Diagnostické metody v lékařské ... -...
-
Upload
truongquynh -
Category
Documents
-
view
219 -
download
0
Transcript of Diagnostické metody v lékařské ... -...
Diagnostické metody v lékařské mikrobiologii
Výuková prezentace z:Lékařské mikrobiologie
Jan Smíšek © ÚLM 3. LF UK 2009
• Soubor znaků s rozdílnou diskriminačníhodnotou
• Základní problémy– Minimum morfologických znaků– Podobné antigeny– Genomová nestabilita – mutace, plasmidy
Princip identifikace
• Přímá diagnostika– Přímý průkaz přítomnosti mikroba (kultivace)
nebo jeho částí (antigen, DNA)
• Nepřímá diagnostika– Průkaz specifické imunitní reakce proti
mikrobovi (specifické protilátky)
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Principy diagnostiky
• Přímé diagnostické metody– Odběr z postiženého orgánového systému –
ideálně pouze málo invazivní (stěr z tonsil, sputum, krev, moč, mozkomíšní mok)
• Nepřímé diagnostické metody– Průkaz protilátek v séru, vzácněji např. v
mozkomíšním moku
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ODBĚR
Odběr materiálu
• Klasické metody přímé diagnostiky– Mikroskopické vyšetření– Kultivační vyšetření
• Pokročilé metody přímé diagnostiky– Specifické testy– Biochemické testy– Detekce antigenu– Citlivost k ATB
• Moderní metody přímé diagnostiky– Detekce DNA
Přímá diagnostika
• Světelná mikroskopie– Nativní (nefixované a nebarvené
preparáty) pozorované fázovým kontrastem nebo v zástinu – slouží jen k popisu základní morfologie
– Fixované a barvené preparáty• Rozdělení podle vlastností buněčné stěny
– Gramovo barvení (Gram pozitivní a negativní)– Ziehl-Neelsenovo barvení (Acidorezistentní)
Klasická přímá diagnostika
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE BAKTERIE A MIKROSKOPIE
• Kultivace na kultivačních půdách– Obecné kultivační půdy – roste na nich většina
mikrobů– Selektivní kultivační půdy – jsou vhodné pro růst
konkrétního skupiny nebo druhu– Diagnostické kultivační půdy – lze jimi prokázat
určitou vlastnost mikroba (zkvašování cukru)– Speciální kultivační půdy – vhodné k růstu náročných
druhů, které nelze běžně kultivovat– Na pevných půdách (agarech) hodnotíme morfologii
kolonií, na tekutých (bujónech) typ růstu
Klasická přímá diagnostika
Klasická přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE KULTIVACE
• Mikroskopické a kultivační vyšetření– Výhody
• Snadné• Levné• Není náročné na technické vybavení
– Nevýhody• Vyžaduje interpretaci zkušeným pracovníkem
Klasická přímá diagnostika
• Specifické testy– Po interpretaci výsledků mikroskopického a
kultivačního vyšetření– Odliší od sebe příbuzné a vzájemně podobné
mikroby– Jsou založeny na specifických chemických
vlastnostech či kultivačních podmínkách• Chemické vlastnosti – průkaz oxidázy, katalázy• Kultivační vlastnosti – CAMP, satelitismus,
rozpustnost ve žlučových solích
Pokročilá přímá diagnostika
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
• Biochemické testy– Jsou založeny na schopnosti bakterií metabolizovat
různé substráty (cukry, aminokyseliny aj.)– Většina bakterií umí zpracovat pouze konkrétní
substráty kombinace substrátů typická pro bakterii biochemický profil
– Komerčně vyráběné testové sady s diagnostickými půdami pro určité skupiny bakterií
• Enterobakterie – fermentující Gram neg. tyčky• Nefermentující Gram neg. Tyčky
– Pro snazší hodnocení zpracování substrátu změna barvy diagnostické půdy
Pokročilá přímá diagnostika
Pokročilá přímá diagnostika
Biochemické vlastnosti bakterií čeledi Enterobacteriacae (tzv. „Krátká pestrá řada“)
indol laktóza sacharóza manitol glukóza ureáza Simons SIM
+ - + - + - + - + + plyn
- + - + - + - HS
Pozn.
