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1Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Atelier PARIS 7-8 Avril 2004" Bases de données "
Intérêt des bases de données pour la spéciation des actinides en milieu
biologique
Application à la toxicologie nucléaire
E.Ansoborlo
V.Moulin, C.Moulin, L.Bion, P.Moisy, C.Madic, G.Cote
Programme de Toxicologie Nucléaire
DEN / DRCP
2Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Plan de l’exposé
1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire
2. Besoins de spéciation en Biologie
3. Etat des connaissances Actinides-Biologie
4. Eléments et milieux d’intérêts
5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"
6. Exemples d’application
7. Perspectives
DEN / DRCP
3Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
1. Etudes dans le domaine de la Toxicologie Nucléaire
Domaine d’étude : Radiotoxicité (hors radiobiologie)
Dosimétrie Interne Toxicité chimique
Eléments d’intérêt : Actinides, PF, PA
Modèles CIPR Programme ToxNuc-E
DEN / DRCP
4Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
1.1 Modes de contamination : CIPR
Incorporation
Métabolisme
Organes cibles
Excrétion
DEN / DRCP
5Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
1.2 Programme de Toxicologie Nucléaire
Programme inter organismes (CEA-CNRS-Inserm-Inra)
Programme multidisciplinaire : physique, chimie, biologie, biochimie, médecine…
2 orientations : Homme et Environnement
• Cibles moléculaires des actinides
• Toxico-cancéro,neurotoxicité, génotoxicité
• Décorporation des actinides
• Transporteurs membranaires, stress oxydant
• Spéciation en milieu biologique
DEN / DRCP
6Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
ADN
Mécanismes de
protection/detoxication
Regulation génétique
Effets sur physiologie
cellulaire
réponsesPrécoces/ tardives
élément chimique
transporteur
?protéines
Moleculescibles
Toxicité chimique Toxicité radiologiqueet /ou
MOX U+Pumacrophage pulmonaire
Niveau cellulaire
Spéciation
DEN / DRCP
7Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
2. Besoins de spéciation en Toxicologie Nucléaire
• Dimensionner les expérimentations
• Comprendre les mécanismes de transfert ou rétention
• Préparer et interpréter les études Décorporation
DEN / DRCP
8Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
3. Etat des connaissances Actinides-Biologie
Actinides Thorium Uranium Neptunium* Plutonium Americium Forme biologique Th4+ UO2
2+ Np4+ NpO2+ Pu4+ Am3+
Rayon ionique (A) 0.99 0.83 0.92 0.88 0.90 0.99 Séjour sang 10 % 1 j
0.3 % 10 j 25 % 5 min 1 % 1 j
20 % 1 h < 1 % 1 j
< 1% 1 h < 1 % 1 j < 1 % 1 j
Complexation sang
100 % Tf 50 % HCO3-
30 % Tf 20 % Globules
80 % Tf 70 % libre 100 % Tf 100 % Tf
Retention organes Os 70 % 10-15 % 30-50 % 30-50 % 50 % 30 %
Foie 5 % 2-10 % 2-10 % 30 % 50 % Reins 3 % 12-25 % 1 %
Tissus mous 4 % 5 % 5 % 5 % 10 % Excretion urines 4-6 % 5 j
7-9 % 20 j 65 % 1 j 70 % 6 j
3-4 % 1 h 15 % 1 j
15-20 % 1 h 20–40 % 1j
0.4 % 1 j 1.4 % 14 j
< 1 % 1j
Ingestion f1 Type M Type S
5 10-4 2 10-4
2 10-2 2 10-3
5 10-4 5 10-4 1 10-5
5 10-4
Modèle CIPR 69 69 67 * 67 67 * Données sur la répartition Np(IV) et Np(V) chez le rat et la souris (Racine 2003, Durbin 1998, Ramounet 1998)
DEN / DRCP
9Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
3.1 Bases de données existantes
• Radionucléide Database (Inhalation, ingestion…) : Données biocinétiques(absorption sang, ingestion…)
• Base de données décorporation (en cours DSV/CARMIN) Familles de ligands, efficacité décorporante, Cst…
• Base de données toxicologiques (DEN/DSV) : comparaison Toxicologie/radiotoxicologie
DEN / DRCP
10Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
4. Eléments et milieux d’intérêtsElémént
s
• Actinides (Th, U, Np, Pu, Am…)
• PF (Cs, Sr, I, Tc, Se…)
