DFGSM3 - CM1 – 2012/2013
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DFGSM3 - CM1 – 2012/2013
Rôle des techniques spéciales dans:
-la démarche diagnostique
- l’évaluation du pronostic des maladies
- les choix thérapeutiques (notion de biomarqueur)Pr Laurence LAMANT
Service d’Anatomie et Cytologie Pathologiques
CHU PURPAN
UE Biopathologie Tissulaire
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie
- Biologie moléculaire in situ et non in situ
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie
- Biologie moléculaire in situ et non in situ
Ziehl
Perls
Fontana
Rouge Congo
PAS
PAS
Trich Masson
But ?1/Mettre en évidence des constituants particuliers dans les cellules ou dans la
matrice extracellulaire 2/Mettre en évidence des agents infectieux
Les colorations les plus courantes
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
Intêrét des colorations spéciales
dans la démarche diagnostique ?
Réaction de Ziehl: mycobactérie
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson
Collagène
Ziehl BAARGrocott Champignons, certains
parasites
Patient immunodéprimé, lésions des doigts et avant bras droit
Réaction de Ziehl: mycobactérie
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson
Collagène
Ziehl BAARGrocott Champignons, certains
parasites
Patient immunodéprimé, lésions des doigts et avant bras droit
Coloration du PAS: Candida Albicans
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson
Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
Cas cliniqueMme TIB…, 38 ans, atteinte d’une leucémie et ayant subi une greffe de moelle osseuse, présente une défaillance multiviscérale. Biopsie hépatique.
AspergillosePAS
Les colorations les plus courantes
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
Substances pathologiques: -par leur présence (agent pathogène)
Mr DA…Etienne né le 7/1/1955
• Renseignements cliniquesPatient consultant pour ascite et œdème des membres inférieurs. Examen biologique: augmentation discrète des transaminases
Hypothèses ?
• Insuffisance cardiaque (ou obstacle sus-hépatq)
• Insuffisance rénale, syndrome néphrotique• Cancer (mésothéliome, carcinose, CHC,
méta hépatique, cancer gynécologique si Femme…)
• Cirrhose (1ère étiologie en France)
Ascite
Mr DA…Etienne né le 7/1/1955
• Renseignements cliniquesPatient consultant pour ascite et œdème des membres inférieurs. Examen biologique: augmentation des transaminases
Biopsie hépatique
Mr DA…Etienne né le 7/1/1955
Diagnostic ?
Trichrome de Masson
CIRRHOSE
Trichrome de Masson Foie
Normal
Les colorations les plus courantes
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
Substances pathologiques: - par leur présence - par leur abondance (Subst. normales en quantité
anormale)
Les colorations les plus courantes
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
•Substances normales en situation attendue
Coloration du Bleu Alcian sur cellules caliciformes mucisécrétantes de la muqueuse intestinale
Coloration de Fontana sur naevus naevocellulaire
cutané
Peu utile !
Tissu sain
Tumeur maligne différenciée
d’origine glandulaire =
Adénocarcinome bien différencié
Tissu sain
Coloration peu utile !
Adénocarcinome bien
différencié
Tissu sain
Adénocarcinome bien
différencié
Tumeur maligne peu différenciée
Tissu sain
Adénocarcinome bien
différencié
Tumeur maligne peu différenciée
Coloration très utile !
Adénocarcinome peu différencié
S’agit-il d’une tumeur : Différencié
e Indifférenciée
Les deux Je ne sais
pas
POINTS
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
Carcinome malpighien
Adénocarcinome
Mélanome
LymphomeTumeurs malignes différenciées:
ressemblent au tissu normal dont elles
dérivent
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
Tumeurs malignes indifférenciées: pas de ressemblance avec
un tissu normal
Nécessité de colorations spéciales
?????
Adénocarcinome peu différencié
Fontana
Tumeur pulmonaire maligne peu différenciée
Métastase pulmonaire
d’un Mélanome
Les colorations les plus courantes
Coloration Principales substances colorées
PAS Glycogène, mucines neutres, champignons
Bleu Alcian Mucines acides
Rouge Congo Amylose
Perls Hémosidérine (fer ferrique)
Fontana-Masson Mélanine, lipofuscines
Trichrome de Masson Collagène
Ziehl BAAR
Grocott Champignons, certains parasites
Substances pathologiques: - par leur présence
- par leur abondance - par leur situation (Subst. « normales » en situation
anormale)
Mr RO…Damien né le 5/6/1938
• Renseignements cliniquesPatient ayant un antécédent de mélanome
Mélanine
Pas de Mélanine
Mr RO…Damien né le 5/6/1938
• Renseignements cliniquesPatient ayant un antécédent de mélanome. Consulte pour des troubles du transit amenant à une coloscopie qui met en évidence une lésion polypoïde suspecte. Biopsie sous endoscopie:
Adénocarcinome colique bien différencié
Coloration du Bleu Alcian, inutile dans
ce contexte
Mr RO…Damien né le 5/6/1938• Renseignements cliniques
Patient ayant un antécédent de mélanome. Consulte pour des troubles du transit amenant à une coloscopie qui met en évidence qui met en évidence une lésion polypoïde suspecte. Biopsie : adénocarcinome colique bien différencié
Biopsie hépatique d’une de ces lésions
Pourquoi ?
