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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica
DENGUE: ALVOS MOLECULARES POTENCIAIS E NOVAS
PERSPECTIVAS TERAPÊUTICAS
Mariana Montemagni Pires
Trabalho de Conclusão do Curso de
Farmácia-Bioquímica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas da
Universidade de São Paulo.
Orientador(a):
Profa. Dra Jeanine Giarolla Vargas
São Paulo
2017
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SUMÁRIO
p.
Lista de Abreviaturas 3
Resumo 5
1. Introdução 7
2. Objetivos 13
3. Materiais e Métodos 14
4. Resultados e Discussão 15
4.1. Inibidores de Entrada 18
4.2. Inibidores de Replicação 24
5. Conclusão 31
6. Bibliografia 33
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LISTA DE ABREVIATURAS
ADE Dengue exacerbada dependente de anticorpo (antibody-dependent
enhancement)
AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency
Syndrome)
ALT Alanina aminotransferase
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Brasil
AST Aspartato aminotransferase
βOG N-octil-β-d-glicosídeo
CC50 Concentração do composto que provoca morte em 50% das células
CDC Centro de controle e prevenção da doença (Center for Disease
Control and Prevention)
CRDS Curdlan sulfate compound
DAA Agente antiviral direto (Direct Antiviral Agent)
DENV Vírus da dengue
DF Dengue febril (dengue fever)
DHF Febre hemorrágica (dengue hemorrhagic fever)
DSS Síndrome do choque (dengue shock syndrome)
DWS Dengue com sinais de alarme (dengue with warning signs)
DWWS Dengue sem sinais de alarme (dengue without warning signs)
EC50 Concentração do composto que induz metade do efeito máximo
FcR Receptor Fc (fragment, crystallizable)
GAG Glicosaminoglicano
HCV Vírus da hepatite C
IB Instituto Butantan
IL Interleucina
IMPα/β1 Importina
JAK Via de sinalização extracelular-núcleo (Janus kinase)
MS Ministério da Saúde, Brasil
MTase Metiltransferase
NES Sequência de exportação nuclear (nuclear export signal)
NI Inibidor análogo ao nucleotídeo (nucleotide analog inhibitor)
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NHS Serviço Nacional de Saúde, Reino Unido (National Health Service)
NLS Sequência de importação nuclear (nuclear localization sequence)
NNI Inibidor não-nucleotídico (non-nucleotide inhibitor)
PNCD Plano Nacional de Controle de Dengue
PRR Receptor de reconhecimento padrão (Pattern Recognition Receptor)
RdRp RNA polimerase RNA-dependente
REA Relação Estrutura-Atividade
RMN Ressonância magnética nuclear
RNA Ácido ribonucleico (ribonucleic acid)
SD Dengue grave (severe dengue)
SNC Sistema Nervoso Central
STAT Via de sinalização extracelular-núcleo (Signal Transducer and
Activator of Transcription)
WHO Organização Mundial da Saúde (World Health Organization)
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RESUMO
MONTEMAGNI PIRES, M. Dengue: alvos moleculares potenciais e novas
perspectivas terapêuticas. 2017. Trabalho de Conclusão de Curso de
Farmácia-Bioquímica – Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Universidade
de São Paulo, São Paulo, 2017.
Palavras-chave: Dengue, DENV, novos alvos, tratamento.
INTRODUÇÃO. Segundo a Organização Mundial de Saúde, a dengue é
classificada como doença tropical negligenciada, com alta incidência em países
em desenvolvimento. Não possui tratamento específico, o que contribui para os
elevados números de mortes e hospitalizações nas áreas atingidas. Dessa
forma, o planejamento de compostos específicos, seguros e eficazes para o
tratamento desta infecção é uma necessidade urgente. OBJETIVO. Face ao
exposto, o objetivo deste trabalho é apresentar um panorama geral sobre a
dengue, discutindo, principalmente, sobre alvos moleculares promissores, bem
como moléculas que podem ser úteis no tratamento da doença Pretende-se,
também, apresentar, quando possível, a relação estrutura-atividade destes
antivirais. MATERIAL E MÉTODOS. O trabalho foi realizado através de revisão
bibliográfica. Foram utilizados artigos científicos, em português e inglês,
acessados nas bases de dados Web of Science e PubMed. Alguns websites
também foram consultados. O primeiro passo foi a busca pelos artigos, seguido
pela seleção dos materiais. Prosseguiu-se, então, com uma leitura dinâmica e
com os artigos e publicações selecionados, realizou-se a leitura aprofundada e
as informações obtidas foram analisadas, interpretadas e discutidas.
RESULTADOS. O genoma do vírus da dengue é composto por RNA de fita
simples, senso positivo, que codifica proteínas estruturais, denominadas de
capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E), fundamentais na ligação ao
receptor, fusão de membrana, indutor de resposta imune, hemaglutinação,
formação e maturação do vírion. Já as não-estruturais, NS1, NS2A, NS2B,
NS3, NS4A, NS4B e NS5, são responsáveis pelos processos de replicação,
montagem e evasão da resposta imune do hospedeiro. Algumas moléculas
estão em estudo por atuarem como inibidores destas proteínas. CONCLUSÃO.
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Apresentaram-se 13 moléculas promissoras neste trabalho. Entre elas, quatro
apresentaram eficácia e segurança in vivo (7-DMA/MK-0608, ST-148, ST-610 e
composto 1/NITD008) e nove foram estudadas apenas em testes in vitro
(CRDS, SA-17, NITD448, DN59, 1OAN1, ARDP0006, ARDP0009, composto 32
e ivermectina). Entretanto, nenhuma delas foi estudada em ensaios clínicos,
até então. Já os compostos ST-148 e ST-610 precisam ter seus perfis
farmacocinéticos melhorados para administração oral (BYRD et al., 2013a;
BYRD et al., 2013b), enquanto o composto 1/NITD008 deve ser melhor
estudado em relação à sua toxicidade (YIN et al., 2009). O composto 7-
DMA/MK-0608, por fim, não apresentou nenhum obstáculo em seu estudo in
vivo (SCHUL et al., 2007), portanto ensaios clínicos podem ser realizados para
a molécula.
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1. INTRODUÇÃO
O vírus da dengue (DENV) pertence à família Flaviviridae e gênero
Flavivirus, e possui quatro diferentes sorotipos: DENV-1, DENV-2, DENV-3,
DENV-4. Uma vez infectado por um determinado sorotipo, a imunidade a ele é
vitalícia, porém, em uma posterior infecção, com outro sorotipo, há
possibilidade de desenvolver formas graves da doença (MURRAY, QUAM,
WILDER-SMITH, 2013).
