do Departamento de Anatomia do
Instituto de Ciências Biomédicas III da Universidade de São Paulo.
4.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Para a microscopia eletrônica de varredura, 5 animais de cada grupo, foram
anestesiados com Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg), sendo perfundidos com
a solução fixadora de Karnovsky modificada (glutaraldeído a 2,5% e paraformoldeído
2% em solução tampão fosfato de sódio a 0,1M e pH = 7,4) (WATANABE; YAMADA,
1983) injetando-se aproximadamente 60 ml de solução pelo ventrículo esquerdo do
coração.
A junção osteotendínea do tendão calcâneo foi dissecada e imersa na mesma
solução durante 24 horas à 4ºC. Para este tipo de microscopia as amostras não foram
desmineralizadas, em seguida foram lavadas em solução tampão fosfato de sódio a
34
0,1M e pH = 7,4. A fratura ocorreu de acordo com a técnica de congelamento em
nitrogênio líquido empregando o método descrito por Watanabe (1998).
As amostras foram lavadas em solução tampão fosfato de sódio e pós-fixadas
em solução de tetróxido de ósmio a 1%, durante 2 horas à 4ºC, em seguida lavadas
em água destilada e desidratadas em série crescente de alcoóis (70% ao absoluto,
durante 15 min em cada álcool e quatro vezes no absoluto pelo mesmo tempo), a
secagem das amostras foi realizada em aparelho ponto crítico Balzers CPD-030
(Processo FAPESP 86/2549-0) utilizando dióxido de carbono (CO2) líquido.
Estas amostras foram montadas em bases metálicas apropriadas (stubs) e
cobertas com íons de ouro em aparelho Balzers Union SCD-040 (Processo FAPESP
93/444-1) e analisados no microscópio eletrônico de varredura Field Emission Gun
Scanning Eletron Microscope (FEG-SEM) Jeol modelo JSM-7401F da Central
Analítica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo.
4.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO
Para a microscopia eletrônica de transmissão, 5 animais de cada grupo, foram
anestesiados com Xilazina (10mg/kg) e Quetamina (75mg/kg), sendo perfundidos com
a solução fixadora de Karnovsky modificada contendo glutaraldeído a 2,5% e
paraformoldeído 2% em solução tampão fosfato de sódio a 0,1M e pH = 7,4
(WATANABE; YAMADA, 1983) injetando-se aproximadamente 60 ml de solução pelo
ventrículo esquerdo.
A junção osteotendínea do tendão calcâneo foi dissecada e fixada em
glutaraldeído 2,5% durante 4 horas a temperatura ambiente. Em seguida as amostras
foram desmineralizadas com EDTA específico para este tipo de microscopia,
constituído de glutaraldeído 1,9%, cacodilato de sódio tampão 0,06 M e EDTA 0,15
M, pH 7,4 (EVERTS et al., 2012). Em seguida, foi realizada a lavagem com tampão
fosfato de sódio e pós-fixados com a solução de tetróxido de ósmio a 1% durante 2
horas à 4ºC.
Em temperatura ambiente foi realizada a desidratação em série crescente de
alcoóis a partir do 30 ao 100% com banhos de 30 minutos cada e 2 banhos de óxido
de propileno pelo mesmo tempo, para a infiltração da resina as amostras foram
35
colocadas em mistura de resina spurr 1:1 óxido de propileno durante 24 horas em
misturador rotatório, após esta etapa a resina foi substituída pela mistura de resina
spurr 3:1 durante 8 horas, finalmente as amostras foram colocadas em resina pura
durante 24 horas.
A inclusão do material a fim de se obter blocos foi realizada em molde de
silicone de 14 mm (C) x 5 mm (L) x 6 mm (A) que foram levados em estufa a 60ºC por
72 horas para completa secagem. Obtidos os blocos de resina, foi efetuada a
trimagem e os cortes semi-finos de 400 nm e corados com a solução de azul de
toluidina para verificação da área em microscópio de luz. Posteriormente foram
realizados os cortes ultrafinos de 60 nanômetros e coletados em telas de cobre de
200 “mesh” (EMS) e contrastados com a solução de acetato de uranila a 4% por 3 min
(WATSON, 1958; WATANABE; YAMADA, 1983) e com a solução aquosa de citrato
de chumbo a 0,4% por 3 min lavando em seguida com água destilada (REYNOLDS,
1963, WATANABE; YAMADA, 1983). As telas foram examinadas ao microscópio
eletrônico de transmissão Jeol 1010 regulado para 80 kV no Centro de Microscopia
do Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências
Biomédicas I da Universidade de São Paulo.
4.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Para a análise quantitativa diferencial das fibras colágenas dos tipos I e III na
área da junção osteotendínea do tendão calcâneo, utilizamos as imagens histológicas
coradas pelo método de Picro-sírius e analisadas ao microscópio sob luz polarizada.
Utilizando o software “Photoshop CS6” cada fotomicrografia obtida sob luz
polarizada foi composta em três imagens monocromáticas em amarelo, vermelho e
verde, levando em consideração o trabalho de Montes e Junqueira (1991), em que os
autores afirmam que o colágeno tipo I possui coloração amarela e/ou vermelha e o
tipo III tonalidades esverdeadas.
Separando estas cores o próximo passo foi convertê-las em imagens binárias
e quantificar a área de cada colágeno, para estes últimos procedimentos utilizamos o
software gratuito “ImageJ 1.47v” (DIAS et al., 2013).
36
Para avaliar a quantidade de células de fibrocartilagem presentes nas regiões
de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada, utilizamos as imagens
histológicas coradas com hematoxilina-eosina, obtidas com aumento de 50x.
Desenhamos sobre a área de inserção um retângulo de 0,15 mm2 dividido ao meio
em que ocupou toda entese, esta linha divisória foi colocada exatamente acima da
tidemark, dividindo assim as duas regiões de fibrocartilagem de acordo com as figuras
1 e 2. Apenas as células contidas no retângulo foram contadas.
Figura 1 - Aspectos de Microscopia de Luz, corado com Hematoxilina-Eosina
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se a linha tidemark utilizada para posicionar o retângulo utilizado para quantificar
as células de fibrocartilagem. Aumento: 50x, barra: 100µm.
37
Figura 2 - Aspectos de Microscopia de Luz, corado com Hematoxilina-Eosina
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se o retângulo desenhado sobre a tidemark utilizado para quantificar as células
de fibrocartilagem. Aumento: 50x, barra: 100µm.
A medida do comprimento do tendão calcâneo na região de inserção com o
tecido ósseo foi realizada entre o ponto superior de contato do tendão com o osso e o
ponto inferior no final da fibrocartilagem não mineralizada, como mostra a figura 3.
Tanto para esta medida quanto para a contagem das células foi utilizado o software
ImageJ 1.47v.
38
Figura 3 - Aspectos de Microscopia de Luz, corado com Hematoxilina-Eosina
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Identifica-se o local utilizado para medir a espessura do tendão. Aumento: 50x,
barra: 100µm.
As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do software “Instat 3.0”
utilizando o “Teste-T de Student” não pareado, e aplicando ao teste de correção de
Welch, que melhor se aplica a este estudo por possuir dois grupos independentes, foi
adotado nível de “p” menor ou igual a 0,05 os dados foram representados pela média
± desvio padrão (MENDEŞ; AKKARTAL, 2010).
