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Detectores en cromatografía de líquidos (espectrométricos, fluorescencia, refractómetro, dispersión de luz)
1. Introducción 1 2. Detectores 2
2.1 Características generales de un detector 3 3. Detectores en cromatografía de líquidos. Clasificación 4 4. Detectores espectrométricos
4.1 Detector UV-‐Vis 5 4.2 Detector UV onda fija 5 4.3 Detector onda variable 7 4.4 Detector de ordenamiento de diodos 7
5. Detector de fluorescencia 8 6. Detector de índice de refracción 10
6.1 Detector IR-‐Fresnel 11 6.2 Detector de deflexión 11 6.3 Detector interferométrico 11
7. Detector de dispersión de luz 12 8. Incertidumbre en los detectores IR, UV, Fluorescencia 13 9. Sistema de toma y procesamiento de datos 13 10. Aplicaciones. Artículo 14 11. Conclusiones 17 12. Bibliografía 17 1. Introducción El detector es el módulo del cromatógrafo de líquidos, situado a la salida de la columna, que proporcionna de forma continua información acerca de la composición del flujo que circula a través de él. Generalmente origina una señal eléctrica continua, que debidamente amplificada y registrada, constituye el denominado cromatograma, del que se extrae información cuantitativa y cualitativa de la muestra inyectada. La existencia de un detector on-‐line eleva a la categoría de instrumento al cromatógrafo de líquidos.
Uno de los factores que han influido en el retraso del desarrollo de la cromatografía de líquidos con respecto a la cromatografía de gases está relacionado con el sistema de detección. Las concentraciones bajas de un soluto no modifican sustancialmente las características físicas de la porción de fase móvil que lo contiene (por ejemplo densidad, constante dieléctrica etc.) y son indistinguibles respecto a variaciones producidas por el caudal y la temperatura, mientras que en cromatografía de gases pequeñas concentraciones de un vapor en un gas modifican críticamente las propiedades del mismo. No existe en la actualidad un detector en cromatografía de líquidos equivalente al detector de ionización de llama en cromatografía de gases. Otra diferencia importante entre los sistemas de detección usandos en líquidos y gases consiste en que se trata de adaptaciones a la situación dinámica de principios instrumentales ampliamente desarrollados en
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instrumentos (fotómetros, fluorímetros, polarógrafos etc.) mediante el empleo de celdas de flujo, mientras que los empleados en cromatografía de gases tienen en general una concepción y diseño distintos a los instrumentos convencionales. Un aspecto a resaltar es la tendencia a incorporar sistemas de detección continua tal es el caso como el espectrómetro de masas, RMN, técnicas espectroscópicas atómicas, etc. 2. Detectores El detector es la parte del equipo cromatográfico que permite “ver” y ubicar en tiempo y espacio la posición de cada componente de una muestra a la salida de la columna cromatográfica. Se trata del módulo del cromatógrafo de líquidos, situado a la salida de la columna, que proporciona información de forma continua acerca de la composición del flujo que circula a través de él.
Fig 1. Producción de artículos de cromatografía de líquidos con diferentes detectores (gráfico obtenido por medio de la base de datos www.scopus.com)
Dependiendo del propósito final de la cromatografía se habla de cromatografía analítica cuando solo se pretende conocer y cuantificar los componentes de una muestra. En cambio, se habla de cromatografía preparativa cuando la técnica aplicada permite, además de conocer y cuantificar los componentes de la muestra, separarlos físicamente. La modalidad preparativa no permite el uso de detectores destructivos, mientras que estos están permitidos en la modalidad analítica (Sogorb Sánchez et. al 2004).
A diferencia de la cromatografía de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de flama y de conductividad eléctrica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. En la fig. 1 se muestra el incremento con respecto al tiempo de publicaciones que utilizan algunos detectores comúnmente utilizados en cromatografía de líquidos. 2.1 Características generales de un detector
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1976 1980 1984 1988 1992 1996 2000 2004 2008 2012
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ero de
pub
licacione
s
Año de publicación
Detección UV
Detección fluorescencia
Detección Índice de refracción
Detección dispersión de luz
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Las características ideales que debe poseer un detector continuo empleado para HPLC se resume a continuación:
§ Adecuada sensibilidad. Aquello que constituye una adecuada sensibilidad no puede evaluarse de forma cuantitativa. Aunque todos se utilizan extensamente y son adecuados en ciertos casos, sin embargo, los menos sensibles no resultan convenientes para algunas aplicaciones. En general, las sensibilidades de los detectores se encuentran en el intervalo de 10-‐15 a 10-‐8 g de soluto/s.
