Detection Technology for Genetically Modified Crops for Human C
Transcript of Detection Technology for Genetically Modified Crops for Human C
Métodos de detecção e Métodos de detecção e quantificação de Organismos quantificação de Organismos
Geneticamente Modificados e seus Geneticamente Modificados e seus produtos.produtos.
Fábio de Oliveira Pedrosa
CEPPA Ministério da EducaçãoUniversidade Federal do ParanáSetor de TecnologiaCentro de Pesquisa e Processamento de Alimentos CEPPA
Métodos baseados noDNA
Métodos baseados na Proteína
Aspectos Importantes da Aspectos Importantes da Quantificação de OGM’sQuantificação de OGM’s
• Amostragem e preparo da amostra– Procedimento determina a “representatividade” do resultado.
– Tamanho da amostra, homogeneidade da amostra e limiar
de detecção.
– Requerimentos estatísticos devem ser satisfeitos.
– Tipo de material define o método analítico.• Materiais não processados (ex. grãos)
• Ingredientes processados
• Alimentos processados
Materiais de ReferênciaMateriais de Referência• Controles positivos e negativos appropriados.
– Base para validação do procedimento analítico – Procedimento independente
• Efeitos da matriz e consistência similar para amostragem.– Grãos,alimentos, etc…– Estabilidade temporal, homogeneidade e conteúdo de OGM
• Métodos baseados no DNA: requerem muitos controles positivos
• Métodos baseados em Proteínas necessitam de um único padrão.
• Institute of Reference Materials and Measurement
– Geel, Belgica - Padrões Fluka. – Por que não desenvolvermos Padrões brasileiros?
Ahmed, 2002
• Os transgenes codificam para proteínas únicas e diferentes daquelas da planta hospedeira (originalmente não transgênica).
• Técnicas de Immunoensaios usam anticorpos. – Ideais para necessidades qualitativas e quantitativas– Detectam proteínas especificas em substratos complexos
• A proteína alvo deve ser conhecida• Interferências devido interações não-específicas com proteínas,
surfactantes (saponinas), fenólicos, ácidos graxos e fosfatases
Anticorpos policlonais Sensíveis mas apresentam reconhecimento menos específico do antigeno. Reação cruzada
Anticorpos monoclonais Altamente específicos, reconhecimento do antígeno ligeiramente menos sensível.
Métodos de análise baseados na Métodos de análise baseados na detecção de Proteínasdetecção de Proteínas
Métodos de análise baseados na Métodos de análise baseados na detecção de Proteínasdetecção de Proteínas
Western Blot = transferência de proteínas para membranas
1. Em placas de micropoços (Microwell Plate)1. Em placas de micropoços (Microwell Plate)
3. Em Tubos recobertos com anticorpos 3. Em Tubos recobertos com anticorpos
2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay)2. Imunocromatográfico em tiras (Lateral Flow Strip Assay)
4. Imunomagnético
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay):
Western BlotWestern Blot• Teste qualitativo de alta específicidade• Indica se a concentração da proteína OGM está acima ou
abaixo do limiar de concentração requerido• Usado tipicamente para pesquisa• Usa eletroforese desnaturante SDS-PAGE
– Solubiliza e remove agregados de proteínas
Western BlotWestern Blot
As proteínas do gel são transferidas para uma membrana e reveladas com anticorpos específicos
toalha de papelMembranade transferência
toalha de papel
Gel
Extrato celular é aplicado em gel SDS PAGE
Submetido a eletroforese
Western BlotWestern Blot
3. Adicionar anticorpos
monoclonais4. lavar de novo
Anticorpos irão ligar à proteína específica
Revelar o anticorpo ligado para desenvolvimento de cor.
O aparecimento de cor revela a presença da proteína em estudo
• 1. Bloquear os sítios de ligação da membrana com leite desnatado
2. Lavar com ddH2O
5. Adicionar segundo anticorpo (marcado) contra o primeiro anticorpo .
ELISA Placa de micropoçosELISA Placa de micropoços• Micropoços são revestidos com anticorpo
– Quantitativo, altamente sensível, econômico, de alta produtividade, e ideal para análises laboratoriais.
• A proteína não pode estar desnaturada.
– Detecta 0.25% OGM em sementes & 1.4% em alimento tostado (toasted meal)
– Tempo de análise: 90 min
– Necessita leitor óptico de placas para quantificar
ELISA em Placa de micropoçosELISA em Placa de micropoços• Procedimento:• 1. Fixar anticorpo monoclonal específico para a proteína OGM. Eliminar
excesso de anticorpo. Bloquear sitios de ligação com proteínas de leite.• 2. Adicionar extrato total do material em análise. Remover excesso por lavagem.