39
RESULTADOS
40
5 RESULTADOS
5.1 MICROSCOPIA DE LUZ DOS GRUPOS ADULTO E IDOSO
Análises realizadas ao microscópio de luz utilizando a coloração de
Hematoxilina-Eosina foi possível observar perante uma visão geral tanto no grupo
adulto quanto no idoso o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, uma grande
quantidade de espaços trabeculares de diferentes formatos podem ser notados sendo
circundados pelas trabéculas ósseas, perifericamente ao osso calcâneo observa-se a
fibrocartilagem periosteal (Figuras 4A-B).
Em maior aumento da região em que o tendão calcâneo se anexa ao tecido
ósseo, observa-se com maiores detalhes as trabéculas ósseas e espaços
trabeculares de diferentes tamanhos tanto no grupo adulto quanto no idoso, assim
como a fibrocartilagem periosteal, necessária para proteger o osso da compressão
causada pelo tendão durante o movimento de dorsiflexão (Figuras 5A-B).
Ainda em maior aumento da região de inserção do tendão calcâneo ao tecido
ósseo no grupo adulto, nota-se uma pequena linha incompleta denominada tidemark
em que ocorre a transição do tecido conjuntivo não mineralizado do tendão para o
tecido conjuntivo mineralizado no osso calcâneo, trabéculas e espaço trabecular
ficaram evidentes (Figura 6A). A mesma região no grupo idoso analisada com o
mesmo aumento, demonstra uma diferença na tidemark, no grupo idoso ela é uma
linha completa que ocupa todo o local de inserção separando a fibrocartilagem não
mineralizada da mineralizada (Figura 6B).
41
Figura 4 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o aspecto geral do tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O),
fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 25x, barra: 500 µm. (B) Mostra o aspecto geral do tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 25x, barra: 500 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.
A
B
*
FP
T
O
T
FP
* O
42
Figura 5 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto o tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O),
fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas maiores) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra no grupo idoso o tendão calcâneo (T) a inserção (*) ao tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (seta maior) e espaço trabecular (setas menores). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.
A
B
*
FP
T
O
T
FP
*
O
43
Figura 6 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM),
fibrocartilagem mineralizada (FM), uma pequena tidemark entre as fibrocartilagens (elipse tracejada), trabécula óssea (seta maior), espaço trabecular (*). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra no grupo idoso a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), completa tidemark entre as fibrocartilagens (elipse tracejada). Aumento: 100x, barra: 50 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.
A
FnM
FM
B
FM
FnM
*
44
Em maior aumento da junção osteotendínea do tendão calcâneo no grupo
adulto, é possível observar a fibrocartilagem não mineralizada separada da
fibrocartilagem mineralizada por duas incompletas e delgadas linhas denominadas
tidemark, o tecido ósseo aparece evidente entre a fibrocartilagem mineralizada (Figura
7A). No grupo idoso a tidemark é uma linha bem definida e completa, separando os
dois tipos de fibrocartilagem, de forma clara o tecido ósseo se destaca entre a
fibrocartilagem mineralizada (Figura 7B). Uma grande quantidade de condrócitos na
maior parte organizados em fileiras são notados, é possível atentar-se que estas
células na fibrocartilagem não mineralizada próximas a tidemark são maiores que as
localizadas na fibrocartilagem mineralizada em ambos os grupos (Figuras 7A-B).
Na região de inserção ambos os grupos nos demonstra os condrócitos alojados
em lacunas, nota-se que na região de fibrocartilagem não mineralizada eles
apresentam um tamanho maior em comparação aos presentes na região
mineralizada, separando estas duas regiões existe a tidemark, muito delgada e quase
imperceptível no grupo adulto, ao contrário no idoso que é bem definida (Figuras 8A-
B).
É possível observar o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, ao redor
do osso calcâneo repara-se a fibrocartilagem periosteal que se distingue com nitidez
dos tecidos adjacentes, os espaços trabeculares de diversos tamanhos e formatos
rodeados pelas trabéculas ósseas são notados em ambos os grupos (Figuras 9A-B).
Em maior aumento da junção osteotendínea do tendão calcâneo corado com
Azocarmin evidencia-se tanto no grupo adulto quanto no idoso as fibrocartilagens
mineralizada e não mineralizada, entre elas é possível destacar a região de transição
destes tecidos, sendo possível notar os espaços trabeculares circundados por tecido
ósseo (Figuras 10A-B).
Análises em maior aumento da junção osteotendínea nos dois grupos nos
revela a região de transição da região de FnM para a FM, porém destaca-se a grande
quantidade de condrócitos, na maior parte deles organizados em fileiras. É possível
observar que estas células localizadas na FnM possuem um tamanho maior em
relação as presentes na FM, esta característica está presente em ambos os grupos
(Figuras 11A-B).
45
Figura 7 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto duas delgadas tidemark (setas maiores), fibrocartilagem não
mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), condrócitos (setas menores), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (B) Mostra no grupo idoso uma completa e bem definida tidemark (seta maior), condrócitos (setas menores), fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.
A
B
FnM
O
FnM
O
FM
FM
46
Figura 8 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no grupo adulto delgadas tidemark (setas maiores), tecido conjuntivo (setas
menores) entre os condrócitos (cabeças de seta) localizados na fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e mineralizada (FM). Aumento: 400x, barra: 10 µm. (B) Mostra no grupo idoso a tidemark (seta maior), tecido conjuntivo (setas menores), condrócitos (cabeças de seta), fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e mineralizada (FM). Aumento: 400x, barra: 10 µm. Coloração: Hematoxilina-Eosina.
A
B
FnM
FnM
FM
FM
47
Figura 9 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T) inserindo-se ao tecido ósseo (O), a fibrocartilagem periosteal (FP),
trabéculas ósseas (setas), espaço trabecular (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabécula óssea (seta maior), espaço trabecular (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Azocarmim.
A
B
* FP
T O
T FP
* O
*
48
Figura 10 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM),
região de transição entre as fibrocartilagens (seta), espaço trabécular (*), tecido ósseo (O). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra a fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (*), tecido ósseo (O). Aumento: 100x, barra: 50 µm. Coloração: Azocarmim.
A
B
O
FnM
*
O
* FM
FM
FnM
49
Figura 11 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fileiras de condrócitos (seta menor) na região de fibrocartilagem não
mineralizada (FnM), fileira de condrócitos (seta maior) na fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (elipse tracejada), tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (B) Mostra fileiras de condrócitos (setas menores) na região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM), fileira de condrócitos (setas maiores) na fibrocartilagem mineralizada (FM), região de transição entre as fibrocartilagens (elipse tracejada). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Azocarmim.
A
B
FnM
O
FnM
FM
FM
50
Utilizando o método de coloração de Trícromo de Masson em ambos os grupos,
foi possível demonstrar a fibrocartilagem periosteal, próxima a superfície profunda do
tendão, adjacente a junção osteotendínea as trabéculas ósseas ao redor dos espaços
trabeculares de diversos tamanhos e formatos também foram observados (Figuras
12A-B).
A coloração de Trícromo de Masson também nos demonstrou nitidamente os
feixes de fibras colágenas do tendão calcâneo da região de fibrocartilagem não
mineralizada em direção a região de fibrocartilagem mineralizada, estas fibras
apresentam-se organizadas paralelamente ao longo de todo o trajeto. Entre esses
feixes nota-se a presença de fileiras de condrócitos na região de fibrocartilagem
mineralizada tanto no grupo adulto quanto no idoso (Figuras 13A-B-C-D).
