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Diagnóstico de Laboratorio del COVID-19
Dr. Roger Soto Palma
Microbiólogo Inmunohematólogo
Jefatura de Laboratorio Clínico
Hospital CIMA San José
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Virus SARS Cov-2
• Virus de 70 a 90 nm de diámetro.
• Familia Coronaviridae
• Receptor en la célula: ACE-2 (altaafinidad).
• ARN banda sencilla
• Virus cubierto (membranacellular).
• Otros coronavirus que infectan a los humanos: SARS Cov 1, MERS, HCoV-229E, HCoV NL63, HCoV-HKU1, y HCoV-OC43.
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Replicación del virus SARS Cov-2
Swatantra Kumar, et.al. 2020. Morphology, Genome Organization, Replication and Pathogenesis of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS Cov-2)
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Genoma del virus SARS Cov-2
Swatantra Kumar, et.al. 2020. Morphology, Genome Organization, Replication and Pathogenesis of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS Cov-2)
Genoma organizado en 32 kb, con 11 ORF, que codifican para 9680 aminoácidosQue forman las proteínas virales.
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Genoma del virus SARS Cov-2
microbenotes.com
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Diagnóstico de Covid-19• Reacción en Cadena de la
Polimerasa con Retro Transcripción (PCR-RT)
• Detección de antígenos,
• Serología (anticuerpos IgM e IgG)
• Cultivo (líneas celulares Vero)
• Microscopia electrónica
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Curso de la infección por SARS Cov-2
Sethuraman, N. et al. 2020. Interpreting Disgnostic Test for SARS-Cov 2. JAMA, 323(22):2249-2251.
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Sethuraman, N. et al. 2020. Interpreting Disgnostic Test for SARS-Cov 2. JAMA, 323(22):2249-2251• Pacientes hospitalizados con cuadro de Covid-
19 severo presentan una carga viral más alta que los pacientes asintomáticos.
• PCR positivo no necesariamente indica la presenciade virus viables. Cantidad de virus viables empieza a declinar a partir del octavo día de síntomas.
• Los anticuerpos son detectables a partir de la segunda o tercera semana de inicio de la infección.
• Pruebas de ELISA que detectan anticuerpos contra la nucleocápside viral y la proteína de unión al receptor (Espícula) combinados, muestran la másalta sensibilidad y especificidad.
• Sin embargo, para las pruebas serológicas siempreexiste la posibilidad de reacciones cruzadas con anticuerpos dirigidos a otros coronavirus.
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Valor predictivo positivo de acuerdo con cada tipo de prueba
Zhao, J. Et al. Antibody responses to SARS-Cov 2 in Patients of Novel CoronavirusDisease 2019. The Lancet, marzo 2020.
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Diagnóstico Agudo de COVID-19• Metodología de PCR Tiempo Real: más alta sensibilidad y
especificidad.
• Detección de secuencias específicas del ARN del virus SARS Cov-2.
• Muestra: Hisopado nasofaríngeo, hisopado orofaríngeo, aspirado nasofaríngeo (saliva ?)
• Estándar para diagnóstico de casos agudos.
• Hasta la fecha, es la única metodología autorizada para suuso en el país.
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HisopadoNasofaríngeo:
Torundas de DacrónMedio de TransporteViral
Estabilidad de 48 a 72horas, de 2 a 6°C
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¿Qué es la metodología de PCR?
• Técnica molecular para la amplificación de fragmentos de ADN y ARN
• Fases del Análisis: Extracción del material genético, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), detección de secuencias blanco.
• Etapas del PCR:
Desnaturalización, Alineamiento,amplificación
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Extracción de Material Genético
• Ruptura de las células.
• Precipitación del ADN y ARN
• Concentración en un vial de muestra.
• Obtención del Extracto
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Preparación del PCR:
Se agregan los Primers, la Polimerasa y el “Master Mix”
Primers identifican los genes específicos del virus
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Etapas del PCR
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TERMOCICLADOR ROTORGENE
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La SONDA que esuna secuenciamarcada con un Fluorocromo es liberada durante amplificación
Señal luminosa va aumentando conformeaparecen más copias delGen de interés
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Causas de Falsos Negativos en análisis de PCR, entre ellos, para el SARS-Cov 2
• Recolección de la muestra en una etapa muy temprana de la infección.
• Técnica de recolección inapropiada.
• Transporte y almacenamiento inapropiado de la muestra.
• Reactivos degradados.
• Muestra no validada para el análisis.
• Presencia de inhibidores de la Polimerasa en al muestra.
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Causasde Falsos Positivosen análisis de PCR, entre ellos, para el SARS-Cov 2
• Contaminación de la Muestra
• Contaminación del equipo o el sitio de montaje
• Falta de especificidad del kit de PCR (Primer o Sonda): reacción cruzada con otroscoronavirus.
