Diagnostic des anomalies de - ADRHEC plateform · Au cours de la grossesse ADAMTS13 diminue...
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DIU d’Hémostase – Lyon – 2015
Diagnostic des anomalies de
l’ADAMTS13
Professeur Agnès Veyradier
Service d’Hématologie – Hémostase – Thrombose
Hôpital Lariboisière, Paris
Groupe Hospitalier Saint Louis-Lariboisière-Fernand Widal
Université Paris Diderot – Paris 7
PARIS
DIDEROT
université
PA
RIS
7
Etudes hémorhéologiques des années 1980
Le facteur Willebrand (VWF) est la protéine indispensable
à l’adhésion plaquettaire au sous-endothélium
et à l’agrégation plaquettaires dans la microcirculation sanguine
Endothélium
Matrice
sous-endothéliale
Brèche
vasculaire
Plaquette
VWF
Plaquette fibrinogène
Plaquette
VWF
Agrégation
plaquettaire
Adhésion
plaquettaire
VWF : structure multimérique
Dimère : 500 kDa
Tetramère : 1000 kDa
Multimère > 20 000 kDa
Hexamère : 1500 kDa
VWF : sensibilité conformationnelle aux taux de cisaillement du flux sanguin
Multimère de VWF
globulaire
Multimère de VWF
déplié
Régulation physiologique
de la taille des multimères du VWF
La protéase de clivage du VWF : Historique
1996. Purification partielle à partir du plasma humain
1997. Méthode de dosage fonctionnel dans le plasma
1998. Modèle de pathologie humaine : le PTT
2001. Séquence peptidique (famille ADAMTS) : ADAMTS13
2001. Gène
2001. Lieu de synthèse
Depuis 2001.
. Relations structure / fonction
. Régulation
. Rôle en physiologie et pathologie humaines
ADAMTS13
. Gène : chromosome 9 - 29 exons - ARNm 4,6 kb (clonage 2001)
. Biosynthèse : c de Ito du foie, c endothéliales, plaquettes
. Sécrétion dans le plasma (conc : 1 µg/ml; demi-vie : 1 semaine)
. Normes dans le plasma : 50 – 150 %
. Structure : Métalloprotéase de la famille ADAMTS
(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 motifs)
Glycoprotéine monocaténaire de 190 kDa - 1427 ac am
. Fonction : Protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand
. Déficit sévère : Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT)
Récepteurs
cellulaires
(CD36 endothélial)
?
Intégrines
(Ca ++) (Zn ++)
RGDS
Chaîne 3 des intégrines
TSP
3
TSP
5
TSP
7
TSP
6
TSP
8
TSP
2
TSP
4 Metalloprotease TSP
1 Spacer
CUB
CUB
Desint. Cys N
C
Structure d’ADAMTS13
Site catalytique
ADAMTS13
Facteur Willebrand (VWF) [monomère = SU mature]
C2 D’ A1 A2 A3 D3 D4 B1 B2 C1 CK
Domaines d’interaction entre ADAMTS13
et son substrat
Tyr842-Met843
VWF73
VWF73 = Substrat minimal pour ADAMTS13 in vitro
Partie N-terminale indispensable au clivage du VWF in vitro
désint TSP
1 Cyst. spacer métallo CUB CUB
EQAPNLV YM VTGNPASDEIKRLPGDIQVVPIG VGPNANVQELERIGWPNAPILIQDFETLPR EAPDLVLQR
842-843
905 833
Liaison en flux
in vitro
Multimères de VWF clivés
Cellules endothéliales
Multimères de HPM de VWF
Sécrétion des multimères de THPM à partir des corps de Weibel-Palade
Cellules endothéliales
Fonction du couple VWF-ADAMTS13
Sujet Normal
CD 36 ?
Plaquettes
Sujet Normal Patient atteint de PTT
Agrégation spontanée des plaquettes
Libération de thrombi
Fonction du couple VWF-ADAMTS13
CD 36 ?
Variations physiologiques d’ADAMTS13
Conditions ayant en commun une augmentation
physiologique du taux de VWF : diminution d’ADAMTS13
. Âges extrêmes de la vie : nouveau-nés et sujets âgés ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r à la population générale
. Sujets noirs ADAMTS13 plus basse de 10-20% p/r aux sujets blancs
. Au cours de la grossesse ADAMTS13 diminue progressivement à partir de 12 SA
pour atteindre à terme, des taux inférieurs de 15-20% p/r
au taux de base de la patiente
Déficits fonctionnels en ADAMTS13
I- Déficits partiels en ADAMTS13 (Activité entre 10 et 45%)
. Non spécifiques, retrouvés dans de nombreuses pathologies :
sepsis sévère, hépatopathies, HTA maligne, paludisme, MAT
telles que SHU, HELLP syndrome, PTT « non classiques » associés
aux greffes d’organes, aux cancers, au VIH…
. Pertinence clinique ???