Apesar de a dengue causar grandes impactos econômicos e sociais,
ainda existe um descaso nas políticas públicas com campanhas de controle e
incentivo à pesquisa. Desta forma, a doença foi classificada como uma Doença
Tropical Negligenciada, e é considerada uma prioridade para a Organização
Mundial de Saúde (WHO, do inglês World Health Organization). Esta
Organização lançou o programa “Global Strategy for Dengue Prevention and
Control 2012-2020”, com o objetivo de reduzir a epidemia e seus impactos
(WHO, 2012). Denominam-se Doenças Tropicais Negligenciadas infecções
parasitárias, virais, bacterianas ou fúngicas, as quais afetam, principalmente,
populações carentes de países em desenvolvimento. Na América Latina,
estima-se que 40% da população, o que corresponde a 556 milhões de
pessoas, viva abaixo da linha da pobreza (HOTEZ et al., 2008).
A virose não possui tratamento específico, portanto seu controle
depende de políticas públicas de controle dos vetores (MURRAY, QUAM,
WILDER-SMITH, 2013). No Brasil, o Ministério da Saúde, com o objetivo de
controlar a epidemia de dengue após a detecção da cocirculação de três
sorotipos no país, implementou, em 2002, o Plano Nacional de Controle da
Dengue (PNCD). Este plano, no entanto, não atingiu suas metas e a doença
espalhou-se rapidamente por todo o país (PESSANHA et al., 2009).
O primeiro caso de dengue, atualmente conhecido, ocorreu durante a
Dinastia Chinesa, em que sintomas compatíveis com a doença e uma possível
relação com insetos voadores foram descritos em uma enciclopédia médica. O
vetor A. aegypti tem origem incerta, mas acredita-se que ele tenha se
espalhado a partir de navios saindo da África e Ásia entre os séculos XVIII e
XIX. Durante as guerras mundiais a doença expandiu-se rapidamente e, no fim
da Segunda Guerra Mundial, cocirculação de sorotipos e surgimento de formas
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graves da doença foram reportadas na Ásia (MURRAY, QUAM, WILDER-
SMITH, 2013).
Cerca de 3,9 bilhões de pessoas moram em regiões com alto risco de
infecção por dengue, que já atinge 128 países (WHO, 2017). Hales e
colaboradores (2002) acreditam que, até 2085, ao menos 50% da população
mundial estará vivendo em regiões endêmicas (HALES et al., 2002). De acordo
com a WHO, a incidência da doença é de 350 milhões de infecções por ano,
com 96 milhões de pessoas apresentando sintomas (WHO, 2017). Estima-se
que 70% das infecções ocorram na Ásia, 14% nas Américas e 16% na África
(EBI, NEALON, 2016). Entretanto, sabe-se que os números de casos
reportados de infecções, DHF/DSS (do inglês dengue hemorrhagic fever, DHF,
ou síndrome do choque, do inglês dengue shock syndrome, DSS) e morte não
condizem com a realidade.
No Brasil, DENV-1 foi identificado em 1846, DENV-2 em 1990, DENV-3
em 2001 e DENV-4 em 2010 (PASTRANA et al., 2014). Todos os quatro
sorotipos cocirculam no País. Em 2009, o Brasil apresentava o maior número
de casos de dengue no mundo (TEIXEIRA et al., 2009). Somente em 2010, 1
milhão de casos foram reportados no país, com uma taxa de infecção de
538/100.000 habitantes, levando a 94 mil hospitalizações e 678 mortes
(TEIXEIRA et al., 2013). Isso representa cerca de 60,4% de todos os casos
reportados no mundo (MACHADO et al., 2014).
Grandes epidemias de dengue são comuns no continente americano,
sobretudo em países do Caribe, Brasil, Colômbia, Equador, México e
Venezuela. Na América Latina, o número de infecções continua aumentando
de forma alarmante. Em 2011 foram relatados 652.212 casos, já em 2013 o
número subiu para 2.386.836. No mesmo período, o número de mortes
aumentou de 92 para 1.318 (SARTI et al., 2016). Esse perfil também pode ser
visto ao se comparar o número total de casos relatados na década de 80 com
os observados entre 2000 e 2007, que aumentou de 1.033.417 para 4.759.07.
A incidência de DHF/DSS também aumentou no continente, de 13.398, na
década de 80, para 111.724, entre 2000 e 2007, o que pode ser explicado pela
cocirculação dos 4 sorotipos do vírus (MARTÍN et al., 2010). O custo anual da
doença na América chega a US$ 2.1 bilhão, em que 60% corresponde à perda
de produtividade (SHEPARD et al., 2011).
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Dentre os quatro sorotipos, DENV-2 é considerado o mais relevante
por apresentar a maior população efetiva, enquanto DENV-1 e 3 têm
apresentado alto crescimento (COSTA, VOLOCH, SCHRAGO, 2012). Em
relação aos vetores, Kraemer e colaboradores (2015) mapearam a distribuição
do A. Aegypti e A. Albopictus a partir de estudos publicados entre 1960 e 2014.
O A. Aegypti é encontrado, principalmente, em regiões tropicais e subtropicais,
concentrando-se no norte do Brasil e sul da Ásia. Já o A. Albopictus é visto em
regiões com temperaturas mais amenas, concentrando-se no sul da Europa e
do Brasil, além do norte da China, Estados Unidos e Japão (KRAEMER et al.,
2015). O crescente aumento da incidência da virose pode ser explicado pela
maior distribuição destes dois vetores, devido à ineficácia de programas de
controle dos vetores, urbanização, migrações e inundações (TORRES,
CASTRO, 2007).
O ciclo de vida do vírus inicia-se com a ingestão, pela fêmea do A.
Aegypti, de sangue ao picar um indivíduo com viremia. Com isso, ocorre
infecção das células epiteliais do intestino e, em seguida, da hemocele e, por
último, da glândula salivar. O período de incubação, necessário para o
mosquito ser transmissor da doença, é de 8 a 12 dias. Após este período, ao
picar um indivíduo, o mosquito transmite a doença por infectá-lo com o vírus
secretado na saliva. Além da transmissão ao ser humano, também ocorre
transmissão vertical, uma vez que o vírus é capaz de infectar o trato genital e
entrar nos ovos maduros durante a oviposição (POOJA, AMRITA, VINEY,
2014).
A dengue pode ser assintomática ou manifestar-se como dengue febril
(do inglês dengue fever, DF), febre hemorrágica (DHF) ou síndrome do choque
(DSS) (WHO, 2009). Estas denominações foram revisadas em 2009, a fim de
facilitar a identificação de pacientes com maiores riscos de desenvolver
complicações. Basearam-se, então, nos sintomas e sinais indicativos de
desfecho grave da doença (MACHADO et al., 2014). A nova classificação
compreende, atualmente, dois grandes grupos subdivididos em um total de
cinco classificações, de acordo com a gravidade dos sinais e sintomas:
Dengue:
o com sinais de alarme (do inglês dengue with warning signs, DWS):
indivíduo vive ou viajou para área endêmica e apresenta, além de febre, dois
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dos seguintes critérios: náusea, vômito, rash, dores, leucopenia e teste positivo
para torniquete;
o sem sinais de alarme (do inglês dengue without warning signs, DWWS):
indivíduo apresenta dor abdominal, vômito persistente, acúmulo de fluídos,
sangramento de mucosa, letargia, inquietação, hepatomegalia maior que 2 cm,
aumento de hematócrito com rápida diminuição das plaquetas;
Dengue grave (do inglês severe dengue, SD):
o Grave extravasamento de plasma: acúmulo de fluido com dificuldade
respiratória; pode levar ao choque;
o Grave hemorragia: conforme avaliação médica;
o Grave disfunção orgânica: fígado com AST ou ALT abaixo de 1000,
sistema nervoso central (SNC) com consciência prejudicada, coração ou outros
órgãos (WHO, 2009).