Proteína OGM fica ligada ao anticorpo. • 3.Adicionar segundo anticorpo específico para a proteina OGM• 4. Adicionar anticorpo anti-anticorpo específico marcado com enzima
(HRPeroxidase ou fosfatase alcalina). Remover excesso do segundo anticorpo.• 4. Revelar
poço
proteína bloqueadora
Proteína OGMIntensidade da
cor é dependente da
concentração da proteína GMO
AmostraOGM proteína
Anticorpoespecíficomarcado
Segundoanticorpoespecífico
Anticorpoespecíficocapturado por anticorpo
linhateste
linhacontrole
Detecção Imunocromatográfica de OGM
(a) vista lateral do ELISA Resultadonegativo
Resultadopositivo
(b) vista vertical da tira
• Um variante do ELISA com dois anticorpos específicos à proteína expressa sendo um imobilizado e outro livre, que é acoplado a um reagente de cor.
• Rápido, econômico, transferable & good for initial screening
Protocolo de imunocromatografia para folhasProtocolo de imunocromatografia para folhas
• Testes para CryI(Ab) & CP4 EPSPS
• Orgãos vegetais & sementes.
1 2
3
1. Corte disco de folha
2. Adicionar a tubo, e macerar
3. Inserir uma flow tira de teste
Protocolo de imunocromatografia para grãosProtocolo de imunocromatografia para grãos
1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos1. Contar ou pesar grãos equivalentes a 1000 grãos2. Colocar no copo do liquidificado 2. Colocar no copo do liquidificado 3. Adicionar 1000 ml de água destilada3. Adicionar 1000 ml de água destilada4. Liquidificar4. Liquidificar5. Deixar decantar 5. Deixar decantar 6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml6. Pipetar 0,5 ml para tubo plástico de 1,5 ml7. Inserir tira imunocromatográfica7. Inserir tira imunocromatográfica8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente8. Incubar por 5 min à temperatura ambiente9. Ler o resultado9. Ler o resultado
1. Uma banda colorida = Negativo1. Uma banda colorida = Negativo2. Duas bandas coloridas = Positivo2. Duas bandas coloridas = Positivo
Experiência no CEPPAExperiência no CEPPA
Detecção imunocromatográfica - tiras
Kits reagentes da Strategic Diagnostics Inc. USA, soja RR (GR Bulk Soybean test kit) = LOD 0,1%milho (Bt1 Corn Grain test kit) = LOD 1%farelo de soja tostado (RUR Toasted Meal test kit) = LOD 0,9%
Limites de detecção encontrados:Soja - limite de detecção: 0,1% de OGM (ou 1 semente de soja transgênica RR em 1000) . Confiabilidade de 99% (3 sub-amostras)
1 /1000 5 /1000 10 /1000 100 /1/9002 /1000
Controle
Teste
Razão soja GM/soja
Kit de reagentes “GR Bulk Soybean test kit”
0,1 0,2 0,5 1 10% Soja GM
Soja RR
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Ensaio Imunocromatográfico (Tiras)
ELISA ImunomagnéticoELISA Imunomagnético• Particulas Magnéticas como superfícies de suporte sólido
• Revestidas com anticorpos de captura e colocadas em tubos. – Separação usando um magneto exclui reagentes não ligados.– Cinética e precisão superiores devido à uniformidade das
partículas.
VS.
Anticorpos Anticorpos livres para mover em solução.
Considerações sobre os ensaios Considerações sobre os ensaios ELISAELISA
• Otimização e validação são importantes aspectos da padronização das técnicas de detecção de OGM’s
• Devido a grande diversidade de tipos de alimentos otimização e validação são imperativos.
• Fatores afetado a otimização são:1. Parâmetros como: • qualidade dos kits reagentes disponíveis comercialmente• métodos para testar proteínas modificadas• tempos de incubação, etc.2. Limites de detecção (positivo/negativo) ou %3. Rigor nos controles 4. Experiência do laboratório, problemas potenciais de
contaminação do ambiente e de pessoas.
Considerações sobre os Considerações sobre os ensaios ensaios ELISAELISA
• Fatores afetando a Validação incluem:1. Eficiência do método de extração da proteína OGM2. Acurácia dos resultados3. Precisão e habilidade do operador em distinguir
entre valores muito próximos4. Sensibilidade , limite de detecção5. Especificidade (anticorpo monoclonal)6. Reproducibilidade7. Consistência e confiabilidade de detecção
Conclusões sobre os Conclusões sobre os ensaios ensaios ELISAELISA
– ELISA é o método preferido para análise preliminar, qualitativa, de um OGM particular em material não processado, alimentos semi-processado e ingredientes processados, desde que a proteína expressa não esteja degradada e possa ser detectada.
