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Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Autoassemblage de macromoléculesbiologiques via des poly(pyrroles) et/ou des
nanotubes de carbone fonctionnalisés.
Thèse de doctorat
Jessica BAUR
N
N
N
N
N
N
N
NN
N
N
N
_
_
_
2+O
O
N
O
Cu
O
O
O
OH2
H2O
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Sommaire
Introduction
Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules
Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires
Conclusions et perspectives
Remerciements
1
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Introduction généraleLes biocapteurs
SIGNALRécepteur biologiqueAnalytes Transducteur
ElectrochimiqueGravimétriqueOptique
Oligo-sonde / oligo-cible
Anticorps / antigène
Substrat / enzyme …
Film
Thermique…
• Applications : sciences de la vie (agroalimentaire, médecine…), environnement (pollution),
bioterrorisme
• Etape déterminante : immobilisation du biorécepteur sur le transducteur
→ poly(pyrroles) électrogénérés = versatilité, stabilité, conduction, adressage électrochimique
• Challenges : augmenter les performances (sensibilité, spécificité, stabilité…) et diminuer la taille
→ architectures tridimensionnelles à base de nanotubes de carbone 2
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Introduction généraleLes polymères électrogénérés
adsorption
S P S P S P S P
greffage chimique
S P S P S P S P
électropolymérisation
S P S P S P S P
adsorption greffage chimique électropolymérisation
bonne accessibilitédu site actif
moyen non moyen
stabilité non oui ouitaux d’immobilisation faible moyen fortdénaturation possible
des biomolécules non possible possible
rapidité de mise en œuvre oui non non
3
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Introduction généraleLes polymères électrogénérés
S P S PS P
encapsulation ancrage par interactions affines
S P S P S P S P
systèmes affins les + utilisés :
avidine/biotineadamantane/-cyclodextrine
NTA/Cu2+/histidine
encapsulation interactions affines
bonne accessibilitédu site actif
moyen oui
stabilité oui ouitaux d’immobilisation fort moyendénaturation possible
des biomolécules possible non
rapidité de mise en œuvre oui oui
4
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ Structure : feuillet de graphène enroulé « sans couture ».
→ Les deux types de CNTs :Single-Walled Carbon Nanotubes
SWCNTs
200 nm
Multi-Walled Carbon NanotubesMWCNTs
200 nm
Introduction généraleLes nanotubes de carbone (CNTs) : présentation
5
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ Propriétés :
Conductivités thermique et électrique, résistance mécanique, légèreté.
avantage pour les biocapteurs ou les biopiles : haute surface spécifique (1000 m2.g-1)
→ Inconvénients :
purification difficile et/ou coûteuse (carbone amorphe, graphite, particules de catalyseur…)
solubilisation : mise au point d’un pré-traitement[1]
sans prétraitement, SWCNTs dans le THF avec prétraitement, SWCNTs dans le THF [1] R. Haddad et al. Analyst 2009, 134, 2412-2418.
Introduction généraleLes nanotubes de carbone (CNTs) : présentation
6
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ Quelques méthodes :
Fonctionnalisationdes défauts
Fonctionnalisation
non-covalente
CNTsCNTs
Fonctionnalisation covalente
électropolymérisation
→ Techniques utilisées :
- fonctionnalisation non-covalente par -stacking pour l’immobilisation de la GOX
- combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour l’encapsulation d’une hydrogénase NiFe
Introduction généraleLes nanotubes de carbone (CNTs) : fonctionnalisation
7
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Sommaire
Introduction
Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour
l’immobilisation de biomolécules
• Présentation du poly(pyrrole-NTA) et généralités
• Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH
• Mise en évidence d’une nouvelle interaction
Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les architectures biomoléculaires
Conclusions et perspectives
Remerciements8
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Le pyrrole-NTA : généralités→ Structure[2]
NH
O H
O
NO H
OOH
ON
O
N
NH
NH 2
O HO
N
O –
O
O –
O
O –
O
N NH
NH 2OH
O
Cu 2+
acide nitrilotriacétique = NTA
[2] N. Haddour et al. J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 5752-5753.
