L'acqua è un elettrolita H 2 O H + + OH - 2 H 2 O H 3 O + + OH - K w = [H 3 O + ][OH - ] = 10 -14.
Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e...
Transcript of Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e...
Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A e tossine di Fusarium in cereali
mediante purificazione su colonnine ad mediante purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi anticorpo e LC-MS/MS
V.M.T. Lattanzio, M. Solfrizzo, S. Della Gatta, S. Powers, A. Visconti
Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR)Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari (ISPA), BARI
Mycotoxin Total Cereal products
Cocoa, coffee,
tea
Dietetic food and
food supplements
Feed for food-
producing animals
Fruit and vegetables
Herbs and
spices
Nuts, nut
products and
seeds
Other food
product/mixed
Pet food Wine
Aflatoxins 902 46 11 103 26 710 3 3
Deoxynivalenol 4 4
RASFF RASFF Report Report AnnualeAnnuale 20082008NumeroNumero didi NotificheNotifiche
Deoxynivalenol 4 4
Fumonisins 2 1 1
Ochratoxin A 20 3 6 2 5 3 1
Zearalenone 2 2
Patulin 3 1 2
EC regulations EC regulations 1881/2006 and 1126/2007::
Limiti massimi ammissibili di micotossineLimiti massimi ammissibili di micotossinein cerealiin cereali
DeossinivalenoloDeossinivalenolo 1750 µg/kg mais – frumento duro - avena1250 µg/kg altri cereali
AflatossineAflatossine 2 µg/kg AFB1, 4 µg/kg somma di B1, B2, G1, G2
SvulippoSvulippo e validazione e validazione di nuove metodiche analitiche di nuove metodiche analitiche
FumonisineFumonisine 4000 µg/kg mais
ZearalenoneZearalenone 350 µg/kg mais100 µg/kg altri cereali
OchratossinaOchratossina AA 5 µg/kg
TossineTossine TT--2 e HT2 e HT--2 2 In discussione
Analisi di singole classi di micotossineAnalisi di singole classi di micotossine
Differente natura chimica delle micotossine:- Polarita’- Assorbimento UV o in fluorescenza- Forma ionica (dipendente dal pH)
OCRATOSSINA A
NH
O
O
OH
Cl
O
CH3
C
OOH
ZEARALENONE
OH
O
O CH3
AFLATOSSINE
O O
O
O O
OH
DEOSSINIVALENOLO
O
OOH
CH3
CH2
CH3
OH
O
OH
TOSSINA T-2
O
O
H
OH
H
CH3H
Differenti concentrazioni target (da µg/kg a mg/kg)
Presenza in matrici diverse
Differenti strategie analitiche e di preparazione del campione
OH
O
H
OCOCH3CH3CH2
H3COCO
(H3C)2HCH2COCO
H
FUMONISINE
CH3CH3
CH3
OH
CH3NH2
OH
OH
OOH
OO OH
O
OOH
OO OH
O
LCLC--MS/MS => Analisi MultimicotossinaMS/MS => Analisi Multimicotossina
ðCo-extrazione di tutti gli analitið Purificazione delle differenti micotossine in un solo passaggioðRivelazione mediante una tecnica universale, con un ampio range di linearità
Punti chiave nello sviluppo di un metodo multi-micotossina:
ð Co-extrazione: acetonitrile/acqua/acido acetico 79:20:1ð Purificazione: analisi di estratti diluiti 1+1ðRivelazione: LC-ESI-MS/MS, API 4000 Qtrap
X
Determinazione simultanea di 39 micotossine Determinazione simultanea di 39 micotossine in estratti non purificati di frumento e maisin estratti non purificati di frumento e mais
ð Effetto Matrice (Aflatossine)ð Recuperi non accettabili (<60%) per alcune tossine (FumonisineFumonisine)
Sulyok M, Berthiller F, Krska R, Schuhmacher R. Development and validation of a liquid chromatography/tandem mass spectrometric method for the determination of 39 mycotoxins in wheat and maize. Rapid Commun Mass Spectrom.20(2006):2649-59
Sulyok M, Krska R, Schuhmacher R. A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method for the quantification of 87 analytes and its application to semi-quantitative screening of moldy food samples.Anal Bioanal Chem. 389(2007):1505-23.