• PA (Co, Ni…)
• Toxiques (Cd, Be…)
Milieux
• Sang
• Salive
• Sucs Gastriques
• Urine
• Lait Mat-fœtal
• Macrophages…
• Milieux Culture
Familles ligands
• Minéral
• Organique
• Acides aminés, Protéines
• Sucres
• Cations base
• décorporants Paramètres variants : C, pH, I, Redox +précipitation
DEN / DRCP
11Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Exemples de composition de milieux
d’intérêt
Ligands
(M) Sérum
sanguin pH=7.4
Salive
pH=5.6 à 7.6
Sucs Gastriques
pH=1.5 à 5.5
Milieu culture pH=7.3
Lait (g/L) Marternel
pH=4.5 à 7.5
"Minéraux" Carbonates 2.5 10-2 6.6 10-3 2.6 10-2 Phosphates 1.1 10-3 3.7 10-3 2.8 10-3 5.6 10-3 0.1 SCN- 2.1 10-3 F- 7.3 10-6 SO4
2- 3.3 10-4 3.3 10-4 0.4 10-3 0.1 Cl- 9.0 10-2 2.9 10-2 1.2 10-1 1.3 10-1 0.4 NH4
+ 2.6 10-3 6.0 10-3 NO3
- 0.4 10-3 "Organiques" Ascorbates 8.0 10-6 4.7 10-5 Citrates 1.6 10-4 5.4 10-5 0.8 Lactates 1.5 10-3 1.4 10-6 3.3 10-4 Oxalates 9.2 10-6 Aspartate 0.15 10-3 Glutamate 0.15 10-3 Glucose 11.0 10-3 70 "Protéines + acides aminés"
10-4 à 10-5 10-4 à 10-5 10-4 à 10-5 10
Tampon HEPES 17.5 10-3 Albumine 6.3 10-4 Transférine 3.7 10-5 Urée 3.0 10-3 3.3 10-4 Cystéine 0.1 10-3 Glycine 0.25 10-3 "Métaux" Ca2+ 1.4 10-3 1.5 10-3 1.9 10-3 1.0 10-3 0.3 Mg2+ 5.6 10-4 2.7 10-4 3.1 10-4 0.4 10-3 0.5 Na+ 9.0 10-2 1.0 10-2 4.9 10-2 1.4 10-1 0.2 K+ 4.9 10-4 2.0 10-2 1.2 10-2 5.0 10-3 3.0 10-3 Fe2+ 3.0 10-5 5.0 10-6
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12Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Acide de Lewis(Pearson)
Hg Cd Ag Cu(I) Pb Zn Cu(II) Co Fe(II) Fe(III) Mn Ca Mg Cs Sr U
cations mous cations dursintermédiaires
Thiolates (S) Carboxylates (O)Carbonyles
Imidazoles (N)
Acid
es
am
i nés
pro
t éin
es
Acide aspartique
Acide glutamique
Glycine, Tyrosine…
Transferine…
Cystéine
Glutathion
Metallothionéine…
Cahier des charges Métal/ligand
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13Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Cahier des charges Actinides/ligands
Contraintes
Actinides
• Cations durs (Pearson)
• Degrés d’oxydation 3 à 6 (Am3+, Np4+, NpO2
+, Pu4+, UO22+)
• Aptitude hydrolyse M4+> MO2
2+> M3+ > MO2+
• Redox (ex : Np(IV), Np(V))
• Nombreux complexes (OH-, H2PO4
-, HCO3-)
• Cinétique de dissociation des complexes stables lente
Ligands• Atomes donneurs O>N>S
• Denticité ou Nb de sites donneurs
• Stéréochimie du ligand, taille
• Stabilisation (liaisons H)
• Sélectivité/(Na+, Ca2+…)
• Ionisé au pH physiologique
• Hydrosoluble
• Cinétique et thermodynamique
• Ratio Chelatant:métal (>1000:1)
• Toxicité et AMM (autorisation)
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14Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
5. Groupe de travail CETAMA GT 32 "Spéciation"
• Crée en 2000 avec 2 sous-groupes • Bases de données (L.Bion, G.Cote)• Méthodologie (D.Doizi)• Objectifs • Incrémenter Bases de données (BASSIST) • Organisation d ’exercices intercomparaisons• Production 1 Note technique " Spéciation "/an
• Réalisations• Bases de données : U, Pu, Am, Np• Notes techniques "Spéciation" : U, Pu, Co, Tox• Production 1 Note technique Spéciation/an• Workshop (2001, 2004), Publication (RCA)
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15Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
5.1. Etat des lieux données : ex ActinidesSources
• NEA/OCDE
• PSI
• IUPAC
• Smith-Martell
• NIST
• IRSN
• Publications
Familles ligands
• Minéral
• Organique
• Acides aminés, Protéines
• Sucres
• Cations base
• décorporants
• OH-, HCO3-, HPO4
=, SO4
=… OK
• Citrates… (Expertise)
• Données (Exp) manque données
• manque données
• Données (OK)
• qq données (Exp)
Etat des données
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16Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Actinides Thorium Uranium Neptunium Plutonium Americium