Como ELISA tem menor poder de detecção que métodos envolvendo DNA, (métodos de PCR), ele é menos sensível para testar alimentos terminados contendo muitos ingredientes, especialmente se o limite de detecção for baixo.
Alguns OGMs não expressam níveis detectáveis de proteína(NÃO É O CASO COM OS OGMs MAIS COMUNS)
Métodos Baseados no DNAMétodos Baseados no DNA• Se baseiam na complementariedade da duas
fitas do DNA, que hibridizam de maneira sequência-específica. (A=T; CG)
• Reação em cadeia da DNA polimerase
• Requer DNA de alta qualidade
35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminator
CaMV Agrobacterium tumefaciensDiagrama representando a sequência RoundupReady®
Preparo da amostra de DNAPreparo da amostra de DNA• Extração e purificação do DNA
– A extração e a purificação do DNA são etapas importantes na obtenção de um DNA de
qualidade.– O DNA obtido apresentar :
• Alto grau pureza A260/A280 nm superior a 1,8• Massa molecular elevada (>>10000 pb) • Baixo grau de dano do DNA é decorrente de:
– Calor, baixo pH (depurinação), nucleases (degradação enzimática)
Preparo da amostra de DNAPreparo da amostra de DNA• Amostra para a extração do DNA
– A amostra laboratorial deve representar a amostra do campo/alimento:
• material de partida: 1 - 2,5 kg de sementes de soja• 100-350mg de amostra finamente moida para purificação.
DNA pode ainda ser afetado por contaminantes presentes nos diferentes tipos de alimentos e quenibem a detecção do rDNA por PCR, entre eles:
– Polisacarídeos, lipídeos, polifenois & reagentes de extração do DNA
Métodos de extração e purificação de DNA
- Inúmeros
Mais utilizados:1. O método do CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio)
- Recomendado pelo Min. Agricultura.2. O método Wizard da Promega usando resina
magnética. 3. O método proprietário PrepMan Ultra da Applied
Biosystems (Real time PCR).
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Requerimentos para extração do DNA
• Quebrar as paredes celulares– Gelo seco ou nitrogênio líquido
• Romper as membranas celulares– Detergentes : CTAB or SDS
• Inativar nucleases– EDTA quela Mg2+ inibindo nucleases.
• Separar polissacarídeos inibidores • Separar constituintes celulares hidrofóbicos
– lipideos & polifenois com solvente orgânicos• Separar o DNA precipitando e lavando-o
com alcool.Determinar grau de pureza por espectrometria UV em 230,260 e 280 nm.Calcular a razão 260/280 nm…… superior a 1,8
Princípios da reação em cadeia da Princípios da reação em cadeia da DNA polimerase (PCR)DNA polimerase (PCR)
• Permite amplificar o DNA alvo milhões de vezes. • DNA polimerase faz cópias exatas do DNA alvo • Utiliza oligonucleotideos iniciadores (primers) complementares ao gene
de interesse• Permite a Taq-polymerase gerar sequências complementares à região contida entre os pares de primers.• O número de sequências cresce
exponencialmente
Cycles DNA molecules formed1 - 2 1 3 2 4 4 5 8 6 16 7 32 8 64 9 128
10 256 11 512 12 1,024 13 2,048 14 4,096 15 8,192 16 16,384 17 32,768 18 65,536
Mistura de reação:
Tampão de PCR dNTPsTaq polimerasePrimers F (senso) e R (antisenso)MgCl2DNA (5 µl)
Volume Total (25 ou 50 µl/reação)
Reação em cadeia da DNApolimerase (PCR)
Atividades da Taq polimerase
5’ nuclease5’ nucleasePolimerasePolimerase
• Atividade de DNA polimerase Termoestável
• Atividade 5 nuclease associada à polimerização
• Atividade 5 -3 nuclease. Não atrapalha PCR convencional
5’ 3’
5’3’
dNTP
Ciclagem térmica da PCR• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)
22.0
0:1595.095.0
4:00
1:0060.0
1x 30-40x
72.0
desnaturaDNA
anela osprimers
estensãodos primers
0:30
desnaturaDNA
Mecanismo da reação em cadeia da DNA polimerase (Ciclagem térmica)
Gen alvo em dupla fita
Desnaturar fitas e anelar primers
Estender Primers com a Taq Polimerase
Desnaturar, Aneal e Estender Primers
Produtos:
Amplicons
primers F e R
5’
Amplificação exponencial = 2n n = número de ciclos
mostrar animação pcr.exe
Ciclagem térmica : Plateau
• Causas do plateau?– Inativação progressiva da Taq
polymerase, – Redução da eficiência da
etapa de desnaturação– Redução da eficiência do
anelamento dos primers devido a competição com o produto (reanelamento do produto)
– Taq polymerase se torna limitante.