Biomolécules marquées avec des histidines immobilisées :
→ l’ADN du VIHcapteur à ADN pour la détection du VIH
→ la glucose oxydase (enzyme modèle)biocapteur enzymatique pour la détection du glucose
→ L’interaction NTA/Cu2+/histidine
9
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Signal irréversible du motif pyrrole
Formation du (poly)pyrrole :→ augmentation du signal électroactif réversible du poly(pyrrole)
Le pyrrole-NTA : généralités→ Etude électrochimique
→ polymérisation du pyrrole-NTA
→ incubation avec Cu2+ (10-2 mol.L-1, 20 min)
→ incubation avec biomolécule marquée avec des
histidines (0,5 mg.mL-1 ; 30 min)
→ Etapes pour l’immobilisation de biomolécules histidinylées
électrode
GOX
GOX
10
[pyrrole-NTA] = 5.10-3 mol.L-1, CH3CN + LiClO4 (0,1 mol.L-1), électrode Pt (Ø = 5 mm), v = 100 mV.s-1
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
capteur à ADN complet
électrode nue électrode recouverte de
Ppyr-NTA
après ancragede His-ADNsonde
sur le Ppyr-NTA
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Caractérisation qualitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde
clichés de microscopie à fluorescence obtenus après incubation avec avidine-FITC et rinçage,
11
séquence His-ADNsonde :
5 -NH′ 2-(His)5-GAGACCATCAATGAGGAAGCTG-3′électrode
NH
NNH
N
N
O–
O
O–
O O–
O
Cu2+
n
N
NH
NNH
N
NH
N
O
N HNH
SS
N H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
FITC
électrode
NH
NNH
N
N
O–
O
O–
O O–
O
Cu2+
n
N
NH
NNH
N
NH
N
électrode
N
O–
O
O –
O O–
O
Cu2+
OH2H2O
n
N
électrode
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Caractérisation quantitative de l’interaction NTA/Cu2+/His-ADNsonde/ADNcible
microbalance à quartz (QCM), quartz d’or modifiés par le poly(pyrrole-NTA)/Cu2+.
mnA
f2F
21
21
20
Equation de Sauerbrey :
(a) His-ADNsonde, (b) B-ADNcible et (c) avidine
Composé F (Hz) m (ng) n (mol) nombre de brins
His-ADNsonde 71 26 3,3.10-12 2.1012
B-ADNcible 44 16 1,5.10-12 9.1011
avidine 276 100 1,5.10-12
recouvrement surface avec His-ADNsonde : 94 %
pourcentage d’hybridation : 45 %
angle surface-duplex d’ADN : 80 °12
solutions dans le PBS (0,05 mol.L-1, pH = 7, NaCl 0,5 mol.L-1) ; débit : 50 µL.min-1
(a) : 0,01 mg.mL-1, (b) : 0,01 mg.mL-1 et (c) : 0,5 mg.mL-1
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
choix de la sonde électrochimique :
1) Fe(CN)63/4- (4.10-3 mol.L-1), Eapp = OCP / ECS et E = 5 mV rms.
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)
avantages : décomposition du processus électrochimique global en processus élémentaires et cible non marquée
résistance trop importante :
utiliser une sonde neutre
13
principe de la spectroscopie d’impédance électrochimique :
2 E
2 I
Ec
Ic
I
E
représentation utilisée : plan complexe de Nyquist
2) hydroquinone (10-3 mol.L-1), Eapp = 0,4 V / ECS et E = 5 mV rms.
gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.
Circuit électrique équivalent modèle
WRTCRel
CDC
ZW
Rel RTC R Re(Z) ()
- Im(Z) () f°
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Ancrage de His-ADNsonde sur le Ppyr-NTA :
Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN :
J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique
[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, E = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.
Ppyr-NTA Solutions contenant 10-8 mol.L-1 d’ADN complémentaire ou non-complémentaire
demi-cercle → RTC
RTC plus importante avec l’ADN
complémentaire
Ppyr-NTA
14
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courbe d’étalonnage : RTC = f([ADNcible]).
gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1
pente = 89,8 .unité log-1
limite de détection : 10-15 mol.L-1
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Etude du capteur à ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique
détermination de la limite de détection du capteur à ADN[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, E = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.
