Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk ...
Transcript of Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk ...
1
Diagnostikk vedNasjonalt referanselaboratorium for
medisinsk mykologi
Lonny M. KløvfjellFagbioingeniør
Avdeling for mikrobiologi OUS‐Rikshospitalet
lklovfje@ous‐hf.no
DISPOSISJON
• Litt tall/ aktivitet
• Definisjoner
• Diagnostikk / metoder
• Kasus ‐ Pasient
2
Hva er et referanselaboratorium?
En institusjon som er tildelt en nasjonal medisinsk mikrobiologisk referansefunksjon, er tillagt ansvar for å utføre eller videreføre undersøkelser
vedrørende definerte agens, på vegne av alle andre laboratorier.
Referansefunksjoner
• Samle alle gjærsoppisolater fra blodkultur til NORM (identifikasjon og resistensbestemmelse)
• Identifisere (verifisere) vanskelige sopp‐isolater fra andre laber
• Resistensbestemmelse for laber som ikke utfører dette selv
• Stammebank
3
Hvilke analyser har vi?• Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter.‐ Maldi‐TOF‐ Sekvensering‐ Mikroskopi‐ Selektive medier‐ Vitek2
• Påvisning av sopp‐DNA (PCR). Utføres på molekylær‐enheten for oss.
• Langtidsdyrkning mhp sopp• Resistensbestemmelse av gjær‐ og muggsopp.• Pneumocystis IF• Serologi• Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).
LITT TALL……
• I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida.
• Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3‐ 4 %.
• Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I 2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat.
• 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015.
4
Sopp ‐ analyser
Totalt antall analyser i 2015: 6989
SOPPTYPER
GJÆRSOPP
MUGGSOPP
DIMORFE SOPP
DERMATOFYTTER
5
Gjærsopp
•Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer. Sendes som oftest på pensel.
‐Såes ut på Saboraud og kromskål
•Identifikasjon:
–Krom (grønn/ikke grønn)
–Maldi‐TOF
–Andre enkle tester
–Evt. Vitek
–Sekvensering
•Resistensbestemmelse
6
Muggsopp
•Hvis sendt på skål:
–Rask vurdering av farge og øvrig morfologi
–Lupe
–Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk)
–Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ °C)
–Resistensbestemmelse dersom ønsket
• Maldi‐TOF – ID kommer nå
• Sekvensering
• Invasive infeksjoner• Luftveier• Hud• Øye
•Aspergillus
•Penicillum
•Mucorales
7
13
Aspergillus sp
A.fumigatus
A.flavus
A.niger
A.terrus
180 species
• Vel 30 assosiert med human sykdom
Aspergillus
8
Penicillum
Mucorales
9
Dermatofytter
• Tinea pedis – fot• Tinea unguis (onychomycose)
– negler (hånd/fot)• Tinea corporis – kropp (ringorm)• Tinea capitis – hode (hår/skjegg)
10
• Trichophyton rubrum
• Trichophyton mentagrophytes
(interdigitale)
• Microsporum canis
• Microsporum audouinii
• Trichophyton soudanense
• Trichophyton violaceum
Identifikasjon av dermatofytter
Dyrkning og tilsendte isolat:
• Mikroskopi• Kolonimorfologi• Veksttemperatur• Selektive medier• Sekvensering
Direkte på prøvematerialet:
• Dermatofytt – PCR
11
Trichophyton sp T.soudanenseReflexive hyfer
Microsporum ‐makrokonidier
12
Dimorfe sopp
• Gjærsoppform ved 37C• Mugggsoppform 28C
• Histoplasma• Blastomyces• Coccidioides• Penicillum marneffeii
• Sjelden i Norge• Reiseanamnese!• Immunsupprimerte (HIV)
• P3‐lab
Histoplasma capsulatum
13
Mikroskopi
Ulike metoder:• CFW – direkte på prøvemateriale• Bomullsblått‐ Blokkpreparat‐ Nålepreparat‐ Tapeteknikk• Lupe
Noe av det viktigste vi gjør• Rask og sikker• Krever øvelse• Oppslagsverk
• Struktur• Mikrokonidier• Makrokonidier• Sporangier («stilk»)• Forgreninger• Vesikkel («hoder»)• Apophyse («hals»)• Phialider• Fruktlegemer – chleistotechia/pycnidia• Røtter• Størrelse
• Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper.
‐veksthastighet‐temperatur
14
Sekvensering + mikroskopi
Maldi‐TOF + mikroskopi
15
Aspergillus
Penicillum
Mucorales
CALCOFLUORWHITE
• Flourescens – farging• Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp.• Direkte på prøvemateriale• Rask diagnostikk• Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra
hverandre.