Número do Ciclo
Teórico
Real
Log
DN
A a
lvo
• Amplificação é exponencial, mas o aumento exponencial é limitado levando a um plateau.
Confirmação dos Fragmentos de Confirmação dos Fragmentos de DNA amplificados por PCRDNA amplificados por PCR
• Eletroforese em Gel de agarose – tamanho– Verificar se o produto amplificado tem o tamanho
esperado.• Artefatos de mesmo tamanho => falso positivos
• Ensaio “Southern Blot”– Confiável mas demorado
• “Nested PCR” permite discriminação.– 2o. par de primers dentro do amplicon
• Sequenciamento do amplicon– Conveniente e demorado
Tipos de métodos de PCR para detecção de OGMs
1. Qualitativo2. Semi-Quantitativo3. Quantitativo
3.1 Competitivo3.2 Tempo Real -
Sistemas de detecção/quantificação: 3.2.1 Sondas de transferência de energia fluorescente
por ressonância (FRET) - Sistema TaqMan ( 5’ nuclease)
3.2.2 Sistema SybrGreen I (ligante de DNA dupla fita)
PCR Qualitativo
Usa dois pares de primers: F; senso ou 5’ 3’ e R; antisenso ou 3’ 5’
Os fragmentos de DNA amplificados (amplicons) sãoseparados por eletroforese em gel de agarose e visualizados por coloração com Brometo de Etídio.
HPLC e Eletroforese Capilar
Soja, trigo, canola, batata, arroz, milho, tomate, etc.
DNA dupla fita (template ou molde)dNTP’s (dATP, dGTP, dCTP, TTP)Par de oligonucleotídeos iniciadores (primers),
complementares às bordas externas do gene/transgenes de interesse (alvo)
Mg2+
Taq polimerase
Componentes da Reação de PCR:
Legislação da Coordenação de Laboratório Vegetal – CLAV/DDIV/SDA/MAPA
NORMAS PARA CREDENCIAMENTO DE LABORATÓRIO PARA DETECÇÃO DE
MODIFICAÇÃO GENÉTICA EM PRODUTOS E SUBPRODUTOS DE ORIGEM VEGETAL
DOU Nº163 - Seção 1, sexta-feira, 24 de agosto de 2001INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001
Anexo II -
ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS
ISOLAMENTO DE DNA DE GRÃOS E FARINHAS (INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)
MÉTODO CTAB MODIFICADO PARA ANÁLISE DE AMOSTRAS DE ORGANISMOS GENETICAMENTE MODIFICADOS.
PROCEDIMENTO:
1. Pesar 1 Kg de grãos;2. Moer os grãos em moedor de café e colher duas sub-amostras
(200mg) de farinha em um tubo de microcentrífuga;3. Acrescentar 750µL de tampão CTAB e 15µL de beta-Mercaptoetanol;4. Agitar em um vortex durante 2 min;5. Incubar a 65°C por 15 min;6. Adicionar 520µL clorofórmio: álcool. isoamílico (24:1);7. Agitar em um Vortex durante 1 min;8. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min.;
CONTINUA
9.Transferir o sobrenadante para um novo tubo e acrescentar igual volume de isopropanol e 1/2v de acetato de amônio 7,5M;10. Centrifugar 13.000 rpm por 10 min;11. Desprezar o sobrenadante e lavar o precipitado com
etanol 70%;12. Centrifugar 13.000 rpm por 5 min.;13. Desprezar o sobrenadante e secar o precipitado em temperatura ambiente durante 15 min;14. Solubilizar o precipitado em 50µL de água ultra-pura.15. Determinar a concentração e qualidade do DNA em espectrofotômetro;16. Armazenar o DNA a -20°C.
