1

Résumé

Dans leur milieu naturel, les plantes sont soumises à de nombreux stress biotiques et abiotiques.

Depuis le début du réchauffement climatique, certains stress abiotiques deviennent omniprésents et

posent de nombreux problèmes aux grandes cultures. Linum usitatissimum L. est une plante très

utilisée par l’Homme. Les variétés à fibres sont valorisées dans l’industrie textile, mais également

pour la fabrication de matériaux composites. L’étude ci-jointe a pour objectif de mettre en évidence

l’effet d’un stress hydrique sur une variété à fibre de lin (Diane). Pour que l’étude soit la plus

complète possible, différents aspects ont été traités : transcriptomique, protéomique, histologique

et physique. Le stress hydrique entraine des effets à tous les niveaux de la plante, aboutissant à sa

mort si les conditions ne redeviennent pas normales.

Abstract

In their natural environment, plants are subject to many biotic and abiotic stresses. Since the

beginning of global warming, abiotic stresses becoming ubiquitous and cause many problems for

crops. Linum usitatissimum L. is a plant used by humans. Varieties fibers are valued in the textile

industry, but also for the manufacture of composite materials. This study highlights effects of water

stress on a fiber variety of flax (Diane). To make the study as comprehensive as possible, various

aspects were discussed: transcriptomics, proteomics, histology and physical. Water stress causes

effects at all levels of the plant, resulting in its death if conditions do not become normal.

Effets du mimétisme d’un stress hydrique par utilisation

de Poly Ethylène Glycol (PEG) chez Linum usitatissimum L.

BOCQUET Laetitia

Master N2SA Spécialité TVIA - Université Lille 1

Année Universitaire 2013/2014

2

Index des figures

Figure 1 : Evolution de l'aspect des plantules de Linum usitatissumum L. après 2 jours et 2 semaines

et culture................................................................................................................................................. 6

Figure 2 : Gel d'électrophorèse 2D issu de l'une de nos expérimentations (non analysé) .................... 7

Figure 3 : Dendrogramme et profils montrant un groupe de protéines non influencées par le stress

hydrique ................................................................................................................................................. 8

Figure 4 : Dendrogramme et profils montrant un groupe de protéines non influencées par le stress

hydrique mais plutôt par le stade de développement ............................................................................ 8

Figure 5 : Exemple de protéine absente en cas de stress ....................................................................... 9

Figure 6 : Exemple de protéine présente à des niveaux sensiblement égaux en cas de stress ............... 9

Figure 7 : Exemple de protéine présente au début du stress (J1) ......................................................... 10

Figure 8 : Exemple de protéine d'avantage présente en fin de stress (J10).......................................... 10

Figure 9 : HeatMap montrant les niveaux d'expression des gènes de réponse à la déshydratation ..... 12

Figure 10 : HeatMap montrant les niveaux d'expression des gènes de croissance cellulaire et de

développement de la plante en réponse à un stress hydrique............................................................... 12

Figure 11 : Schéma montrant le lien entre le récepteur aux Brassinostéroides et la protéine 14-3-3

(Wang et al., 2001)............................................................................................................................... 16

Figure 12 : Vue d'ensemble d'une coupe transversale de tige de lin (48 jours) colorée au TBO ....... 16

Figure 13 : Coupe transversale de tige de lin (100 jours) colorée au TBO montrant des fibres organisées

en faisceaux .......................................................................................................................................... 16

Figure 14 : Coupe transversale de tige de lin (48 jours) colorée au Phlorogluciol HCl montrant le

xylème et les fibres .............................................................................................................................. 17

Figure 15 : Coupe transversale de tige de lin (100 jours) colorée au Phloroglucinol HCl montrant le

xylème et les fibres .............................................................................................................................. 17

Index des tableaux

Tableau 1 : Résultats de la quantification des ARNs dans les différents échantillons par biophotomètre

(Eppendorf). L1 = Lame 1, L2 = Lame 2, L3 = Lame 3. F = Feuilles, T = Tiges, R = Racines. C =

Contrôle, S = Stress. J4 = 4ème jour. ....................................................................................................... 5