. Mécanismes : consommation par excès de substrat, diminution de
synthèse/sécrétion, inhibition catalytique par IL6, dégradation
protéolytique par enzymes protéolytiques (thrombine, élastases
leucocytaires…)
II- Déficit sévère en ADAMTS13 (Activité <10%)
. Pathognomonique du PTT
. Marqueur diagnostique sensible et spécifique
. Marqueur pronostique probable
. Mécanismes : auto-anticorps ou mutations génétiques
PTT : définition
. Anémie hémolytique mécanique (schizocytes)
. Thrombopénie de consommation
. +/- ischémie multiviscérale (cerveau, rein…)
rein surrénale
colon pancréas
foie coeur
Thrombi de la microcirculation dans différents organes
d’un patient atteint de PTT
PTT : historique, épidémiologie
. Historique
. Adulte : Syndrome de Moschcowitz (1924)
. Enfant : Syndrome d’Upshaw-Schulman (1960)
. Prévalence
4 à 10 cas / million d’habitants / an - (maladie rare)
. Age de révélation (1ère poussée)
Enfance (naissance -> adolescence) : <10% des cas
Adulte : 30-40 ans, sex ratio 2F/1H : >90% des cas
. Evolution par poussées (entrecoupées de rémission)
. sporadiques
. récurrentes (parfois familiales)
. Formes cliniques
. Idiopathiques (~50% des cas)
. Secondaires : infections, grossesse, MAI, médicaments… (~50% des cas)
Structure multimérique du VWF plasmatique
dans le PTT
-
+
multimères
de THPM
- dimère
PTT Normal
Moake et al, Blood 1982
Histopathologie du PTT
Microangiopathie thrombotique
souffrance
endothéliale
Asada et al, Thromb Res 1985
Micro-
vaisseaux
Thrombi de
plaquettes + VWF
Purification d’une protéase spécifique de clivage du VWF : VWF-CP
L’activité plasmatique de la VWF-CP est effondrée (<5%) chez les
patients atteints de PTT Furlan et al, Blood 1997
Physiopathologie du PTT (1)
Le déficit fonctionnel sévère de la VWF-CP dans le PTT est :
. soit acquis par le biais d’auto-anticorps spécifiques
. soit probablement constitutionnel (cas familiaux)
Furlan et al, NEJM 1998
Tsai et al, NEJM 1998
Furlan et al, Blood 1996
Le clonage du gène de la protéase spécifique de clivage du
facteur Willebrand a permis :
. de l’identifier comme le 13ème membre de la famille ADAMTS
(A Disintegrin And Metalloproteinase with ThromboSpondin
type 1 repeats) : ADAMTS13
. de montrer qu’il existe bien des cas héréditaires de PTT
par le biais de mutations récessives du gène d’ADAMTS13 :
maladie orpheline = Syndrome d’Upshaw-Schulman
Levy et al, Nature 2001
Physiopathologie du PTT (2)
Physiopathologie du
purpura thrombotique thrombocytopénique
Formation spontanée de thrombi plaquettaires
dans la microcirculation sanguine
Déficit fonctionnel sévère <10% en ADAMTS13
Accumulation de très grands multimères du VWF très adhésifs
en circulation dans le plasma
Acquis (auto-anticorps anti-ADAMTS13)
Héréditaire (mutations du gène d’ADAMTS13)
Anémie hémolytique mécanique
Thrombopénie de consommation
Ischémie
multiviscérale
Facteurs favorisants
Syndrome d’Upshaw-Schulman
Epidémiologie
. Maladie orpheline :
moins de 10% de tous les cas de PTT
prévalence <0,5 pour 1 million
. Une centaine de patients décrits dans la littérature
. Répartition mondiale ubiquitaire :
Amérique du Nord (USA, Canada)
Europe (UK, France, Allemagne, Autriche, Suisse, Italie, Portugal,
Yougoslavie, Suède)
Asie (Japon, Chine, Iran, Koweit, Turquie)
Australie
Afrique (Maghreb)
Peu de mutations d’ADAMTS13 communes entre les différents pays
. Age de révélation
. à la naissance +++ (ictère, hémolyse, thrombopénie)
. dans la petite enfance ++
. à l’âge adulte : mutation R1060W, grossesse
. Sévérité des poussées
. bicytopénie hématologique …..
… ischémie multiviscérale parfois irréversible
(insuffisance rénale terminale, séquelles d’AVC, d’IDM…)
. Fréquence des poussées :
. périodes de rémission de durée variable (mois, années)
. ou maladie chronique (rémission < 1 mois)
Syndrome d’Upshaw-Schulman
Phénotype clinique variable
. Activité plasmatique ou sérique d’ADAMTS13 < 10%
. Antigène d’ADAMTS13 le plus souvent indétectable < 65 ng/ml
. Autoanticorps anti-ADAMTS13 négatifs
. Titre d’IgG anti-ADAMTS13 < 15 UI/dl
. Activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13 indétectable
Syndrome d’Upshaw-Schulman
Phénotype biologique invariable
. Une centaine de mutations d’ADAMTS13
. Transmission autosomique récessive (maladie orpheline) :
. Les patients sont double hétérozygotes ou homozygotes
. Parmi les homozygotes (~15 mutations) : consanguinité
. Répartition sur toute la longueur du gène
. Mutations faux-sens : 70% / Mutations de terminaison : 30%
. Pas de délétion totale du gène (létale ?)