Amplificação do DNA - Método qualitativo de PCR(INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)
Para cada sub-amostra, 4 tubos de reação de PCR são utilizados em uma reação conforme a descrição abaixo:Água 17,8 ulTampão de PCR 10X 2,5 ulMgCl2 1,0 uldesoxiribonucleotídeos (dNTPs) (10 mM) 0,5 ulPrimersTubo 1 Act F (20 uM) 1,0 ul e Act R (20 uM) 1,0 ulTubo 2 35S-1 (20 uM) 1,0 ul e 35S-2 (20 uM) 1,0 ulTubo 3 35S-3 (20 uM) 1,0 ul e 35S-4 (20 uM) 1,0 ulTubo 4 Nos-1 (20 uM) 1,0 ul e Nos-2 (20 uM) 1,0 ulTaq DNA polimerase (5 U/ul) 0,2 ulDNA (200 ng) 1,0 ulTotal 25,0 ul
O tubo 1 é um controle interno para verificar a qualidade do DNA vegetal. Os tubos 2, 3 e 4 são para verificar a presença de transgênico, pois amplificam regiões regulatórias comuns aos transgênicos em uso. Outros três controles são agregados durante a PCR: DNA proveniente de grãos não transgênicos (controle negativo), ausência de DNA (controle negativo para verificar contaminação durante a manipulação da amostra) e DNA grãos contendo 0,1% de transgênicos (controle positivo).
35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminator
CaMV Agrobacterium tumefaciensDiagrama representando a sequência RoundupReady®
Método dirigido para detectarpromotor 35S e terminador NOS
(INSTRUÇÃO NORMATIVA Nº 32, DE 19 DE JULHO DE 2001)
Reação de amplificação em termociclador MJR PTC-100
Desnaturação inicial: 96°C 2 minDesnaturação: 94°C 1 minAnelamento: 62°C 45 segExtensão: 72°C 45 segExtensão final: 72°C 45 segNúmero de ciclos: 35A interpretação dos resultados é efetuada através da verificação da presença de fragmentos de DNA nas amostras, observada após a eletroforese em gel de agarose 2% em tampão TBE, com o mesmo tamanho do fragmento observado no controle positivo e ausente nos controles negativos. Para uma amostra ser considerada positiva, os três pares de primers que detectam OGMs deverão resultar em amplificações semelhantes ao controle positivo.
PCR QuantitativoPCR Quantitativo
Métodos :1. PCR convencional (semi-quantitativo a quantitativos)2. Método de PCR CompetitivoMétodo de PCR Competitivo3. PCR Quantitativo Tempo-Real3. PCR Quantitativo Tempo-Real
• Determina a percentagem de OGM no alimento
Coding region 3’5’ TerminatorPromoter
• ex. determinar a concentração de soja GM (35S-CP4 EPSPS) em grãos.
35SF
R
NOS
PCR convencional
PCR QUANTITATIVO CONVENCIONAL
As concentrações dos produtos presentes no ponto A (PONTO FINAL) determinados por densitometria após eletroforese em gel de agarose e são grafados em função da percentagem de OGMs presentes na amostra inicial.
O resultado demonstra que a proporcionalidade entre a concentração de DNA e os produtos de PCR (faixa dinâmica) é limitada no PCR convencional.
13. Soja RR + controle externo14. Soja RR + controle externo
Exemplo de determinação quantitativa da concentraçãode OGM por PCR convencional
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
16 1718 19 2021 22 23
1. Padrão de peso molecular2. 5% soja RR3. 2% soja RR4. 1% soja RR5. 0,5% soja RR6. 0,1% soja RR7. Soja não-transgênica8. Soja não-transgênica 9. Controle sem DNA10. Amostra OGM11. Amostra OGM12 . 100% soja RR
Exemplo de determinação quantitativa da concentraçãode OGM por PCR convencional
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314
15 16 17181920 21 22
15. Padrão de peso molecular16. Amostra + controle externo17. soja RR + Controle interno(ubiq) 18. Amostra + Controle interno(ubiq) 19. Amostra + Controle interno(ubiq)20. Soja não-transgênica +
Controle interno(ubiq)
Processamento posterior das bandas coradas
1. Determinar a intensidade das bandas por densitometria2. Utilizar os padrões normalizados contra a referência
interna para construir curva padrão3. Determinar as concentrações das amostras desconhecidas utilizando a curva padrão.
Duração 1-2 dias
Ciclagem TérmicaPCR Semi-quantitativo “ traditional” ou
“Convencional” • Amplificação Quantitativa de genes alvo• Dificuldades:
– Grande esforço para estabelecer condições ótimas de reação (concentrações de DNA alvo e primers)
– Difícil de reproduzir, mas não impossível!!!! – Difícil desenhar um controle interno (escolher gene
conservado ubíquoto tipo pirofosfatase, lectina, zeina, ubiquitina, etc.) mas não impossível!!!!