Tableau 2 : Moyennes des tailles (en cm) des plantules de lin en culture avec différentes concentrations

de PEG, après 2 jours et 2 semaines de culture. ................................................................................... 6

Tableau 3 : Liste dénombrant les gènes les plus différenciellement exprimés, ne sont considérés induits

ou réprimés uniquement les gènes dont le ratio (Stressé Cy5)/(Contrôle Cy3) est supérieur à 2 ou

inférieur à 0,5). ..................................................................................................................................... 11

3

Introduction

Le lin (Linum usitatissumum L.) est une

Dicotylédone de la famille des Linacées. Il

s’agit d’une plante annuelle cultivée dans le

monde entier. Les variétés à fibres sont princi-

palement valorisées dans l’industrie textile,

mais aussi pour la production de matériaux

composites (Gorshkova et al., 2012). Les varié-

tés oléagineuses permettent la production

d’huiles, de résines et de solvants. L’Homme

porte également un intérêt aux propriétés nutri-

tionnelles du lin, la teneur élevée en acide

α-linoléique de ses graines aurait des effets bé-

néfiques pour la santé humaine (Cunanne et al.,

1993). Ses nombreuses utilisations font du lin

une espèce très étudiée en recherche. Des

études de régénération in vitro peuvent par

exemple être citées (Pretova and Williams,

1986 ; Rutkowska-Kraus et al., 2003 ; Yildiz

and Özgen, 2004). D’autres études concernant

les effets des pathogènes qui ravagent les cul-

tures (Roberts and Pryor, 1995 ; Kroes et al.,

1998) ont été mises en évidence, ainsi que des

projets de transformation de certains cultivars

(Basiran et al., 1987).

Le lin est principalement cultivé dans les

régions tempérées. Outre les stress biotiques, il

doit également faire face à de nombreux stress

abiotiques. Depuis le début du réchauffement

climatique, les facteurs environnementaux fluc-

tuent beaucoup et sont devenus un problème

omniprésent pour les cultures. De trop fortes

températures peuvent avoir divers effets néga-

tifs sur les plantes (Cross et al., 2003), tout

comme un excès d’UVB et/ou d’ozone

(R. Tripathi1 et al., 2011), des chocs de faibles

températures peuvent par exemple entrainer des

modifications du protéome (Tafforeau et al.,

2002).

1 PEG : Poly Ethylène Glycol

Il est à présent connu que non seulement le

génotype (Rennebauma et al., 2002), mais aussi

certains stress, ont un effet sur la qualité des

fibres de lin. Dans le cadre de notre étude, nous

nous sommes intéressés aux effets d’un stress

abiotique en particulier, le stress hydrique. Une

publication a précédemment révélé un impact

de ce stress sur la teneur de certaines hormones

(Pospíšilová et al., 2000). L’objectif général de

cette étude est de mettre en évidence les modi-

fications physiques, protéomiques et transcrip-

tomiques d’un tel stress sur des plantules de lin.

En effet, un stress affecte différents processus

dans la vie d’une plante.

Matériels et Méthodes

Le matériel végétal utilisé est Linum usitatissu-

mum L. (variété Diane). Les plants ont été

cultivés in vitro et stressés par différentes con-

centrations de PEG1 6000 introduites dans leur

milieu de culture. Les plantes n’ont donc pas

réellement été privées d’eau, le PEG induit un

stress osmotique qui mime un stress hydrique.

Induction du stress et conditions de culture

Les graines de Lin ont d’abord été mises à

germer dans des milieux MS2 classiques

pendant 2 semaines. A ce stade, les plantules

obtenues mesuraient entre 5 et 6 cm. Ces

dernières ont alors été mises en culture dans des

milieux MS contenant en plus du saccharose

20g/l et différentes concentration de PEG (0, 1,

2, 5 et 10 mM), ces milieux ont été solidifiés

avec de l’agar à 6g/l. Les sessions de relevés

des résultats ont été effectuées après 2 jours de

culture, puis 2 et 4 semaines.

Les analyses suivantes auraient dû être effec-

tuées sur les prélèvements de ces plantes, mais

par soucis de temps, elles ont été faites sur des

plants cultivés en serre l’année précédente.