1 Test na produkci indolu - Kovácsovo činidlo (podobné Ehrlichovu činidlu); test je pozitivní při přítomnosti červené vrstvičky na hladině
2-4
Test štěpení (utilizace) laktózy, sacharózy a manitolu - indikátorem je bromthymolová modř
5 Test štěpení glukózy - ve Wassermanově zkumavce (je široká), v ní menší zkumavka - tzv. „plynovka“ - pokud je v ní bublina vzduchu, znamená to, že bakterie štěpí glukózu za vzniku plynu
6 Test na produkci ureázy (tzn. schopnost štěpit močovinu) - zkumavka s šikmo nalitým agarem obsahujícím močovinou, indikátorem změny pH je fenolováčerveň
7 Amoniumcitrát (Simons)
8 SIM agar - pokud je zákal jen kolem vpichu, bakterie je nepohyblivá (nebo byla její pohyblivost nějakým způsobem ovlivněna); pokud je zákal v celém objemu agaru, bakterie je pohyblivá (např. Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, etc.); dále se na tomto agaru testuje produkce sirovodíku - ten zde tvoří černé sraženiny
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
• Výsledky se hodnotí podle matice a zaznamenají např. do hodnotícího programu v PC
Pokročilá přímá diagnostika
• Program vyhodnotí pravděpodobnost shody s typovými biochemickými profily konkrétních druhů
Pokročilá přímá diagnostika
• Detekce antigenu– Přímý průkaz antigenu v biologickém
materiálu – průkaz infekce konkrétním druhem
• Aglutinací (latexová aglutinace)• Imunofluorescenčně• ELISA
– Průkaz antigenu v čisté kultuře – identifikace konkrétního kmene
• Používají se diagnostická séra sérotypizace(zpětná aglutinace)
Pokročilá přímá diagnostika
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
• Určení citlivosti k antibiotikům– Velký terapeutický význam– Určení citlivosti / rezistence konkrétního kmene– Disková difúzní metoda – nejčastější, disky
napuštěné ATB – měří se velikost inhibičních zón– E test – proužek s klesající koncentrací ATB, drahé !!!– MIC (Minimální Inhibiční Koncentrace) – bujón s
klesající koncentrací ATB – nejnižší koncentrace při níž bakterie nevyroste = MIC
Pokročilá přímá diagnostika
Pokročilá přímá diagnostika
VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE ATB
• Detekce DNA mikroba– Hybridizační metody
• Průkaz navázáním značených genových sond na specifické úseky DNA nebo RNA
– Amplifikační metody• Průkaz pomnožením specifických úseků DNA• Polymerázová řetězová reakce (PCR)
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD
Moderní přímá diagnostika
• Založena na průkazu specifických protilátek hostitele proti mikrobovi
• Klasické metody nepřímé diagnostiky– KFR, Přímá aglutinace, Hemaglutinace
• Moderní metody nepřímé diagnostiky– ELISA, Western blot
• VÍCE VIZ. VÝUKOVÉ CD A PREZENTACE SEROLOGIE
Nepřímá diagnostika
• Lokalizovaná infekce (pneumonie)– Odběr lokálního materiálu (sputum)– Mikroskopie (morfologie, Gram, Ziehl-
Neelsen)– Kultivace (krevní agar, McConkeyho agar,
Sabouraudův agar)– Diagnostický test dle výsledků mikroskopie a
kultivace• CAMP, satelitismus, enterotest atd.
– Určení citlivosti k ATB terapeutickédoporučení
Diagnostický postup
• Závažná specifická infekce (meningitida)– Odběr lokálního materiálu (likvor) i krve– Rychlý průkaz antigenů v likvoru (latexová
aglutinace)– Mikroskopie a kultivace likvoru– Hemokultura (kultivace krve)– Při průkazu bakteriálního původce vyšetření
citlivosti k ATB– Jinak průkaz protilátek (spirochety a viry) a
DNA (viry)
Diagnostický postup