Zbl. Bakt. II. Abt. 134 (1979), 423 - 428

[Bot anisches Institut del' Univer sitat H eidelber g, H eid elberg, ERD]

Die Ausbreitung von Agrobacteri'um-Stammen im Weichagar

The Spreading of Agrobacteriu1n Strains in Soft-Agar

ROLl' BEIDERBECK und ROSEMARIE HOHL

Mit 3 Abbildungen

Summary

In a diluted synthetic med ium solidif ied by 0.17 % agar populations of Agrobclcterium spreadwith a velocity of 0 to 20 mm/24 hours. This spread ing is a conse quence of che motact ic movemen tan d cell division . Different ba cter ial st ra in s spread with a charac ter ist ic velocity each. Loss of theTI-plasmid leaves the spreading behaviour unimpaired. It is change d a fte r the introduction ofviru lence by Kerr transfer or afte r prolonged cu ltu re in D -amino acid s.

Zusammenfassung

In eillem verdunnten , syn t het ische n Niihrmediull1, ver fest igt mit 0,17 % Agar, breit en sichPopula ti on en von Agrobact erium mit Geschwindigkeit.en von 0 bis 20 Il}m/24 Std. aus, Diose Au s­br eitung ist K on sequenz von che motaktischer Bewegung und Zellteilung, Ver schi edene Bakter ien ­st arnme wandern mi t eine r je wei ls cha ra ktorisniache n Gesch windi gkei t . Verlust des TI-Plasmidenbeein trachtigt das Ausbrcitungsverm ogon ni ch t . E s kann jed och veranderf werden bei Einfuh­rung del' Virulen z mi t tels K err-Tran sfer oder durch lan gerc Kultur in DvArn inosauren .

Aqrobaci erium. iumefaciesu: ist ein phytopathogenes Bakterium, das im Bodenlebt und an hoheren Pflanzen 'I'umorbildung auslost. Von di esem Bakterium sindmehrere hundert verschiedene Stamme bekannt, die sich im Grad ihrer Virul enzunterscheiden (DE LEY et al. 1966). Einige sind stark tumorbildend (hochvirulent),andere avirulent. In den letzten Jahren sind experimentelle Techniken entwiekeltworden, mit deren Hilfe man die Virulenz zwischen solchen Stammen iibertragenkann (BOMHOFF et al. 1976, GENETELLO et al. 1977, KEHR 1969, KERR et al. 1977).Dabei steht man stets VOl' dem Problem, virulente und avirulente Elterstamme undR ekombinanten au s beiden untorsoheiden zu miissen, Als Kriterien werden Re sistenzgegen Antibiotica (HAMILTON and CHOPAN 1975) und Stoffwechseleigenschaften(VAN LAREBEKE et al. 1975) herangezogen. Val' all em beim Vergleieh nahe verw andterSt amrne ist es wiinschenswert , dariib erhinaus so viele Unterscheidungsmerkmalewie moglioh zur Hand zu haben, Es wurde daher versucht. , di e F iihigkeit von Agro­bacterium zur Ausbreitung im Boden (STAPP 1958) -fiir cine Charakterisierung vonStammen nutzbar zu machen.

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Material und Methoden

Stamme

Verwendet wurdon Sta.mme von Agrobacterium tumefaciens, A. radiobacter, A. rhizogenes undA. rubi. Ihre Herkunft und pathogenen Eigensehaften, gepruft an der Tumorbildung an Blat.ternvon Kalanchoe daigremontiana (BEIDERBECK 1970), sind in 'I'abelle 1 aufgelistet.

Anzucht der Bakterien

Sie erfolgte in einem fliissigen, vollsynthetisehen Medium (MONOD 1946), das 20faeh verdimntwurde (MS/20), unter Sehiitteln bei 27-28 °C.

St.atnme, die unter diesen Bedingungen nieht wuchsen, wurden im gleichen Medium unterZusatz von 0,5 mg/l Biotin, 0,5 mg/l Nicotinsaure, 0,5 mg/l Ca-Pantothenat und 0,05 mg/l Gluta­mat unter sonst gleiehen Bedingungen kultiviert (Medium MSV/20).

Ausbreitung der Bakterien

Sie wurde auf Platten mit den Medien MS/20 und MSV/20, verfestigt mit 0,1-0,3 % Agar(Difeo), gepriift. Als optimale Agarkonzontration erwies sieh 0,17 %. Gelegentlieh wurden zuVergleiehszweeken Platten mit Tryptonbriihe (BEIDERBECK et al. 1973) oder NT/3-Medium(BEIDERBECK 1975) bonut.zt.