2 MS : Murashige & Skoog (1962)

4

Analyse protéomique

Les protéines ont été extraites de plantes culti-

vées en serre préalablement stressées avec 30

mM de PEG, elles proviennent d’échantillons

aériens prélevés à différents moments après

induction du stress : 1, 4 et 10 jours. Nous avons

donc un total de 6 échantillons : 3 contrôles (J1-

J4-J10) et 3 stressés (J1-J4-J10). L’extraction

n’a pas été réalisée au cours des séances de TP.

Néanmoins, le protocole est identique à celui

utilisé par Goulas et al., (2001). Les culots

protéiques obtenus ont d’abord été resolubilisés

dans un tampon de réhydratation dont la com-

position est détaillée en annexe 1.

Les strips utilisées sont des ReadyStripTM IPG

de 17cm avec gel d’acrylamide 4%T – 3%C,

équipées d’un gradient de pH 3-10 NL. Elles

ont d’abord été réhydratées grâce à un courant

électrique continu de 50V, à 20°C avec 300µL

de culot resolubilisé et de l’huile minérale

(BioRad) pendant 16h. Après la réhydratation,

des papiers wicks ont été posés en dessous des

électrodes pour absorber un maximum de sels,

afin que ceux-ci n’interfèrent pas avec les

protéines au cours de l’IEF3. L’IEF a ensuite été

lancée, elle s’est déroulée en plusieurs étapes :

montée progressive à 300V en 10 minutes, puis

à 3500V en 30 minutes, et à 8000V en 30

minutes, pour finir par une phase de 8000V

avec 55 000VH pour atteindre 60 000VH. Les

strips ont été maintenues à 500V jusqu’à

récupération. Elles ont ensuite été équilibrées

par deux lavages de 15 minutes dans deux

solutions d’équilibration différentes (composi-

tion en annexe 1).

Pour préparer la deuxième dimension de l’

électrophorèse, les strips équilibrées ont été

déposées en haut des gels de seconde dimen-

sion polymérisés (composition en annexe 1), un

marqueur de taille a également été ajouté. Le

3 IEF = IsoElectroFocalisation

tout a été scellé avec de l’agarose 0,5%. Les

plaques contenant les gels ont ensuite été

placées dans la machine à électrophorèse préa-

lablement remplie avec le tampon de migration

(composition en annexe 1). Le run a ainsi pu

être lancé, il s’est déroulé en 2 phases :

première phase de 30 minutes à 5W/gel,

seconde phase de 3h40 à 30W/gel.

Une fois la deuxième dimension effectuée, les

gels ont été démoulés et rincés par 3 lavages de

5 minutes chacun à l’eau ultra pure. Ces

derniers ont ensuite pu être colorés au bleu de

Comassie BioSafe : 1h de trempage dans la

solution de coloration. Ils ont ensuite été lavés

une dernière fois à l’eau ultra pure avant la

révélation.

Analyse transcriptomique

L’analyse par microarray est aujourd’hui beau-

coup utilisée pour regarder l’expression de

gènes, notamment chez le lin, dans une condi-

tion donnée ou à un moment donné du cycle de

développement (Fenart et al., 2010 ; Roach and

Deylohos, 2008).

Les microarrays utilisées sont des « puces à fa-

çon » (lames Nexterion AL) comportant 6144

ESTs de lin en duplicata. La banque d’ESTs a

préalablement été créée par l’équipe Fibres

Végétales de l’UMR1281 à Lille, le séquençage

a été réalisé par Genoscreen. Ces banques ont

ensuite été amplifiées puis annotées par un étu-

diant BT M1 GP en 2011 à l’institut Pasteur de

Lille. Le spotting des ESTs obtenus a été réalisé

par le robot Spotter Qarray 2 (Genetix) à

l’institut Pasteur de Lille par l’équipe Trans-

criptomique et Génomique Appliquée (TAG),

appartenant au réseau Lille Genomic Advanced

Network (LIGAN).

5

Dans le cadre de notre étude, nous avons réalisé

3 lames. Chacune d’entre elles a permis l’ana-

lyse d’un organe en particulier, en comparant

les conditions stressées (10mM PEG pendant 4

jours) et contrôles : lame 1 pour les feuilles,

lame 2 pour les tiges et lame 3 pour les racines.