§ Buena estabilidad y reproducibilidad § Respuesta lineal para los solutos que se extienda a varios órdenes de magnitud § Tiempo de respuesta corto que sea independiente del caudal § Alta fiabilidad y manejo sencillo. Hasta el punto de que el detector debería estar a prueba
de la impericia de operadores inexpertos § Respuesta semejante para todos los solutos, por el contrario, una respuesta selectiva y
altamente predecible para uno o más tipo de solutos § Volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de la banda y no es
necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas, como es el caso de los detectores para cromatografía de gases.
§ Insensible a cambios ambientales: presión, caudal, temperatura, etc. Es importante también que sea insensible al cambio de composición de la fase móvil en la modalidad no isocrática
§ Operación continua durante largo tiempo y su empleo debe ser fácil y cómodo para el analista
§ Automatización. Su funcionamiento debe ser asequible a la automatización para incorporarlo a los instumentos CLAR comandados por un único microprocesador.
Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector debe ser menor que el 20%
del volumen de la banda cromatografica. Las burbujas que puedan existir en el detector producen ruido, y por eso se debe aplicar una contrapresión al detector, para impedir que se formen durante la despresurización del eluyente (Harris, Daniel C. 2001).
Los errores más comunes que surgen de la detección se refieren a la falta de estabilidad, sensibilidad o linealidad. Estos problemas son poco frecuentes con los detectores UV debido a la simplicidad de la detección ultravioleta y al desarrollo que los mismos han experimentado. A pesar de ello, estos factores deben estudiarse adecuadamente, especialmente si se desean analizar trazas. La linealidad, o rango lineal, es una condición imprescindible en todo método cuantitativo en el cual se calcula la concentración de analito en la muestra comparándola con un solo estándar.
En general la falta de linealidad se soluciona reduciendo la masa de soluto inyectado. Sin embargo, es posible operar con sistemas no lineales siempre y cuando se utilice una curva de calibración como referencia cada vez que se realice el análisis.
3. Detectores en cromatografía de líquidos. Clasificación
Los detectores en cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Una serie de clasificaciones de los detectores según diferentes criterios y aspectos de la detección se encuentra en la tabla 1. La distinción generalmente más empleada diferencia dos grupos de detectores, los que se basan en la medida de una propiedad de la disolución responden a una propiedad del efluente, tal como el índice de refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto
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responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente límite, que no son inherentes a la fase móvil.
Los principales detectores a tener en cuenta en cromatografía de líquidos se muestran en la tabla 2, de los cuales los detectores ultravioleta-‐visible, fluorescencia, índice de refracción y electroquímicos son los más comunes. En la mayoría de los métodos relacionados con HPLC el detector utilizado es el detector de absorbancia UV-‐Vis de longitud de onda variable o de diodos (DAD). Este hecho se debe a que éste detector, tiene la mejor combinación de sensibilidad, versatilidad y fiabilidad.. Sin embargo en el caso de especiación orgranometálica, se pueden emplear distintas técnicas espectrométricas atómicas como detectores y en muchas ocasiones se utilizan técnicas de derivatización para aumentar el grado de detectabilidad en absorción en UV-‐Vis, fluorescencia o electroquímcia (Reyes & Walton, 2003)
Tabla 1. Clasificación de los detectores empleados en cromatografía de líquidos .
Según el tipo de medida Absoluta (Solute property) Relativa (Bulk property)
Según propiedad general del soluto Detectores de concentración Detectores de masa
Según generalidad de la respuesta Universal Selectivo
Según el tipo de salida de señal Normal Integral
Diferencial
Tabla 2. Detectores más comunes en HPLC
Espectrométricos
Detector de absorción UV-‐Vis Detector de longitud de onda fija UV Detector de onda variable UV Detector de fotodiodos en serie (DAD)
Detector de fluorescencia Detector de espectrometría de masas
Electroquímicos Detector electroquímico (ECD) Detector amperométrico Detector potenciométirco Detector culombimétrico Detector conductimétrico
Otros Detector de índice de refracción
Detector de dispersión de luz
También uno de los detectores más populares de todos es el detector de absorción UV-‐Vis, aunque su uso esta limitado porque no es un detector universal. Por el contrario, el detector de espectrometría de masas si es universal por lo que se está utilizando cada vez más aunque todavía es caro su mantenimiento. Del detector utilizado dependen la exactitud, la precisión y el límite de detección conseguidos en la separación de distintos componentes (Gómez. & Valcárcel, 1988).