Bestimmung der Bakterienausbreitung

Auf je drei Weichagarplatten wurde zentral ein Tropfen (ca. 0,05 ml) Baktorionsnsponsion(1-5 X 108 Zellenjml) aufgetropft. Die Platten wurden bei 27°C im Dunklen inkubiert (ADLER1966). Naeh 0, 24, 48, 72 Std. und gelegentlieh spater wurde der Durehmesser der bakterien­durchwachsenen Agarzone mit einem em-MaE bestimmt. Zum Zeitpunkt des Auftragens betrugder Durehmesser des Tropfens 6-7 mm.

Jedes Experiment wurde mehrfaeh wiederholt (Tab. 1), und in jedes Experiment wurde alsReferonz der Stamm B 6 von A. tumejaciens eingesehlossen.

Berechnung der Ausbreitungsgeschwindigkeit

Naehdem die bakteriendurehwaehsene Zone im Zentrum der Platte mindestens 10 mm Durch­messer erreieht hatte (lag-Phase der Ausbreitung iiberwunden), wurde die Anderung des Zonen­durehmessers pro 24 Std. bestimmt. Mittelwerte aus mehreren Experimenten wurden erreehnetund die Standardabweiehungen ermittelt.

Ergebnisse

Vor versuche zur Ermittlung giinstiger Experimentierbedingungen zeigten, daBsich A. tumefaciens, B6, in Tryptonbriihe und in den synthetischen Medien MS undMSV in einer kreisformigen, scharf begrenzten Zone ausbreitet, nicht jedoch im Me­dium NT/3. Fiir weitere Experimente wurden daher ausschlieBlich die Medien MSund MSV verwendet. Hier ist die Ausbreitungsgeschwindigkeit der Bakterien um sogrolser, je geringer die Agarkonzentration (Fig. 1) und die Glukose-Konzentration(Fig. 2) ist. Als Medien fiir die weiteren Experimente dienten damit MS/20 und MSV/20 mit 20 mg Glukose pro Liter und 0,17 %Agar. Geringere Glukose-Konzentrationenlassen keine scharfen Ausbreitungszonen erkennen, geringere Agarkonzentrationenmachen das Hantieren der Platten nahezu unmoglioh,

In den Platten mit MS/20 erfolgt nach Uberwinden einer lag-Phase die Ausbrei­tung der Bakterien mit einer tiber weite Bereiche der Platte konstanten Geschwindig­keit (Fig. 3). Irn Bereich dieser konstanten Geschwindigkeiten wurden die nachfol­genden Bestimmungen durchgefiihrt.

Die Ausbreitung von Agrobacterium-Stalllmen im W eiehagar 425

t:.¢(mm/ 24hJ

15

12

8

4

Q)

0./ 0.15 0.2 % Agarkonz.

t:.¢ @(mm/ 24hJ

25

20

15

10

5

20 50 100 mg Glucose/ {

t:.¢®(mm/24h)

50

40

20

24 48 96 h

Abu. 1. Aushreit ung des St ammes B 6 vo n A . tumejociens in Medium M8 /20 mit orhohter Glukose ­Konzentrat ion in Abhangigkei f VO n der Agarkonzentraf.ion .

Abb, 2. Ausbre it ung de s Stammes B 6 von A. tum efaoien s in Medium MS/20 mit variierter Glukose­Konzentra ti on .

Abb, 3. Ausbreitung von Stamm AT 4 in Medium M8/20 in Abhangigkeit von der Zeit.

Di e Au sbrei tung d el' Stiimme: Bakterien verschiedener Arten und Clust erbreit en sich in MSj20 mit unterschiedlicher, fiir jeden Stamm charakteristischerGeschwindigkeit aus, die 0-20 mm pro 24 Std. betragen kann. Zusatz von Vitarninen(MSVj20) forder t die Ausbreitung bereits reagierender Stamm e nicht (vgl. B6 , B6M;Tabell e 1). Einige Stamme wachsen nicht auf MSj20 und breiten sich auch nicht aus(z. B. 13333, 13334, 15834) . Nach Zusatz von Vit aminen lassen sich diese z. T. zuWachstum und Ausbreitung veranlassen (13333, 13334), abel' Wa chstumsfahigkeitist keine hinreichende Voraussetzung fiir die Ausbreitung: Die Stamme 15834 undVOl' allem AT8 wachsen auf MSVj20 gut, bleiben abel' am Auftragungsort auf del'Platte liegen (Tabelle I) .