Em 2014, o Brasil começou a utilizar a nova classificação como base e
estabeleceu, no guia do Ministério da Saúde, as seguintes denominações:
Fase Febril: febre com duração de 2 a 7 dias concomitante com cefaleia,
fraqueza muscular, mialgia, artralgia e dor retro-orbitária; pode haver
exantema, anorexia, náusea, vômito e diarreia;
Fase Crítica:
o Dengue com sinais de alarme: a diminuição da febre é acompanhada
por sinais de alarme como dor abdominal, vômitos persistentes, acúmulo de
fluídos, hipotensão postural, hepatomegalia maior que 2 cm, sangramento de
mucosa, letargia, inquietação, aumento de hematócrito;
o Dengue Grave: extravasamento de plasma com acúmulo de fluídos e
dificuldade respiratória, sangramento grave ou disfunção orgânica com
comprometimento do fígado, coração, SNC, pulmão e rins;
Choque: ocorre devido ao alto extravasamento de plasma durante
24-48 horas, e pode levar à morte em apenas 12 horas se não tratado
rapidamente; pode haver disfunção cardíaca grave, síndrome da angústia
respiratória e pneumonite;
Hemorragia grave: grande hemorragia sem choque prolongado;
Disfunção grave de órgãos: hepatites, encefalites, miocardites;
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Fase de Recuperação: reabsorção do fluido, normalização do débito
urinário; podem ocorrer bradicardia, rash e até infecções bacterianas (MS,
2016).
Atualmente não existe tratamento antiviral contra a dengue (CDC,
2016; NHS, 2016). Pacientes são tratados, basicamente, com terapia de
suporte e fluidos. Diagnóstico rápido e correto, no início da doença, é
importante para definir qual terapia será realizada, iniciá-la rapidamente e evitar
hospitalizações desnecessárias. Da mesma forma, o monitoramento contínuo,
em busca de sinais de alarme, é fundamental a fim de evitar a progressão da
infecção para a fase crítica, bem como para o choque. A terapia indicada pelo
Ministério da Saúde é definida conforme classificação A-D, baseada no
diagnóstico recebido:
Grupo A: pacientes diagnosticados com dengue em fase febril sem
sinais de alarme, comorbidades e risco social. Monitoramento em busca de
sinais de alarme deve ser realizado diariamente por um profissional da saúde.
A terapia é realizada em casa, com hidratação oral a base de soro, sucos e
outros líquidos que permitam a recuperação dos eletrólitos perdidos durante a
febre e vômitos. Paracetamol pode ser utilizado para febre. Anti-inflamatórios
não esteroides não devem ser administrados, pois podem agravar
sangramentos;
Grupo B: pacientes diagnosticados com dengue em fase febril sem
sinais de alarme, mas com comorbidades e/ou risco social e/ou condição
especial. Monitoramento constante da contagem de hematócritos e em busca
de sinais de alarme. O paciente é hospitalizado em leito de observação, mas a
terapia também se baseia em hidratação oral e paracetamol, se necessário;
Grupo C: pacientes diagnosticados com dengue com sinais de alarme,
mas sem sinais de gravidade. Contagem de hematócritos deve ser realizada
antes do início da terapia e monitorada continuamente ao longo do tratamento.
O paciente é hospitalizado em leito de internação e a terapia de hidratação é
intravenosa;
Grupo D: pacientes diagnosticados com dengue grave. Contagem de
hematócritos deve ser continuamente monitorada. O paciente é hospitalizado
em leito de emergência para terapia com fluido isotônico cristaloide
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intravenoso. Realiza-se transfusão de sangue naqueles com hemorragia grave
ou choque (MS, 2016; WHO, 2009).
A única vacina registrada no país, Dengvaxia®, foi desenvolvida pela
Sanofi-Aventis com vírus quimérico dos quatro sorotipos de DENV, obtidos por
tecnologia de DNA recombinante. Associou-se o vírus atenuado da febre
amarela e os sorotipos de DENV. O registro foi concedido pela Agência
Nacional de Vigilância Sanitária em 28/12/2015 e a vacina encontra-se
disponível somente em clínicas particulares (ANVISA, 2017b; G1, 2016; Sanofi
Pasteur, 2017). O Instituto Butantan também vem investindo em uma vacina
tetravalente com vírus atenuado, que se encontra em fase três da pesquisa
clínica (IB, 2017; Portal Brasil, 2016).
O desenvolvimento de uma vacina, no entanto, representa grandes
desafios, uma vez que ela deve imunizar o indivíduo, de forma vitalícia,
igualmente e simultaneamente, contra os quatro sorotipos. A vacina com vírus
atenuados, apesar de eficaz, apresenta algumas desvantagens como a
necessidade de doses de reforço, em intervalos de pelo menos seis meses. A
inoculação isolada não induz imunização à todos os sorotipos. Desta forma,
existe um risco de a resposta incompleta induzida pelas imunizações iniciais
exacerbar a resposta imunológica, caso o indivíduo se infecte pela doença
durante o período entre as doses (POOJA, AMRITA, VINEY, 2014).
Devido à inexistência de tratamentos específicos, ressalta-se a
importância do planejamento de antivirais seguros e eficazes potencialmente
ativos nesta enfermidade. As evoluções nos métodos de identificações de alvos
moleculares, tais como nas técnicas de raios-X e ressonância magnética
nuclear (RMN), permitiram grandes avanços no campo da química
farmacêutica medicinal (FERREIRA et al., 2015). Mais de 100.000 proteínas
tiveram suas estruturas reconhecidas, fornecendo informações cruciais no
design de um líder (BERMAN, 2000; FERREIRA et al., 2015). Assim, a
estratégia de Structure Based Drug Design tornou-se muito importante no
desenvolvimento de um fármaco (BLUNDELL, 1996; SALUM, POLIKARPOV,
ANDRICOPULO, 2008; MOITESSIER et al., 2016).
Alguns estudos mostraram que DENV-2 e 3 estão mais associados à
DHF, e que DENV-2 asiático é mais virulento que DENV-2 americano, já que o
último está mais associado à DF. Alterações de nucleotídeos foram
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identificadas nos genes de algumas proteínas, em especial no aminoácido de
posição 390 da glicoproteína E, sítio ligado à especificidade ao alvo e virulência
(RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010).