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4. Detectores espectrométricos La detección en cromatografía de líquidos en su mayoría se lleva acabo en celdas de flujo en forma de “Z”. La miniaturización de la celda de flujo de detección, en HPLC, disminuye el volumen interno, lo que implica que disminuye la dispersión de los analitos y favorece el estrechamiento de las zonas en que se encuentran una vez separados: los picos cromatográficos son más estrechos y menos solapados entre sí (Valcárcel & Cárdenas, 2000). En su mayoría los detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la celda de flujo y el otro a través de un filtro. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representación del logaritmo del cociente de las dos señales detectadas en función del tiempo (Skoog, 2001). 4.1 Detector UV-‐Vis Es el detector más empleado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal, y permite detectar analitos en el orden de los nanogramos. No es destructivo y puede emplearse con gradiente de disolventes, con la única limitación de que éstos sean transparentes en la longitud de trabajo (Skoog, 2001). En general permiten cambiar el volumen de su celda, típicamente con volúmenes de 1 a 12 mL. Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y de temperatura. El detector UV opera en el rango de 190 a 350 nm, y suele extenderse a la zona visible del espectro 350-‐700 nm recibiendo así el nombre de detector UV-‐Vis. La concentración del analito en la muestra se determina por la aplicación de la ley de Beer A=abc, donde A es la absorbancia, a es la absortividad molar del analito, b es el camino óptico de la celda medido en cm y c es la concentración del analito en la muestra expresado en mol/L.
Existen dos tipos de detectores UV: los detectores de onda fija y los de longitud de onda variable (Skoog, 2001).
4.2 Detector UV onda fija Este detector opera a longitudes de onda prefijadas, determinadas por las líneas de emisión de su lámpara, habitualmente de mercurio de baja presión. Como longitudes de onda de trabajo se utilizan las bandas de emisión de la lámpara de mercurio, especialmente la fuerte línea de 254 nm. El verdadero monocromador del instrumento es la propia emisión de la lámpara pero, para eliminar líneas de otras longitudes de onda lejanas a la línea de trabajo se utilizan filtros de interferencia (fig. 2). Además de la longitud de onda de 254 nm, suelen emplearse filtros que permiten trabajar a 313, 334, 365 nm. El empleo de filtros de óxidos de fósforo permite trabajar incluso a 280 nm. La lámpara de mercurio emiten a esa longitud de onda. El cambio de lámpara permite incluso trabajar a otras longitudes de onda, por ejemplo a 214 nm con una lámpara de Zn, a 229 nm con una lámpara de Cd.
Fig. 2. Esquema de un detector de UV de onda fija 4.3 Detector onda variable
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Este detector es simplemente un espectrofotómetro, en el cual se reemplaza el compartimiento de cubetas por una celda de flujo. Es mucho más versátil que el detector de longitud de onda fija ya que al tener red de difracción permite seleccionar libremente la longitud de onda de trabajo. Se puede escoger así la longitud de onda de máxima absorción del analito para aumentar la sensibilidad de medición. Emplea una lámpara de emisión continua, de Deuterio o Xenón (fig. 3). La luz emitida por la lámpara se enfoca en un monocromador, habitualmente una red halográfica de difracción, y la luz monocromática escogida se dirige hacia la celda de medida y de allí hacia el fotomultiplicador (Quattrocchi, et al 1992).
Fig. 3. Esquema de un detector de UV de onda variable
4.4 Detector de ordenamiento de diodos Uno de los últimos adelantos en los detectores UV es el denominado ordenamiento de diodos (fig. 4). En los dispositivos “convencionales”, la red de difracción se ubica antes de la celda, la que recibe luz monocromática seleccionada por la red. En los detectores de ordenamiento de diodos se emplea un sistema óptico invertido: la celda se ilumina con luz “blanca”, es decir, no monocromada y la luz emergente de la celda llega a la red de difracción y allí es dispersada hacia el elemento fotosensible. En lugar de una fotocelda se emplea un conjunto de fotoceldas o fotodiodos montados en un chip de sílicio (Quattrocchi, et al 1992). De esta forma, se consigue medir no solo la luz transmitida a una longitud de onda, sino todo el espectro de absorción del eluído en tiempo real (ventaja multiplex).