[ADNcible] croissantes entre (a) 10-17 et (f) 3,1.10-6 mol.L-1
RTC augmente avec [ADNcible]
J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072. 15
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Elaboration d’un capteur à ADN pour la détection du VIH→ Etude du capteur à ADN par conductimétrie
courbe d’étalonnage pour f = 3 Hz[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, E = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.
courbe d’étalonnage : Z3Hz = f([ADNcible]).
gamme de linéarité : 10-15 à 10-8 mol.L-1
pente = 82,8 .unité log-1
limite de détection : 10-15 mol.L-1
Z3Hz augmente avec [ADNcible]
16J. Baur et al. Anal. Chem. 2010, 82, 1066-1072.
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ Interaction NTA/Cu2+/histidine performante pour l’immobilisation de l’ADN
→ Soupçons d’interaction entre le polymère et la biotine
Mise en évidence d’une nouvelle interaction entreNTA/Cu2+ et la molécule biotine
17
NTA/Cu2+/(histidine)2
N
NH
NH 2
O HO
N
O –
O
O –
O
O –
O
N NH
NH 2OH
O
Cu 2+
NH
NH
O
S
N
O –
O
O –
O
O –
O
Cu 2+
NHNH
O
S
COOH
COOH
NTA/Cu2+/(biotine)2
[2] R. Griesser et al. Biochemistry 1970, 9, 3285-3293.
interaction entre l’atome S de la biotine
et l’ion Cu2+ démontrée en 1970[2]
→ Démonstration qualitative de cette nouvelle
interaction par microscopie à fluorescence :
cliché obtenus après incubations avec GOX-B et l’avidine-FITC puis rinçage,
Rappel : pas d’ancrage de l’avidine-FITC sur les électrodes
ni sur le Ppyr-NTA/Cu2+
GOX
électrode
N
O–
O
O –
O O–
O
Cu 2+
ONH
N H
S S
NH
NH
O
n
N
O
N HNH
S
SN H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
FITC
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
NH
NH
S
O
N
O–
O–
O–
O
OO
Cu2+
NHNH
S
O
COOH
COOH
Ppyr-NTA
Ancrage de B-ADNsonde sur le Ppyr-NTA :
Détection du phénomène d’hybridation de l’ADN :
Phénomènes d’ancrage et
d’hybridation confirmés
Comparaison des deux
systèmes délicate (interaction
et ADN différents)
Utilisation d’enzyme (GOX)
pour comparaison
J. Baur et al. Electrochem. Commun. 2010, 12, 1287-1290.
Mise en évidence d’une nouvelle interaction NTA/Cu2+/biotine
→ Etude de l’ancrage de l’ADN par spectroscopie d’impédance électrochimique :
18
[hydroquinone] = 10-3 mol.L-1, Eapp = 0,4 V / ECS, E = 5 mV rms, électrode CV (Ø = 3 mm) et gamme de fréquences : 0,1 Hz à 500 kHz.
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Courbes typiques cinétique enzymatique :
I = f([glucose])
→ aux faibles [glucose] : partie linéaire
initiale = sensibilité de l’électrode
→ aux fortes [glucose] : plateau = Jmax,
saturation de l’enzyme en substrat.
Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)
19Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).
GOX
électrode
NH
NNH
N
N
O–
O
O–
O O–
O
Cu2+
n
N
NH
N
N H
N
N H
N
NH
N
GOX
électrode
N
O–
O
O –
O O–
O
Cu 2+
ONH
N H
S S
NH
NH
O
n
N
O
N HNH
S
SN H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
électrode
NH
NNH
N
N
O–
O
O–
O O–
O
Cu2+
n
N
NH
NNH
N
NH
N
O
N HNH
SS
N H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
GOX
O
N HNH
S
SN H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
S
N HNH
O
S
NH
N H
O
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Perméabilités : poly(pyrrole-NTA) : Pm = 10-1 cm.s-1 et poly(pyrrole-biotine) : Pm = 10-3 cm.s-1 (facteur 100)
Performances similaires entre les systèmes NTA/Cu2+/histidine et NTA/Cu2+/biotine
Meilleures performances en présence du duplex d’ADN → + d’enzymes immobilisées (ADN agit comme un
éventail)
Comparaison des résultats obtenus pour l’immobilisation de la glucose oxydase (enzyme modèle)
SystèmePpy-NTA/Cu2+/
His-GOX
Ppy-NTA/Cu2+/
B-GOX
Ppy-NTA/Cu2+/ADNduplex/
avidine/B-GOX
Ppy-biotine/
avidine/B-GOX [3]
Jmax (µA.cm-2) 11,5 13,2 21,8 1
Jmax relatif 100 % 80 % 130 % 10 %
sensibilité
(mA.mol-1.L.cm-2)0,5 0,6 0,9 0,15
sensibilité relative 100 % 80 % 125 % 40 %
activité enzymatique
en solution (U.mg-1)150 220 220 110
[3] S. Cosnier et al. Anal. Chem. 1999, 71, 3692-3697.