ð Co-extrazione: acetonitrile/acqua 80:20metanolo/acqua 70:30 (fichi, uva passa)
ð Purificazione: analisi di estratti diluitið Rivelazione: LC-ESI-MS/MS (+)
X
Spanjer M, Rensen PM, Sholten JM. Food Addit. Contam. 25 (2008) 472-489
Determinazione simultanea di 33 micotossine in estratti non purificati di arachidi, pistacchi, frumento, mais, cornflakes, uva passa e fichi
ð Rivelazione: LC-ESI-MS/MS (+)X
ðRecuperi non accettabili per alcune micotossine:FB1 20% (RSDr 72%), FB2 46% (RSDr 8%) (slurry di mais)
ðEffetto Matrice Aflatossine fino a 53% soppressione ionicaTossine T2 e HT2 fino a 65% soppressione ionica (slurry di frumento)
ðBassa sensibilità per DON (ioni positivi)
UPLCUPLC--MS/MSMS/MSDeterminazioneDeterminazione simultaneasimultanea didi 17 17 micotossinemicotossine in in alimentialimenti e e mangimimangimi
ð Tempi di analisi ridottiðElevata sensibilità
(LOD <0.2 µg/kg)
ð Elevata risoluzione
Ren Y. et al. J. Chromatogr. A 1143 (2006) 48-64
ð Estrazione con acetonitrile/acqua 84:16
ESI (-) (1) NIV; (2) DON; (3) FX; (4) OTA; (5) 3-ADON; (6) 15-ADON; (10) ZON; (11) ZAN (IS)
ESI (+) (7) ATG2; (8) ATM1; (9) ATG1 (12) ATB2; (13) ATB1; (14) CTN; (15) HT-2; (16) T-2; (17) ZAN (IS); (18) SMC; (19) VCG.
ð2 corse cromatograficheESI(+) – ESI(-)Tempo totale < 10 min
acetonitrile/acqua 84:16ðSPE clean upFumonisine escluse!
ðCo-estrazione di tutti gli analitiAlte percentuali di metanolo o acetonitrile (> 75%)
Afs, OTA, ZEA, DON, T-2/HT-2Alte percentuali di acqua (50%) o basso pH
FumonisineðPreparazione del campione
PuntiPunti CriticiCritici nellonello svilupposviluppo didi un un metodometodo multimulti--micotossinamicotossina
Analisi di estratti diluitiPurificazione dell’estratto: SPE - IAC
(OASIS HLB: Sørensen et al. 2005, J. Chromatogr. B, 820:183
Lattanzio et al.2008, Food Addit. Contam. 25:320)
ðSeparazione cromatograficaðIonizzazione e riduzione dell’effetto matrice
Determinazione simultanea di aflatossine, ocratossina A,fumonisine, tricoteceni e zearalenone in cereali mediante LC-MS/MS
e purificazione su colonnine ad immunoaffinità
Lattanzio VMT, Solfrizzo M, Powers S, Visconti A Rapid Commun Mass Spectrom, 21 (2007) 3253-3261
2) Purificazione su colonnine ad immunoaffinità multi-anticorpo
1) Doppia Estrazione
Basata sull’uso di nuove colonnine ad immunoaffinità(VicamVicam,, MYCOMYCO66inin11TMTM) contenenti anticorpi peraflatossine, ocratossina A, fumonisine, deossinivalenolo,zearalenone, tossine T-2 e HT-2.
3) Rivelazione mediante LC-ESI-MS/MS
Campione (10 g)
Tampone fosfato (pH 7.4)50 mL, 60 min shaking
Aggiunta di Metanolo al pellet(metanolo/acqua ~ 70:30)
CentrifugazionePrelievo dell’estratto
Estratto Adeossinivalenolo,fumonisine,tossine (T-2) e HT-2
Preparazione del campione Preparazione del campione
Myco6in1TM
Clean up su colonnine a immunoaffinità
(metanolo/acqua ~ 70:30) 60 min shaking
CentrifugazionePrelievo dell’estratto
e diluizione Estratto Baflatossine, ocratossina, zearalenone
LC-ESI-MS/MS
Estratto A Estratto B
DESI
Q1 Q2 Q3
17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8Time, min
17.8 18.0 18.2 18.4 18.6 18.8 19.0 19.2 19.4 19.6 19.8Time, min
Ottimizzazione delle Condizioni MSOttimizzazione delle Condizioni MS
Selezione degli ioni precursori
[DON + CH3COO]- m/z 355.0 -
+
[DON + CH3COO]- m/z 355.0[AFG2 + H]+ m/z 331.1[AFG1 + H]+ m/z 329.1[AFB2 + H]+ m/z 315.0[AFB1 + H]+ m/z 313.2[HT2 + NH4]+ m/z 442.0[T2 + NH4]+ m/z 484.0[FB1 + H]+ m/z 722.0[FB2 + H]+ m/z 706.2[OTA + H]+ m/z 404.0[ZEA –H]- m/z 317.0
-
-
Polarity switching Buona Separazione Cromatografica
Fase Mobile:Metanolo/Acqua
0.5% acido acetico
1mM ammonio acetatoEluizione in Gradiente
FBs - OTA
T2-HT2-DON
x 3.0
(-) (+)(+) (-) (+)
DON
T-2
FB1
FB
ZEA100
Inte
nsity
, %
Cromatogramma (TIC) di un estratto di mais artificialmente contaminato con: 500 µg/kgDON; 2 µg/kg AFG2, AFB2; 6 µg/kg AFG1; 10 µg/kg AFB1; 500 µg/kg FB1; 250 µg/kg FB2;100 µg/kg HT-2, T-2, ZEA; 20 µg/kg OTA.