Análises realizadas sob uma vista geral do tendão e do osso calcâneo
utilizando a coloração de Pricro-sirius nos possibilita observar no grupo adulto e no
idoso o tecido tendíneo inserindo-se ao ósseo, adjacentemente encontra-se a
fibrocartilagem periosteal e ao centro as trabéculas preenchem o tecido parcialmente
formando cavidades, os espaços trabeculares (Figuras 14A-C). Estas mesmas
regiões analisadas sob luz polarizada nos permitiu observar o colágeno tipo I com tons
de amarelo e vermelho e o tipo III com coloração esverdeada, quanto a isto, destaca-
se a predominância do tipo I no grupo adulto e o tipo III no idoso, a fibrocartilagem
periosteal no adulto se distingue com clareza do tecido ósseo no adulto, enquanto no
idoso esta região não é tão bem observada (Figuras 14B-D).
Observações realizadas na região de inserção das fibras colágenas que
constituem o tecido tendíneo ao ósseo em maior aumento em ambos os grupos,
revelam a disposição geral destas fibras (Figuras 15A-C). Analisando a mesma área
sob luz polarizada é possível distinguir com clareza as fibras colágenas do tipo I e III
que constituem o tendão inserindo-se ao tecido ósseo, as fibras que compõem o
tendão demonstram uma disposição paralela entre si e bem organizada em direção
ao osso que apresenta colágeno distribuído de forma dissonante (Figuras 15B-D).
As fibras colágenas do tendão em ratos idosos demonstram uma inserção mais
profunda ao tecido ósseo e uma predominância de colágeno tipo III (Figura 15D),
enquanto que nos ratos adultos as fibras não se inserem tão profundamente e o
predomínio é de colágeno tipo I (Figura 15B).
51
Figura 12 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A) e idosos (B). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T) inserindo-se ao tecido ósseo (O), a fibrocartilagem periosteal (FP),
trabéculas ósseas (setas), espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (FP), trabécula óssea (seta), espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Tricromo de Masson.
* A
B
FP
T
*
*
*
FP
T
O
O
52
Figura 13 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A-B) e idosos (C-D). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior),
feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (seta menor). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (B) Mostra fileira de condrócitos (seta menor), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (cabeça de seta). Aumento: 200x, barra: 20 µm. (C) Mostra feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (seta menor). Aumento: 100x, barra: 50 µm. (D) Mostra fileira de condrócitos (seta menor), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem não mineralizada (seta maior), feixes de fibras colágenas na região de fibrocartilagem mineralizada (cabeça de seta). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Tricromo de Masson.
A B
C D
53
Figura 14 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A-B) e idosos (C-D). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T), região de fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas) e
espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius. (B) Mostra o tendão (seta), fibrocartilagem periosteal (FP), tecido ósseo (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada. (C) Mostra o tendão (T), região de fibrocartilagem periosteal (FP), trabéculas ósseas (setas) e espaços trabeculares (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius. (D) Mostra o tendão (seta), fibrocartilagem periosteal (FP), tecido ósseo (*). Aumento: 50x, barra: 100 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada.
A B
C D
FP
T
*
FP *
FP
T
* FP
*
54
Figura 15 - Microscopia de luz da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos (A-B) e idosos (C-D). Corte de amostra desmineralizada com solução de EDTA 7% em temperatura ambiente
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A-C) Mostra as fibras tendíneas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O). Aumento: 200x, barra:
20 µm. Coloração: Picro-sirius. (B-D) Mostra as fibras tendíneas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O), separação entre as fibras colágenas do tecido tendíneo ao ósseo (linha tracejada). Aumento: 200x, barra: 20 µm. Coloração: Picro-sirius, imagem sob luz polarizada.
A
C D
*
O
B
*
O
* O
* O
55
5.2 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO ADULTO
Análises realizadas em microscópio eletrônico de varredura, utilizando a
técnica de criofratura com nitrogênio líquido na região de inserção osteotendínea do
tendão calcâneo, em pequenas ampliações, 50x, 200x e 500x nas figuras 16A, 16B e
16C respectivamente nos revela o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo. As
trabéculas ósseas próximas a região de inserção foram demonstradas, assim como
espaços trabeculares ausentes de qualquer tipo de tecido em seu interior (Figura
16A).
Observa-se claramente as fibras colágenas que constituem o tendão calcâneo
inserindo-se ao tecido ósseo, é notável uma evidente transição entre estes dois
tecidos em maior aumento (Figura 16C).
Em maior aumento da região osteotendínea é possível observar com nitidez
entre as fibras colágenas que compõem o tendão calcâneo uma célula de
fibrocartilagem, assim como ficou evidente no tecido ósseo outra célula do mesmo
tipo. Lacunas, ou seja, pequenas cavidades em que estas células se alojam são
constatadas tanto na tecido tendíneo quanto ósseo (Figura 17A).
A mesma área analisada com um aumento ainda maior nos revela a disposição
das fibras colágenas pertencentes ao tendão inserindo-se ao tecido ósseo (Figura
17B).
Análise realizada em grande aumento nos revela a forma de como os feixes de
fibras colágenas que constituem o tendão calcâneo se inserem inicialmente na região
de fibrocartilagem não mineralizada, evidenciando nesta área lacunas de células de
fibrocartilagem presentes tanto entre os feixes de fibras colágenas quanto na
fibrocartilagem não mineralizada (Figura 18A).
É possível ainda demonstrar a transição entre as fibrocartilagens não
mineralizada e mineralizada, sendo que a não mineralizada apresenta fibras
colágenas não tão bem organizadas em comparação com a fibrocartilagem
mineralizada. Células de fibrocartilagem em ambas as regiões são notadas
organizadas em fileiras, sendo que entre estas células um grupo isogênico de
condrócitos foi observado (Figura 18B).
56
Figura 16 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), espaço trabecular (*) e trabéculas
ósseas (setas). Barra: 100 µm. (B) Mostra o tendão calcâneo (T) e o tecido ósseo (O). Barra: 50 µm. (C) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O) e a zona de transição entre os dois tecidos (*). Barra: 10 µm.
A B
C
T T
O
O
T
O
* *
*
57
Figura 17 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão (T), tecido ósseo (O), célula de fibrocartilagem entre as fibras
colágenas tendíneas (seta maior preta), célula de fibrocartilagem no tecido ósseo (seta maior branca), lacuna de célula de fibrocartilagem no tendão (seta menor) e lacunas de células de fibrocartilagem no tecido ósseo (cabeças de seta). Barra: 10 µm. (B) Mostra o tendão calcâneo (T), fibras colágenas (setas) inserindo-se ao tecido ósseo (O). Barra: 2 µm.
O
T
T
O
A
B
58
Figura 18 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013).
Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas do tendão (*) inserindo-se a região de fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e a presença de lacunas de células de fibrocartilagem (setas). Barra: 5 µm. (B) Mostra a transição entre a fibrocartilagem não mineralizada (FnM) e a fibrocartilagem mineralizada (FM), fibras colágenas na FnM (cabeças de seta), células de fibrocartilagem em fileiras (setas menores) e um grupo isogênico de condrócitos (seta maior). Barra: 10 µm.