. Mécanismes : déficit quantitatif ou qualitatif d’ADAMTS13
Syndrome d’Upshaw-Schulman
Génotype
Métalloprotéase Desint. TSP
1 Cys Spacer TSP
2
TSP
3
TSP
4
TSP
5 TSP
6
TSP
7
TSP
8 CUB1
I79M
V88M*
A95P
H96D
R102C
S119F
R193W*
T196I
S203P
L232Q
H234Q
D235H
A250V*
S263C
R268P
C311Y
C322G
T323R
F324L
R328G
C347S
P353L
C365X*
W390C*
W390X
R398H
E444G
Q448E
Q449X*
P457L
P475S
R507Q
C508Y*
R528G
Splice :
In15 :
1787 -26G>A
Frameshift :
1783-1784 TT del
A900V
S903L
C908Y*
C908S
R910X
C951G
W1016X
C1024G
A1033T
R1034X
R1060W*
R1095W
R1096X
R1123C* Q44X*
R7W
Splice :
In3 : G>A
In4 : 414+1 G>A
In6 : 686+1>A 686+1T>G
Frameshift :
Ex7 : 718-724 del G+C
Splice :
In8 : 987
+ 11C>T
or +69C>T
Int/ex8 :
8 bp del
Ex 9 : G>A
Splice :
In10 :
1244 -2T>G
1245 -32C>G
Splice :
In 13 :
+2T >A
1584 +5G>A
1584 +106C>G
1584 +236T>C
Ex12 :
G>A
A596V
P618A
R625H
A631V
P671L
I673F
P671L
T673F*
R692C
C695W
A732V
Frameshift:
Ex19 :
2279G>A
2279delG
2376del26
C758R
Q802X
Frameshift:
Ex20 :
2549delAT
H960D
C977W
Splice :
In22 :
2861 +55C>T
R1206X
C1213G*
C1213Y
I1217T
R1219W*
C1239V*
W1245X*
K1256F
K1256S
R1336W
D1362V
Frameshift:
Ex27 :
3769insT
CUB2
Splice :
In28 :
4077 +32T>C
Frameshift :
4143insA
Mutations d’ADAMTS13 dans le syndrome d’Upshaw-Schulman
E812X
Mutations de novo
Mutations françaises
Mutations exprimées dans des recombinants*
PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13
. 90% de tous les PTT lié à déficit sévère en ADAMTS13
. Prévalence : 4 à 10 cas par million d’habitants / an
. Age : adultes +++ (âge de la 1ère poussée : 30-40 ans)
. Sex ratio : 2F / 1H
. Contexte : idiopathique / contexte clinique associé
. Mécanismes
. autoimmunité (IgG anti-ADAMTS13) : 90% des cas
. autres (défaut de synthèse/sécrétion, dégradation, inhibition …) : 10% des cas
Phénotype clinique variable
. Age de révélation de la maladie : adulte >>>>> enfant (rares cas chez grands
enfants et adolescents)
. Caractère idiopathique = contexte clinique associé (maladies auto-immunes
LED SAPL…)
. Degré de l’atteinte ischémique (thrombopénie -> ischémie multiviscérale)
. Fréquence des poussées (récurrentes sporadiques -> chroniques)
. Exigences thérapeutiques (plasmathérapie +/- immunosuppresseurs)
Phénotype biologique variable
IgG anti-ADAMTS13 : détectables dans ~70% des cas
PTT par déficit sévère acquis en ADAMTS13
Auto-anticorps anti-ADAMTS13
dans le PTT acquis (1)
. Dans 75% des PTT acquis : IgG combinant une
activité inhibitrice et une complexation à l’antigène
. Rarement : IgM et/ou IgA
. Polyclonaux et toujours dirigés contre le domaine
Cys-rich d’ADAMTS13
. Associés d’emblée ou précèdent l’apparition
d’autres auto-Ac (FAN)
Auto-anticorps anti-ADAMTS13
dans le PTT acquis (2)
. Induisent le déficit sévère acquis de l’activité d’ADAMTS13
retrouvé en poussée de PTT
. Le plus souvent, disparaissent en rémission clinique,
parallèlement à une normalisation de l’activité d’ADAMTS13
. Parfois, persistent en rémission clinique :
- à un titre élevé, parallèlement à une ADAMTS13 indétectable
- à un titre moindre, parallèlement à une ADAMTS13 détectable
ADAMTS13 dans les MAT
Expérience 1999-2014
du CNR-MAT (Centre National de Référence des MicroAngiopathies Thrombotiques)
ADAMTS13 en France : historique 1999-2012
2000 2002 2005 2006 2011 2012
U143 Inserm/
Hématologie A. Béclère
(D. Meyer)
Méthode originale de mesure
d’ADAMTS13 activité
(ELISA VWF full-length)
et application aux MAT
Thèse de Sciences A. Veyradier
1999
Réseau clinico-biologique d’étude des MAT
Cliniciens: réanimateurs,
hématologues, néphrologues, internistes
Biologistes:
ADAMTS13 : Hémato A. Béclère/U143 Inserm
Complément: Immunologie HEGP
Thèse d’exercice médecine P. Coppo