Fig. 4. Detector de ordenamiento de diodos compuesto por (1) lámpara de Deuterio; (2) Sistema de lentes; (3) Chopper; (4) celda; (5) red de difracción; (6) ordenamiento de fotodiodos
Es el detector ideal para realizar el desarrollo de los métodos analíticos por HPLC, ya que permite asegurar, dentro de ciertos límites, la integridad de un pico cromatográfico. El único problema que presenta es que no es un detector universal, ya que solamente detecta aquellos
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compuestos que presentan la absorción en esta zona del espectro. Afortunadamente existe una amplia gama de compuestos que tienen ésta propiedad. En él se incluyen todos los compuestos aromáticos, los alquenos y todos aquellos compuestos que presentan enlaces múltiples entre C, N, O y S. Únicamente se elije otro detector cuando:
§ El analito presenta poca o ninguna absorción en el UV o Visible § El analito, a las concentraciones en las que se encuentra en la muestra, presenta poca
absorción en el UV o Visible § Existen interferencias en la muestra § Se necesita información estructural cualitativa
5. Detector de fluorescencia La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación electromagnética. Las especias excitadas se relajan al estado fundamental, liberando su exceso de energía en forma de fotones. Una de las características más atractivas de los métodos de fluorescencia es su sensibilidad inherente, la cual es, con frecuencia, de uno a tres órdenes de magnitud mejor que las de la espectroscopia de absorción, porque la sensibilidad de los primeros se puede reforzar, sea aumentando la energía del haz de excitación o por amplificación de la señal del detector. Es de destacar que ninguna de estas opciones mejora la sensibilidad de los métodos basados en los procesos de absorción porque el parámetro en la ley de Beer basado en la concentración es el logaritmo de una proporción:
− log𝑃!𝑃= 𝑎𝑏𝑐
Al aumentar la energía P0 se incrementa proporcionalmente P y no tiene efecto sobre la
sensibilidad. De manera parecida, incrementando la amplificación de la señal del detector se influye en las dos magnitudes medidas de forma idéntica, lo que evita cualquier mejoría. No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican mucho menos que los métodos de absorción debido al número relativamente limitado de sistemas químicas que se pueden hacer fluorescer. En general, los métodos de fluorescencia son de uno a tres órdenes de magnitud más sensibles que los métodos basados en la absorción. Existen dos tipos de instrumentos:
§ Fluorómetros: utilizan como fuente una lámpara de Hg a baja presión, que funciona a 254,
546, 691, 793 nm, estas longitudes de onda se aíslan con filtros y un tubo fotomultiplicador es el detector.
§ Espectrofluorómetros: la fuente empleada es una lámpara de arco de xenón, de alta presión, se necesita radiación continua de 300 a 1300 nm, son de doble haz, tienen dos sistemas de monocromación para aislar la longitud de onda deseada, la otra radiación obtenida se divide en dos, una al fotomultiplicador de referencia y la otra para por la muestra (fig. 5).
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Fig 5. Esquema de un detector de fluorescencia
La fotoluminiscencia está limitada a un número relativamente pequeño de sistemas que incorporan características estructurales y ambientales que hacen que la velocidad de los procesos de desactivación sin radiación se reduzcan hasta el punto que la reacción de emisión puede competir cinéticamente. Para analitos que no poseen fotoluminiscencia nativa se utiliza la derivatización. Este tratamiento puede ser necesario para reducir la polaridad de las especies y de este modo poder usar columnas de reparto y no de intercambio iónico, para aumentar la respuesta del detector para todos los componentes de la muestra o bien, para aumentar selectivamente la respuesta del detector para determinados componentes de la muestra (Skoog, 2001).
Los procedimientos de derivatización se dividen en precolumna y postcolumna. La derivatiazación postcolumna involucra los siguientes pasos: separación de los analitos
en la columna cromatográfica, introducción de un reactivo de de derivatización en el sistema efluente de la columna; paso de los líquidos combinados a través de un colector mezclador seguido por un espiral de reacción y finalmente bombeo de los analitos derivatizados a través del sistema de detección.