As proteínas, estruturais e não-estruturais, fundamentais para o ciclo
de infecção e replicação viral, constituem, portanto, importantes alvos
moleculares. Tais proteínas, assim como moléculas com potenciais ações
sobre elas e, assim, promissoras no tratamento da dengue, serão discutidas
adiante neste trabalho. Um tratamento ideal para a dengue deve apresentar as
seguintes características: (1) ser eficaz contra os quatro sorotipos do vírus,
com perfil de segurança bem tolerado em todas as faixas etárias; (2) ter baixa
toxicidade e interação com outros medicamentos; (3) apresentar rápida ação e
resolução dos sintomas, de preferência para administração oral, em dose única
diária, a fim de aumentar a aderência ao tratamento e diminuir os custos com
internações e (4) deve ser estável em temperatura ambiente, a fim de facilitar
sua distribuição para zonas rurais e de baixo custo. Ressalta-se que os países
mais afetados também estão entre os mais pobres (CHAN, OOI, 2015; LIM et
al., 2013). Um dos principais problemas em torno de terapias com agentes
antivirais diretos (DAA, do inglês direct antiviral agents) é a rápida queda na
viremia, que reduz em 10 vezes dentro de 24 horas e em 100 vezes dentro de
48 horas. Questiona-se, assim, se este tipo de abordagem é realmente útil para
o tratamento da dengue. Assim, o antiviral deve ter ação rápida e o diagnóstico
deve ser realizado o mais cedo possível, o que não é realidade para grande
parte da população em risco de infecção (LIM et al., 2013).
2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS
A dengue representa um problema de saúde pública em muitos países
e regiões. O esquema terapêutico constitui, basicamente, do controle dos
sinais e sintomas da doença. Assim, o planejamento de compostos específicos,
seguros e eficazes para o tratamento desta infecção é uma necessidade
urgente. Face ao exposto, o objetivo deste trabalho é apresentar um panorama
geral sobre a dengue, discutindo, principalmente, sobre alvos moleculares
promissores, bem como moléculas que podem ser úteis no tratamento da
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virose. Pretende-se apresentar, quando possível, a relação estrutura-atividade
destes antivirais.
3. MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado através de revisão bibliográfica. Utilizaram-se
artigos científicos, em português e inglês, acessados nas bases de dados Web
of Science e PubMed. Consultaram-se, também, alguns websites.
O primeiro passo foi a busca pelos artigos, entre 23 de Julho de 2016 e
20 de abril de 2017, realizada usando-se os seguintes descritores: dengue,
DENV, DHF, alvos moleculares, targets, doenças negligenciadas, neglected
tropical diseases, antiviral agents, tratamento, treatment, inhibitor. Devido à
grande quantidade de material relacionado à dengue, a coleta de artigos foi
restrita àqueles que apresentassem os descritores em seu título ou abstract.
Publicações em websites também foram pesquisadas usando-se as mesmas
palavras-chave no buscar do Google. Restringiu-se somente a materiais
publicados nos últimos 10 anos, ou anterior a isso, no caso de artigos com
grande número de citações.
Realizou-se a primeira seleção dos artigos e publicações através da
leitura do título e seu abstract, ou resumo, se aplicável. Em um segundo
momento, prosseguiu-se com uma leitura dinâmica, a fim de selecionar aqueles
materiais de interesse para o trabalho. Ao todo, selecionaram-se 60 artigos,
publicações e websites. Com os artigos e publicações escolhidos, prosseguiu-
se com a leitura aprofundada e registro das informações extraídas. Por fim, as
informações obtidas foram analisadas, interpretadas e discutidas através de
uma leitura analítica e readequação do texto.
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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O genoma do vírus da dengue é composto por RNA de fita simples,
senso positivo, de aproximadamente 11 kb, que codifica proteínas estruturais e
não-estruturais (Figura 1). As proteínas estruturais são denominadas de
capsídeo (C), membrana (M) e envelope (E), já as não-estruturais são NS1,
NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (KAPTEIN, NEYTS, 2016).
Figura 1. Estruturas das proteínas e as regiões da fita de RNA onde elas
estão inseridas (adaptado de TOMLINSON, MALMSTROM, WATOWICH, 2009).
A proteína C, formada por quatro α-hélices (α1 – α4), é rearranjada em
dímeros para formar uma molécula côncava, com as hélices α4 - α4’
constituindo a base, responsável pela interação com o RNA. As hélices α2- α2’
e α1- α1’, no topo da estrutura, estão envolvidas com membranas (BYRD et al.,
2013a). A proteína M contém sete cadeias β antiparalelas, estabilizadas por
três ligações dissulfeto. Esta proteína pode ser encontrada nas células
infectadas como proteína pré-membrana (prM). Sua transformação, em
proteína de membrana, ocorre com a liberação do vírion no meio extracelular, e
é fundamental na formação e maturação do vírion. A glicoproteína E é
composta por três domínios: (1) domínio I, com localização central; (2) domínio
II contém uma alça interna e está envolvido na fusão e dimerização da proteína
E. Nele está, também, a maioria dos grupos e subgrupos de epítopos cross-
reativos e (3) domínio III é semelhante à imunoglobulina. Acredita-se interagir
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com o receptor, com funções de ligação ao alvo, fusão de membrana, induzir
resposta imune e provocar a hemaglutinação. Por esta razão, é considerado
um importante imunógeno (POOJA, AMRITA, VINEY, 2014). Ademais, sabe-se
que a glicoproteína E é o principal alvo de anticorpos neutralizantes durante a
infecção (YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).
As proteínas não-estruturais participam, principalmente, dos processos
de replicação, montagem e evasão da resposta imune do hospedeiro (LIM et al,
2013), são elas:
NS1 é uma glicoproteína de 50 kDa, secretada por células infectadas na
forma de hexâmero. A hipótese de sua ação está relacionada com o
mecanismo de patogênese da doença, uma vez que é detectada do início da
infecção até a recuperação, além de apresentar grandes quantidades nos
casos de choque (YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).
NS2A, NS4A, NS4B e NS5 estão envolvidas na inibição da resposta
inata mediada por IFN tipo 1, pois reduzem a ativação de STAT (RODENHUIS-
ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010). A proteína NS5, uma das mais estudadas,
contém um domínio metiltransferase (MTase) no N terminal, além de um
domínio RNA polimerase RNA-dependente (RdRp), no C terminal. Já a NS3
possui como domínio N terminal uma serina endoprotease e, como domínio C
terminal, RNA trifosfatase e helicase. Por fim, NS2A, NS2B, NS4A e NS4B
atuam na formação do complexo de replicação viral (LIM et al, 2013).