FnM
FM
B
A
* * *
FnM
59
Examinando a região de fibrocartilagem mineralizada mais detalhadamente,
em maior aumento é possível identificar a morfologia da lacuna de uma célula de
fibrocartilagem. Esta apresenta a mesma forma da célula que a ocupava, possuindo
um formato ovalado, sendo que ao seu redor as fibras colágenas apresentam-se bem
organizadas, dispostas paralelamente umas às outras (Figura 19A).
Um grupo isogênico de condrócitos também foi observado, ao redor da lacuna
de cada condrócito e separando uma célula da outra a matriz territorial é demonstrada
(Figura 19B).
No tecido ósseo foi possível analisar com riqueza de detalhes uma parte de um
osteócito ocupando sua devida lacuna, os processos celulares que comunicam-se
com outros osteócitos ficaram evidentes assim como os canalículos, local por onde
percorre tais processos celulares (Figura 20A).
Observa-se também em outra região mineralizada uma lacuna ausente de
osteócito, nesta situação podemos evidenciar a disposição da fibras colágenas que a
constituem, fica claro que estas não possuem um arranjo análogo. No interior
constata-se os orifícios dos canalículos e exteriormente parte do trajeto destes (Figura
20B).
Identifica-se em análises de MEV realizadas no tecido ósseo a presença de
aglomerados de células sanguíneas maduras entre as trabéculas ósseas (Figura
21A). Observando detalhadamente com grande aumento, nota-se a forma como estas
células se agrupam e a presença de tecido conjuntivo entre elas (Figura 21B).
Averiguações realizadas ao redor destes aglomerados, constata-se a presença
de seios venosos medulares e as células sanguíneas maduras em seu interior (Figura
21C).
Analises mais minuciosas do tendão nos revela hemácias presentes entre
diversos feixes de fibras colágenas, nota-se que estes não apresentam uma
disposição ordenada e possuem espessuras variadas (Figura 22A).
Em maior aumento destes feixes observa-se a presença de gotículas lipídicas
dispostas ao longo das fibrilas colágenas, em alguns momentos estas gotículas unem
duas ou mais fibrilas que também não demonstram possuir um arranjo ordenado entre
elas (Figura 22B).
60
Figura 19 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a lacuna de uma célula de fibrocartilagem (**) na região de fibrocartilagem
mineralizada (*). Barra: 1 µm. (B) Mostra um grupo isogênico de condrócitos (**) envolto pela matriz territorial (*). Barra: 2 µm.
*
*
*
**
**
**
*
*
B
A
61
Figura 20 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra um osteócito (*) com seu processo celular (cabeça de seta) dentro de uma
lacuna, assim como os canalículos (setas). Barra: 1 µm. (B) Mostra uma lacuna vazia, internamente os orifícios dos canalículos (setas menores), fibras colágenas (seta maior) e externamente os canalículos (cabeças de setas). Barra: 1 µm.
A
B
*
62
Figura 21 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra conjuntos de células sanguíneas maduras (*) entre as trabéculas ósseas (setas).
Barra: 100 µm. (B) Mostras as células sanguíneas maduras (*). Barra: 10 µm. (C) Mostra seios venosos medulares (*) e as células sanguíneas maduras no interior dos seios venosos (setas). Barra: 10 µm.
A B
C
*
*
*
*
*
*
63
Figura 22 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra hemácias (setas maiores) entre o feixes de fibras colágenas do tendão (setas
menores). Barra: 5 µm. (B) Mostra gotículas lipídicas (cabeças de setas) presentes nas fibrilas colágenas (setas). Barra: 2 µm.
A
B
64
5.3 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO GRUPO IDOSO
Ao analisar a região de junção osteotendínea do tendão calcâneo utilizando a
técnica de criofratura em nitrogênio líquido examinadas em microscópio eletrônico de
varredura, nota-se em pequenos aumentos o tendão se inserindo ao osso calcâneo
(Figuras 23A-B-C), espaços trabeculares presentes no tecido ósseo puderam ser
observados (Figura 23A), assim como a fibrocartilagem periosteal revestindo
externamente a superfície óssea que entra em contato com o tecido tendíneo (Figura
23B).
Em um aspecto geral da junção osteotendínea é possível observar as fibras
colágenas que compõem o tendão calcâneo inserindo-se ao tecido ósseo, uma clara
zona de transição entre os dois tecidos fica evidente neste aspecto (Figura 24A).
A mesma região analisada em maior aumento nos revela que as fibras
colágenas não apresentam um homogêneo padrão de disposição ao inserirem-se no
tecido ósseo e que estas podem se anexar em feixes ou individualmente (Figura 24B).
Averiguações realizadas na região de fibrocartilagem não mineralizada nos
revelou células de fibrocartilagem dispostas em fileiras muito bem organizadas (Figura
25A). Um maior aumento desta área exibiu as células alojadas em suas lacunas
individuais, ao redor as fibras colágenas organizadas paralelamente em um mesmo
trajeto formam a matriz extracelular (Figura 25B).
Ao analisar a região de fibrocartilagem mineralizada, foi possível identificar
lacunas de células de fibrocartilagem e observar como o tecido conjuntivo forma uma
rede de fibras colágenas para compor a lacuna, externamente ao seu redor uma densa
matriz é demonstrada (Figura 26A).
Na mesma região um grupo isogênico de condrócitos foi exposto, rodeando
cada lacuna e até mesmo separando uma da outra pode ser constatada a matriz
territorial (Figura 26B).
65
Figura 23 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), espaço trabecular (*). Barra: 100 µm.
(B) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O), fibrocartilagem periosteal (*). Barra: 100 µm. (C) Mostra o tendão calcâneo (T), tecido ósseo (O). Barra: 50 µm.
B
C
T
T
T
*
O
O
O *
A
66
Figura 24 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fibras colágenas (*) inserindo-se ao tecido ósseo (O), zona de transição (*).
Barra: 20 µm. (B) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se ao tecido ósseo (*). Barra: 1 µm.
B
A
**
*
*
* O
67
Figura 25 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra fileiras de células de fibrocartilagem (setas). Barra: 10 µm. (B) Mostra as células
de fibrocartilagem (setas menores), lacunas (setas maiores), fibrocartilagem não mineralizada (*). Barra: 5 µm.
B
A
*
*
68
Figura 26 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra a lacuna de uma célula de fibrocartilagem (**) na região de fibrocartilagem
mineralizada (*). Barra: 1 µm. (B) Mostra as lacunas de um grupo isogênico de condrócitos (**) envoltos pela matriz territorial (*). Barra: 2 µm.
B
A
**
*
*
**
**
*
*
*
69
Análises de MEV com grandes aumentos revelam os feixes de fibras colágenas
que constituem o tendão calcâneo e demonstram uma organização paralela
longitudinal, nestes feixes apresentam-se inseridas gotículas de gordura de formato
arredondado e tamanhos variados (Figuras 27A-B-C).
Ainda analisando o tendão calcâneo em grandes ampliações além dos feixes
de fibras colágenas que apresentam trajetos variados e até mesmo ramificações, as
gotículas de gordura de diversos tamanhos ficaram evidentes. É possível detectar
entre estes feixes de colágeno a presença de hemácias, com seu característico
formato arredondado achatado (Figuras 28A-B).
O tecido ósseo apresenta uma inúmera quantidade de trabéculas ósseas
circundando espaços trabeculares (Figura 29A), que podem ou não apresentar em
seu interior tecido medular. Em maior aumento as trabéculas apresentam abundante
quantidade de lacunas de osteócitos espalhadas por todo o tecido mineralizado
(Figura 29B).