– Problemas de especificidade de primers – Necessário realizar eletroforese dos produtos de
amplificação e todo processamento posterior (densitometria, etc.)
– Difícil de conseguir alta produtividade
PCR QuantitativoPCR Quantitativo• Normaliza um marcador de OGM (ex. 35S) a um gene de
referência específico da planta (ex. Lectina).• Combina 2 reações de quantificação absoluta; mede a
concentração de DNA da amostra e permite– Determinar o número de cópias/genoma de ambos os genes
(transgene e referência)– Determinar = % de OGM’s na amostra.
• PCR Multiplex– Ambos pares de primers na mesma reação– Razão entre número de cópias do genoma GM/número de
cópias total do genoma
Método de PCR CompetitivoMétodo de PCR Competitivo• Co-amplificação da sequência alvo (transgene) e do
padrão interno (ex. lectina para soja; zeina para milho) – Gene alvo específico de concentração desconhecida e molde
controle de concentração conhecida. (1%)• Uso preferencial dos mesmos primers que amplificam
sequências de 2 tamanhos diferentes.
• Duplo QC-PCR usa 2 reações diferentes– GM alvo e gene específico
• ex. gene da lectina (lel) em soja para RRS
– Concentração do gene competidor equivalente a 1% da soja geneticamente modificada (+/-)
QC-PCRQC-PCR
Adapted from Hübner et al., 1999
PCR EM TEMPO REAL
• Detecção em tempo Real dos produtos de amplificação de DNA alvo (gene) pela reação em cadeia da DNA polimerase.
• PCR em tempo Real (Real-Time PCR) usa fluorescência o que permite a medida direta e a quantificação dos produtos da reação amplificação.
• Permite a quantificação precisa e reproduzível dos ácidos nuclêicos.(DNA e RNA)
• Vantagens do PCR em Tempo Real
– Ampla faixa dinâmica de detecção (faixa de sensibilidade)
– Química em tubos fechado• Dispensa electroforese• Dispensa processamento posterior dos produtos
de PCR (gel, coloração, hibridização, densitometria, autoradiografia, etc.)
– Alta produtividade de análises• Utiliza placas de micropoços (microwell plate) de 96
poços
PCR em Tempo RealAplicações: • Determinação de Transgênicos
(OGMs)• Expressão gênica• Quantificação de Cancer• Detecção de dano do DNA • Controle Qualidade• Quantificação de Patógenos• Entre outras.
Etapas do PCR em Tempo Real
Preparo da amostra
TermoCiclagem
Detecção da Fluorescência
Único Instrumento
Detecção de curvas de PCR tempo Real
Análise dos Dados
AnálisesGerais
Análises de AplicaçõesEspecíficas
Preparo da amostra
• Purificar DNA– Purificado
• Vários métodos
– Kit PrepMan Ultra Applied Biosystems
35S promoter EPSPS CP4EPSPS CP4 NOS terminatorCaMV Agrobacterium tumefaciens
DNAdupla fita
Ciclagem Térmica
Preparo da amostra
TermoCiclagem
Detecção da Fluorescência
único instrumento
Detecção de curvas de PCR tempo Real
Análise dos Dados
AnálisesGeral
Análises de AplicaçõesEspecíficas
Ciclagem Térmica
• 2 “Químicas”
– Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease, Sondas Taqman • Vantagem: a especificidade é garantida pela
sonda Taqman
– SYBR ligante de DNA dupla fita
Todos dsDNA produtos são detectados necessário realizar análise de dissociação (Tm)
Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease
• Sonda Fluorescente Taqman– Única para cada gen alvo
– Anela entre os 2 primers a 10°C acima dos primers
• Aumenta a especificidade da reação
• Aplicações:– Quantificação de OGM’s
– Detecção de polimorfismo
– Quantificação de ácidos nuclêicos por PCR Tempo Real
Fluorescent Resonant Energy TransferFluorescent Resonant Energy Transfer
Ciclagem Térmica Taqman usa FRET
Estrutura das sondas Taqman
Sonda(não fluoresce)
Reporter (FAM,VIC)
Quencher (Tamra)
R Q
R
Q
R Q
Clivada
Fluoresce
(5’ Nuclease)
Taq polimerase
Atividade 5 nuclease da Taq polimerase
5’ nuclease5’ nucleasepolimerasepolimerase
• Atividade associada à polimerização
5’ 3’
5’3’
dNTPs
Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease
Polimerização
Deslocamento
5’primer
Taq
3’ 5’
QR
5’
5’3’
R
Q
Não fluoresce
Não fluoresce
Ensaio Fluorogênico 5’ Nuclease
Clivagem
Polimerização Completada
R
Q
QR
Fluoresce
Fluoresce
SYBR corante para fita dupla de DNA
• SYBR® green 1 DYE– SYBR fluoresce ao se
ligar ao DNA dupla fita– Qualquer DNA dupla fita
NON-specific
– Usado para ensaios de identificação de genes alvo (screening)
– Baixo custo
– Problema: dimeros dos primers ou produtos de PCR não-específicos também fluorescem.