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min
AFG2
AFG1
AFB2
AFB1HT-2
T-2FB2
OTA
0
Inte
nsity
,
20% B
40% B
63% B
Colonna: Gemini RP18 (150 × 2.0 mm, 5 µm) PhenomenexFlusso: 200 µl/minColumn oven: 40 ºCSolv A: H2O, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH4Solv B: CH3OH, 0.5% acido acetico, 1mM AcNH4Volume iniettato: 20µl (100 mg matrice)
Livelli difortificazione
(µg/Kg)
Recupero, % (RSDr, n=3) Criteri CEN di accettabilità(EU regulation N. 401/2006)
MAIS FRUMENTO ORZO
DONDON 100 – 2000 64 (4) 95 (0.6) 60 (9) 100-500 µg/Kg Recupero 60-110%, RSDr ≤ 20> 500µg/Kg Recupero 70-120%, RSDr ≤ 20
AFGAFG22 0.4 – 8 103 (3) 95 (5) 90 (13)< 1 µg/Kg Recupero 50-112%,1-10 µg/Kg Recupero 70-110%AFGAFG11 1.2 – 24 88 (2) 90 (3) 87 (6)
Validazione del metodo: RECUPERI e RIPETIBILITA’Validazione del metodo: RECUPERI e RIPETIBILITA’
1-10 µg/Kg Recupero 70-110%> 10 µg/Kg Recupero 80-110%RSDr = 0.66 RSDR
AFBAFB22 0.4 – 8 97 (3) 101 (0.7) 83 (6)
AFBAFB11 2 – 4 92 (5) 88 (4) 84 (6)
FBFB11 100 – 2000 83 (8) - - ≤ 500µg/Kg Recupero 60-120%, RSDr ≤ 30> 500µg/Kg Recupero70-110%, RSDr ≤ 20
FBFB22 50 – 1000 74 (6) - -
HTHT--2+T2+T--2 (*)2 (*) 40 – 800 76 (4) 79 (2) 86 (11) 100-200 µg/Kg Recupero 60-130%, RSDr ≤ 40> 200 µg/Kg Recupero 60-130%, RSDr ≤ 30
ZEAZEA 20 – 400 94 (4) 79 (1) 88 (9) ≤ 50 µg/Kg Recupero 60-120%, RSDr ≤ 40> 50 µg/Kg Recupero 70-120%, RSDr ≤ 25
OTAOTA 4 – 80 94 (7) 99 (0.6) 91 (9) 1-10 µg/Kg Recupero 70-110%, RSDr ≤ 20
(*) Durante l’estrazione in PBS si verifica l’drolisi della tossina T-2 in HT-2, le due tossine sono quindi quantificate come somma.
Limite di Rivelabilità(µg/Kg)
Limiti massimi ammissibiliEC regulations 1126/2007, 1881/2006
MAIS FRUMENTO ORZO
DONDON 5.8 5.1 2.4 1750 µg/kg mais – frumento duro - orzo1250 µg/kg altri cereali
AFGAFG22 0.5 0.6 0.1
2 µg/kg AFB1, AFGAFG11 0.4 0.2 0.1
Validazione del metodo: LIMITI di RIVELABILITA’ (S/N=3)Validazione del metodo: LIMITI di RIVELABILITA’ (S/N=3)
2 µg/kg AFB1, 4 µg/kg somma di B1, B2, G1, G2
AFGAFG11 0.4 0.2 0.1
AFBAFB22 0.1 0.4 0.1
AFBAFB11 0.3 0.2 0.2
FBFB11 0.5 - -4000 µg/kg somma di FB1 + FB2 in mais
FBFB22 1.4 - -
HTHT--2+T2+T--22 1.4 1.1 0.6 In discussione
ZEAZEA 0.7 1.2 0.8 350 µg/kg mais100 µg/kg altri cereali
OTAOTA 0.2 0.2 0.2 5 µg/kg
Cromatogramma (TIC) di un campione di MAIS naturalmente contaminato da5 µg/kg DON, 72 µg/kg FB1, 16 µg/kg FB2, 0.5 µg/kg ZEA e 0.3 µg/Kg OTA.