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Tabelle 1. Di e Ausbreitung v on A grobacterium-St iirrunen in Weichagar

Stamm H erkunft Virulenz Au sbreitung del' Bakterien Expt.,1 0 (mm/24 h)

x S

Medium ~IS/20

A . tumefaciensB6 Bopp + 26,4 2,3 22B6Ri Bei + 26,3 1,6 3B62Fu Bei + 23,0 1,0 3B6M Manigault + 28,3 4,1 4B6·806 JAL 14,7 2,3 3Met VIII/2 Bei 0 0 3Met VIII/32 Bei 0 0 3nBV7 J AL + 31,3 4,5 3IIBNV6 .JAL 16,0 0 3058·3 H amil t on + 35,7 3,5 338·7 ·5 H ami lt on 38,5 7,8 3AT I BBA + 30,7 2,1 3AT 3 BBA + 39,0 6,1 3AT4 BBA + 27,0 3,6 3AT8 BBA + 2,5 1,7 481 ~Ianigault + 24,3 3,5 3MA 8 Manigaul t + 24,5 2,1 213 Beltra + 38,0 3,5 342 IV JAL + 30,0 3,5 3'1'37 JAL + 29,0 0 3A6 JAL + 34,0 3,5 3133 3:1 JAL + 2,0 0,7 2

A . rhizoqenesTR 7 JAL + 25,3 0,6 315834 J AL + 2,0 2,8 30 71 Albinger + 43,7 2,1 3A . rubi13334 JAL + 0 0 2

A . radiobacterK84 Kerr 17,3 4,0 3

M edium lVISV/ 2 0

A . tumefacieneB6 Bopp + 26,3 2,3 6Met VIII/2 Bei 0,3 0,6 3Met VIII/32 Bei 0 0 3AT8 BBA + 0,7 0,6 3133 33 JAL + 10,5 0,6 4

A. rhizogenes15 834 JAL + 1,7 0,6 3A. rubi13 334 JAL + 28,3 1,4 3

BBA: B iologisohe Bundesanste.lt fUr Land- und F ors t wir t schaft, Berlin-Dahlem; Bei : Beiderbeck ,Stamm ist Derivat vo n B6; JAL: Prof . J . A. LIPPINCOTT, Evanston , USA.

D ie Ausbreit ung von Agrobacterium-St iimmen im W ei chagar 427

A.nd erung d er Au sbrei tungsgeschwindigkeit: St amme, die eng miteinandervcrwandt sind (136, B6:NI, B6Ri z. B.) breiten sieh mit sehr ahnlichen Geschwindig­keiten aus. Nimmt man einern virulent en St amm durch Kul tur bei 36 °0 da s virulenz­verleihende Plasmid (HAMILTON and OHOPAN 1975), so bleibt sein Ausbreitungsver­mogen unverandert erha lten (z. B. 0 58-3 und 38-7-5). Umgckehrt kann die Einflih­rung der Viru lenz durch KERR-1'ransfer (ALBINGER u. BEIDERBECK 1977) die Aus­breitungsgeschwindigkeit cines Agrobacterium-Sta mmes st ark verandern : die Re­kornbinante 0 7l aus dem avirulenten St amm IIBNV6 und dem wurzelinduzieren­den Stamm 15 834 breitet sich wesentlich schneller au s als beide Elt erst amme.

A.nderung der Virulenz durch A.nderung der :Membraneigenschaften nach langerKultur in D-Methionin (SKRZIPCZYK u.BEIDERBEcK 1976) ist verbunden mit derUnfahigkeit zur Ausbr eitung in Weiehagar (Met VIII/2 , Met VIII/32).

Diskussion

Die Ausbreitung der Agrobakterien in Weiehagar ist Konsequenz des ehemotak­tischen Aufsuohens von Nah rst offen (Glukose) an der Peripherie der Population(ADLER 1966), verbunden mit Zcllverm ehrung. Sie gesehieht mit ahnlichen Geschwin­digk cit en , mit denen Agrobacteri1lm aueh im Boden wandern soll (STAPP 1958).

Die Ausbreitungsgesehwindigkeit ist fur [eden Bakterienst amm eharakte rist ischund kann als ein einfach zu messendes Untersoheidungsmer kmal bei Viru lenz-Trans­fer-Experim ent en z. 13. dienen. Ausbreitung ist nieht kor reliert mit der Virulenz,d. h. der F iihigkeit der Stamme zur Induktion von Tumoren , 'I'eratornen oder \Vurzeln.Voll virulente Stamme konn en unfahig zur Ausbr eitung sein , avirulente Starnme sichausbreiten . Verlust des TI- Pl asmiden flihr t nicht automati seh zu A.nderung en derAusbreitung, Einfiihrung del' Viru lenz kann andererseit s die Ausbreit ungsgesehwin­digkeit beeinflussen .

Literatur

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NALSTEENS, J. P., and VAN MONTAGU, M.: Acquisition of Tumor Inducing Ability by Non­oncogenic Aqrobacteria as a Result of Plasmid Transfer. Nature 255 (1975),742-743.Wir danken der Deutschen Forschungsgemeinschaft fur finanzielle Unterstiitzung.

Adresso der Autoron:

Prof. Dr. R. BEIDERBECK und R. HOHL, Botanisches Institut der Univorsitat Heidelberg, 1mNeuenheimer Feld 360, D . 6900 Heidelberg.