Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
-
Upload
deviann-lopez -
Category
Documents
-
view
243 -
download
0
Transcript of Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
1/20
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
2/20
2
2.1 PENGERTIAN
Spektrofotometri merupakan salah satu jenis teknik dari spektroskopi yang
mempelajari tentang absorpsi dan emisi radiasi dari suatu senyawa. Radiasi tersebut
didasarkan atas gelombang elektromagnetik dengan kecepatan m/detik (Sudarmadji,
1996; Holme & Peck, 1998). Gelombang elektromagnetik tersebut dapat diketahui panjang
gelombangnya dari spektrum sinar yang dibiaskan. Spektrum-spektrum tersebut dibagi
menjadi dua yakni cahaya tampak dan cahaya tak tampak. Dengan adanya spektrum inilah,
maka dapat digunakan untuk menganalisa suatu senyawa atau mikrobia dalam dalam
sejumlah penelitian. Alat yang betindak untuk spektrofotometri disebut spektrofotometer
(Christian, 1994).
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukurabsorbansi dengan
cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu pada suatu obyek kaca atau
kuarsa yang disebutkuvet. Sebagian dari cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan
dilewatkan. Nilai absorbansi daricahaya yang dilewatkan akan sebanding dengan
konsentrasi larutan di dalamkuvet.
2.2 JENISJENIS SPEKTROFOTOMETRI
Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan.
Diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Spektrofotometer Vis (Visible)
2. Spektrofotometer UV (Ultra Violet)
3. Spektrofotometer UV-Vis
4. Spektrofotometer IR (Infra Red)
http://id.wikipedia.org/wiki/Absorbansihttp://id.wikipedia.org/wiki/Kuarsahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Cahayahttp://id.wikipedia.org/wiki/Konsentrasihttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://www.codecogs.com/eqnedit.php?latex=3/times%2010^{8}http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Konsentrasihttp://id.wikipedia.org/wiki/Cahayahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Kuvet&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Kuarsahttp://id.wikipedia.org/wiki/Absorbansi -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
3/20
3
1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis)
Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya
tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap
oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga
semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama
ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan
simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C)
dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilkii warna. Hal ini
menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk
sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan
reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus
betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk
senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat
berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat
dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru
menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar
konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometer UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy
hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan
daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogenhanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
4/20
4
Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua pertikel.
Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap
sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa
preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau
centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut
sempurna.
Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein
terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu
dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample
dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada
panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample
(Absorbansi tinggi), maka konsentrasi protein terlarut semakin besar. Spektrofotometri UV
memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian
preparasi sample.
Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi darisenyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini
berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar
sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk
sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan.
Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk
sample tak berwarna.
4. Spektrofotometer IR (Infra Red)
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
5/20
5
Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometer ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah
dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan
pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektro IR meskipun
bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif.
Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa,
terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan
adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap
panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal
standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni.
Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva
yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry
(NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan
baku yang bersifat rutin dan cepat.
2.3 BAGIAN ATAU KOMPONEN SPEKTROFOTOMETER
Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu :
a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah memiliki pancaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak,
ultraviolet dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat rambut
terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa, daerah
panjang gelombang (l ) adalah 3502200 nanometer (nm).
b.
Monokromator
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
6/20
6
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis
menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda
(terdispersi).
c.
Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan sebagai tempat contoh atau
cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet biasanya terbuat dari kwars, plexigalass, kaca, plastic
dengan bentuk tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada pengukuran di
daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass, sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat
dipakai sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk
pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d.
Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai
panjang gelombang. Detektor akan mengubah cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya
akan ditampilkan oleh penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk menentukan
konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Spektrofotometer akanmengukur intensitas cahaya melewati sampel (I), dan membandingkan ke intensitas cahaya
sebelum melewati sampel (Io). Rasio disebut transmittance, dan biasanya dinyatakan dalam
persentase (% T) sehingga bisa dihitung besar absorban (A) dengan rumus A = -log %T.
2.4 PRINSIP KERJA SPEKTROFOTOMETER
Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang
gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1
menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh
prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut
akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya
menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut (Campbell et
al., 2011).
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
7/20
7
Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer (Campbell et al., 2011).
Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun
secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang
mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum
Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus
dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai
absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan
persamaan:
A = b c
A = Absorban
= koefisien ekstingsi molar
b = tebal larutan (kuvet)
c = konsentrasi larutan
Tipe-tipe SpektrofotometerPada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer,
yaitu
1. Single-beam instrument
Single-beam instrument
dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukurabsorbansi pada panjang gelombangtunggal.
Single-beam instrument
mempunyai beberapakeuntungan yaitu sederhana, harganya
murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakankeuntungan yang nyata. Beberapa
instrumen menghasilkansingle-beam instrument
untuk pengukuran sinar ultra violet dan
http://2.bp.blogspot.com/-8vSdKK8p2wg/UDDFS5ZoKbI/AAAAAAAABPc/iNSEPYzvuvM/s1600/spektrofotometer.jpg -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
8/20
8
sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190sampai 210 nm dan paling tinggi
adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).
2. Dou ble-beam i nst ru m ent
Double-beam
dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.Double-beaminstrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan
cerminyang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan
blangko dansinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang
keluarmenjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh
alat pembaca (Skoog, DA, 1996).
2.5 KALIBRASI ALAT SPEKTROFOTOMETER
Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelumdigunakan untuk analisis. Secara umum sbb:
1.
Nyalakan alat spektrofotometer
2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)
3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.
4.
->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur
saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.
5.
Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer
6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam
bentuk teks)
Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang
Hal-hal yang harus diperhatikan :
http://4.bp.blogspot.com/_F2K3be_pU9E/TTfZu7o_SCI/AAAAAAAAADI/zg2Ucycc3h0/s1600/Picture0004.jpg -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
9/20
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
10/20
10
Prosedur Kerja
1. Pembuatan Kurva Standar
http://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/screenshot_4.png -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
11/20
11
2. Penentuan Kadar Vitamin C
3. Data dan perhitungan
http://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/perhitungan.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/kadar.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/perhitungan.pnghttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/kadar.png -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
12/20
12
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisiskualitatif dari suatu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi
juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik
seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi
senyawa murni skala kecil.Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang
dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan
pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT
adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat
dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai
jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh
pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0
A. Fungsi Kromatografi Lapis Tipis
http://www.facebook.com/pages/w/107511932611897http://id.wikipedia.org/wiki/Kualitatifhttp://id.wikipedia.org/wiki/Sampelhttp://himka1polban.files.wordpress.com/2013/11/ppm.pnghttp://id.wikipedia.org/wiki/Sampelhttp://id.wikipedia.org/wiki/Kualitatifhttp://www.facebook.com/pages/w/107511932611897 -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
13/20
13
Digunakan untuk tujuan analitik
Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau
pemadaman fluoresensi, radiasi UV
Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) ataudengan cara elusi 2 dimensi
Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan
merupakan noda yang tidak bergerak
Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor) yang dalam
penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar
Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi
dalam pelarutnya)B. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel
denganpelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakanfase diam dari bentukplat
silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau
campuran larutan yang digunakan dinamakaneluen.Semakin dekat kepolaran antara sampel
dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Visualisasi
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi.Tahapan ini
sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat
karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji.Salah satu yang dipakai
adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin.Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)
adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila
pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.
Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.
Nilai Rf
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu
perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama
walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini
digunakan sebagai nilaiperbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat
retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktorretensi.
Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :
http://www.facebook.com/pages/w/105649302803388http://id.wikipedia.org/wiki/Fasehttp://id.wikipedia.org/wiki/Plathttp://id.wikipedia.org/wiki/Silikahttp://id.wikipedia.org/wiki/Eluenhttp://www.facebook.com/pages/w/109344559092075http://id.wikipedia.org/wiki/Keterampilanhttp://id.wikipedia.org/wiki/Metodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Tepathttp://id.wikipedia.org/wiki/Ujihttp://www.facebook.com/pages/w/112411485441121http://id.wikipedia.org/wiki/Ninhidrinhttp://id.wikipedia.org/wiki/Gugushttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Relatif&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Perbandingan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Retensi&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Retensi&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Perbandingan&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Relatif&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Gugushttp://id.wikipedia.org/wiki/Ninhidrinhttp://www.facebook.com/pages/w/112411485441121http://id.wikipedia.org/wiki/Ujihttp://id.wikipedia.org/wiki/Tepathttp://id.wikipedia.org/wiki/Metodehttp://id.wikipedia.org/wiki/Keterampilanhttp://www.facebook.com/pages/w/109344559092075http://id.wikipedia.org/wiki/Eluenhttp://id.wikipedia.org/wiki/Silikahttp://id.wikipedia.org/wiki/Plathttp://id.wikipedia.org/wiki/Fasehttp://www.facebook.com/pages/w/105649302803388 -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
14/20
14
Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut padaplat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di
bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang
polar dan berinteraksi dengan adsorbentpolar dari plat kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dapat dijadikanbukti dalam mengidentifikasikansenyawa.Bila identifikasi nilai Rf
memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memilikikarakteristik yang
sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan
merupakan senyawa yang berbeda.
a. Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom
silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H
selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-
aluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang
kita sebutkan tentang jel silika kemudian digunakan serupa untuk alumina.
b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram
Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawa-
senyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung
pada:
Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul
senyawa dengan pelarut.
Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada baga imana besar
atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat
dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang
lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya.
Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam
http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Plat&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Polar&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bukti&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Karakteristik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Karakteristik&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/wiki/Senyawahttp://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Bukti&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Polar&action=edit&redlink=1http://id.wikipedia.org/w/index.php?title=Plat&action=edit&redlink=1 -
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
15/20
15
pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa
dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini
akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari
permukaan silika.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan
yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali
pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses
penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat
senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik
ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
C. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau
alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga
mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam
pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan
isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning
a. Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang
merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
16/20
16
Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis:
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis
di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan
tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa batas pelarut berada di bawah garis dimana posisi bercak berada.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh
dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari
campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini
akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
b. Perhitungan nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari
lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini
berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna
masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas
kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
17/20
17
Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah
menjadi:
nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf
untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi
pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah.
c. mengidentifikasi senyawa-senyawa
Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya. Caranya :
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil
yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan
yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang
sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam
amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas
dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang
terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan
bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui
posisi dan warnanya.
D. Kromatografi Lapis Tipis pada Substansi Tak Berwarna
a. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkansinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
18/20
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
19/20
19
Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke
fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis
yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin
penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral.
Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan
penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur
kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat,
mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah
antara 11-12 % b/b.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik
dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak.
Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.
2. Fase Gerak pada KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencoba-
coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknikyang sensitive
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara
0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non
polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai
fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.
Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi
solut-solut yang bersifat basa dan asam.
3. Aplikasi (Penotolan) sampel
-
8/10/2019 Deviannistia suyonoputri spektrofotometri
20/20
20
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana
dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan
menurunkan resolusi.