Le matériel de départ est de l’ARN extrait de

plantes cultivées en serre, par le kit Trireagent

(Euromodex). La teneur en ARNs des diffé-

rents échantillons a ensuite été quantifiée grâce

à un biophotomètre.

Tableau 1 : Résultats de la quantification des ARNs dans les

différents échantillons par biophotomètre (Eppendorf). L1 = Lame 1, L2 = Lame 2, L3 = Lame 3. F = Feuilles, T = Tiges,

R = Racines. C = Contrôle, S = Stress. J4 = 4ème jour.

Extraits ng/µl 260/280 (ARN/pro-

teines)

260/230 (ARN/glu-

cides)

µl pour

10µg

L1FCJ4 4702 1,85 2,76 2,13

L1FSJ4 2904 1,99 1,66 3,44

L2TCJ4 676 1,85 1,99 14,8

L2TSJ4 1499 1,71 1,71 6,07

L3RCJ4 1641 1,85 1,70 6,10

L3RSJ4 1289 1,71 1,40 7,76

A partir des 10µg d’ARN obtenus, une reverse

transcription couplée à l’incorporation des fluo-

rochromes a permis la synthèse d’un ADNc

marqué dans une machine MJ PTC-200 Peltier

Thermal Cycler. Cette étape s’est faite en

plusieurs parties. L’ARN a d’abord été mélangé

avec des oligo-dT (Roche) et de l’eau DMPC,

la dénaturation s’est faite à 70°C pendant 10

minutes. Les fluorochromes ont ensuite été

ajoutés sous forme de dCTP marqués (GE

Healthcare), Cy5 pour la condition stressée et

Cy3 pour le contrôle ; ainsi que le mix compre-

nant 0,1M DTT, le tampon d’hybridation

DigEasy (Roche), des dNTP non marqués ap-

pauvris en dCTP, des RNAsines (Promega)

40U/µl et la Superscript II en Kit (Invitrogen)

200U/µl. Le marquage s’est fait pendant 2h

d’incubation à 42°C. L’arrêt de la réaction et la

dégradation de l’ARNm se sont fait par ajout de

NaOH 0,2M pendant 15 minutes à 65°C.

Le NaOH a ensuite été neutralisé avec du HCl

0,2M. Les ADNc marqués ainsi obtenu ont

ainsi pu être purifié par utilisation d’un kit

Qiaquick de Quiagen.

Avant hybridation, les lames ont été bloquées

afin d’éviter toute fixation de l’ADNc au

polymère entre les spots. Le protocole est le

suivant : 2 lavages 0,2% SDS, 2 rinçages

H2Omq, 3 minutes à 90°C puis rinçage

H2Omq, 15 minutes à température ambiante

dans une solution « réductrice » (0,13g NaBH4,

40µL PBS, 13µL EtOH 100% spectronorme), 2

lavages 0,2% SDS puis 2 rinçages H2Omq. Les

lames ont ensuite été séchées par centrifuga-

tion.

Les échantillons d’ADNc marqués ont enfin pu

être déposés sur les différentes lames, et recou-

verts d’une lamelle. Ces dernières ont été mises

dans des chambres d’hybridation Corning et le

tout a été placé à 42°C pendant 16h pour que

l’hybridation ait lieu. Après hybridation, les

lames ont été lavées dans plusieurs bains :

4xSSC, 2xSSC 0,1% SDS (2 fois), 0.1xSSC ;

puis elles ont été séchées par centrifugation.

La lecture des lames a été faite par un scanner

GenePix4000B de Molecular Devices, les

images ont pu être analysées grâce au logiciel

GenePix Pro 6.0 software (Molecular Devices

Corporation, Sunnyvale, CA, USA). Après

application d’une grille de reconnaissance et

élimination des spots de faible intensité, le bruit

de fond a été soustrait, et les données ont été

normalisées. Les valeurs non normalisées pour

Cy3 < 0 et Cy5 < 0 ont été supprimées. La zone

de significativité pour ratio Cy5normalisé / Cy3

a été fixée de manière à ne retenir que les

valeurs supérieures à 2 et inférieures à 0,5. Les

données ont ensuite été analysées et un

regroupement fonctionnel des gènes a pu être

effectué.