Analisando outras regiões do tecido ósseo detectamos em alguns espaços
trabeculares a presença de tecido medular, nota-se que este possui uma consistência
viscosa pela quantidade de tecido gorduroso, desta forma não é possível identificar
as células sanguíneas maduras, ainda nas trabéculas ósseas destaca-se a presença
de lacunas de osteócitos (Figuras 30A-B).
70
Figura 27 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixe de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas). Barra: 2 µm. (B)
Mostra feixe de fibras colágenas (*), gotículas de gordura. Barra: 0,5 µm. (C) Mostra feixe de fibras colágenas (**), fibras colágenas (setas), gotícula de gordura (*). Barra: 1 µm.
A B
C
*
* *
*
**
71
Figura 28 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra feixes de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas menores), hemácia
(seta maior). Barra: 2 µm. (B) Mostra feixes de fibras colágenas (*), gotículas de gordura (setas menores), hemácia (seta maior). Barra: 1 µm.
B
A
*
*
*
*
*
72
Figura 29 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra as trabéculas ósseas (setas), espaços trabeculares (*). Barra: 100 µm. (B)
Mostra os espaços trabeculares (*), lacunas de osteócitos (setas). Barra: 50 µm.
B
A
*
*
*
*
*
*
73
Figura 30 - Microscopia eletrônica de varredura da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Técnica de criofratura de amostra não desmineralizada
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra tecido medular (*), trabéculas ósseas (**), lacunas de osteócitos (setas). Barra:
50 µm. (B) Mostra tecido medular (*), trabécula óssea (**). Barra: 10 µm.
B
A
* **
**
**
*
74
5.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO ADULTO
Analises de microscopia eletrônica de transmissão da região de inserção do
tendão calcâneo ao tecido ósseo, nos revela conjuntos de fibras colágenas possuindo
uma organização uniforme e dispostas paralelamente umas às outras. Estas fibras
que constituem o tendão atravessam a região de fibrocartilagem não mineralizada e
por fim adentram a fibrocartilagem mineralizada (Figuras 31A-B).
Na região de fibrocartilagem não mineralizada analisada com MET, foi possível
identificar condrócitos organizados em fileiras e localizados entre as fibras colágenas
que se arranjam de modo paralelo ao redor destas células (Figura 32A).
Análises realizadas em um condrócito desta mesma região em maior aumento
nos revela seu núcleo com formato arredondado e um grande reticulo endoplasmático
granular ocupando uma ampla parte do citoplasma. Ao redor desta célula os
processos citoplasmáticos se destacam ocupando a matriz territorial e até mesmo se
desprendendo nesta matriz que rodeia o condrócito alojado sobre uma lacuna (Figura
32B).
Já ao analisar a região de fibrocartilagem mineralizada é possível observar os
núcleos dos condrócitos apresentando formas variadas e não definidas (Figuras 33A-
B-C). Porém, nota-se os mesmos alojados em lacunas, rodeados por uma matriz
territorial que é circundada por fibras colágenas, mais externamente constata-se a
matriz interterritorial (Figura 33A).
Ao redor dos condrócitos processos citoplasmáticos projetam-se e até mesmo
se desprendem sobre a matriz territorial (Figuras 33A-B). No interior da célula, o
retículo endoplasmático granular é bem desenvolvido e ocupa uma ampla parte do
citoplasma (Figura 33C).
75
Figura 31 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A-B) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se na fibrocartilagem mineralizada (*).
Barra: 200 nm.
B
A
*
*
*
*
76
Figura 32 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra na região de fibrocartilagem não mineralizada os condrócitos (setas), núcleo
dos condrócitos (*), fibras colágenas (**). Barra: 1 µm. (B) Mostra uma ampliação do condrócito direito da figura A, com o núcleo (N), retículo endoplasmático granular (setas menores), processos citoplasmáticos (cabeça de seta), lacuna (seta maior), matriz territorial (*). Barra: 0,4 µm.
A
*
*
**
**
N
B
*
77
Figura 33 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra na região de fibrocartilagem mineralizada condrócito e seu núcleo (N), processos
citoplasmáticos (seta), lacuna (cabeça de seta), matriz territorial (parêntese preto), fibras colágenas (*), matriz interterritorial (parêntese branco). Barra: 0,4 µm. (B) Mostra na mesma região um condrócito, núcleo (N), processos citoplasmáticos (setas), fibrocartilagem mineralizada (*). Barra: 0,4 µm. (C) Mostra o núcleo de um condrócito (N), vasto retículo endoplasmático granular (setas). Barra: 0,2 µm.
A
*
N
N N
C
*
* B
78
Figura 34 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Mostra um osteócito (cabeça de seta), núcleo (N), processo celular (seta menor),
canalículo (seta maior), lacuna (*). Barra: 0,5 µm.
Análise de MET demonstra um osteócito embebido em uma matriz óssea
mineralizada, seu núcleo possui o formato alongado e ocupa quase todo o interior
celular, os processos celulares estão situados no interior dos canalículos e através
destes se comunicam com outros osteócitos (Figura 34).
Ao analisar o tendão calcâneo seccionado longitudinalmente em MET, foi
possível demonstrar a organização das fibras colágenas agrupadas em feixes, sendo
que em cada feixe estas estão dispostas em sentidos variados, podendo em um
estarem distribuídas longitudinalmente, em outro transversalmente, obliquamente, ou
até mesmo arranjado da mesma forma em feixes vizinhos. Células tendíneas,
conhecidas como tenócitos são encontradas entre estes conjuntos de fibrilas e se
comunicam uns com os outros através de extensos prolongamentos citoplasmáticos
(Figura 35A). Em maior aumento nota-se um padrão de estriações de forma
homogênea ao longo de toda fibrila colágena (Figura 35B).
N
*
79
Figura 35 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar adultos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra os feixes de fibras colágenas (*) do tendão calcâneo seccionado
longitudinalmente, tenócitos (cabeças de setas), prolongamentos citoplasmáticos (setas). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra as estriações das fibrilas colágenas do tendão. Barra: 0,3 µm.
B
A
*
*
*
*
80
5.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO DO GRUPO IDOSO
Análises realizadas na junção osteotendínea do tendão calcâneo sob MET nos
revela a maneira com que as fibras colágenas se inserem ao tecido mineralizado,
estas se organizam de forma símil em feixes de variados tamanhos, porém alguns
desses feixes inserem-se mais superficialmente enquanto outros mais profundamente
no tecido ósseo (Figuras 36A-B).
Sob um aspecto geral das fibrocartilagens no grupo idoso, podemos notar a
presença de condrócitos, que por sua vez não apresentam formato definido,
arranjados em fileiras. Ao redor de cada célula identifica-se a matriz territorial que
também separa células próximas, continua a esta matriz existe a interterritorial,
constituindo o maior espaço entre estas células. Os núcleos na maioria das vezes
apresentam formatos arredondados/ovalados, mas podem ser alongados e
preencherem quase todo o interior celular ou ainda não apresentarem formato definido
(Figuras 37A-B).
Na região mais externa da fibrocartilagem os condrócitos apresentam-se com
um formato alongado, o núcleo ocupa boa parte do citoplasma celular, externamente
a célula feixes de fibras colágenas estão dispostos tanto longitudinalmente quanto
transversalmente (Figura 38A).