Sequência alvo DNA
Desnaturação
SYBRGreenCorante para fita dupla de DNA
SYBRGreenCorante para fita dupla de DNA
Polimerização Completa
Polimerização
Ciclagem térmica• Perfil de ciclagem térmica Universal (PCR) (o.C)
50.0
2:00
0:1595.095.0
15:00
1:0060.0
UNG
ativação daTaq Gold
1x1x
40x
Perfile de Dissociação
entre 60 to 95C°0.5C°/cicle
SYBR GREEN
72
Um único Instrumento
Preparo da amostra
TermoCiclagem
Detecção da Fluorescência
Único instrumento
Detecção de curvas de PCR tempo Real
Análise dos Dados
AnálisesGerais
Análises de AplicaçõesEspecíficas
Único Instrumento
• Mecanismos de detecção e instrumentos diferem dependendo do fabricante.
• Instrumento mais vendido e usado.– Applied Biosystems
• CEPPA
• Outros Fabricantes de Termocicladores Tempo Real– Biorad (similar ao AB)
– Westburg
ABI 7000/7700
Detecção Fluorescente
Preparo daamostra
Ciclagem térmica
Detecção Fluorescente
Análises deaplicaçõesespecíficas
Único instrumento
Real time detection of PCR curves
Detecção Fluorescente
Filter Wheel
CCDCamera
Lâmpada
Excitation Filter
96-Well PlatePeltier-based block thermal cycling system
Multi-Element
Lens
DichroicMirrorFresnel Lens
Well Lenses
Fold Mirror
Análise dos Dados
In single instrument
Real time detection of PCR curves
AnáliseGeral
AnálisesEspecíficas
Preparo daamostra
Ciclagem térmica
Detecção Fluorescente
Análises dosdados
Desenho Experimental
• Mistura de reação:– Universal master mix (taqman or SYBR green)
• Tampão de PCR + dNTPs• Amplitaq Gold polimerase• UNG (evita contaminação, não necessário)• ROX reporter = referência fluorescente interna
• Primers F (senso) e R (antisenso) do gene alvo• Primers F (senso) e R (antisenso) do controle interno
– Sonda Taqman – Volume Total (25 ou 50 µl/reação)
• Pipetar mistura para os micropoços (Amostra em triplicata)
• Adicionar DNA (5 µl)• Centrifugar a placa para eliminar bolhas de ar
Desenho Experimental
Definir distribuição das amostras na placa
• Serão:– 6 concentrações de amostras padrão =18 poços– Controle positivo = 2 poços– Controle negativo = 2 poços– 37 Amostras desconhecidas (2X) = 74 poços
• Custo dos reagentes @ R$ 4000,00
PCR terminado, Análise dos Dados
• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros• A Fluorescência dos corantes é calculada usando
um algorítmo multicomponente.• Reporteres são normalizados contra a referencia
interna o fluoróforo ROX• Correções da linha de base• Curva de dissociação (SYBR green 1)
• Resultados dependente da aplicação– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar (Cycle
Threshold)– Medidas de Ponto Final
Espectros brutos
A B C D
FAM/SYBR VIC/JOE TAMRA/NED ROX
Dados coletados no final de cada ciclo.
• Algoritmo calcula automaticamente a contribuição de cada fluoróforo.
Referência Fluorescente Rox• ROX é uma referênca fluorescente passiva
presente no tampão. Sinais dos Reporteres são normalizados contra ROX para eliminar variações operacionais
• Níveis de Fluorescência são diferentes no meio e laterais da placa– Diferenças ópticas nos plásticos das placas– Erros de pipetagem
Amostra1FAM
ROX
ROX
FAM
Amostra2
FLU
OR
ES
CE
NC
IA
FLU
OR
ES
CE
NC
IA
Gráfico das Fluorescências da Amplificação Normalizado
Sinal do ReporterRn =
ROX
Sinal normalizado do reporter (FAM) contra ROX
Rn
Número do ciclo
Correção da linha de base
Reporter signalnRn =
ROXn
Reporter signal6-16
ROX6-16
Rn
Cycle number
Sinal do reporter normalizado e linha de base corrigida
Linha de baseCicle 3-14
Todos os dados começam no 0
Curva de dissociação• Immediatamente depois do PCR, aumenar a Temperatura de
60 a 95 °C
• Produtos do DNA (amplicons) irão desnaturar.