6

Analyses histologiques

Au cours de cette séance nous avons observé au

microscope, des coupes transversales de tiges

de Linum usitatissimum L. en condition non

stressée. Nous avons utilisé des plantes fraiches

de 48 jours, ainsi que des tiges de plantes plus

âgées (100 jours) conservées dans de l’éthanol

à 75%.

Nous avons réalisé deux colorations diffé-

rentes, pour chacune d’entre elles, les coupes

ont été réalisées par utilisation de lames de

rasoir sur les parties les plus épaisses des tiges.

Les protocoles diffèrent selon les types de

plantes utilisées, et les colorations. Pour une

coloration au TBO4 0,1%, le colorant peut être

directement appliqué sur les coupes provenant

des plantes fraiches. En revanche, les coupes

faites à partir des plantes conservées dans

l’alcool doivent être réhydratées avant d’être

immergées dans le colorant, pour que la colora-

tion puisse prendre. Elles subissent préalable-

ment des bains successifs dans de l’éthanol

50% - puis 30% - et H2Omq. Après coloration,

les coupes sont rincées dans de l’eau déminéra-

lisée avant d’être montées entre lame et lamelle

dans un mélange 50% H2O / 50% glycérol.

Elles sont ensuite observées au microscope.

Pour une coloration au Phlologlucinol HCl, les

coupes réalisées à partir de plantes fraiches

doivent subir des bains d’éthanol successifs

(30% - 50% - et 70%) avant d’être plongées

dans la solution de coloration. Les tiges âgées

de 100 jours étant déjà déshydratées, elles

peuvent directement être colorées par la

solution. Après les 10 minutes de coloration, la

révélation se fait par ajout d’HCl pour toutes les

coupes. Ces dernières sont ensuite montées

entre lame et lamelle dans de l’éthanol à 70%

et observées au microscope.

4 TBO = Bleu de Toludine Otha

Résultats et discussion de l’analyse

physique des plantes stressées

Résultats

Au total, 640 graines de lin ont été mises à

germer. Lors du repiquage, pour mettre les

plantules dans les milieux contenant le PEG,

nous avons dénombré 98% de germination et

2% de contamination. A ce moment, les plan-

tules présentaient 2 niveaux de feuilles. Après

2 et 14 jours, les tailles ont été mesurées, les

résultats sont reportés dans le tableau suivant.

Tableau 2 : Moyennes des tailles (en cm) des plantules de lin

en culture avec différentes concentrations de PEG,

après 2 jours et 2 semaines de culture.

[PEG]

mM

Tailles à

2 jours

Tailles à

2 semaines

T 7,5 ± 0,41 12,13 ± 0,25

1 6,75 ± 0,5 7,25 ± 0,29

2 6 ± 0,41 5,88 ± 0,48

5 5,5 ± 0,41 5,13 ± 0,48

10 5,13 ± 0,25 4,5 ± 0,41

Figure 1 : Evolution de l'aspect des plantules de Linum

usitatissumum L. après 2 jours et 2 semaines et culture

7

D’une manière générale, les parties aériennes

sont fortement affectées par le PEG (Figure 1),

alors que les parties racinaires semblent moins

touchées. (Voir le détail des observations dans

la partie Interprétations).

Interprétations

L’analyse des tailles montre clairement un effet

du stress sur la croissance des plantules, cet

effet se ressent dès 1mM de PEG et s’accroit

pour les concentrations plus élevées. Nous

pouvons même remarquer pour les concentra-

tions 2, 5 et 10mM, que les plantules ont

tendance à s’affaisser et à se recourber sur elles-

mêmes (Figure 1), elles paraissent plus petites

après plusieurs semaines de culture.

Les plantules des tubes témoin (0mM) croient

rapidement en longueur jusqu’à atteindre le

bouchon du tube, puis de nouvelles tiges

feuillées très vertes et épaisses redémarrent au

niveau des cotylédons. Elles possèdent

beaucoup de feuilles. A partir de la première

concentration en PEG (1mM), un problème de

développement peut être mis en évidence. En

effet, les plantules grandissent moins et

certaines redémarrent des tiges feuillées sans

avoir terminé leur croissance apicale. Jusqu’à

1mM de PEG les tiges sont d’un vert prononcé,

à partir de 2mM les tiges et les feuilles perdent

de leur couleur et deviennent marrons au fur et

à mesure que les concentrations en PEG

augmentent. Leur diamètre diminue, ainsi que

leur nombre de feuilles. (Figure 1).