U143 Inserm/
Hématologie A. Béclère
(D. Meyer/A.Veyradier)
Nouvelles méthodes
d’investigation
d’ADAMTS13
FRETS-VWF73
IgG anti-A13
Séquençage gène A13
PNMR 1: 3ème vague de labellisation
Centre National de Référence
des MicroAngiopathies Thrombotiques (CNR-MAT)
Coordonnateur : P. Coppo
50 Équipes cliniques (sites CNR + CC)
Labos référents:
ADAMTS13 : A. Veyradier
Complément : V. Frémeaux-Bacchi
Expertise HAS
Renouvellement CNR-MAT
(PNMR2)
U770 Inserm
(C. Denis)
Souris KO ADAMTS13
Laboratoire de génétique,
CHU Nantes
(P. Boisseau, S. Bezieau)
Génotypage d’ADAMTS13
2010
Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : historique
De la recherche clinique au diagnostic médical
Tests phénotypiques pour les patients
Inserm U143
Inserm U143
Hémato bio
Hôp. A. Béclère
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
Hématol bio
Hôp. A. Béclère
Hémato bio
Hôp.
Lariboisière
Inserm U770
Tests génotypiques pour les patients
1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014
Inserm U143/U770 Génétique
Hôp. Hôtel-Dieu - CHU de Nantes
Réseau clinico-biologique des MAT Centre National de Référence des MAT (PNMR)
Lille
Nantes
Strasbourg
Bordeaux
Toulouse
Montpellier Marseille
Tours
Caen Rouen
Clermont-
Ferrand
Lyon
Rennes
Reims
Dijon
Amiens
Limoges
Angers
La Réunion
Paris
CNR-MAT Assistance Publique-Hôpitaux
de Paris
Saint Antoine
Saint Louis
Pitié Salpêtrière
Tenon…
Antoine Béclère
HEGP
19
Centres
de
Compétences
CNR-MAT : maillage territorial
Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT
Service d’Hématologie biologique
S. Thouzeau-Benghezal, S. Savigny,
S. Capdenat, Dr A. Stepanian, Pr A. Veyradier
Etude phénotypique
(ADAMTS13 activité
FRETS-VWF73 et full-length VWF
IgG anti-ADAMTS13 titrage et inhibiteur)
Service de génétique moléculaire
Dr P. Boisseau, Pr S. Bezieau
Etude génétique d’ADAMTS13
Inserm U770,
Le Kremlin Bicêtre
P. Legendre
Dr C. Denis, Dr P. Lenting,
Recherche fondamentale
Modèle murin ADAMTS13 KO
2000 2002 2001 2003 2005 2004 2006 2008 2007 2009 2011 2010
Nombre de tests ADAMTS13
phénotypiques
1000
2000
3000
Soins courants
Recherche clinique
Labellisation
CNR-MAT
PNMR1
Laboratoire ADAMTS13 du CNR-MAT : activité
. Total sur 14 ans : environ 15 000 tests phénotypiques
-> recrutement national
-> 1 à 3 séries d’ADAMTS13 activité / semaine
-> compte rendus spécialisés experts
-> avis spécialisé (tel, email) dans 30% des cas
2012 2013
Filière MARIH
PNMR2
adultes
enfants
PTT héréditaires PTT acquis
Cohorte du CNR-MAT de
PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13
(~850 patients)
Age de révélation :
. adulte (93%)
. pédiatrique (7%)
Etiologie (tous âges):
. Acquise (94%)
. Héréditaire (6%)
Etiologie (enfants):
. Acquise (44%)
. Héréditaire (56%)
Etiologie (adultes):
. Acquise (98%)
. Héréditaire (2%)
mais ……
Cohorte du CNR-MAT de
PTT lié à un déficit sévère d’ADAMTS13
révélé en contexte obstétrical
(42 patientes)
PTT acquis
(80%)
PTT héréditaires
(20%)
Moatti-Cohen et al, Blood 2012
Exploration biologique
d’ADAMTS13
I- Etapes pré-analytiques
II- Méthodes biologiques
. Activité d’ADAMTS13
. Antigène d’ADAMTS13
. Auto-anticorps anti-ADAMTS13
. Gène d’ADAMTS13
I- Etapes pré-analytiques
. Etude phénotypique (activité, antigène, recherche d’auto-Ac)
- Plasma citraté ou serum
- Si absence de ttt extemporané : congélation à -20°C ou -80°C
- Si ttt sur un site extérieur, envoi dans la carboglace
- Limites :
communes à toutes les techniques
. EDTA : inactivation d’ADAMTS13 in vitro
. Hémolyse : inactivation d’ADAMTS13 in vitro
propres aux méthodes VWF full-length
. Taux de VWF:Ag > 300 UI/dl
propres aux méthodes fluorimétriques
. Autofluorescence de certains plasma/serum ?