Forme biologique Th4+ UO22+ Np4+ NpO2
+ Pu4+ Am3+ Rayon ionique (A) 0.99 0.83 0.92 0.88 0.90 0.99
Log ß1 (I=0) Hydroxyde (OH-) ß1 = -2.4
ß4 = -18.4 ß1 = -5,2 ß1 = -0.29
ß4 = -9.8 ß1 = -11.3 ß1 = -0.78
ß4 = -8.4 ß1 = -7.3
Carbonate (CO32-) ß5 = 29.8 ß1 = 9.67
ß2 = 16.94 ß3 = 21.60
ß4 = 36.7 ß5 = 35.6
ß1 = 4.96 ß2 = 6.53 ß3 = 5.5
ß4 = 35.9 ß5 = 34.5
ß1 = 7.8 ß2 = 12.3 ß3 = 15.2
Phosphate (PO43-) 13.33
(HPO42-) 13.0 7.24 2.95
(H2PO4-) 3.0
(H3PO4) 0.76 2.4 Citrate (Cit3-) 14.2# 8.4# 3.74# 17.6# 9.6# Chlorure (Cl-) 1.1 0.17 1.5 1.8 1.05 Glycine (L-) 10.5# 8.0# 3.31*(I=0.1) 4.1# (I=1)
Cystéine (L2-) 9.2# 6.7# 4.2# (I=1) Aspartate ((L2-) 11.0# 9.3# 2.6 #(I=1) 4.81* (I=0.1) Glutamate (L2-) 10.8# 9.2# 2.7 #(I=1) 5.6# (I=1)
Transferrine 16 22,5 EDTA (L4-) 26.6# 13.6 (±4.3)# 24.6#(I=1) 9.3# 29.0# 19.6# DTPA (L5-) 32.8# 21.1# 29.3# (I=0.5) 11.7# 29.5# (I=0.5) 26.2#
*Smith & Martell, # IUPAC Database
5.1. Etat des lieux données : ex Actinides
DEN / DRCP
17Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
6.1. Exemple d’application des bases de données
• Spéciation des actinides dans le sang
• Précipitation intracellulaire de l’uranium (rein)
• Répartition différente de 3 espèces Pu (foie)
DEN / DRCP
18Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Spéciation actinides dans le sang
U022+
Am3+ Pu4+
Np02+
DEN / DRCP
19Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Spéciation actinides dans le sang
Pu4+
Np4+
Th4+
Np02+
DEN / DRCP
20Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Précipitation intracellulaire de l’U (rein)
Uranium sous forme bicarbonate [U]=8x 10-4M
Précipités d’uranium / cellule LLC-PK1 (x 80000)
Spectre analyse X (EDAX)
Uranium
Phosphore
Spéciation théorique
DEN / DRCP
21Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
1 7 14 30 90
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
238Pu-cit239Pu-nit239Pu-phyt
Temps (jours)
% activité injectée
Rétention hépatique de différentes formes chimiques de Pu au cours du temps après contamination I.V.
DEN / DRCP
22Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
6.2. Exemple de détermination de Constantes thermodynamiques
• Spéciation du Neptunium dans le sang
• Décorporation de l’U par un Biphosphonate (EHBP)
• Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine
DEN / DRCP
23Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Exemples
Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)
• Nombreuses manip in vivo sur Np(IV) et Np(V)
• Dans le sang Np sous 2 formes• NpO2
+ libre + NpO2HPO4- + NpO2CO3
-
• Np4+ lié à la transferrine (log K1~22)
• Dans l’os sous 1 forme :Np4+
• Np4+ lié hydroxyapatite
344.6 400 500 600 700 800 900 1000 1105.2
-0.11
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.59
NM
A N p (IV )
N p (IV ) + N p (V )
N p (V )
Np4+ en milieu citrate partiellement oxydé
Np4+
Np02+
DEN / DRCP
24Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Np4+
NpO2+
Cas du Neptunium (thèse R.Racine, Paris XI, 2001)
DEN / DRCP
25Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Caractérisation du complexe UO22+ - EHBP
P P
OHO
OHOHO
OH
OH
R
P P
RO
OHOHO
OH
OH
- Possède une AMM (maladie de Paget)
- Nombreuses études biologiques : Hoffschir (2000) Hengé-Napoli (1999) Ubios (2001)
- Famille des diphosphonates
DEN / DRCP
26Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Confirmation de la stœchiométrie du complexe 1 : 1m/z = 673-677 [(UO2)(H3L)(ClO4)2]- pH 2m/z = 679 [(UO2)(H2L)(H3L)]- pH 4
Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log = 6.0 ± 0.4
MH2L log = 11.0 ± 0.6
ESI-MS
SLRT
Constante de stabilité, I = 0.1 : Espèces : MH3L log = 6.0 ± 0.6
En accord avec Nash* log = 11.76 ± 0.01 (extraction)
*Nash K. L. Radiochimica Acta 1993, 61, 147.