Por otro lado, en la derivatización precolumna, la mezcla de analitos se hace reaccionar con el agente derivatizante antes de ser separados. Las técnicas difieren principalmente de las condiciones de reacción. Para este proceso, se deben satisfacer los siguientes requerimientos:
§ Reacciones rápidas bajo condiciones moderadas para dar rendimientos cuantitativos del
derivado § Los derivados deben ser estables por varios días, de preferencia a temperatura ambiente
para permitir el análisis automatizado de varias muestras. § No debe haber interferencias del reactivo, productos de ruptura o reacciones secundarias. § Debe haber una respuesta lineal a los intervalos de concentración típicos de la mayoría de
las aplicaciones. § Los derivador deben tener factores de respuesta molar razonablemente similares.
6. Detector de índice de refracción
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Los detectores de índice de refracción son universales y responden a todos los solutos, son muy sensibles a los cambios de temperatura, pero no así a la de concentración. Son diferenciales, el disolvente que va hacia la columna pasa a través de la cubeta y el eluyente de la columna pasa por la otra mitad.
Los compartimientos están separados por una placa de vidrio montada con un ángulo tal que si las dos disoluciones tienen índices de refracción diferentes, se produce una desviación del haz incidente. La desviación del haz es amplificada y registrada (Skoog, 2001).. El esquema de este detector se presenta en la figura 6.
Fig. 6. Esquema de un detector de índice de refracción
No puede utilizarse con programación de disolventes porque el cambio de la composición de la fase móvil se acompaña del cambio de su índice de refracción. Como consecuencia, no puede estabilizarse la línea base. Existen tres tipos diferentes de detectores de índice de refracción: Fresnel, Deflexión e Interferométrico (Remington, 2003) 6.1 Detector IR-‐Fresnel Es un detector diferencial que utiliza dos celdas, una de medición que es atravesada por el eluído de la columna, y una celda de referencia por la cual fluye la fase móvil pura. Opera según la ley de Fresnel, que establece que “la cantidad de luz reflejada en una interfase líquido/vidrio varía con el ángulo de incidencia y con el índice de refracción del líquido”. Posee una celda de medición pequeña, del orden de 3 mL que está constituida por un prisma, una base de acero pulida y un sello de teflón entre ambos. Para cubrir todo el rango de índice de refracción (h=1.33 a 1.63) se utilizan dos prismas, el primero se utiliza con disolventes de fase reversa y el segundo con disolventes de fase normal. Para evitar el calentamiento de la celda por radiación entre ésta y la lámpara se coloca un filtro infrarrojo (Quattrocchi, et al 1992). 6.2 Detector de deflexión Es un detector diferencial que, a diferencia del Fresnel, sólo usa un prisma para todo el rango de índices de refracción, pero empleando celdas de mayor tamaño, del orden de los 8 a 10 mL. Una celda contiene la fase móvil pura, y a través de otra celda fluye el eluído de la columna. Cuando se produce un cambio de índice de refracción en la celda de muestra, se produce un cambio en la trayectoria del haz luminoso que es registrado por el sistema óptico (Quattrocchi, et al 1992). 6.3 Detector interferométrico En este detector la luz emitida por la fuente luminosa se polariza y divide en dos haces por un divisor de onda. Luego se focalizan ambas ondas y atraviesan la celda de referencia y la de medida. Finalmente se recombinan por una segunda lente y por un divisor de onda para llegar al
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fotomultiplicador. Cuando se produce una diferencia entre los índices de refracción de ambas celda tiene lugar un cambio de fase entre ambas ondas y esto origina una diferencia en la intensidad de luz que llega al fotomultiplicador. 7. Detector de dispersión de luz Estos detectores han demostrado su utilidad en la determinación de pesos moleculares de polímeros y péptidos. Su funcionamiento es el siguiente: el efluente de la columna pasa a través de un nebulizador y se convierte en gotitas finas con un gas N2, que se conducen a un tubo donde se evaporan y se origina analito sólido. Las partículas de analito pasan a través de un haz láser. La radiación dispersdada se detecta de forma perpendicular al flujo, con un fotodiodo de Si. Su respuesta es la misma para todos los solutos no volátiles, es más sensible que el índice de refracción. Su representación gráfica se observa en la figura 7. (Barquero Quirós, 2004)
Fig 7. Diagrama de las etapas de detección por dispersión de luz 8. Incertidumbre en los detectores IR, UV, Fluorescencia El ruido de fondo producido por el detector de índice de refracción (IR) se ve influenciado por los cambios en la composición del efluente de la columna, presión y temperatura. La concentración de 1 ppm corresponde a un cambio en el índice de refracción de aproximadamente 10-‐7 unidades IR, debido a las fluctuaciones de la composición de la fase móvil. La temperatura puede causar un efecto considerable en la respuesta del detector. Se ha reportado que un cambio en 1°C puede causar un cambio de 6x10-‐4 unidades IR. Con respecto a la
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presión, ésta puede cambiar la densidad del líquido y como consecuencia el IR, sin embargo el cambio en la temperatura afecta más que la presión, aunque ésta última compromete la estabilidad de la línea base.