Nas camadas mais profundas da fibrocartilagem os condrócitos apresentam
formatos arredondados/alongados, o núcleo possui formato similar ao da célula e
ocupa menos espaço na porção citoplasmática (Figuras 38B-C), nucléolo com formato
arredondado e próximo a membrana nuclear foi evidenciado (Figura 38C).
Reticulo endoplasmático granular e a presença de mitocôndrias podem ser
observados. Nesta região de fibrocartilagem as matrizes territorial e interterritorial são
visualizadas com facilidade (Figuras 38B-C).
81
Figura 36 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra as fibras colágenas (setas) inserindo-se na fibrocartilagem mineralizada (*).
Barra: 0,5 µm. (B) Mostra as fibras colágenas (**) e fibrocartilagem mineralizada (*). Barra: 0,5 µm.
B
A
* *
* *
*
**
**
82
Figura 37 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra condrócitos (setas), matriz territorial (parênteses preto), matriz interterritorial
(parêntese branco), lacuna (*), tecido conjuntivo (**). Barra: 1 µm. (B) Mostra núcleo dos condrócitos (*), processos citoplasmáticos (setas), tecido conjuntivo (**). Barra: 0,5 µm.
B
A
* **
**
*
*
**
**
83
Figura 38 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra núcleo de um condrócito (N), lacuna (seta), fibras colágenas horizontais (*) e
transversais (**). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra núcleo (N), reticulo endoplasmático granular (seta) de um condrócito, matriz territorial (*) e interterritorial (**). Barra: 0,5 µm. (C) Mostra núcleo (N), nucléolo (seta maior), mitocôndrias (setas menores), matriz territorial (*) e interterritorial (**). Barra: 0,5 µm.
A B
C
*
**
N
N
*
**
N
* **
84
Análises realizadas no tecido mineralizado revelaram os osteócitos com
formatos alongados e núcleos sem formas definidas, estes por sua vez encontram-se
encapsulados em lacunas, seus processos celulares apresentam diversos tamanhos
como pode ser demonstrado (Figura 39A).
Através de um corte transversal foi possível observar os processos celulares
com formatos arredondados percorrendo o interior de canalículos para se
comunicarem com outras células (Figura 39B).
Secções realizadas no sentido longitudinal do tendão calcâneo nos revelou
conjunto de feixes de fibras colágenas que constitui o tecido tendíneo, estas fibras
apresentam uma ordenada disposição dentro de cada feixe, porém podem apresentar
disposições diferentes entre um feixe e outro (Figura 40A).
As análises dessas fibras em grandes aumentos, nos revelaram as fibrilas
colágenas e suas características estriações, estas possuem um padrão homogêneo e
um perfeito espaçamento entre cada estria ao longo de toda fibrila (Figuras 40B-C).
85
Figura 39 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra no tecido mineralizado (TM) um osteócito (seta maior), núcleo (asterisco
branco), processos celulares (setas menores), lacuna (asterisco preto). Barra: 0,5 µm. (B) Mostra num corte transversal o canalículo (Can), processo celular (P). Barra: 50 nm.
B
A
* *
TM
Can P
86
Figura 40 - Microscopia eletrônica de transmissão da junção osteotendínea do tendão calcâneo de ratos Wistar idosos. Amostras desmineralizadas com solução de EDTA 0,15M, pH 7,4
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Mostra os feixes de fibras colágenas (*) seccionados longitudinalmente. Barra: 1 µm.
(B-C) Mostras as fibrilas colágenas. Barras: 50 nm, 25 nm, respectivamente.
A B
C
*
* *
87
5.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Os valores obtidos revelam que a quantidade de colágeno tipo I no grupo adulto
foi de 29,154 ± 8,152% e do tipo III foi de 10,224 ± 3,623%, os resultados estatísticos
demonstram uma quantidade 65% maior de colágeno tipo I em comparação ao tipo
III, sendo que a diferença entre eles é extremamente significante (p < 0,0001), os
dados estão representados no gráfico 1A.
A quantidade média de colágeno tipo I no grupo idoso foi de 12,388 ± 6,853%
e do tipo III foi de 18,285 ± 3,232%, os resultados demonstram uma quantidade 32%
menor de colágeno tipo I em comparação ao tipo III, sendo que a diferença estatística
entre eles foi significante (p = 0,0166), os dados estão exibidos no gráfico 1B.
A quantidade média de colágeno tipo I no grupo adulto foi de 29,154 ± 8,152%
e no grupo idoso 12,388 ± 6,853%, os resultados estatísticos demonstram uma
quantidade 57% maior do tipo I no grupo adulto, a diferença entre os dois grupos é
extremamente significante (p = 0,0002), os dados estão expressos no gráfico 1C.
A quantidade média de colágeno tipo III no grupo adulto foi de 10,224 ± 3,623%
e no grupo idoso 18,285 ± 3,232%, os resultados demonstram uma quantidade 44%
menor de colágeno tipo III no grupo adulto em relação ao idoso, a diferença estatística
entre os grupos é extremamente significante (p < 0,0001), os dados estão
apresentados no gráfico 1D.
88
Gráfico 1 - Quantidade de colágeno nos grupos de animais adultos e idosos
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I e III no grupo adulto, (***)
indica diferença estatística extremamente significante entre os dois tipos. (B) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I e III no grupo idoso, (*) indica diferença estatística significante entre os dois tipos. (C) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo I entre o grupo adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante entre os dois grupos. (D) Gráfico demonstrando os valores médios de colágeno tipo III entre o grupo adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante entre os dois grupos.
A B
C D
89
A quantidade de células de fibrocartilagem presentes na região de
fibrocartilagem não mineralizada no grupo adulto foi de 91,112 ± 10,857 e na região
de fibrocartilagem mineralizada de 65 ± 10,112 os dados estatísticos demonstram uma
quantidade 29% maior de células na região não mineralizada em comparação com a
região mineralizada, esta diferença é considerada extremamente significante (p <
0,0001), os dados estão expostos no gráfico 2A.
A quantidade de células de fibrocartilagem existentes na região de
fibrocartilagem não mineralizada no grupo idoso foi de 75 ± 17,407 e na região
mineralizada de 42,143 ± 5,984 os valores estatísticos demonstram uma quantidade
44% maior de células na região não mineralizada comparado com a região
mineralizada, esta diferença é considerada muito significante por apresentar p =
0,0022, os valores estão representados no gráfico 2B.
Na região de fibrocartilagem não mineralizada a quantidade de células de
fibrocartilagem no grupo adulto foi de 91,112 ± 10,857 e no grupo idoso de 75 ±
17,407, os dados demonstram uma quantidade 18% maior de células na região não
mineralizada no grupo adulto em relação ao idoso, porém, estatisticamente não existe
diferença, sendo que p = 0,0605, os dados são exibidos no gráfico 2C.
Na região de fibrocartilagem mineralizada a quantidade de células de
fibrocartilagem no grupo adulto foi de 65 ± 10,112 e no grupo idoso 42,143 ± 5,984,
os valores demonstram uma quantidade 35% maior de células nesta região no grupo
adulto comparado ao idoso, estatisticamente esta diferença é considerada
extremamente significante (p = 0,0003), os valores estão expressos no gráfico 2D.