• Fluorescência do SYBR green cairá durante a desnaturação
SYBR® fluorescência
SYBR® dissociados dsDNA
Temperatura
Flu
ore
scên
cia
Curva de Dissociação
• Primeira derivada dos dados brutos
• Pico = Tm do amplicon
• Segundo pico observado na temperatura menos indica:
• Dimeros dos primers
• Amplificação não específica.
PCR completado, Análise dos Dados
• ABI prism coleta dados primários em 4 filtros
• A Fluorescencia dos corantes é calculada usando um algorítmo multicomponente.
• Reporteres são normalizados contra a referência interna o fluoróforo ROX
• Correções da linha de base
• Curva de dissociação (SYBR green 1)
• Resultados dependente da aplicação– Quantificação da reação de PCR pelo Ciclo limiar
(Cycle Threshold)– Medidas de Ponto Final
Ciclo limiar (Cycle Threshold)
• Ciclo limiar Ct– Número de ciclos de
amplificação necessário para a fluorescência ultrapassar o limiar (fluorescência mínima)
– O Liminar (Threshold) é determinado na fase exponencial: o meio da parte linear quando a fluorescência é grafada logaritmicamente
–
threshold
threshold
exponential
exponential
Faixa Dinâmica e curva padrão
Amplificação de diluiçõesseriadas de amostra padrão
Curva padrão mostrando unidades 8 logs da faixa dinâmica linear
Quantificação absoluta
• Resultados de amplificação do DNA de amostras de concentrações conhecidas como curva padrão: Ct versus concentração
• Calcular a concentração da amostra desconhecida com a curva padrão.
• A inclinação da curva padrão dá informação sobre a eficiência do PCR. 100% eficiência inclinação (tg) = -3.33
• Correlação R da indicação da reproducibilidade da pipetagem e deve ser 0.99≥
Inclinação= -3.33R 0.99≥
PCR em tempo real
A concentração dos produtos é determinadacontinuamente por medidas de fluorescência.
Na reação de PCR em tempo real (RT-PCR) a amplificação é proporcional ao número do ciclo durante a fase exponencial do PCR. Em contraste com o PCR convencional existe uma relação linear entre a concentração dos produtos de PCR e a concentração de DNA durante a fase exponencial do RT-PCR.
Determinar ponto de amostra conhecida que é o mesmo e referencia-lo a fragmento GM desconhecido.
Resumo dos métodos de detecção de Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMsprodutos de OGMs
Ahmed, 2002
Teste em CampoLaboratórios de análisede rotinaCEPPA
PesquisaEmpregado principalmente em:
SimSimNãoApropriado para teste de campo?
Não SimNão Fornece resultadosQuantitativos?
2,005,00150,00Custo/amostra (US$)
10 min30-90 min2 dias Duração
AltaAltaAlta Sensibilidade
nãoSimSim Necessita equipamentospecial
Simples Moderada DificilFacilidade de uso
Imunocromatográfico (tiras)
ELISAWestern blot
Baseados na ProteinaParâmetro
Resumo dos métodos de detecção de Resumo dos métodos de detecção de produtos de OGMsprodutos de OGMs
Ahmed, 2002
Laboratórios de análisede rotinaCEPPA
Laboratórios de análisede rotina
Laboratórios de análisede rotinaCEPPA
PesquisaEmpregado principalmente em:
NãoNãoNãoNãoApropriado para teste de campo?
simSimNãoNãoFornece resultadosQuantitativos?
450,00350,00250,00150,00Custo/amostra (US$)
1 dia2 dias1,5 dias6 horasDuração
AltaAltaMuito AltaModeradaSensibilidade
SimSimSimSimNecessita equipamentospecial
DificilDificilDificilDificilFacilidade de uso
PCR emTempo Real
-PCR Competitivo
PCRQualitativoSouthern blot
Baseados no DNAParametro
Outros métodos em desenvolvimento
1. Espectrometria de infra vermelho próximo (NIR)2. Microarranjos de DNA - DNA chips
Agradecimentos
CEPPA:Ariene Costa Prado Yoshiyasu Fabiana Nicol Barbieri Arion Zandoná Filhos
Mundo:Darcy PawlikFarid E. AhmedB. Leyman