Desaphy Tossico 9 - test di tossicit ) · sono soggetti ai test di valutazione ... Età contenuto...
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TOSSICOLOGIA-9
TEST DI TOSSICITA’
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Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015Farmacologia e Tossicologia, 2015
Test di Tossicità
2011© J.F. DESAPHY
Ogni sostanza chimica introdotta sul mercato o in fase di sviluppo deve
essere soggetta alla sperimentazione tossicologica per soddisfare le
normative delle agenzie governative.
Anche i prodotti di scarto dei processi industriali
sono soggetti ai test di valutazione tossicologica.
Alcuni organismi di tutela in Italia:
ISS: Istituto Superiore della Sanità (www.ISS.it)
AIFA: Agenzia Italiana del Farmaco
(www.agenziafarmaco.it)
ASL: agenzie sanitarie locali
2011© J.F. DESAPHY
ISS
ISS
2008© J.F. DESAPHY
ISS
2008© J.F. DESAPHY
SVILUPPO DEL FARMACO
2009© J.F. DESAPHY
Scoperta e selezione delle molecole
Studi pre-clinici
Richiesta di autorizzazione per sperimentazione sull’uomo
Studi clinici Fase 1 (volontari sani)
Studi clinici Fase 2 (studio pilota in pazienti)
Studi clinici Fase 3 (studio su larga scala in pazienti)
Richiesta di autorizzazione all’immissione in commercio
Immissione sul mercato
Farmacovigilanza
3
6
11
anni
0
Obiettivi
2008© J.F. DESAPHY
Valutazione della tossicità
determinazione del potenziale di ogni sostanza ad agire come veleno
e delle condizioni con cui questo potenziale può realizzarsi
determinazione dei meccanismi di tossicità
Valutazione del rischio
accertamento quantitativo della probabilità del manifestarsi degli
effetti tossici di una sostanza in determinate condizioni
Regolamentazione
controllo della produzione, trasporto, vendita, utilizzo, e smaltimento
delle sostanze chimiche considerate tossiche
Test di Tossicità
2008© J.F. DESAPHY
Proprietà chimiche e fisiche
sostanza in oggetto, probabili contaminanti, intermedi di sintesi,
prodotti di scarto, metaboliti
Esposizione e destino ambientale
Studi di degradazione (idrolisi, fermentazione, fotoreazioni, ecc...)
Degradazione nel suolo e/o nell’acqua in varie condizioni
Mobilità e dissipazione nell’ambiente
Accumulo nelle piante e negli animali, nel cibo
Effetti su animali selvatici
in animali scelti: mammiferi selvatici, uccelli, pesci ed invertebrati
tossicità acuta, accumulo, funzione riproduttiva
Test in vivo
Test in vitro
Test di Tossicità in vivo
2008© J.F. DESAPHY
Saggi in vivo
Tossicità acuta
DL50 e CL50 orale, dermica, inalatoria
irritazione oculare (vietato in molti paesi)
irritazione e sensibilizzazione cutanea
Tossicità subcronica
30-90 giorni per via alimentare, dermica, inalatoria
���� determinazione del NOAEL
Tossicità cronica e sulla funzione riproduttiva (~2 anni)
per via alimentare (inclusi test di oncogenesi)
teratogenicità e riproduzione (multi-generazionale)
Saggi specifici
neurotossicità, cardiotossicità, metabolismo
farmacodinamica, comportamento
�Somministrazione in vivo della sostanza (per via orale, cutanea, inalatoria,
iniettiva): acuta, subcronica, cronica
�Valutazione della mortalità (DL con tossicità acuta)
�Analisi dei segni clinici di tossicità
�Esame patologico post-mortem per la valutazione di anomalie tessutali
Mortalità (tossicità acuta)
2008© J.F. DESAPHY
DL50: dose che uccide la metà degli animali
% c
um
ula
tiva d
i anim
ali m
ort
i
5 5,6 6 6,7 7 7,8 8,98
dose di farmaco (mg/kg)
Num
ero
di anim
ali m
ort
i
dose di farmaco (mg/kg)
5 5,6 6 6,7 7 7,8 8,98
Istogramma delle frequenze Curva cumulativa
100 %
50 %
DL50
DL50
2008© J.F. DESAPHY
Esempio di variabilità:
Sostanza chimica Specie/genere via DL50 (mg/kg)
N-metil-N-(1-naftil)- topo/M orale 371
Fluoracetamide dermica 402
sottocutanea 250
ratto/M orale 115
dermica 300
sottocutanea 78
Fattori di variabilità della DL50:
Specie salute temperatura
Razza stato nutrizionale orario
Età contenuto intestinale stagione
Peso via di somministrazione ciclo giorno/notte
Genere stabulazione errori umani
Tossicità subcronica
2008© J.F. DESAPHY