16
BOMULLSBLÅTT ‐ tapeteknikk
• Lactophenolblått
• Blank tape
• Objektglass
• Dekkglass
17
Pneumocystis ‐ Immunfluorescens
• Vi bruker farge fra Biorad (Monofluo P. jirovecii IFA Test Kit)• Monoklonal, FITC merket antistoff• BAL og Indusert sputum
1. Forbehandler med di‐thio‐threitol og PBS2. Sentrifugerer3. Bunnfall på objektglass4. Tørkes5. Fikseres6. Farges7. Mikroskoperes
18
Resistensbestemmelse av sopp
• Etest
• Flytmetode
• RPMI‐skåler
Amfotericin B leses av ved 100 % hemming
Øvrige midler leses av ved 80 (90) % hemming
• Amphotericin• Fluconazole• Voriconazole• Caspofungin• Anidulafungin• Micafungin• Itraconazole
• Posaconazole• Flucytosin
• Isovuconazole
• Vi bruker brytningspunkter anbefalt av EUCAST• Ikke alle sopp har fått brytningspunkter
19
Buljongfortynning
• Gullstandard for resistensbestemmelse• EUCAST bruker dette ved utarbeidelse av brytningspunkt.• Statens Serum Institut i København utfører buljongfortynning
20
Screening for azole‐resistens hos Aspergillus
Serologi
• Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus)
‐ Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos
pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar.
‐ Elektroforese.
‐ Titrering ved positivt funn.
• Galaktomannan (utføres hos virus‐avdelingen)
‐ Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter.
‐ Komponent i celleveggen hos Aspergillus.
‐ Enzym immuno assey; EIA‐teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i
serum (spinalvæske og BAL).
21
Fritekst..... fritekst..... fritekst
•Fugleantigen (immundiffusjon):
–Utføres ved mistanke om allergi mot due, høns eller undulat
• Dimorfe sopp (immundiffusjon):
–Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)
Pr.nr:
Pr.nr:
Pr.nr:
Ktr
1111111
1 2
1 1
12
2 2
3 3
33
44
4 45 5
5 5
22
Kryptokokk‐antigen• Ø‐hjelp• Utføres på spinalvæske, serum og BAL• Hurtigtest fra IMMY• Rimelig, rask og enkel
Dermatofytt‐PCR
•Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR
•Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton
•Realtime PCR
•Smeltepunktsanalyse:
23
Påvisning av sopp‐DNA
Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet
• Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA ‐ Utføres vanligvis parallelt‐ Sterilt materiale‐ BAL hos immunsupprimerte
• Mucorales DNA‐Rhizomucor sp‐Lichtheimia sp (Absidia)‐Rhizopus sp
• Pneumocystis jirovecii DNA‐ semikvantitativ‐ Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive
• Påvisning av sopp‐DNA direkte på prøvematerialet‐ Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter‐ ITS2 og D1D2‐ Der sopp‐DNA påvises, utføres en sekvensering‐ Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i
internasjonale databaser for sopp.‐ Arbeidskrevende metode.
24
Kasus
• Leverabscess hos nøytropen pasient etter
pseudomonassepsis.
• Ultralydveiledet leverbiopsi.
Leverbiopsi soppmikroskopi – calcofluorwhite
Mikroskopi:
brede, vridde irregulære hyfer uten septa.
• Tid til farging ca 2 minutter
Mucorales
25
Leverbiopsi PCR
Mucorales PCR:
Rhizomucor sp DNA påvist
• Undersøkelsen tar < 2 timer,
• settes opp daglig
Soppsekvensering direkte på biopsien:
Rhizomucor pusillus DNA påvist
• 3 x pr uke, tid 2‐3 dager
Mucorales
• Ømfintlige hyfer
• Oppvekst kan utebli om prøven mortres eller pasienten står på
antimykotika
• Trenger ofte 37 grader
26
Dyrkning mucoreles
Rhizomucor pussilus
Lokkløfter
Viktig med rask mistanke til kliniker
Behandling: Kirurgi OG høy dose amfotericin B og med posakonazol
Pasienten
• Gjentatte leverreseksjoner
• Høydosert liposomalt amfotericin B og posakonasol
• Frisk
27
Mucormykose
• Disseminert form med affeksjon av flere organer.
• Risikofaktorer som for Aspergillusinfeksjoner
• Dessuten • Ketoacidose
• Ukontrollert diabetes mellitus
• Vorikonazol profylakse eller behandling
Mikroskopi av BAL og fra kultur
Takk for oppmerksomheten