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1) Plataforma QiaGen
Sistema abierto: reactivos de varias casas comerciales se adaptan y validan con estos
equipos.
Extracción de hasta 12 muestras al mismo tiempo.
Procesamiento de hasta 32 muestras.
Tiempo de procesamiento aproximado: 4 horas
Preparación de muestras, montaje e interpretación de los resultados necesita de personal
capacitado.
Se usa actualmente en nuestro Laboratorio para determinación de tuberculosis, enfermedades de transmisión sexual, dengue, zika, chikungunya y papiloma
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Plataforma QiaGen: Kits disponibles en Laboratorio CIMA para COVID-19
KIT PCR-RT Marca País de Fabricación
Fecha deAutorización (para su uso en LabCIMA)
Genes queDetecta
GeneFinder COVID-19 Plus
Elitech(OSANGHealthcare)
Corea del Sur 31 de Marzo del 2020
RdRpEN
SARS-Cov-2 Real Time PCR
VIASURE(CerTest Biotec)
España 6 de abril ORF1abN
Vitassay qPCRSARS-Cov-2
Vitassay (Vitassay Healthcare S.L.U.)
España 7 de abril ORF1abN
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2) Plataforma Film Array
• Sistema cerrado: solo para kits Film Array
• 5 kits en uso actualmente: Panel Respiratorio, panel Gastrointestinal, panel de Pneumonía, panel de Meningitis, panel de Identificación de Hemocultivos.
• Procesamiento dura 1 hora 10 minutos
• Un kit por muestra, solo es posible correr 1 muestra a la vez por equipo
• El Laboratorio cuenta con 2 analizadores
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Plataforma FilmArray para COVID-19
• Casa Biomeriux desarrolló el kit SARS-Cov 2 R-Gene Test.
• Resultado en 45 minutos* (*tiempo de respuesta depende del número de muestras pendientes de analizar)
• Disponible a partir del 12 de mayo, permiso otorgado para su uso desde el 8 de abril
• Se podrían montar un máximo 2 muestras a la vez
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Panel FilmArray COVID-19
• Fabricante: Biofire Defense LC
• País de fabricación: Estados Unidos (Biofire)
• Tecnología PCR RT
• Genes que detecta: ORF1ab (dos regiones), ORF8
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AnalizadorTORSH Film Array
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TécnicasSerológicas
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AntibodyPerformance
Measure
Estimate of
Performance
95% Confidence
Interval
IgG Sensitivity (PPA) 100% (88/88) (95.8%; 100%)
IgG Specificity (NPA)99.6%
(1066/1070)(99.0%; 99.9%)
IgGPPV at
prevalence = 5%92.9% (83.4%; 98.1%)
IgGNPV at
prevalence = 5%100% (99.8%; 100%)
Abbott Architect SARS-CoV-2 IgG
Fuente: https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance
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AntibodyPerformance
Measure
Estimate of
Performance
95% Confidence
Interval
Combined Sensitivity (PPA) 93.8% (120/128) (88.2%; 96.8%)
Combined Specificity (NPA) 96.0% (240/250) (92.8%; 97.8%)
CombinedPPV at
prevalence = 5%55.2% (39.2%; 69.8%)
CombinedNPV at
prevalence = 5%99.7% (99.3%; 99.8%)
Cellex qSARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid TestDe
Fuente: https://www.fda.gov/medical-devices/emergency-situations-medical-devices/eua-authorized-serology-test-performance
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AntibodyPerformance
Measure
Estimate of
Performance
95% Confidence
Interval
IgM Sensitivity 100% (30/30) (88.7%; 100%)
IgM Specificity 100% (80/80) (95.4%; 100%)
IgG Sensitivity 96.7% (29/30) (83.3%; 99.4%)
IgG Specificity 97.5% (78/80) (91.3%; 99.3%)
Combined Sensitivity 100% (30/30) (88.7%; 100%)
Combined Specificity 97.5% (78/80) (91.3%; 99.3%)
CombinedPPV at
prevalence = 5%67.8% (35.0%; 88.4%)
CombinedNPV at
prevalence = 5%100% (99.4%; 100%)
Healgen COVID-19 IgG/IgM Rapid Test Cassette
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Próximas Pruebas disponibles para SARS-Cov 2• Panel Respiratorio Film Array 2.1: Panel con 17
virus y bacterias que causan infecciones respiratorias más el SARS Cov-2.
• Anticuerpos IgG contra SARS-Cov 2: inmunoensayo automatizado por metodología de quimioluminiscencia, para analizador Architecti1000 SR.
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GRACIAS