90
Gráfico 2 - Quantidade de células de fibrocartilagem nas regiões de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada nos grupos de animais adultos e idosos
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: (A) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na
área de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada no grupo adulto, (***) indica diferença estatística extremamente significante. (B) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem não mineralizada e mineralizada no grupo idoso, (**) indica diferença estatística muito significante. (C) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem não mineralizada nos grupos adulto e idoso. (D) Gráfico demonstrando a quantidade média de células de fibrocartilagem presentes na área de fibrocartilagem mineralizada nos grupos adulto e idoso, (***) indica diferença estatística extremamente significante.
A B
C D
91
Gráfico 3 - Espessura do tendão calcâneo
Fonte: (CURY, D. P., 2013). Legenda: Demonstra a espessura do tendão calcâneo ao se inserir no tecido ósseo em ambos os
grupos.
O tendão calcâneo ao se inserir no tecido ósseo no grupo adulto apresenta uma
espessura média de 490,014 ± 96,794 µm e no grupo idoso uma espessura de
465,374 ± 58,515 µm. Os dados analisados demonstram que no grupo adulto a
espessura do tendão é 5% maior em relação ao grupo idoso, estatisticamente não
existe diferença significante entre ambos, sendo que p = 0,4804. Os dados estão
representados no gráfico 3.
92
DISCUSSÃO
93
6 DISCUSSÃO
Os nossos resultados demonstraram as características morfológicas estruturais
e ultraestruturais da junção osteotendínea do tendão calcâneo, assim como as
alterações das fibras colágenas e das células de fibrocartilagem tanto nas regiões de
fibrocartilagem não mineralizada quanto mineralizada em ratos adultos e com
envelhecimento.
Pode-se afirmar ao observarmos em ML de ambos os grupos que estas
revelaram a constituição do tendão formado por células organizadas em fileiras
separadas por um tecido conjuntivo. Kannus (2000) explica que feixes deste tecido
compõem as fibras colágenas constituindo assim a unidade básica do tendão, e que
esta é a menor unidade visível ao microscópio de luz. Além disso, Benjamin e Ralphs
(1998) demonstraram que além das células enfileiradas presentes no tecido tendíneo,
existem grânulos e filamentos de proteoglicanos.
Por outro lado, a inserção do tendão no tecido ósseo constitui uma complexa
área a qual a transição entre estes dois tecidos ocorre por aproximadamente 1 mm
(O'BRIEN, 1997). Toda essa região é composta por 4 zonas e conseguimos identificá-
las com melhor clareza nas imagens de ML coradas com Picro-sirius e analisadas sob
luz polarizada, estas zonas são: 1) tendão, 2) fibrocartilagem não mineralizada, 3)
fibrocartilagem mineralizada e 4) tecido ósseo.
A primeira zona é a parte terminal do tendão, o qual o tecido lamelar é composto
de feixes de colágeno alinhados longitudinalmente, separados por tecido conjuntivo
frouxo que se funde com o peritendão e contem um variado número de fibras elásticas.
O tendão muda gradualmente ao longo da distância de poucos micrômetros para
dentro da segunda zona, a fibrocartilagem não mineralizada. As células assumem o
fenótipo de condrócitos. A terceira zona consiste de fibrocartilagem mineralizada,
sendo que a passagem da segunda para a terceira ocorre de forma abrupta na linha
de frente de mineralização visto como uma linha basofílica (tidemark) e finalmente a
quarta zona, composta de tecido ósseo trabecular (BENJAMIN; EVANS; COPP, 1986;
CLAUDEPIERRE; VOISIN, 2005; THOMOPOULOS et al., 2006).
Além disso, os nossos dados ao nível de ML, em cortes corados com
Hematoxilina-Eosina revelaram a linha de transição que separa a fibrocartilagem não
mineralizada da mineralizada, essa linha é denominada tidemark.
94
Thomopoulos et al. (2006) em um estudo sobre a orientação das fibras
colágenas na região osteotendínea podem esclarecer que esta é uma linha basófila e
representa uma frente de calcificação e ainda os autores Wopenka et al. (2008)
explicam que é o local em que a mineralização com apatita abruptamente se inicia e
Benjamin et al. (2002) enfatizam referindo que a tidemark indica a mudança repentina
no grau de mineralização, do zero no tendão para ~60wt% no tecido ósseo.
Em análises de dados em nosso estudo, no grupo de animais adultos
identificamos tidemark dupla, concordando com os de Oegema et al. (1997) que
explanam que esta ocorre como consequência da fase de ossificação “start-stop” e
que ela possui uma suave ondulação, essa última característica ficou evidente nos
dois grupos de animais adultos e envelhecidos examinados em nosso trabalho.
Quando a tidemark é examinada ao MET esta caracteriza-se por apresentar
uma camada elétron densa de material granular conforme é mostrado por Rufai,
Ralphs e Benjamin (1996).
Os nossos resultados ao ML revelaram diversas células de fibrocartilagem na
porção terminal do tendão, organizadas em fileiras ou em pares, tendo algumas
atravessando a linha tidemark e sendo encontradas na mesma disposição na região
de fibrocartilagem mineralizada, porém em tamanho menor. Benjamin e Ralphs (2000)
revelaram as células e referiram sobre o desenvolvimento de tendões e ligamentos
confirmando os nossos achados, dizendo que estas são organizadas em fileiras e
separadas por feixes de tecido conjuntivo.
Para Claudepierre e Voisin (2005) as células desta região assumem fenótipo
de condrócitos tornando-se arredondadas, arranjadas e distribuindo-se em pares ou
fileiras na matriz extracelular e são contínuas desde a primeira zona de
fibrocartilagem.
De acordo com as nossas observações os condrócitos apresentam formas
arredondadas/alongadas, revelando vários processos citoplasmáticos de diferentes
comprimentos e alojados em lacunas. Yanagisawa et al. (2012) também reportaram
sobre os processos citoplasmáticos das celulas e afirmam que eles se desprendem
na matriz territorial, as fibrilas colágenas que os rodeiam formam estruturas
tridimensionais interligadas cercando estas células para formar a lacuna.
Assim como os condrócitos os nossos resultados permitem observar
claramente os osteócitos em nível de ME, que também se alojam em lacunas
formadas por uma complexa rede de fibras colágenas dispostas de maneira a
95
constituir uma cavidade do mesmo formato da célula que a ocupa, os osteócitos
apresentam processos celulares no interior de canalículos intercomunicando-se com
as células vizinhas.
Apresentam uma morfologia dendrítica, embora seu corpo celular possua
formato fusiforme em ossos longos ou algumas vezes arredondado em ossos chatos,
conforme os resultados de Rochefort, Pallu e Benhamou (2010), em geral as lacunas
e os canalículos da rede lacuno-canalicular são rodeados por matriz óssea (BURGER;
KLEIN-NULEND, 1999). As lacunas contêm os corpos celulares com delgados
processos citoplasmáticos ricos em actina (cada célula possui de 50-60 processos
celulares) que se propagam através de canalículos (VAN HOVE et al., 2009).
Observando com o método de ME, Holmbeck et al. (2005) identificaram que os
osteócitos são separados fisicamente da matriz óssea, mas aparentemente para
compensar seu isolamento de outras células, eles mantêm uma elaborada rede de
processos citoplasmáticos através das quais interagem com outros osteócitos e
células de revestimento nas superfícies endosteal e periosteal da área correlata.
Durante o processo de envelhecimento o corpo sofre diversas alterações tanto
em níveis macroscópios quanto microscópios e essas alterações também foram
analisadas e quantificadas neste estudo.