FB172 µg/kg
FB216 µg/kg
100
%
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min
x 5.0DON
5 µg/kg
ZEA0.5 µg/kg
OTA0.3 µg/kg
0
Inte
nsit
y, %
Cromatogramma (TIC) di un campione di FRUMENTO naturalmentecontaminato da 2.4 µg/kg DON, 55.2 µg/kg HT-2+T-2, 7.4 µg/kg ZEA e 1.6µg/kg OTA.
100 HT-2*55.2 µg/kg ZEA
7.4 µg/kg
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55Time, min
0
% DON2.4 µg/kg
OTA1.6 µg/kg
* Somma di T-2 + HT-2
Effetto matriceEffetto matrice
Fase mobile HPLC
Estratto di mais purificato su colonnine a immunoaffinità
Rette di calibrazione ottenute solubilizzando le tossine standard in
DONDON
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
25 50 75 100 125 150
injected ng
Valutazione della significatività della differenza di pendenzatra retta di calibrazione in fase mobile e in matrice
t-Test (p = 0.05, n = 6, t value = 2.4)
MAIS FRUMENTO ORZO
DONDON -0.3 0.3 -0.1
Soppressione ionica
No effetto matrice
AFBAFB11
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0
injected ng
10000
20000
30000
40000
50000
60000
AFGAFG11 -6.2 2.2 2.0
AFBAFB11 -15.0 0.2 -0.4
FBFB11 0.3 - -
FBFB22 -1.6 - -
HTHT--22 -0.5 0.6 0.6
TT--22 -0.8 0.6 1.0
ZEAZEA -1.0 0.0 -6.8
OTAOTA -2.6 0.8 -0.6
MAIS Campione 1µg/kg
MAIS Campione 2µg/kg
Metodo utilizzato per l’analisidelle singole tossine
Multi tossina
Singolatossina
Multi tossina
Singolatossina
DONDON 121 122 30 22 MacDonald et al., 2005, J AOAC(IAC-HPLC/UV)
FBFB11 488 510 114 99 Sydenham et al, 1996, J. AOAC (SAX-HPLC/FD)
FBFB 144 138 42 29
CONFRONTO con METODICHE VALIDATECONFRONTO con METODICHE VALIDATE
FBFB22 144 138 42 29
HTHT--22 17 8 9 6.3Visconti et al, 2005, J. Chromatogr. A (IAC-HPLC/FD)
TT--22 - 6 - 5.9
ZEAZEA 95 80 132 142MacDonald et al., 2005, J AOAC(IAC-HPLC/FD)
AFsAFs nd nd nd ndTrucksess et al., 1991, JAOAC(IAC-HPLC/FD)
OTAOTA nd na nd na
ü E’ stato sviluppato un metodo sensibile, accurato e preciso per la determinazionesimultanea di aflatossine (B1, B2, G1, G2), fumonisine (B1, B2), ocratossina A, tricoteceni(DON, HT-2, T-2) e zeralenone in cereali, mediante LC-ESI-MS/MS.
ü La co-estrazione quantitativa di tutte le 11 micotossine è stata ottenuta mediante dueestrazioni sequenziali con PBS e metanolo/acqua (70:30).
ü Per la purificazione degli estratti sono state testate nuove colonnine a immunoaffinitàmulti-anticorpo:
CONCLUSIONICONCLUSIONI
- La purificazione su colonnine a immunoaffinità riduce l’effetto matrice o lo elimina del tutto.- La calibrazione in matrice o l’utilizzo di standard marcati con isotopo 13C12 rimangono necessari per unadeterminazione quantitatica accurata.- La purificazione e pre-concentrazione del campione consentono di ottenere sensibilità elevata anchecon strumentazione di medio costo.
üAccuratezza e ripetibilità conformi ai criteri stabiliti dal CEN (Regolamento EC No 401/2006)
üBuon accordo tra i risultati ottenuti con il metodo proposto e quelli ottenuti con metodivalidati per l’analisi di singole tossine.