Métastase du mélanome ou du carcinome colique ?
Traitement totalement différent
Bilan d’extension (TDM)
Autre lésion (bénigne, maligne…)?
Examen microscopiqueLa carotte biopsique adressée qui mesure 20 mm montre un parenchyme
hépatique dont l’architecture normale est détruite par une prolifération tumorale. Elle est constituée d’amas cellulaires sans architecture particulière. Les cellules sont atypiques, fréquemment en mitose.
Foie normal péritumoral
Nodule
Tumeur maligne peudifférenciée/indifférenciée
Foie normal péritumoral
Comment aller plus loin ?
Pas de glandePas de mélanine
HEHE Pas de kératine
Métastase du mélanome ou du carcinome colique ?
Autre tumeur ?
PEAU
COLON
Foie
Discrets dépôts de Mélanine
invisibles sur HE? Présence d’une mucisécrétion?
Métastase du mélanome ou du carcinome colique?
Examen microscopiqueLa carotte biopsique adressée qui mesure 20 mm montre un parenchyme
hépatique dont l’architecture normale est détruite par une prolifération tumorale. Elles est constituée d’amas cellulaires sans architecture particulière. Les cellules sont atypiques, fréquemment en mitoses. La coloration du Bleu Alcian met en évidence des vacuoles de sécrétion au sein de certaines cellules. La coloration de Fontana est négative.
Bleu Alcian
Métastase hépatique de l’adénocarcinome colique
Chimiothérapie adaptée à un adénocarcinome colique métastatique
• Renseignements cliniquesPatiente sans antécédent particulier qui a consulté pour épilepsie et chez qui est découverte une tumeur cérébrale unique. Exérèse. Tumeur primitive? Métastase?
Mme F.. Née en 1970
Pas de glandePas de mélaninePas de kératine
Examen microscopiqueIl s’agit d’un parenchyme cérébral siège d’une prolifération tumorale maligne
d’architecture diffuse, ne formant pas de structure glandulaire, sans pigment identifiable sur la coloration de routine. Pas de signe de kératinisation. Les cellules sont très atypiques, fréquemment en mitoses. Les caractéristiques de cette tumeur n’évoquent pas une tumeur primitive. Cependant, la coloration du Bleu Alcian ne met pas en évidence de vacuoles de sécrétion; La coloration de Fontana ne met pas en évidence de mélanine.
Bleu Alcian
Diagnostic ???Tumeur primitive : non
(sur la base de son aspect cytologique,de sa bonne limitation)
Lymphome cérébral?
Autre tumeur:
Métastase de carcinome, mélanome, sarcome ?
Conservation d’antigènes des
lignées lymphoïdes, épithéliales,
conjonctives ou mélanocytaires ??Outil?
Immunohistochimie
Comment aller plus loin ??
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques
- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie- Biologie moléculaire in situ et non in situ
Immunohistochimie
1 = Antigène2 = Anticorps primaire3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase (DAB)
• Principe ?
Exemple de l’IHC
immunoenzymatique indirecte
Immunohistochimie
1 = Antigène2 = Anticorps primaire3 = Anticorps secondaire couplé au complexe avidine-biotine péroxydase 4 = Révélation par substrat de la peroxydase (DAB)
• Principe ?
Exemple de l’IHC
immunoenzymatique indirecte
Immunohistochimie • Principe général
Exemple de l’IHC
immunoenzymatique indirecte
Exemple de l’IHC
immunoenzymatique indirecte
Exemple de l’IHC
immunoenzymatique directe
Immunohistochimie • Objectif ?
Mettre en évidence des Ag intracellulaires ou
extracellulaires grâce à des Ac spécifiques
• Sur quel matériel ?
Immunohistochimie
• Coupes en congélation
• Coupes en paraffine (démasquage Ag)
• Examen cytologique
• Sur quel matériel ?
Immunohistochimie
• Coupes en congélation
• Coupes en paraffine (démasquage Ag)
• Examen cytologique
• Sur quel matériel ?
Immunohistochimie
• Coupes en congélation • Coupes en paraffine (démasquage Ag)
• Examen cytologique
Antigène cytoplasmique
HbS
Antigène nucléaire
Ki67
Antigène membranaire
erbB2
• Quels antigènes ?
• Avec quel mode de révélation ?