référence
20
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
• Avantages du poly(pyrrole-NTA) :→ bonne perméabilité du polymère et faible limite de détection
→ possibilité d’immobiliser des molécules marquées avec des histidines OU des biotines
→ adressage électrochimique propre aux polymères électrogénérés
• Avantages de l’interaction NTA/Cu2+/histidine :→ réversibilité de l’interaction NTA/Cu2+/histidine
• Avantages du nouveau système NTA/Cu2+/biotine :→ par rapport au système NTA/Cu2+/histidine : disponibilité commerciale des molécules biotinylées
→ par rapport au système classique avidine/biotine : meilleures performances
→ alternative séduisante au système avidine/biotine
Conclusions 1ère partie : le poly(pyrrole-NTA)
21
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Sommaire
Introduction
Le poly(pyrrole-NTA) : une plateforme polyvalente pour l’immobilisation de biomolécules
Les nanotubes de carbone et leur incorporation dans les
architectures biomoléculaires
• Fonctionnalisation multiple de CNTs
• Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion d’une réductase
Conclusions et perspectives
Remerciements
22
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ L’interaction CNT/pyrène :
→ Synthèse de pyrènes fonctionnalisés par des partenaires affins :
pyrène-NTA pyrène-biotinepyrène-adamantane
O
OS
O
NH NH
NH
OO
NH
O
OH OO H
N
O
O H
+
Fonctionnalisation multiple des CNTs pour l’immobilisation d’enzymes (GOX)
23
_
_
_
2+N
NCu
O
O
N
O
O
O
O
NN
dépôt SWCNTs dispersés20µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF
séchageélectrode électrode
répétition x2
→ Procédure :trempage de l’électrode dansune solution contenant un oudes pyrènes fonctionnalisés
5.10-4 mol.L-1 dans le THF
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Fonctionnalisation simple des SWCNTs
Système
NTA/Cu2+/histidine
Système
adamantane/-cyclodextrine
24
Système
biotine/avidine/biotinesolutions contenant un des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1)
Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).
NH
NNH
N
N
O–
O
O –
O O–
O
Cu 2+
électrode
GOXNH
N
N H
N
N H
N
NH
N
S
N HNH
O
S
NH N H
O
GOX
électrode
O
N HNH
SS
N H
NH
O
S
NHNHO
S
NH
NH
O
électrode
GOX
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Système Pyrène-NTA/Cu2+/His-GOX
Pyrène-adamantane/-CD-GOX
Pyrène-biotine/avidine/B-GOX
Jmax (µA.cm-2) 44,8 (51 %) 135,4 (100 %) 5,1 (4 %)
sensibilité(mA.mol-1.L.cm-2) 2,38 (45 %) 8,20 (100 %) 0,11 (1 %)
seuil de détection (mol.L-1) 10-5 3,1.10-6 3,4.10-4
gamme de linéarité (mol.L-1) 10-5 – 6,3.10-3 3,1.10-6 – 9,4.10-3 3,4.10-4 – 1,2.10-2
activité de l’enzyme en
solution (U.mg-1)150 230 220
référence
Comparaison des résultats obtenus pour la fonctionnalisation simple des SWCNTs
Système adamantane/-cyclodextrine le plus performant
Gammes de linéarité et seuil de détection similaires entre les systèmes adamantane/-cyclodextrine et
NTA/Cu2+/histidine
Plus mauvais : avidine/biotine → phénomène d’écrantage dû à l’avidine 25
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Fonctionnalisation multiple des SWCNTs
26
mélange équimolaire 1/1/1 des 3 pyrènes (5.10-4 mol.L-1)
Eapp = 0,6 V / ECS, tampon phosphate (0,1 mol.L-1, pH = 7).