. Hyperbilirubinémie
. Etude génétique
- Sang total EDTA ou citraté conservés à +4°C pdt 72 h ou -20°C
- Consentement éclairé du patient
Exploration biologique d’ADAMTS13
Principe
Dégradation d’un substrat exogène (VWF full-length ou courts peptides de VWF)
par l’ADAMTS13 du plasma testé.
Les produits de dégradation du VWF clivé par ADAMTS13 sont mesurés par des
techniques :
- électrophorétiques (multimères ou fragments)
- immunologiques (CBA, VWF:Ag, Chr-VWF73)
- d’agrégation plaquettaire (VWF:RCo)
- fluorimétriques (FRETS-VWF73)
- de spectrométrie de masse (SELDI-TOF)
Normes : 50 – 150 %
Objectif
Détection des déficits fonctionnels sévères: activité d’ADAMTS13 <10%
II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (1)
Exploration biologique d’ADAMTS13
Indications pour le diagnostic médical
. Devant une suspicion de MAT en phase aiguë, confirmation ou infirmation
du diagnostic de PTT (paramètre sensible et spécifique)
- dans 95% des cas : non urgent ! Délai préconisé < 10 jours.
- dans 5% des cas : urgent car nécessité d’ajustement thérapeutique rapide
. confirmation diagnostique de PTT pour indication traitement
immuno-modulateur si intolérance à la plasmathérapie ou flare-up
. diagnostic d’exclusion de PTT pour indication d’eculizumab
. Suivi biologique en rémission des patients ayant un(des) ATCD de poussées
de PTT (paramètre ayant une valeur pronostique quant au risque de
rechute)
II- Méthodes biologiques : Activité d’ADAMTS13 (2)
Exploration biologique d’ADAMTS13
Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)
Multimères du VWF (SDS-agarose)
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Furlan et al, NEJM 1998
Dilutions
plasmatiques 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 Tp 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640
Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100%
Patient PTT Activité d’ADAMTS13 <10%
Méthodes électrophorétiques (VWF full-length)
Fragments de dégradation du VWF (SDS-PAGE)
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Tsai HM, NEJM 1998
Sujet normal Activité d’ADAMTS13 100%
Patient PTT Activité d’ADAMTS13 <10%
300 kDa -
250 kDa -
SU - VWF
clivage par
ADAMTS13
Méthodes immunologiques (VWF full-length)
ELISA VWF:Ag
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Obert et al, Thromb Haemost 1999
Sujet normal
Patient PTT
Plasma
+ BaCl2
rvWF WT
(substrat) +
Protéolyse
Mesure du VWF:Ag résiduel par ELISA
Acm
anti-vWF
C-term
Acm
anti-vWF
N-term
ou
Méthode Fluorimétrique (VWF-73)
FRETS-VWF73
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Kokame et al, Br J Haematol 2005
Avantages et inconvénients des méthodes
selon le substrat VWF utilisé
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Méthodes Avantages Inconvénients
Méthodes
VWF full-length
Méthodes
VWF-73
Home-made
Longues (plusieurs jours)
Interférence du VWF:Ag
endogène du patient
Non adaptables en kit commercial
Méthodes de référence,
évaluées
Sensibles à ~toutes les
mutations d’ADAMTS13
Méthodes de référence,
évaluées
Rapides (1 journée)
Pas d’interférence du VWF:Ag
endogène du patient
Adaptables en kit commercial
Interférence selon mode de
révélation (autofluorescence spontanée)
Non sensible à certaines
mutations d’ADAMTS13
Corrélation des différentes méthodes
Mesure de l’activité d’ADAMTS13
Méthodes « home made » de référence entre elles (littérature 2006-2010)
(full-length vs full-length et full-length vs VWF-73)
Littérature -> bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères
mais discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales
Méthodes «home made» versus kits commerciaux récents
. Etude multicentrique nationale en 2011 pilotée par le CNR-MAT
(12 labos des Centres de Compétences du CNR-MAT, ~10 échantillons)
-> nécessité d’évaluer les kits commerciaux ADAMTS13 act. pour aider les
Laboratoires des Centres de Compétences du CNR-MAT à choisir le meilleur kit si
volonté de développer la technique sur site pour les urgences
. Publication récente : Mackie et al, Thromb Haemost janvier 2013
Evaluation des Kits American Diagnostica (Fret-VWF86) et Technoclone (Chr-VWF73)
versus méthode home made frets-VWF73 : 159 échantillons
-> assez bonne corrélation inter-méthodes pour le diagnostic des déficits sévères mais
discordances pour les déficits partiels et les valeurs normales
Evaluations menées par le laboratoire ADAMTS13
du CNR-MAT en 2013-2014
EVALUATION DE 2 KITS COMMERCIAUX
. Projet initial
Evaluation en parallèle du kit Genprobe® et du kit Technoclone ® …
mais rupture de stock du kit Technoclone ® pendant 6 mois
. Finalement
. Evaluation du kit Genprobe ® début 2013
. Evaluation du kit Technoclone ® fin 2013-début 2014
. NB : auto-financement des réactifs (pas de conflit d’intérêt)
PARTICIPATION AU STANDARD INTERNATIONAL
. (NIBSC, United Kingdom) sous l’égide du SSC VWF/ADAMTS13 de l’ISTH
. Très bons résultats
Evaluation du kit Genprobe ®
pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (1)
Principe de la méthode
Dégradation d’un substrat FRETS-VWF73 par l’ADAMTS13 du plasma testé.