Immunohistochimie
• Immunoenzymatique (indirecte; peroxydase, PAL)
• Immunofluorescence (directe)
erbB2
Anti-IgG
Pemphigoïde bulleuse
Adénocarcinome sein
Coupes fixées
Coupes congelées
Coupes congelées
Coupes fixées
Immunohistochimie
Intérêt diagnostique
Intérêt
pronostique
Intérêt thérapeutique
S’agit-il d’une tumeur : Différencié
e Indifférenciée
Les deux Je ne sais
pas
POINTS
Intérêt
diagnostiqueDiagnostic des tumeurs indifférenciées
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
Tumeurs malignes indifférenciées: pas de ressemblance avec
un tissu normal
Nécessité de colorations spéciales Bleu Alcian
+Adénocarcinome peu différencié
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
S’agit-il d’une tumeur :
Différenciée
Indifférenciée
Les deux
Je ne sais pas
Tumeurs malignes indifférenciées: pas de ressemblance avec
un tissu normal
Nécessité de colorations spéciales
Si négatives…
Bleu Alcian -Fontana -
Tumeur maligne indifférenciée
IHC
Tumeurs
Anti-CK Anti-LCA (CD45)
Anti-PS100
Carcinome
Lymphome
Mélanome
…
Tumeurs
Anti-CK Anti-LCA (CD45)
Anti-PS100
Carcinome
+ - -
Lymphome
- + -
Mélanome
- - +
…
Tumeur cérébrale
Mélanome?
Carcinome?
Lymphome?
IHC
Colorations négatives, non contributives
Ac anti-CD45
Ac anti-CK
Ac anti-PS100
• Colorations spéciales négatives• Anti-CD45 –• Anti-CK –• Anti-PS100 +
Métastase cérébrale d’un mélanome
H&E
Tumeurs Anti-CK Anti-LCA (CD45)
Anti-PS100
Carcinome + - -
Lymphome - + -
Mélanome
- - +
Anti-CD45 Anti-CK Anti-PS100
H&E Ganglion médiastinal
Mélanome?
Carcinome?
Lymphome?
Ac anti-CD45
Ac anti-CK
• Colorations spéciales négatives• Anti-CD45 –• Anti-CK +
Métastase ganglionnaire d’un carcinome peu différencié
Anti-CD45 Anti-CKH&E
Tumeurs Anti-CK Anti-LCA (CD45)
Anti-PS100
Carcinome
+ - -
Lymphome - + -
Mélanome - - +
Ag HbS
Intérêt
diagnostiqueMise en évidence d’agents pathogènes
Intérêt
diagnostiqueMise en évid. de cellules tumorales rares
Recherche de micrométastase non décelable sur H&E, par immunohistochimie avec anti-
PS100, dans un ganglion chez un patient atteint d’un mélanome
Homme 75 ans
Métastase osseuse
Intérêt
diagnostiqueMise en évid de produits spécif de tumeur
Métastase osseuse d’un adénocarcinome
Diagnostic ?
Intérêt
diagnostique
Anti-PSA
Diagnostic ?
Métastase osseuse d’un adénocarcinome PROSTATIQUE
Ganglion normalCryptes normales
Tumeur avec faible index de prolifération
Tumeur avec fort index de prolifération
Meilleur pronostic
Intérêt
pronostiqueProlifération cellulaire (Ag Ki67) Oncogènes
Intérêt
thérapeutiqueMise en évidence de cibles thérapeutiques
» * RE dans le cancer du sein» * ErbB2 dans le cancer du sein
Adénocarcinome du sein
H&E
Anti-oestrogènes (Tamoxifène)
Ac humanisé anti-ErbB2: Herceptine
ErbB2
Facteurs prédictifs de réponse
thérapeutique
RE
Ac humanisé anti-ErbB2: Herceptine
ErbB2
Immunohistochimie
CISH
Biologie moléculaire
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques
- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie
- Biologie moléculaire - Hybridation in situ
- PCR (non in situ)
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques
- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie
- Biologie moléculaire - Hybridation in situ
- PCR (non in situ)
• Hybridation in situ
-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en
congélation• Sondes froides (= non radio-actives)
• Chromogéniques (CISH)
• Fluorescentes (FISH)
-Applications • Détection d’amplification génique, de translocations chromosomiques • Détection du génome de certains virus
Gène HER2 non amplifié
Gène HER2 amplifié
Adénocarcinome
mammaire
?????