En la detección por fluorescencia, el pH, composición de la fase móvil (incluyendo oxígeno disuelto) juegan un papel importante, por ejemplo la longitud de onda de emisión e intensidad de fluorescencia los compuestos aromáticos ionizables son dependientes del pH. La respuesta de muchos compuestos es dependiente de la temperatura, causando una disminución en intensidad de 1-‐2% por °C. También a altas concentraciones la fluorescencia llega a ser no linear.
En la detección de UV, los principales errores dependen en gran medida de la longitud de onda seleccionada y general se observa que al aumentar la longitud de onda de trabajo la incertidumbre aumenta. Los gases disueltos alteran la línea base (N2 y He reducen la absorbancia a la mitad) y en algunos casos promueven la aparición de picos fantasma (V. J. Barwick, 1999). 9. Sistema de toma y procesamiento de datos El resultado del ensayo cromatográfico es, por un lado, la obtención de fracciones separadas de los componentes de la muestra, y por el otro, la de un gráfico o cromatograma, de cuya interpretación pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas (Quattrocchi, et al 1992). Este registro y la eventual manipulación se obtienen a partir de la señal proveniente del detector por medio de un sistema de toma y procesamiento de datos, entre los que se puede citar están:
§ Registrador gráfico: convierte la señal en un gráfico del tipo X-‐Y § Integrador: permite no sólo obtener un registro gráfico (cromatograma) sino también su
tratamiento matemático para el cálculo de concentraciones. § Computadora: básicamente, el integrador es una computadora de uso muy específico. En
este punto, se puede hablar de una computadora de escritorio, que permite con el software apropiado tanto el registro gráfico del cromatograma como los cálculos apropiados, la manipulación de datos, el almacenamiento de ensayos, generación de reportes, e incluso el manejo global de varios cromatógrafos. Como las computadoras necesitan señales digitalizadas, se necesita una interfase analógica-‐digital que convierta la señal analógica entregada por el detector,
10. Aplicación. Determination of metoprolol in human plasma and urine by high-‐performance liquid chromatography with fluorescence detection El metoprolol pertenece al grupo de medicamentos llamados b-‐bloqueadores. Los b-‐bloqueantes son antagonistas de las acciones endógenas de las catecolaminas adrenalina y noradrenalina, en particular sobre el receptor adrenérgico-‐β, parte del sistema nervioso simpático. El metoprolol se usa para tratar la presión arterial alta (hipertensión). También se usa para aliviar la angina (dolor de pecho) y para prevenir que se presenten más ataques al corazón en aquellos pacientes que hayan padecido anteriormente uno de estos ataques. Su estructura se presenta en la figura 8 (a) así como la del atenolol, el cual es el estándar interno (b). (a)
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(b)
Fig. 8. Estructura química de (a) metoprolol y del estándar interno (b) atenolol
En la literatura se han sido reportado varios métodos para la determinación de metoprolol en plasma humano y fluídos biológicos: GC-‐MS, HPLC, LC-‐MS y LC-‐MS/MS. B. Yilmaz y colaboradores proponen un método sensible, específico y rápido, HPLC con detección de fluorescencia, para determinar metoprolol en pacientes con hipertensión. El método fue validado y se evaluó linealidad, estabilidad, precisión y exactitud de acuerdo a los requerimientos de la guía de ICH. Además se estableció un bajo límite de detección (LOD) del rango de ng/mL. Al mismo tiempo este método fue utilizado para un estudio de farmacocinética en plasma y orina de humano. En la tabla 3 se observan las características del sistema cromatográfico y el procedimiento de preparación de muestra se muestra en la fig 9.