ON
O ONH
NH
O S
OH HO
HO
ON
O ONHNH
O
S
OH HO
HO
GOX
avidine-CD-GOX
S
N HNH
O
ON
O ONHNH
O
S
OH HO
HO
GOX
GOX
Cu2+
His-GOX
S
N HNH
O
_
_
_
Cu2+
ON
O ONHNH
O
S
O O
O
GOX
GOX
GOX
NHN
N HN
B-GOX
Département de Chimie Moléculaire
Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
Fonctionnalisation multiple des SWCNTs→ Résultats :
→ Démonstration possibilité de fonctionnaliser les SWCNTs avec les 3 systèmes affins considérés
(NTA/Cu2+/His, avidine/biotine, adamantane/-CD) par simple trempage.
→ Applications : détection multienzymatique à activités combinées, détection de plusieurs analytes…
Enzyme -CD-GOX B-GOX His-GOX
Jmax (µA.cm-2) 5,3 8,4 13,5
sensibilité(mA.mol-1.L.cm-2) 0,30 0,53 0,59
seuil de détection (mol.L-1) 3,6.10-5 3,6.10-5 3,6.10-5
gamme de linéarité (mol.L-1) 3,6.10-5 – 6,3.10-3 3,6.10-5 – 6,3.10-3 3,6.10-5 – 1,6.10-2
activité de l’enzyme en solution (U.mg-1) 230 220 150
27
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
3 clusters FeS
site actifNiFe
→ L’hydrogènase NiFe de Desulfovibrio fructosovorans pour la
bioconversion de l’énergie :
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
Enzyme qui catalyse de façon réversible :
H2 = 2 H+ + 2e-
capacité double :
- transformer H2 en énergie électrique
- stocker H2 → Mode de fonctionnement pour l’oxydation de H2 (transfert d’électrons indirect) :
électrodeH2
2 H+
H2ase oxydée
H2ase reduite MV2+
MV·+
e-
28
→ Combinaison performances CNTs et poly(pyrrole)
H2ase H2ase
H2ase H2ase
électrode de carbone vitreux
H2ase hydrogénase=
viologène=
CNTs=
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
dépôt CNTs : n x 10µL à 0,1 mg.mL-1 dans le THF
mélange H2ase (0,2 mg.mL-1) + pyrrole-MV (4.10-3 mol.L-1) : 10 µL
polymérisation : Eapp = 0,8 V / ECS, H2O + LiClO4 (0,1 mol.L-1).
→ Polymère choisi : le poly(pyrrole-viologène)
viologène = médiateur pour le transfert électronique entre l’enzyme et l’électrode
structure[4] : N
N
N+
+
viologène = MV2+
(médiateur rédox)
dépôt mélangeH2ase + monomère
électro-polymérisation
29[4] S. Cosnier et al. J. Electroanal. Chem. 1997, 433, 113-119.
→ Immobilisation par encapsulation dans le film de poly(pyrrole-viologène) sur des dépôts de CNTs :
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
dépôt SWCNTs dispersés
séchageélectrode électrode
répétition (n fois)
électrode électrodeséchage
H2ase H2ase
H2ase H2ase
électrode
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Biosystèmes Électrochimiques & Analytiques
→ Etude sur électrode de carbone vitreux :
MWCNTs
Meilleures performancesavec les MWCNTs 30
H2ase H2ase
H2ase H2ase
électrode
H2ase hydrogénase=
viologène=
CNTs=
→ Etude sur électrodes de carbone vitreux modifiées par les CNTs :
Jcat = 17 µA.cm-2
SWCNTs
Jcat = 103 µA.cm-2
électrode de carbone vitreux
Jcat = 301 µA.cm-2
quantités d’enzyme et de monomère constantes, dégazage Ar 30 min, H2 30 min puis
activation H2ase : Eapp = - 0,8 V / ECS (15 min) dans le tampon phosphate (0,1 mol.L-1,
pH = 7) et étude dans la même solution par CV et enfin Ar 15 min puis CV.