Chr 17
Her2 Intérêt
thérapeutique
Biologie moléculaire• Hybridation in situ
-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en congélation• Sondes froides (= non radio-actives)
• Chromogéniques (CISH)• Fluorescentes (FISH)
-Applications • Détection d’amplification génique, de
translocations chromosomiques
• Détection du génome de certains virus
Détection par FISH d’une fusion entre
deux gènes
Gène A Gène B
Gène de fusion
Classification OMS Translocation Gènes impliqués Fréquence (%)Intérêt diagnostique
Intérêt pronostique
Biologie moléculaire• Hybridation in situ
-Techniques• Coupes en paraffine ou coupes en congélation• Sondes froides (= non radio-actives)
• Chromogéniques (CISH)• Fluorescentes (FISH)
-Applications • Détection d’amplification génique, de
translocations chromosomiques
• Détection du génome de certains virus
Sonde anti-HPV (chromogénique)
Intérêt diagnostique
Techniques spéciales
- Colorations histochimiques
- Histoenzymologie
- Microscopie électronique
- Immunohistochimie
- Biologie moléculaire - Hybridation in situ
- PCR (non in situ)
Anomalies géniques
-Translocations chromosomiques
Applications en anatomie pathologique
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
Gène de fusion
Amorce A
Amorce B
Anomalies géniques
-Translocations chromosomiques
-Mutations
Applications en anatomie pathologique
• PCR (Polymerase Chain Reaction)
MutationEx: Cancer colorectal métastatique
Surexpression d’un récepteur transmembranaire à activité
TK : EGFR, dans de nombreuses tumeurs solides dont le cancer colorectal, impliqué dans la prolifération cellulaire
EGFR: potentielle cible thérapeutique dans le cancer colorectal
Gène KRAS
KRAS muté: inutile de
prescrire des anti-EGFR
Intérêt thérapeutique
Notion de biomarqueurs
• Définition: caractéristique mesurée objectivement (cad avec une précision et une reproductibilité suffisantes) et évaluée comme indicateur de processus physiologiques ou pathologiques ou de l’action d’un médicament
Notion de biomarqueurs
• Intérêt en biologie médicale: * En prévention pour identifier ou calculer
un risque ou une prédisposition pathologique
Notion de biomarqueurs
• Intérêt en biologie médicale: * En prévention pour identifier ou calculer
un risque ou une prédisposition pathologique
* Pour diagnostiquer une maladie dans une population
Notion de biomarqueurs
• Intérêt en biologie médicale: * En prévention pour identifier ou calculer
un risque ou une prédisposition pathologique
* Pour diagnostiquer une maladie dans une population
* Orienter un traitement et en assurer le suivi, mesurer la réponse au traitement, adapter la stratégie thérapeutique
• Protéines sériques (biologie hors anapath)
PSA et ADK prostate (dépistage, diagnostic, suivi, rechute)
Notion de biomarqueurs
• Intérêt en biologie médicale: * En prévention pour identifier ou calculer
un risque ou une prédisposition pathologique
* Pour diagnostiquer une maladie dans une population
* Orienter un traitement et en assurer le suivi, mesurer la réponse au traitement, adapter la stratégie thérapeutique
• Protéines tissulaires, ARNm, gènes
• Protéines tissulaires (détectables par IHC)
Biopsie ganglionnaireLymphome
IHC anti-CD3 (marqueur T)
IHC anti-CD20 (marqueur B)
Lymphome B
Lymphome B
Anticorps anti-CD20
(Rituximab)
+
Chimiothérapie
conventionnelleAvant 1998
Lymphome
B
CD20Après 1998
Déplétion lymphocytes B
Mort des cellules CD20+
Biopsie ganglionnaireLymphome
I HC anti-CD3 (marqueur T)
I HC anti-CD20 (marqueur B)
Meilleur typage dulymphome
Lymphome B
Indication thérapeutique
Anticorps anti- CD20
Rituximab
La protéine CD20 est devenue
un biomarqueur
• I ntérêt en biologie médicale:* En prévention pour identifi er ou calculer un
risque ou une prédiposition pathologique
* Pour diagnostiquer une maladie dans une population
* Orienter un traitement et en assurer le suivi, mesurer la réponse au traitement, adapter la stratégie thérapeutique
• Protéines tissulaires (détectables par IHC)
* RE, HER2 dans adénocarcinome mammaire
IHC ErbB2
La protéine erbB2/HER2
est un biomarqueur
• I ntérêt en biologie médicale:* En prévention pour identifi er ou calculer un
risque ou une prédiposition pathologique
* Pour diagnostiquer une maladie dans une population
* Orienter un traitement et en assurer le suivi, mesurer la réponse au traitement, adapter la stratégie thérapeutique
• Gènes, ARNm (détectables par FISH, PCR)
CISH HER2
Le gène erbB2/HER2
est un biomarqueur
+/-Inhib. EGFR
Le gène KRAS est un
biomarqueur
IHCColorations
CISH/FISHH&E HIS PCR, …
Evolution de la discipline…
1852 1879 19841632 1990
Evolution de la discipline…
1852 1879 19841632 1990
I HCColorations CISH/FISHH&E HI S PCR, …I HCColorations CISH/FISHH&E HI S PCR, …
2012
Traitement à la carte des
tumeurs