Tabla 3. Condiciones de operación para la determinación de metoprolol por HPLC con detección de fluorescencia
Características del sistema cromatográfico:
Ø HPLC Perkin Elmer serie 200 Ø Detector de fluorescencia 276 nm (excitación) y 296 nm (emisión) Ø Fase móvil, metanol:agua (50:50, v/v) + 0.1% TFA Ø Columna C18 (5 mm, 4.65 mm x 250 mm id) Ø Flujo 1 mL/min
Fig 9. Procedimiento de extracción del metoprolol
Las curvas de calibración se preparadon a partir de una solución stock de metoprolol (1 mg/mL), ésta solución fue diluída posteriormente para obtener una concentración de 1 mg/mL, para plasma el rango de trabajo fue de 3-‐200 ng/mL y 5-‐300 ng/mL para orina. Las muestras biológicas se obtuvieron de pacientes con hipertensión arterial y se colectaron a diferentes tiempos para poder llevar a cabo el estudio de farmacocinética.
0.5 mL plasma + X mL IS
0.5 mL NaOH 1 M
Agitación 5s
3 mL etilacetato: dietilét
Agitación 30s
Centrifugación 3000 rpm, 7 min.
FO
Evaporación con N2, 40°C
1 mL MeOH
20 µL
HPLC
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La mayoría de los compuestos farmacéuticos pueden ser analizados con una columna C18, debido a esto, el metoprolol fue analizado satisfactoriamente por cromatografía en fase reversa. La correcta separación se logró con las condiciones de la tabla 3, logrando de esta forma obtener un tiempo corto para el analito (4.7 min). Los cromatogramas típicos de esta determinación se pueden observar en la fig. 10.
En los cromatogramas se observa que el proceso de extracción permite eliminar en su mayoría las interferencias endógenas de los fluídos biológicos. Cabe mencionar que el metoprolol no necesito de una reacción de derivatización para poder realizar su detección, esto quiere decir que pertence al reducido grupo de sustancias con fluorescencia nativa. En la tabla 4 se resumen los resultados obtenidos durante la validación de este método analítico.
Fig. 10. Cromatogramas representativos de plasma (izquierda)/ orina (derecha) (a) sin fármaco; (b) fortificado con metoprolol (100 ng/mL) y atenolol (IS) (200 ng/mL); y (c) 2 h después de la administración del fármaco a los pacientes. Tabla 4. Resumen de la validación del método analítico
Parámetro Plasma Orina Linealidad 3-‐200 ng/mL 5-‐300 ng/mL Precisión 0.97 % 1.16 % Exactitud 4.88 % 5.28 % LOQ 3 ng/mL 5 ng/mL LOD 1 ng/mL 1.5 ng/mL Recobro 95.6±1.53% 96.4±1.75%
Finalmente el método descrito en el artículo, fue utilizado para llevar acabo un estudio
farmacocinética cuya curva se observa en la fig 11. De éste gráfico se obtienen importantes parámetros como la concentración máxima que alcanza el metoprolol en plasma, así como su vida media entre otros parámetros. La utilización de detección de fluorescencia permite la obtención
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de unos bajos LOD, lo cual hace que este método de análisis sea aplicable a estudios clínicos donde las concentraciones de fármacos en fluido biológico son muy bajas (B. Yilmaz et al, 2010)
Fig. 11. Concentraciones plasmáticas de metoprolol en pacientes con hipertensión arterial después de una dosis única de 100 mg 11. Conclusiones El detector es un dispositivo electrónico que registra una propiedad físico-‐química del material eluido por la columna en función del tiempo. Los detectores actuales tienen un amplio rango dinámico que, normalmente, permite trabajar en las escalas analítica y preparativa con el mismo aparato. Los detectores actuales tienen sensibilidades que permiten la detección de concentraciones muy pequeñas y admiten rápidamente el cambio de una fase móvil a otra.
Para que el eluído de la columna cromatográfica pueda ser evaluado, debe pasar por la celda de un detector, la cual tiene, naturalmente, un volumen finito. El detector puede contribuir de dos formas al ensanchamiento de banda, en función de su componente hidráulico (tubos de ingreso a la celda, volumen y geometría de la celda) y su componente electrónico (la velocidad de respuesta).
Evidentemente el volumen de esta celda debe ser pequeño, para que no vuelva a mezclar los componentes que fueron separados en la columna. Además del volumen de celda debe considerarse su diseño, ya que celdas que induzcan flujos turbulentos son capaces de producir dispersión, independientemente del generado por su volumen. 12. Bibliografía
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