O ciclo de replicação do vírus da dengue inicia-se com a adsorção à
célula, promovida pela glicoproteína E, e endocitose mediada por clatrina
(Figura 2). Na vesícula, a acidez promove uma reorganização das proteínas E,
de dímeros para trímeros. Essa mudança expõe a alça do domínio II, que
promove a fusão do vírus com a membrana endossomal, liberando o
nucleocapsídeo viral no citoplasma da célula hospedeira. Na célula, ocorre o
desnudamento e o RNA é traduzido como uma única proteína. No retículo
endoplasmático, ocorre o processamento desta proteína por proteases, com a
separação entre as diversas proteínas estruturais e não-estruturais. As
proteínas não-estruturais iniciam a replicação do genoma viral e o novo RNA é,
então, envolto pela proteína C para formar o nucleocapsídeo. No retículo
também é sintetizada a bicamada lipídica que envolve o nucleocapsídeo. A
bicamada é formada por 180 cópias de glicoproteína E e proteína prM, que se
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associam em trímeros contendo três E e três prM cada. Nesta etapa, a prM
atua como chaperona, impedindo a fusão hidrofóbica entre a alça do domínio II
da E e as membranas da célula. O complexo prM-E é transformado ao longo
do complexo de Golgi, devido ao pH ácido. Ocorre a clivagem de prM pela
protease furina e rearranjo da proteína E em 90 dímeros. Após esta
transformação, o vírion é liberado para o meio extracelular. Essa estrutura,
composta por um envelope icosaédrico e nucleocapsídeo esférico, compõe um
vírion maduro, isolado inicialmente por Hotta e Sabin na década de 40
(LAUGHLIN et al., 2012; RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010;
YACOUB, MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).
Figura 2. Ciclo de replicação do vírus da dengue (adaptado de RODENHUIS-
ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010).
Ainda não se conhecem os alvos celulares do vírus da dengue, mas
estudos identificaram monócitos, macrófagos e células dendríticas como
possíveis locais de ação. Estes alvos, avaliados em humanos e ratos,
apresentam os receptores Fc (FcR) (LAUGHLIN et al., 2012; RODENHUIS-
ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010; YACOUB, MONGKOLSAPAYA,
SCREATON, 2016)
18 de 39
Na imunidade inata, células infectadas produzem IFNs do tipo 1 e 2,
após interação do vírus com receptores PRRs. Com isso, há ativação de
JAK/STAT e expressão de dezenas de proteínas efetoras, o que leva à
mudanças metabólicas e à resposta imune adaptativa, com maturação das
células dendríticas e ativação de linfócitos T e B. A imunidade humoral é
desenvolvida após seis dias da infecção, e anticorpos são direcionados
sobretudo às proteínas E, prM e NS1. Os anticorpos neutralizantes mais
potentes atuam principalmente no domínio III da glicoproteína E, impedindo a
ligação do DENV com os receptores celulares. Bloqueiam, desta forma, a
entrada do vírus na célula. No entanto, isso não neutraliza a infecção, já que
anticorpos não são capazes de atuar em vírus já internalizados por células
FcR. Este mecanismo é descrito como uma hipótese para o desenvolvimento
de ADE (do inglês, antibody-dependent enhancement), que ocorre quando um
indivíduo apresenta uma segunda infecção pelo vírus, mas de outro sorotipo,
com desenvolvimento de um quadro mais grave da doença. A infecção destas
células pelo vírus, além de suprimir a resposta imune inata, ativa as células T e
há, assim, grande liberação de citocinas, causando dano das células
endoteliais e, por fim, extravasamento de plasma (LAUGHLIN et al., 2012;
RODENHUIS-ZYBERT, WILSCHUT, SMIT, 2010; YACOUB,
MONGKOLSAPAYA, SCREATON, 2016).
4.1. Inibidores de entrada
A Tabela abaixo apresenta as estruturas químicas dos compostos
discutidos nesta seção (Tabela I).
19 de 39
Tabela I. Estruturas químicas dos Inibidores de entrada
CRDS (ICHIYAMA et al., 2013)
NITD448 (POH et al., 2009)
SA-17 (LIM et al., 2013)
Alguns compostos estão em estudo devido à capacidade de se ligarem
à proteína E, inibindo a adsorção e/ou fusão do vírus com a membrana
endossomal. Impedem, assim, sua entrada na célula (CHAN, OOI, 2015).
CRDS (do inglês, curdlan sulfate compound) é um grupo de moléculas
que possuem em sua estrutura química uma cadeia β-D-(1→3) glucano com
ácido piperidina-N-sulfônico, diferenciando-se pelo grau de sulfatação e massa
molecular (Tabela I). Este composto é estudado para o tratamento de HIV e
20 de 39
age impedindo a entrada do vírus na célula hospedeira, no início da doença.
Ichiyama e colaboradores (2013) comprovaram que CRDS interfere em
mecanismos de adesão e fusão do vírus DENV, previnindo, em pelo menos
60%, o desenvolvimento de ADE. Bloqueia, também, a formação de syncytia
(fusão de células infectadas). Adicionalmente, induz alterações estruturais nos
vírions, os quais formam agregados após o tratamento. Além disso, o estudo
mostrou eficácia in vitro contra os quatro sorotipos da dengue (EC50 = 0,262
mg/mL para DENV-1; EC50 = 0,007 mg/mL para DENV-2; EC50 = 0,01 mg/mL
para DENV-3; EC50 = 0,069 mg/mL para DENV-4). O mecanismo de ação
ainda não foi definido. Acredita-se que a molécula atue inibindo a internalização
do vírus por endocitose, além da fusão pH-dependente com a membrana
endossomal. Isso ocorre porque o CRDS se liga à proteína E no chamado βOG
binding pocket, cavidade hidrofóbica da proteína, contornada pela alça ‘kl’,
localizada entre dois monômeros nos domínios II e III-I, próximo à alça de
fusão (Figura 3). A cauda da molécula, por sua vez, interage com resíduos 100
a 108 do domínio II, vizinhos à alça de fusão. Esta alça ‘kl’ compreende os
peptídeos 268 a 280 e é de grande importância para a mudança de
conformação da proteína E, em trímero. Na ligação de CRDS ao βOG binding
pocket, há formação de ligação de hidrogênio com Gli 275 e interação
hidrofóbica com Asn 276, resíduos da alça ‘kl’. O efeito final observado é o
comprometimento da fusão do vírus com a membrana endossomal da célula
hospedeira. Há, então, a conversão da proteína E em trímero e, assim, as
exposições da alça do domínio II, estão impedidas. A presença da molécula
entre os monômeros causa, igualmente, impedimento estérico. A alça ‘kl’ não
consegue rotacionar os domínios II e III, movimento necessário para a
conversão. Dentre as interações de CRDS com a proteína, existem ligações de
hidrogênio com os resíduos His 244, Lis 310, Asn 153 e Lis 247 e interações
hidrofóbicas com Trp 101, Asn 103, His 244 e Gli 28. A ligação de hidrogênio
com Lis 310 é especialmente importante, pois, neste sítio, ocorre, também, a
ligação com o receptor GAG, mediador da adesão do vírus à célula hospedeira.
Além disso, a carga negativa dos grupos sulfato interage com a carga positiva
das glicoproteínas do vírus, causando alterações estruturais. Essas
modificações podem levar à agregação dos vírions, além da possível
modificação conformacional, responsável por impedir a adesão do agente
21 de 39
causador à célula hospedeira. Por fim, um estudo de relação estrutura-
atividade mostrou que, quanto maior a massa molecular, maior a eficácia da
molécula (ICHIYAMA et al., 2013).
Figura 3. Representação das interações entre CRDS e βOG binding pocket
(adaptado de ICHIYAMA et al., 2013).