Révélation par fluorimétrie.
Calibrants et CQ du kit (bas : 16-26% / haut : 47-57%)
CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%)
Echantillons testés : n = 209
. 13 PTT héréditaires (USS)
. 38 PTT acquis en poussée
. 31 PTT acquis en rémission
. 97 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres…)
. 30 sujets sains
Thouzeau S, Capdenat S, Stepanian A, Coppo P, Veyradier A.
Thrombosis Haemostasis 2013
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
ADAMTS13 activity
(In-house FRETS-VWF73)
ADAMTS13 activity
(ATS-13 ® Activity Assay)
[Number] of tested samples
Total = 209
[51] [86] [72]
Limite de sensibilité : 10%
Limite de sensibilité : 15%
Seuil de relevance
clinique : 10%
Evaluation du kit Genprobe
ADAMTS13 (2)
51 échantillons <10% :
3 discordants (sur-estimés)
86 échantillons entre 11 et 49% :
65 discordants
dont 17 sous-estimés (<10% !)
et 48 sur-estimés
72 échantillons entre 50 et 100% :
presque tous surestimés
Evaluation du kit Genprobe®
pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (3)
Conclusion
. Limites techniques :
Seuil de détection (15%) trop élevé et > seuil de relevance clinique
Calibrants non optimaux
. Bonne sensibilité pour détecter les taux d’ADAMTS13 < 10%
. Défaut de spécificité
-> sur-diagnostic de déficit sévère (!) dans 17 cas/65 (~1 cas / 4)
. Surestimation quasi-systématique des valeurs détectables
-> problème de suivi des patients en rémission +++
(sous-diagnostic d’un début de rechute biologique qui pourrait justifier une
Injection préventive de rituximab ?)
Evaluation du kit Technoclone ®
pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (1)
Joly B, Stepanian A, Hajage D, Thouzeau S, Capdenat S, Coppo P, Veyradier A.
Thrombosis Research, 2014
Principe de la méthode
Dégradation d’un substrat FRETS-VWF73 par l’ADAMTS13 du plasma testé.
Révélation par colorimétrie.
Calibrants (n=6) et CQ du kit (n=2)
CQ internes (PTT < 10%, pool 50%, pool 100%)
Echantillons testés : n = 247
. 19 PTT héréditaires (USS)
. 75 PTT acquis en poussée
. 52 PTT acquis en rémission
. 71 MAT diverses (SHU, sepsis, cancers, MAI et autres…)
. 30 sujets sains
ADAMTS13 activity (%)
(Technozym® ADAMTS13 activity ELISA)
ADAMTS13 activity (%)
(In-house FRETS-VWF73)
[94] [15] [53] [85]
[Number] of tested samples
Total = 247
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Evaluation du kit Technoclone
ADAMTS13 (2)
Seuil de relevance
clinique : 10%
94 échantillons <10% :
11 discordants (sur-estimés)
68 échantillons entre 11 et 49% :
4 sous-estimés (<10% !)
Autres plutôt sous-estimés
85 échantillons entre 50 et 100% :
Globalement sous-estimés
Limite de sensibilité : 10%
Limite de sensibilité : 3%
-40
-20
0
20
40
60
0 25 50 75 100
FR
ET
S-V
WF
73 -
Chr-
VW
F73
(FRETS-VWF73 + Chr-VWF73)/2
Mean
6.6
+1.96 SD
41.7
-1.96 SD
-28.5
Evaluation du kit Technoclone
ADAMTS13 (3) Graphe de Bland et Altman
149 échantillons dont l’activité d’ADAMTS13 est > 10%
Le test Chr-VWF73
(Technoclone) :
. a tendance à sous-
estimer l’act. A13
. mesure des valeurs
très dispersées de
manière aléatoire
Evaluation du kit Technoclone®
pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (4)
Conclusion
. Seuil de détection (3%) bien adapté au seuil de relevance clinique (10%)
. Pistes d’amélioration techniques : ajouter un calibrant (~80%) et des CQ
. Pour la détection d’une activité d’ADAMTS13 < 10%
- assez bonne concordance avec la méthode de référence FRETS-VWF73
- mais ~12% de résultats faux négatifs
Attention à ne pas « manquer » le diagnostic biologique de PTT
. Pour la mesure précise d’une activité d’ADAMTS13 >10% (entre 11 et 100%)
- tendance à la sous-estimation systématique des valeurs détectables
- grande variabilité des mesures, de manière aléatoire
Attention à ne pas surestimer le risque de rechute et par conséquent, l’indication
d’une injection préventive de rituximab lors du suivi des patients PTT en rémission
clinique
.