Referindo-se especificamente na região de junção osteotendínea do tendão
calcâneo os nossos resultados não revelaram nenhuma alteração macroscópica,
entretanto, microscopicamente uma alteração evidente nas análises realizadas com
ML foi a quantidade de células de fibrocartilagem presentes nas regiões de FnM e FM.
Em ambas as regiões a quantidade de células foi maior no grupo de animais
adultos em comparação aos de envelhecimento, mesmo não sendo estatisticamente
significante, observa-se uma pequena diminuição na espessura do tendão ao se
inserir no tecido ósseo de animais envelhecidos.
A nível ultraestrutural as análises nos revelaram as células do grupo de animais
adultos contendo as organelas citoplasmáticas mais desenvolvidas, porém, em ambos
os grupos os núcleos apresentaram aparecer com formatos variados. Por outro lado,
Benjamin, Tyers e Ralphs (1991) afirmam que o núcleo celular normalmente é
arredondado, mas frequentemente pode caracterizar-se de forma denteada ou
multilobada.
Holmes (1971) analisando as alterações ocasionadas pelo envelhecimento nos
tendões da cauda, do calcâneo, do músculo flexor superficial dos dedos e no músculo
96
extensor dos dedos em cachorros, gatos, ratos e macacos, assim como em nosso
estudo, o autor declara que as células possuem grandes núcleos com variados
formatos.
As alterações ocorridas com o processo de envelhecimento, tanto
morfologicamente quanto bioquimicamente são muito bem embasadas por Floridi,
Ippolito e Postacchini (1981) afirmando o seguinte: 1) aumento no volume da matriz
extracelular com relativa diminuição no número de células; 2) diminuição das
organelas celulares; 3) aumento no diâmetro das fibras colágenas. Bioquimicamente
os autores supramencionados explicam que as mudanças são: 1) aumento no
conteúdo de colágeno; 2) diminuição no conteúdo de mucopolisacarídeo e água e 3)
diminuição no turnover de colágeno.
Em um estudo nas alterações advindas com o envelhecimento no tendão
calcâneo de humanos Strocchi et al. (1991) indentificaram mudanças histológicas e
ultraestruturais, assim como em nosso estudo os autores afirmam não aparentar
alterações na arquitetura do tendão quando analisados macroscopicamente, porém,
mudanças celulares e nos componentes fibrosos foram identificados por eles, assim
como, uma regular diminuição no número de células.
Análises ultraestruturais realizadas por Strocchi et al. (1991) demonstram as
células de fibrocartilagem com processos citoplasmáticos longos e delgados, no idoso
os autores demonstram um número reduzido de processos citoplasmáticos curtos,
além de uma diminuição na quantidade e tamanho das células.
No envelhecimento as mudanças funcionais induzem a uma redução na
capacidade de síntese celular, de valores de pico nos recém-nascidos e jovens e o
mínimo na fase de envelhecimento, conforme o relatado por Ippolito et al. (1980);
Floridi, Ippolito e Postacchini (1981) e Squier e Magnes (1983).
A diminuição da síntese provocada pelo envelhecimento ocorre pelas células
apresentarem aparelhos de Golgi diminuído, poucas cisternas de retículo
endoplasmático granular e escassas mitocôndrias (BENJAMIN; TYERS; RALPHS,
1991).
Quanto a presença de número de células também foi avaliado por Lavagnino,
Gardner e Arnoczky (2013), empregando os métodos de análises estatísticas
encontraram uma diminuição significativa no número de células por mm2 o que condiz
com nossos achados. Os autores ainda enfatizam afirmando que o núcleo das células
alongam-se com o referido processo de envelhecimento.
97
Quando as espécimes foram examinadas sob luz polarizada revelaram uma
alteração de tecido conjuntivo com o envelhecimento, sendo que no grupo de animais
adultos o tipo I prevalece e no animal idoso há um predomínio do tipo III.
As fibrilas de colágeno tipo I são estruturas resistentes que fornecem ao tecido
tendíneo força e durabilidade mecânica e o tipo III possui fibrilas mais delgadas em
comparação ao tipo I e possui um papel importante no processo de cicatrização,
porém não possuem a mesma força para resistirem a esforços mecânicos (MAFFULLI
et al., 2000; ERIKSEN et al., 2002; JÄRVINEN et al., 2004; BUCKLEY et al., 2013).
Por outro lado, Józsa et al. (1984) e Maffulli et al. (2000) esclarecem que a
presença do colágeno tipo III normalmente ocorre pela diminuição da resistência do
tendão à forças tensíveis e pode, no entanto, predispor o tendão a rupturas
espontâneas.
Smith et al. (1999) afirmam que a proporção de colágeno tipo III / tipo I aumenta
com o envelhecimento e os nossos resultados podem corroborar na interpretação do
mecanismo morfofuncional, Riley et al. (1994) e Gonçalves-Neto et al. (2002)
completam referindo que a alteração de colágeno aumenta os casos de lesões e
doenças.
Essas alterações de colágeno além de ocorrer no tendão, também acontecem
no tecido ósseo e foram demonstradas em nosso estudo. Ritchie et al. (2006) explica
que esse processo com o avanço da idade acarreta uma deterioração na rigidez da
matriz óssea além de alterações nas estruturas em dimensões em escalas micro e
nanométricas. Eventuais alterações na integridade e a baixa qualidade da rede de
colágeno com o avanço da idade pode resultar em pontes mais fracas e, por
conseguinte, uma menor resistência à fendilhação no osso idoso (WANG et al., 2002;
RITCHIE et al., 2006).
Por fim, é necessário enfatizar que o presente trabalho não apresenta todos os
aspectos inerentes a pesquisa em junção osteotendínea. O emprego de diferentes
métodos de investigação nesta área pode trazer interpretações dos mecanismos
morfofuncionais.
Portanto, outros projetos serão necessários para melhor elucidação destes
aspectos em trabalhos experimentais com associação de substâncias relacionadas
ao tratamento das alterações nas estruturas osteotendíneas.
98
CONCLUSÃO
99
7 CONCLUSÃO
De acordo com a metodologia utilizada e os resultados obtidos podemos
afirmar que:
I. Macroscopicamente não é possível identificar nenhuma alteração na
região analisada;
II. A região terminal do tendão, que entra em contato com o tecido ósseo
diminuiu 5% no grupo idoso, porém esse valor não é estatisticamente
significante;
III. Através de ML observa-se uma redução na quantidade de células de
fibrocartilagem presentes na FnM e na FM no grupo idoso comparado
ao animal adulto;
IV. ML sob luz polarizada nos demonstrou de forma clara a alteração no
colágeno, sendo predominante no grupo adulto o tipo I e no grupo idoso
o tipo III. Como as fibrilas de colágeno tipo III são mais finas que as tipo
I e não possuem a mesma resistência a esforços mecânicos as chances
de lesões aumentam com o envelhecimento;
V. A nível ultraestrutural as células de fibrocartilagem apresentam
processos citoplasmáticos curtos e em número reduzido e uma
diminuída capacidade de síntese devido a aparelhos de Golgi menores,
poucas cisternas de retículo endoplasmático granular e uma menor
quantidade de mitocôndrias no grupo idoso em relação ao adulto;
VI. Em ambos os grupos avaliados os núcleos celulares apresentam formas
e tamanhos variados.
100
REFERÊNCIAS
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REFERÊNCIAS
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