Outro composto potencial é o SA-17, derivado da doxorubicina (Tabela
I). A doxorubicina é uma antraciclina utilizada como antibiótico antineoplásico.
É obtida a partir de Streptomyces peucetius, apresentnado atividade in vitro
contra alguns flavivirus, incluindo DENV-2 (EC50 = 0,67 ± 0,37 µg/mL).
Entretanto, possui alta citotoxicidade e atividade citostática (CC50 = 13 ± 0,7
22 de 39
µg/mL). SA-17, por sua vez, apresentou atividade in vitro contra DENV-1 e
DENV-3, e duas vezes maior contra o DENV-2 (EC50 = 0,34 ± 0,20 µg/mL), e
menor citotoxicidade (CC50 = 28 ± 2,7 µg/mL) (KAPTEIN et al., 2010). Em um
estudo, observou-se que o composto atua no início do ciclo de reprodução do
vírus, reduzindo adesão e fusão às células hospedeiras (KAPTEIN et al., 2010;
AYALA-NUÑEZ et al., 2013). Seu mecanismo e REA não foram totalmente
elucidados, mas estudos mostraram que SA-17 se liga diretamente ao vírion,
no βOG binding pocket da proteína E (Figura 4). Interage, igualmente, com os
resíduos Ala 50, Tyr 137 e Gln 200 através de ligações de hidrogênio, com os
resíduos Thr 48, Pro 53, Lis 128, Leu 135, Phe 193, Leu 198, Ala 205, Ile 270,
Gln 271, Thr 280 e Gli 281 por interações hidrofóbicas, sendo os resíduos Thr
48 e Ala 50 essenciais para a fusão do vírus à membrana endossomal (AYALA-
NUÑEZ et al., 2013; KAPTEIN et al., 2010).
Figura 4. Representação das interações entre SA-17 e βOG binding pocket
(KAPTEIN et al., 2010).
23 de 39
Poh e colaboradores (2009) estudaram a atividade in vitro do composto
NITD448 (Tabela I). Os experimentos comprovaram a capacidade de inibir a
infecção por dengue (EC50 = 9,8 µM), de suprimir a reprodução viral com 25
µM, além da citotoxicidade de CC50 = 49 µM. Acredita-se que o composto atue
inibindo a fusão do vírus à membrana endossomal, por interação do carboxilato
do anel cromenona com os resíduos Lis 128 e Gln 52 da proteína E. A ligação
do triflúor-fenil com βOG binding pocket também parece ser importante (Figura
5) (POH et al., 2009).
Em vermelho: ligações de hidrogênio
Em cinza: interações hidrofóbicas
Figura 5. Representação das interações entre NITD448 e βOG binding
pocket (POH et al., 2009).
Dois peptídeos foram estudados in vitro devido à capacidade de inibir
infecção por dengue e ADE. O alvo era a glicoproteína E. DN59
(MAILGDTAWDFGSLGGVFTSIGKALHQVFGAIY), EC50 de 6 µM, mimetiza a
haste pré-membrânica da proteína E (aminoácidos 412 a 444) e se liga à
proteína E trimérica, impedindo a fusão (LIM et al., 2013; NICHOLSON et al.,
2011). Adicionalmente, o peptídeo leva à liberação de RNA pelo vírus, através
da formação de poros em sua membrana de bicamada lipídica. Interage,
igualmente, com vesículas lipídicas em competição com a haste pré-
membrânica da proteína E, embora a concentração necessária para produzir
este efeito seja muito maior (EC50 = 17 µM) (LOK et al., 2012). Foi
24 de 39
demonstrado, ainda, que os aminoácidos 419 a 440 são responsáveis pela
afinidade do peptídeo à proteína E. Já os 441 a 444 estão envolvidos na
interação com a membrana do vírus. Portanto, substituições nos aminoácidos
419 a 440 levam à perda de atividade. Por outro lado, modificações em 441 a
444 modelam a eficácia do peptídeo: quanto mais hidrofóbica for esta região,
melhor é a atividade antiviral, já que aumenta a interação com a membrana da
bicamada lipídica viral (SCHMIDT, YANG, HARRISON, 2010). 1OAN1
(FWFTLIKTQAKQPARYRRFC), com EC50 de 3 µM, mimetiza a região
responsável pela conexão dos domínios I e II (aminoácidos 41 a 60) e interage
com proteínas E monoméricas. Altera, portanto, a estrutura da superfície dos
vírions e a simetria icosaédrica do vírus, bloqueando adesão e fusão (COSTIN
et al., 2010; NICHOLSON et al., 2011; LIM et al., 2013).
4.2. Inibidores de replicação
A Tabela II apresenta as estruturas químicas dos compostos discutidos
nesta seção.
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Tabela II. Estruturas químicas dos inibidores de replicação
ARDP0006 (LIM et al., 2013)
ARDP0009 (TOMLINSON et al., 2009)
7-DMA/ MK-0608 (CARROLL et al., 2009)
Composto 1/ NITD008 (CHEN et al., 2010)
Composto 32 (STEUER et al., 2011)
Ivermectina (LIM et al., 2013)
N S
NH2
O
HN
S
NN
ST-148 (SCATURRO et al., 2014)
ST-610 (BYRD et al., 2013a)
Byrd e colaboradores (2013) demonstraram que o composto ST-148
(Tabela II) é capaz de diminuir a replicação dos quatro sorotipos da dengue em
células hospedeiras. Os achados mostraram a diminuição da viremia em 52
vezes, se administrado por via intravenosa, ou em 3 vezes, se administrado via
oral, sem apresentar citotoxicidade. Reduziram, ainda, os níveis de citocinas
inflamatórias, em testes in vivo (BYRD et al., 2013a). ST-148 reduz a
quantidade de proteína C (capsídeo), disponível para a montagem dos vírions.
26 de 39
O composto compromete a redistribuição desta proteína do citosol para o
nucléolo, além da ligação às gotículas de lipídeo derivada do retículo
endoplasmático (BYRD et al., 2013a; SCATURRO et al., 2014). Além disso,
provoca estabilização da interação entre os dímeros de proteína C, formando
oligômeros, após o tratamento. O resultado final é a diminuição da replicação
viral e, portanto, da viremia. Esta estabilização afeta, também, a capacidade do
vírus em infectar uma célula após sua entrada, pois, uma vez no citosol, a
estabilização do capsídeo impede a liberação do RNA. A presença de ST-148
leva à alteração na posição das hélices α3 e α4. Por esta razão, ocorre a
abertura de uma fenda entre a hélice α1 de um dímero e as hélices α1’ e α3’ do
outro dímero, onde o composto se liga, estabilizando o tetrâmero (Figura 6). A
cadeia fenil do composto se liga à Phe 33, enquanto a fração tieno piridina
interage com a Ser 34 e Arg 68. Resíduos lipofílicos da fenda fortalecem a
ligação do ST-148, uma fez que o composto é altamente lipofílico. A ligação à
Ser 34 é fundamental. Demostraram-se que mutações neste aminoácido levam
à perda de atividade (SCATURRO et al., 2014). Ademais, ligação às hélices α1
prejudica a interação do capsídeo com membranas, afetando a montagem de
novos vírions (BYRD et al., 2013a).