Recommandations du CNR-MAT
pour la mesure de l’activité d’ADAMTS13
à des fins de diagnostic médical
Idéalement, la mesure de l’activité d’ADAMTS13 (technique et interprétation)
effectuée dans le cadre de la documentation biologique d’une suspicion de MAT :
. relève d’une activité biologique experte supraGH dédiée aux maladies rares (plateforme
biologique du CNR-MAT) . repose en 1ère intention sur la technique FRETS-VWF73 . doit être contrôlée par une 2ème méthode utilisant un substrat VWF full-length
. systématiquement pour les patients pédiatriques
. en cas de discordance avec la présentation clinique ou de pb analytique
(autofluorescence par ex.) pour les patients adultes
Le kit commercial Technoclone est le plus performant en 2014. Les utilisateurs
doivent cependant en connaitre les limites et ne pas hésiter à avoir recours au labo
ADAMTS13 du CNR-MAT en cas de doute ou de problème technique et/ou
d’interprétation.
II- Méthodes biologiques : Antigène d’ADAMTS13
Exploration biologique d’ADAMTS13
. Principe
ELISA utilisant des Anticorps polyclononaux ou monoclonaux
anti-ADAMTS13
Méthodes home made et kits commerciaux
. Normes : 700 – 1400 ng/ml
. Indication pour le diagnostic médical
Caractérisation des déficits fonctionnels sévères héréditaires
en ADAMTS13 (syndrome d’Upshaw-Schulman) :
Distinction déficit quantitatif / déficit qualitatif
II- Méthodes biologiques :
Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (1)
Exploration biologique d’ADAMTS13
. Titrage des IgG anti-ADAMTS13
. Principe
ELISA utilisant de l’ADAMTS13 recombinante sauvage et une révélation par des Anticorps anti-IgG
humaines. Méthodes home made et kits commerciaux.
. Seuil de positivité: ~15 UI/ml
. Sensibilité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 est positif dans ~75% des PTT acquis auto-immun en
phase aiguë
. Spécificité : le titre d’IgG anti-ADAMTS13 peut être discrètement positif chez un très faible
pourcentage de sujets sains ayant une activité d’ADAMTS13 normale
. Indication pour le diagnostic médical
Test de 1ère intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.
Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, le tirage des IgG anti-ADAMTS13 est
indiqué afin d’objectiver une cause auto-immune au déficit sévère en ADAMTS13 (PTT acquis auto-
immun).
II- Méthodes biologiques :
Auto-anticorps anti-ADAMTS13 (2)
Exploration biologique d’ADAMTS13
. Recherche d’une activité inhibitrice circulante anti-ADAMTS13
. Principe
Mesure de l’activité ADAMTS13 résiduelle de mélanges, à différents ratios, de plasma testé + plasma
témoin. Méthodes home made.
. Seuil de positivité: variable selon les méthodes
. Sensibilité : une AIC anti-ADAMTS13 est retrouvée dans ~60% des PTT acquis auto-immun en phase
aiguë
. Spécificité : une AIC anti-ADAMTS13 n’est jamais détectée si l’activité d’ADAMTS13 est >10%
. Indication pour le diagnostic médical
Test de 2ème intention pour la recherche d’auto-Ac anti-ADAMTS13.
Si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est inférieure à 10%, la recherche d’une AIC anti-ADAMTS13
est indiquée et permet :
. si les IgG anti-ADAMTS13 sont positives, d’objectiver leur éventuel caractère
inhibiteur (~80% des cas)
. si les IgG anti-ADAMTS13 sont négatives, une IAC anti-ADAMTS13 est rarement mise
en évidence et pourrait alors être liée à la présence d’IgA/IgM anti-ADAMTS13
II- Méthodes biologiques :
Analyse génétique d’ADAMTS13
Exploration biologique d’ADAMTS13
Principe Séquençage des 29 exons et des jonctions exon/intron du gène d’ADAMTS13
Indication pour le diagnostic médical Confirmation du diagnostic de PTT héréditaire (Syndrome d’Upshaw-Schulman)
devant une histoire clinique et un phénotype biologique évocateurs :
- poussées de PTT récurrentes depuis l’enfance ou déclenchées par la grossesse
- activité d’ADAMTS13 (méthode full-length et méthode VWF-73) < 10%
de manière constante (en poussée de PTT en en rémission)
avec IgG anti-ADAMTS13 négatives
Sensibilité : des mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 sont retrouvées
dans ~99% des USS
Spécificité : les mutations bi-alléliques du gène d’ADAMTS13 ont une spécificité
de 100% dans le diagnostic de l’USS
Arbre décisionnel simplifié pour l’investigation d’ADAMTS13
à visée diagnostique dans le PTT : recommandation CNR-MAT
ADAMTS13 activité non effondrée
effondrée
IgG / inhibiteur anti-ADAMTS13
positif négatif
ADAMTS13 activité
non effondrée effondrée
(+ auto-Ac anti-ADAMTS13 nég.)