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
H2ase H2ase
H2ase H2ase
électrode
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→ Caractérisation par microscopie électronique à balayage (MEB) :MWCNTs
avant polymérisation
après polymérisation
Surface « lissée » avec les SWCNTsConservation de la porosité avec les MWCNTs ↔ meilleures performances 31
200 nm 200 nm
200 nm
SWCNTs
200 nm
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
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→ Evolution de l’intensité catalytique en fonction de la quantité de MWCNTs :
Probablement dû à : augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs,meilleure perméabilité,transfert d’électrons facilité du fait d’une meilleure conduction…
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Partielinéaire
quantités d’enzyme et de monomère constantes, seul VMWCNTs change
partie anodique des courbes de voltampérométrie cyclique
courbe Jcat = f(quantité MWCNTs) linéaire
entre 10 et 50 µL de MWCNTs déposés
Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase
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• Fonctionnalisation multiple de SWCNTs :→ mise en œuvre simple par trempage
→ possibilité de fonctionnalisation avec 3 systèmes affins différents
• Combinaison CNTs/poly(pyrrole) pour la connexion électrique d’une hydrogénase→ résultats préliminaires mais prometteurs
→ augmentation du signal obtenu après dépôt de CNTs en général et plus particulièrement avec les MWCNTs
• Nanotubes de carbone : → augmentation de la surface spécifique des électrodes
→ augmentation de la conduction et de la perméabilité des films
Conclusions 2ème partie : les nanotubes de carbone
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CONCLUSIONS GENERALES
• Potentiel des films de poly(pyrrole) et des nanotubes de carbone pour :→ augmenter sensibilité et seuil de détection des architectures biomoléculaires
→ immobilisation de biomolécules en général
→ réaliser systèmes multifonctionnels
→ combinaison des deux : amplification des performances
PERSPECTIVES
• Poly(pyrrole-NTA) : NTA/Cu2+/biotine
→ réversibilité,
→ utiliser dans des biocapteurs (Ab/Ag, ADN…),
→ taux de recouvrement de surface.
• CNTs :→ architecture multifonctionnelle : applications diverses,
→ connexion d’une hydrogénase NiFe : optimisation du système.
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Remerciements
Jury :Rapporteurs : Dr. Elisabeth Lojou et Pr. Alexander Kuhn
Examinateurs : Dr. Gérard Bidan et Pr. Pierre Gros
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Equipe BEA :
Directeurs de thèse : Dr. Serge Cosnier et Dr. Michael Holzinger,
Dr. Chantal Gondran, Arielle Le Pellec, Dr. Alan Le Goff, Dr. Karine Gorgy
Permanents et étudiants du DCM
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Merci pour votre attention!
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Système Pyrène-NTA/Cu2+/His-GOX
Pyrène-adamantane/-CD-GOX
Pyrène-biotine/avidine/B-GOX
temps de réponse (s) 10 30 20
Jmax (µA.cm-2) 44,8 (51 %) 135,4 (100 %) 5,1 (4 %)
sensibilité(mA.mol-1.L.cm-2) 2,38 (45 %) 8,20 (100 %) 0,11 (1 %)
seuil de détection (mol.L-1) 10-5 3,1.10-6 3,4.10-4
gamme de linéarité (mol.L-1) 10-5 – 6,3.10-3 3,1.10-6 – 9,4.10-3 3,4.10-4 – 1,2.10-2
KM apparent(mol.L-1)
11,8.10-3 1,6.10-3 66,4.10-3
activité de l’enzyme en
solution (U.mg-1)150 230 220
Fonctionnalisation simple des SWCNTs
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0.2 0.4
20 µA
E (V vs ECS)
A
, ,
0.2 0.4
quantité deMWCNTs
déposés (µL)
10
20 µA
E (V vs ECS)
2030
40506070100
B
, ,
20
40
60
0 30 60 90
I (µA)
quantité de MWCNTs déposés (µL)
Connexion d’une hydrogénase NiFe sur les MWCNTs→ Etude de l’évolution du signal de Fe(CN)6
4- en fonction de la quantité de MWCNTs :
Courbe I(Fe(CN)64-) = f(quantité MWCNTs) linéaire entre 10 et 60 µL de MWCNTs déposés.
Confirme l’hypothèse d’augmentation de la surface spécifique des électrodes due aux MWCNTs
mais ne la valide pas : vérifier absence d’accumulation de Fe(CN)64- dans les MWCNTs.