Os tons em laranja representam um dímero, e os tons em azul, outro dímero; ST-148 é representado em verde; O aminoácido S34 é representado no modelo CPK.
Figura 6. Conformação do capsídeo tetrâmero antes (esquerda) e depois
(direita) da ligação de ST-148 ao aminoácido S34 (adaptado de SCATURRO et al.,
2014).
Estudaram-se ARDP0006 e ARDP0009 devido às eficácias em inibir
replicação em DENV-2, in vitro (Tabela II). Ambas as moléculas apresentaram
baixa toxicidade e boa seletividade para NS2B-NS3 protease: ARDP0006 EC50
= 4,2 ± 1,9 µM e CC50 = 69 ± 4 µM, e ARDP0009 EC50 = 35 ± 8 µM e CC50 ≥
27 de 39
300 µM. ARDP0006 interage com o sítio ativo desta enzima nos resíduos Gln
35, His 51 e Ser 135 e com o bolsão S1, nos resíduos Gli 151 e Gli 153.
ARDP0009 também interage com os mesmos resíduos, mas possui uma
interação extra com o resíduo Tyr 150 no bolsão P1 (Figura 7) (TOMLINSON et
al., 2009).
Em rosa: sítio ativo da protease
Em verde: bolsão S1 da protease
Figura 7. Interação dos compostos ARDP0006 (A) e ARDP0009 (B) com a NS2B-NS3
protease (TOMLINSON et al., 2009).
Estudo realizado por Steuer e colaboradores (2011) teve como objetivo
sintetizar possíveis inibidores da NS3 protease. Sabendo-se que a enzima
apresenta uma serina (Ser 135) em seu sítio ativo, pensou-se, primeiramente,
em aldeídos para a síntese. Este grupo funcional interage com a serina
nucleofílica, de forma covalente e reversível, formando hemicetais. Os
aldeídos, no entanto, foram substituídos por α-cetoamida, por serem mais
eletrofílicas. Tentativas de planejamento como: saturação e redução da cadeia,
substituição da insaturação por um ciclopropil, substituição da função α-ceto
por α-hidroxi e por α-epoxi, ou substituição da função cetoamida por amida
resultaram em compostos com baixa atividade. Já a metilação na posição β é
tolerada. Isso mostra que a função α-cetoamidas é fundamental para a
atividade do composto. A insaturação por sua vez, confere à molécula
28 de 39
conformação rígida e plana, necessária para a interação com a região 1 do sítio
ativo (S1), onde está a Ser 135. Acredita-se que a metilação tolerada na
posição β seja um indício de que a molécula pode ser substituída, nesta
posição, por cadeias que interajam com a segunda região do sítio ativo (S2).
Estabelecido como grupo farmacofórico a cadeia α-cetoamida β,γ-insaturada
(composto 1, Tabela II), prosseguiu-se com variações da cadeia aril, na
posição γ. Nesta etapa, observou-se que grupos doadores de elétrons
conferem atividade inibitória, enquanto grupos aceptores diminuíam esta
atividade. Grupo das posições 3 ou 4 do anel deve ser um doador de elétron
em S1, por ligação de hidrogênio, para Tyr150 e Asp129. Por fim, analisaram-
se as substituições no nitrogênio da α-cetoamida. Grupos alquil menores, como
o metil, e maiores, como o pentil, mantiveram a atividade. Por outro lado,
ciclohexano e o benzeno levaram à perda de atividade devido à alta
hidrofobicidade. Já os grupos com heteroátomos apresentaram bons
resultados. Estes grupos apresentam caráter hidrofílico, especialmente os
grupos contendo oxigênio. Selecionou-se o composto 32 (Tabela II) como
melhor opção de tratamento por, além de ter alta atividade inibitória, é seletivo
à protease, apresentando baixa interação com a trombina humana. Testes in
vitro comprovaram sua eficácia, ao diminuir em 1000 vezes a viremia. Não
mostrou citotoxicidade nas concentrações utilizadas (STEUER et al., 2011). A
Figura 8 mostra as interações da molécula com a protease, em comparação ao
grupo farmacofórico.
Figura 8. Representação das interações entre o sítio ativo da NS3 protease e os
compostos 1 (rosa) e 32 (verde) (adaptado de STEUER et al., 2011).
29 de 39
O composto ST-610 (Tabela II), por sua vez, foi identificado como
potente inibidor da helicase da proteína NS3, inibindo-a nos quatro sorotipos da
dengue. Alguns dos resultados em testes in vivo foram: (1) EC50 = 0,236 ± 0,06
µM para DENV-1, EC50 = 0,272 ± 0,05 µM para DENV-2, EC50 = 0,256 ± 0,17
µM para DENV-3, EC50 = 0,203 ± 0,09 µM para DENV-4 e (2) citotoxicidade de
CC50 ≥ 100 µM (BYRD et al., 2013b; CHAN, OOI, 2015). Acredita-se que ele
interaja com o resíduo Ala 263 da proteína, que, junto com outros aminoácidos,
como Thr 264, estabeleçam ligação de hidrogênio com a cadeia hidroxil-ribose
dos substratos do RNA. Desta forma, ST-610 pode interferir na ligação da
proteína com os substratos do ácido nucleico ou pode translocar a fita de RNA
pelo canal (BYRD et al., 2013b).
Ivermectina (Tabela II), atualmente utilizada como anti-helmintos,
demonstrou atividade anti-dengue, in vitro, para os quatro sorotipos, em dois
estudos. A molécula interage com IMPα/β1, inibindo o reconhecimento de NS5
por esta proteína (EC50 = 1,6 µM para DENV-1; EC50 = 1,4 µM para DENV-2;
EC50 = 1,2 µM para DENV-3; EC50 = 1,3 µM para DENV-4). Apesar de não
atuar sobre NS5, há indícios de que apresente atividade inibitória sobre NS3. A
proteína NS5, para desempenhar sua função como polimerase, contém, entre
os aminoácidos 320 e 405, a região NLS (do inglês, nuclear localization
sequence). Esta região é responsável pelo sinal de importação nuclear. Já a
denominada região NES (do inglês, nuclear export signal), é responsável pelo
sinal de exportação. Juntas, elas medeiam o transporte nucleocitoplasmático
de NS5. Neste sentido, NLS é reconhecida pela IMPα/β1 (importina), a qual faz
o transporte de proteínas para o núcleo celular. Portanto, uma vez bloqueada a
importina, o transporte de NS5 para o núcleo celular será interrompido. A
função nuclear desta proteína será inibida (WAGSTAFF et al., 2012; TAY et al.,
2013).