•Prova di una ampia gamma di dosi
•Almeno due specie diverse
•Determinazione del NOAEL: “No Observed Adverse Effect Level”
dose massima che non produce effetti avversi
•Determinazione dell’ADI: “acceptable daily intake”
quantità giornaliera di un composto chimico che,
assunto per tutta la vita, non produce effetti tossici apprezzabili
•Determinazione della RfD: “reference dose”
Dose giornaliera di riferimento per l’esposizione cronica orale
Segni clinici di tossicità
2008© J.F. DESAPHY
•Aspetto (mortalità e morbidità; condizioni della pelle, del pelo, delle mucose)
•Occhi (esame oftalmologico di cornea e retina)
•Consumo di cibo ed acqua / valutazione del peso corporeo
•Anomalie comportamentali
•Frequenza respiratoria / EEG / ECG / EMG (encefalo, cardio, mio)
•Ematologia (emoglobina, ematocrito, eritrociti, leucociti, piastrine, coagulazione)
•Ematochimica (bilancio elettrolitico, acido-base, glucosio, azoto ureico, lipidi,
sieroproteine, indicatori di danno d’organo (transaminasi e fosfatasi
per il fegato; 3-metil-istidine e creatin-chinasi per il muscolo)
•Analisi delle urine (pH, densità, zuccheri, proteine, chetoni e bilirubina,
urine delle 24 ore, tossici e metaboliti)
•Analisi delle feci (sangue occulto, contenuto in fluidi, tossici e metaboliti)
Esame patologico post-mortem
2008© J.F. DESAPHY
Cartilagine
Cavità nasale
Cieco
Cervello
Cistifellea
Colon
Digiuno
Duodeno
Esofago
Ghiandole mammarie
Ghiandole salivari
Ileo
Ipofisi
Laringe
Linfonodi
Midollo spinale
Milza
Muscoli della coscia
Nervo sciatico
Occhi
Ossa
Ovari
Paratiroidi
Pelle
Polmoni e bronchi
Prostata
Reni
Retto
Stomaco
Surrene
Testicoli
Timo
Utero
Vescica
Vescicole seminali
+ Masse anomale
Necropsia
Prelievo e processo organi
Peso
Osservazione
Istologia
Inclusione dei tessuti
Colorazione
Microscopia ottica
Immuno-istochimica
Inclusione dei tessuti
Anticorpi monoclonali
Microscopia ottica
Regolazione della
sperimentazione animale
2014© J.F. DESAPHY
DIRETTIVA 2010/63/UE DEL PARLAMENTO EUROPEO E DEL CONSIGLIO
del 22 settembre 2010
sulla protezione degli animali utilizzati a fini scientifici
Test di Tossicità in vitro
2008© J.F. DESAPHY
• Colture primarie di cellule di mammifero
• Metabolismo organospecifico ben riprodotto durante le prime ore
• Quantità limitata di cellule, problemi di purezza delle cellule
• Capacità di proliferazione limitata (non adatte allo studio della mutagenesi)
• Linee cellulari
• Organo-specificità del metabolismo molto ridotta
• possibilità di manipolazione genetica (OGM)
• Batteri
• Metabolismo specifico
• possibilità di manipolazione genetica (OGM)
• struttura cromosomica diversa
• Frazioni subcellulari di organi
• Metabolismo sbilanciato verso l’attivazione
• Metabolismo extra-cellulare
• Co-coltura
• Necessita la formazione di contatti inter-cellulari
Attività metabolica in vitroTipo cellulare
Enzima Epatociti V79 Salmonella
(coltura primaria) (linea cellulare) (batteri)
Citocromo P-450 ++ -- --
UDP-glucuronosil-transferasi ++ -- --
Glutatione S transferasi ++ ++ ++
N-acetiltransferasi ++ --* ++
Fenolsulfotransferasi ++ -- --
Epossido idrolasi ++ -- --
* presente nel clone V79NH
2009© J.F. DESAPHY
Frazione S9
Attività ridotta
cit P-450 monossigenasi
UDP-glucuronosil-transf
Miscela S9
Attività ripristinata
cit P-450 monossigenasi
Attività ridotta
UDP-glucuronosil-transf
Sbilanciamento verso
l’attivazione metabolica
+ NADP
+ isocitrato
NADPH
Isocitrato deidrogenasi
S9: Frazione subcellulare di fegato di ratto
Test con i batteri
Test di mutazione genica
Test di delezione
perdita della funzione di alcuni geni
Test di retromutazione (test di Ames)
riacquisto di una funzione genica
persa in seguito ad una mutazione
Test di riparazione del DNA
ceppi con diversi capacità di riparazione del DNA
2008© J.F. DESAPHY
Test di AmesCeppi di Salmonella typhimurium che necessitano l’apporto di istidina esogena in
seguito a mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi della biosintesi
dell’aminoacido. Si misura la capacità del composto in esame di retro-mutare
(reversioni) il gene.