Séquençage du gène
d’ADAMTS13
PTT
en
poussée
PTT
en
rémission
Diagnostic PTT acquis PTT héréditaire
…..
pas de mutation mutations
?
Cas clinique N°1
Un nouveau-né (fille) présentant un ictère développe à J2 de vie,
une thrombopénie à 20 giga/L associé à une anémie à 10 g/dL
avec 3% de schizocytes. Il existe une protéinurie modérée sans
insuffisance rénale. Il n’y a aucun contexte clinique particulier.
Les parents sont cousins germains et il y a dans la fratrie de 4
enfants, un frère décédé à quelques jours de vie dans un tableau de
défaillance multiviscérale inexpliqué (il y 10 ans) et 2 sœurs bien
portantes.
Vous suspectez une MAT.
Cas clinique N°1
1. Quels examens biologiques complémentaires
demandez-vous ?
Réticulocytes :
Coombs érythrocytaire : négatif
LDH :
Biliribine non conjuguée :
Haptoglobine : effondrée
ADAMTS13 activité : effondrée <10%
Fractions de la voie alterne du complément : C3, C4, CH50 : normaux
Cas clinique N°1
2. Quel diagnostic suspectez-vous ? Pourquoi ?
. PTT héréditaire (syndrome d’Upshaw-Schulman)
. Tableau clinique évocateur : ictère néonatal + anémie hémolytique mécanique
+ thrombopénie profonde sans contexte clinique particulier
. Consanguinité parentale
. Probable atteinte d’un frère ainé décédé (ischémie systémique)
. Forme acquise de PTT rarissime voire inexistante à cet âge
3. Quels examens biologiques complémentaires
demandez-vous ? Selon quel protocole ?
Cas clinique N°1
. Contrôle de l’effondrement de l’activité d’ADAMTS13 sur un 2ème
prélèvement (Attention : préciser au clinicien de prélever avant
l’initiation d’une plasmathérapie)
. Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : négatives
. Eventuellement : dosage de l’Antigène d’ADAMTS13
. Séquençage du gène d’ADAMTS13 : mutations bi-alléliques du
gène d’ADAMTS13
. Enquête familiale : phénotypique et génotypique
Cas clinique N°2
Une femme de 38 ans arrive aux urgences d’un centre hospitalier
pour asthénie, dyspnée, pétéchies diffuses et céphalées.
La NFS plaquettes retrouve une anémie à 8 g/dL avec 3% de
schizocytes et une thrombopénie à 15 giga/L. La fonction rénale est
normale. L’examen neurologique retrouve une discrète confusion
mentale. Les beta-hCG sont négatives.
La patiente n’a pas d’ATCD médical particulier et elle ne prend pas
de traitement. On retrouve la notion d’un lupus chez sa sœur.
2. Quel diagnostic suspectez-vous ? Quels examens biologiques complémentaires demandez-vous ?
. PTT acquis auto-immun idiopathique
. Bilan d’hémolyse : réticulocytes, coombs érythrocytaire, LDH, bilirubine C/NC,
Haptoglobine
. Mesure de l’activité d’ADAMTS13 : <10%
. Titrage des IgG anti-ADAMTS13 : 100 UI/ml
Cas clinique N°2
3. La patiente est traitée par plasmathérapie (EP) pendant
10 jours et entre en rémission clinique.
Le contrôle de l’activité d’ADAMTS13 à 6 mois en rémission
montre une activité toujours effondrée <10%.
Qu’en pensez-vous ?
Quelle attitude préconisez-vous ?
. Risque de rechute important dans les 2 premières années
. Surveillance biologique systématique tous les 3 mois (en dehors de tout
événement clinique intercurrent)
. Si l’activité d’ADAMTS13 reste <10% à 1 an, discuter avec les cliniciens du
CNR-MAT l’indication d’un traitement préventif des rechutes par Rituximab
Cas clinique N°2
A. Veyradier, M. Wolf, A. Stepanian, P. Coppo.
ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Willebrand.
EMC (Elsevier Masson SAS, Paris), Biologie Médicale, 90-20-0003-A, 2011
A.Veyradier, P. Coppo.
ADAMTS13, von Willebrand factor specific cleaving protease.
Med Sci (Paris) 2011 Dec; 27(12): 1097-1105.
Bibliographie