D = 250 µs, L = 100 µs, time 1s, pH = 5.06
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
450 500 550 600Longueur d'onde
I. F
luo
.
0 µl UO22+
2 µl UO22+
6 µl UO22+
10 µl UO22+
15 µl UO22+
30 µl UO22+
70 µl UO22+
120 µl UO22+
ech13 4.2e-5M UO2 + 0eq EHBP pH2 cone30
570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680m/z0
100
%
0 eq HEDP
0.25 eq HEDP
0.5 eq HEDP
0.75 eq HEDP
1 eq HEDP
1.25 eq HEDP
1.5 eq HEDP
2 eq HEDP
5 eq HEDP
Titration à pH = 2[UO2
2+] = 4.10-5 M[EHBP] = 0 à 5 équiv.
m/z Assignment
567-573 [(UO2)(ClO4)3]-
673-677 [(UO2)(H3L)(ClO4)2]-
Complexe UO22+-EHBP par ES-
MS
DEN / DRCP
27Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Matrice biologique
Sang, peau, foie
Etudes cellulaires in vitro
Toxicité du Co sur les kératinocytes
Spéciation du Co dans les lignées
d’hépatocytes (prgm décorporation)
Matrice environnement
Sol, plantes, systèmes aquatiques….
Fixation du 57Co dans les sols
Phytoextraction de cellules
végétales (prgm transfert
sol plantes)
Système Cobalt-citrate, cobalt-cystéine
Matrices simples pour étude fondamentale
via plate forme spectroscopique
Co-Citrate, Co-Cystéine, Co-EDTA (référence)
DEN / DRCP
28Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Etude en ES-MS et CI-ICP/OES: Stoechiométrie 1/1
• Confirmation de la constante de complexation Co(II)/Cit: Log 1 = 4.5 0.4
• Pas d’observation du complexe Co-Cit en raison de son caractère labile Résultats en accord avec la littérature (A. A. Ammann, J. Chromatogr. A, 2002, 947, 205)
Le ligand citrate: acide organique Ligand très abondant dans les milieux biologiques et environnement
• Sang : 10-4M
• Solubilisation des métaux : transport et biodisponibilité
Peu de données concernant le système Co-Cit (1/1) en milieu aqueux
pKa1 = 3.14pKa2 = 4.77pKa3 = 6.39
Utilisation sous forme d’acide citrique
O
HO
O
OH
OH
OHO
DEN / DRCP
29Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Le ligand cystéine: acide aminé Rôle important dans la structure des protéines via sa fonction SH
Peu de données récentes concernant le système
Co-Cyst (1/1) en milieu aqueux
pKa (COOH)= 1.82
pKa (SH)= 8.24
pKa (NH3+
)= 10.36
HS
O
OH
HNH2
HS
O
O-
HNH3+
Activation sélective des sites: étude en fonction du pH
Phénomènes rédox inhérents au couple Co3+/Co2+
DH2
-O S
O
+H3N
S O-
NH3+
OH
H
Présence de O2: oxydation de la cystéine
2RSH RSSR + 2H+ + 2e- (favorisée en milieu basique)
Etude en ES-MS: Stoechiométrie 1/1
DEN / DRCP
30Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
Etude du système Co – cystéine
"La spéciation du Co dans le domaine de la toxicologie nucléaire: milieux environnementaux et biologiques".NT CETAMA 02-07. E. Ansoborlo et al.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12 14pH
Co(II) libre
Co(II)Cyst
Spéciation par ES-SM
Co(II)DH2
Co(III)Cyst2
• Complexe 1-1 avec la cystéine majoritaire à pH5• Complexe avec la cystine (dimère) à pH neutre• Complexe 1-2 avec oxydation de Co à pH basique
Diagramme obtenu expérimentalement
% des
espèces
A intégrer dansles outils de spéciation
théorique type JCHESS
DEN / DRCP
31Journées PARIS 7-8 Avril 2004 Strasbourg
7. Perspectives• Programme ToxNuc-E : plateforme spéciation
Thèse Np-Pu/transferrine aspect redox (P.Moisy, 2004) Thèse Pu-protéines ES-MS (C.Moulin, 2004)
• Poursuite travaux GT 32 : intercomparaison Tc Note spéciation Np Publi intercomparaison Am (L.Bion) Intercomparaison solution U, phosphates, citrates
• Participation CDTP école des mines
• Organisation 2ème Workshop spéciation Institut Curie (15-16 Novembre 2004)