Inibidores de polimerase são classificados em duas categorias:
(1) Inibidores análogos ao nucleotídeo (NIs, do inglês nucleotide analog
inhibitors). Quando convertidos ao trifosfato correspondente, competem com os
substratos naturais (nucleotídeos) e são incorporados à cadeia de RNA. Como
resultado, levam ao término da elongação ou causam mutações nas próximas
sínteses de RNA. Esta categoria é a mais utilizada, porém apresenta maior
potencial para o desenvolvimento de resistência pela polimerase;
30 de 39
(2) Inibidores não-nucleotídicos (NNIs, do inglês non-nucleotide inhibitors)
ligam-se ao sítio alostérico, inativando a enzima ou impedindo alterações
conformacionais necessárias para a iniciação e elongação na síntese de RNA
(LIM et al., 2013).
Schul e colaboradores (2007) analisaram uma série de compostos e
identificaram, entre eles, o 7-DMA (7-deaza-2’-C-metiladenosina) (Tabela II)
(SCHUL et al., 2007). Esta molécula também foi estudada por Carroll e
colaboradores devido à sua eficácia contra HCV. Estes pesquisadores a
nomearam como MK-0608 (Tabela II) (CARROLL et al., 2009). O composto foi
capaz de reduzir a viremia de dengue em testes in vivo, atuando em NS5
polimerase (RdRp). Diminuiu, também, a resposta inflamatória aguda ao vírus,
já que os níveis de TNF-α, IL-6, IL-12, IFN-γ e MCP-1 abaixaram após o
tratamento (SCHUL et al., 2007). Baseado nisso, Chen e colaboradores (2007)
demonstraram que o composto 1 (Tabela II) também foi capaz de bloquear a
síntese de RNA viral, reduzindo, em 10 vezes a viremia. Após sua conversão
para a forma 5’-trifosfatada, o composto atua como um NI, competindo com os
substratos naturais a serem inseridos no RNA pela NS5 polimerase. A porção
3’-OH da ribose é fundamental para a ligação do composto ao RNA. Já a
porção 2’-C-acetileno, após inserida na cadeia, faz impedimento estérico e
bloqueia o elongamento da fita. O planejamento iniciou com alguns
substituintes na posição 2’-C em análogos de adenosina. Compostos com as
substituições metila e acetileno apresentaram os melhores resultados (EC50 =
1,12 µM e CC50 ≥ 50 µM para metila; EC50 = 1,41 µM e CC50 ≥ 40 µM para
acetileno), enquanto as substituições etila, vinila e propino resultaram em perda
de atividade (EC50 ≥ 50 µM). Prosseguiu-se, então, com a análise da atividade
de análogos 2’-C-acetileno ribose de outras bases, citocina e guanosina, porém
ambos os compostos apresentaram resultados insatisfatórios (EC50 ≥ 100 µM).
Sabendo-se que análogos de adenosina com substituição 2’-C-alquil na ribose
sofrem desaminação, pela adenosina desaminase intracelular, para derivados
de inosina, substituiu-se o nitrogênio da posição 7 por um carbono (composto
1) (tabela III). Esta alteração, por impedir a modificação intracelular do
composto, melhorou sua atividade (EC50 = 0,7 µM) e citotoxicidade (CC50 ≥ 100
µM). Algumas substituições no carbono 7 foram testadas, no entanto, todas
falharam (CHEN et al., 2010). Importante mencionar que este composto é um
31 de 39
pró-fármaco que depende de enzimas conversoras para que sua forma
trifosfatada seja obtida.
Tabela III. Análogo de adenosina vs Composto 1/ NITD008
Análogo de adenosina com substituição 2’-C-acetileno
(adaptado de CHEN et al., 2010)
Composto 1/ NITD008 (adaptado de CHEN et al., 2010)
5. CONCLUSÃO
Embora a dengue atinja milhões de pessoas anualmente (WHO, 2017;
BHATT et al., 2013), ainda não existe um tratamento capaz de curar a doença
(CDC, 2016; NHS, 2016). Seu controle, atualmente, é realizado apenas com
terapia de suporte (MS, 2016; WHO, 2009), prevenção por controle do vetor
(MURRAY, QUAM, WILDER-SMITH, 2013) e, mais recentemente, por vacina
(ANVISA, 2017b; G1, 2016; Sanofi Pasteur, 2017). Inúmeros são os compostos
estudados para o tratamento da dengue, obtidos por Structure Based Drug
Design no caso de novas moléculas, ou estudados contra alvos diferentes, no
caso de medicamentos já existentes para outras doenças. No entanto, poucos
são os compostos que seguem para estudos clínicos. Para isso, é necessário
entender-se as limitações e aplicar-lhes melhorias moleculares.
Neste trabalho foram apresentadas 13 moléculas promissoras. Entre
elas, três já haviam sido estudadas para outras doenças (CRDS, ivermectina,
7-DMA/MK-0608) e dez eram novos compostos (SA-17, NITD448, DN59,
1OAN1, ST-148, ARDP0006, ARDP0009, composto 32, ST-610 e composto
1/NITD008). Ainda, quatro apresentaram eficácia e segurança in vivo (7-
DMA/MK-0608, ST-148, ST-610 e composto 1/NITD008) e nove foram
estudadas apenas em testes in vitro (CRDS, SA-17, NITD448, DN59, 1OAN1,
ARDP0006, ARDP0009, composto 32 e ivermectina). Entretanto, nenhuma
delas foi avaliada em ensaios clínicos, até então. Para se prosseguir com
32 de 39
estudos clínicos é necessário que a molécula tenha demonstrado eficácia e
segurança em estudos in vivo (ANVISA, 2017a).
Entre os compostos, 7-DMA/MK-0608 e 1/NITD008, já avaliados em
animais, apresentaram bom perfil farmacocinético para administração oral, com
boa disponibilidade na administração de duas doses orais ao dia, por três dias
(SCHUL et al., 2007; YIN et al., 2009). Já o composto ST-148 apresentou
queda na viremia de três vezes no tratamento oral e de 52 vezes no tratamento
intravenoso (BYRD et al., 2013a). O ST-610 mostrou biodisponibilidade oral de
apenas 7% enquanto a biodisponibilidade intraperitoneal foi de 56% (BYRD et
al., 2013b). Ambos precisam, portanto, de modificações moleculares, as quais
possam melhorar seu perfil farmacocinético. O 1/NITD008 apresentou, no
entanto, efeitos adversos em tratamentos de duas semanas em ratos e
cachorros (YIN et al., 2009). Avaliações futuras devem ser feitas a fim de se
identificar as causas e contorná-las, para que o composto possa ser,
finalmente, testado em humanos. Já durante o estudo in vivo de 7-DMA/MK-
0608, nenhum obstáculo foi encontrado (SCHUL et al., 2007). Ensaios clínicos
podem ser realizados para a molécula.
33 de 39
6. BIBLIOGRAFIA
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Considerações e
definições para pesquisa clínica. Disponível em: http://www.anvisa.gov.br/
medicamentos/pesquisa/def.htm. Acesso em: 13 Abril 2017 (a).
ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Consulta a
medicamentos registrados, Dengvaxia. Disponível em: http://consultas.
anvisa.gov.br/#/medicamentos/. Acesso em: 19 Fevereiro 2017 (b).
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