La sensibilità dei ceppi viene aumentato da mutazioni ulteriori
Esistono ceppi ricombinanti per gli enzimi del metabolismo
2008© J.F. DESAPHY
Coltura di Salmonella
istidina-dipendenti
Miscela S9
Potenziale mutagene
coltura su
Agar senza
istidina
incubazione
2 giorni 37°Cmutagene
non-mutagene
Test di AmesCeppo mutazione uvrB rfa plasmidi mutagenesi
TA1535 hisG46 + + --------- sostituzione
TA100 hisG46 + + pKM101 sostituzione
TA1538 hisD3052 + + --------- frame-shift
TA98 hisD3052 + + pKM101 frame-shift
TA102 hisG428 - + pKM101, pAQ1 sostituzione
Sistema di riparazione per taglio
Mutazione in liposaccaridi
(aumentata permeabilità
di membrana)
Riparazione per ricombinazione
Aumenta la probabilità di errori
Multicopie di hisG428Tipo di
mutagenesi
evidenziato
TA 98TA 1538
TA 100
L’aflatossina B1 induce mutazioni
per sostituzione di basi
Nell’uomo, la tossina provoca
la mutazione AGG in AGT
nel codon 249 del Gene p53
associata al carcinoma
epatocellulare
2008© J.F. DESAPHY
Test con le cellule animaliTest indicatori
effetti valutati sulle cellule trattate
Legami covalenti col DNA
Rotture nella catena del DNA
Scambio di cromatidi fratelli
Riparazione del DNA
Test di aberrazioni cromosomicheeffetti valutati sulla cellula durante la fase mitotica
Test del micronucleoeffetti valutati sulle cellule figlie
Test di mutazione genicaperdita di funzione delle cellule figlie
Test di trasformazione cellulareacquisto di proprietà proliferativa
2008© J.F. DESAPHY
Test indicatori
•Formazione di legami covalenti del composto saggiato col DNA
•Composti radioattivi con 3H (costosi)
•Tecniche immunologiche (uso di anticorpi)
•Idrolisi seguita da separazione per HPLC degli aminoacidi modificati
•Idrolisi seguita da marcatura con 32P e separazione per cromatografia
•Induzione di rotture nella catena del DNA
•Eluizione alcalina
•Elettroforesi alcalina su gel di una singola cellula (test di Comet)
Lisi delle cellule trattate con detergenti e proteasi
Eluizione alcalina (pH 12-13) del DNA su filtro poroso
La quantità di DNA eluito dal filtro è proporzionale al numero di rotture
2008© J.F. DESAPHY
Test di aberrazioni cromosomiche
Incubazione di linee cellulari con potenziale clastogene
Blocco delle cellule in metafase con colchicina
Analisi citogenetica per evidenziare aberrazioni strutturali
2008© J.F. DESAPHY
cariotipocolorazione Fish
Fluorescence In situ hybridization
Trisomia 21Rotture del DNA
Scambi intercromosomici
Test del micronucleoCorpuscoli contenenti cromatina e circondati da membrana
costituiti da cromosomi interi o frammenti prodotti durante la divisione cellulare
dopo rotture cromosomiche o danneggiamento dell’apparato mitotico
Identificati al microscopio ottico dopo colorazione della cromatine
2008© J.F. DESAPHY
apoptosi
Si può praticare sia in vitro sia in vivo sul topo (si testano tre dosi di tossico
e si analizzano le cellule progenitrici dei globuli rossi)
Composto apoptotico
Composto
clastogeno
Composto
clastogeno
Test di mutazioni geniche•Test HPRT su cellule CHO (chinese hamster ovary)
6-tioguanina nucleotide citotossico
Basi puriniche libere nucleosidi monofosfatiIpoxantina fosforibosiltransferasi
sintesi DNA
Ipoxantina fosforibosiltransferasi
necrosi
Il composto saggiato in grado di mutare il gene che codifica per l’HPRT sul
cromosoma X renderà le cellule mutate resistenti alla presenza di 6-tioguanina nel
media di coltura
•Test della timidina chinasi su cellule di linfoma di topi (L5178K)
Trifluorotimidina (TFT) TFT fosforilato citotossicoTimidina chinasi
necrosi
2008© J.F. DESAPHY
Test di trasformazione cellulare•Test su linee cellulari di fibroblasti di topo
Cellule con capacità di crescita infinita ma soggette ad inibizione
della proliferazione per contatto con cellule vicine
Disinibizione della proliferazione con formazione di foci costituiti
da cellule ammucchiate facilmente individuabili dopo colorazione
mutagene
•Test su cellule embrionali di hamster siriano
mutagene
Queste cellule isolate da embrioni presentano il vantaggio di aver proprietà di
crescita normali e di possedere un’ampio corredo di enzimi metabolizzanti
Le cellule mutate si riconoscono dalla loro proprietà di crescita disordinata e da
un ratio citoplasma/nucleo assai diverso rispetto alle cellule normale.
2008© J.F. DESAPHY
FINE