Après 4 semaines de culture, les plantules

témoins ont continué leur croissance, alors que

les plantules stressées ont peu évolué. La

plupart des plantules pour 5 et 10 mM de PEG

sont mortes, l’effet commence alors à être

visible sur les racines.

L’effet du stress par le PEG commence à de

faibles concentrations (1mM), il s’accentue

rapidement et prend de l’importance avec le

temps.

Résultats et discussion de l’analyse

protéomique par électrophorèse 2D

Résultats

Probablement à cause de la charge insuffisante

du colorant, les gels obtenus ne permettent pas

une analyse correcte, ils n’ont pas été analysés.

L’un d’entre eux est visible dans la photo ci-

dessous.

Figure 2 : Gel d'électrophorèse 2D issu de l'une de nos

expérimentations (non analysé)

Pour cette raison, l’analyse à l’aide du logiciel

SameSpot (Non Linear Dynamics) s’est faite

sur des gels provenant d’une étude antérieure.

A l’issue de cette analyse, les dendrogrammes

ont permis d’établir des groupes de protéines à

partir des divers profils protéiques. Beaucoup

de protéines sont influencées par le stress, alors

que d’autres ne semblent pas affectées (figure

3). Certaines sont plutôt affectées par le stade

de développement de la plante (figure 4).

8

Figure 3 : Dendrogramme et profils montrant un groupe de protéines non influencées par le stress hydrique

Figure 4 : Dendrogramme et profils montrant un groupe de protéines non influencées par le stress hydrique mais plutôt par le stade de développement

9

Concernant les protéines influencées

spécifiquement par le stress, elles peuvent être

présentes dans toutes les conditions de stress,

ou uniquement à certains moments (figures 5 à

8).

Protéine inhibée par le stress (figure 5)

Figure 5 : Exemple de protéine absente en cas de stress

Protéines différenciellement présentes selon les jours en condition de stress (figures 6 à 8)

Figure 6 : Exemple de protéine présente à des niveaux sensiblement égaux en cas de stress

10

Figure 7 : Exemple de protéine présente au début du stress (J1)

Figure 8 : Exemple de protéine d'avantage présente en fin de stress (J10)

11

Interprétations

Au cours de notre étude, nous avons effectué

une électrophorèse 2D classique. Un autre type

d’électrophorèse peut être utilisé pour une

étude similaire, il s’agit de la 2D-DIGE

(Tafforeau et al., 2002). Cette dernière permet

la comparaison de 2 échantillons différents sur

un même gel.

Malheureusement, par soucis de temps nous ne

sommes pas allés au bout de notre analyse

protéomique. Nous nous sommes arrêtés à la

comparaison des gels, les protéines explicitées

ci-dessous n’ont donc pas pu être identifiées.

Néanmoins, les différents profils protéiques

montrent des différences significatives selon

les conditions, mais également selon les jours.

D’une part, nous pouvons remarquer que toutes

les protéines ne sont pas affectées par le stress

(figure 3). Certains groupes protéiques sont

plutôt impliqués dans le cycle de développe-

ment, la figure 4 montre par exemple des pro-

téines d’avantage présentes au J10, que la

plante ait été stressée ou non. D’autres parts, un

grand nombre de protéines semblent affectées

par le stress hydrique. La figure 5 montre une

protéine présente dans les plantes contrôles, et

dans une moindre mesure dans les plantes

stressées, il s’agit donc d’une protéine absente

en cas de stress. Les figures 6 à 8 montrent des

protéines d’avantage présentes en condition

stressée. Certaines ont des profils protéiques

assez réguliers, elles sont visibles à des niveaux

sensiblement égaux au fil des jours en condition

de stress (figure 6). D’autres sont plutôt

présentes en début de stress (J1 - figure 7), ou

en fin de stress (J10 - figure 8).

On distingue donc des profils protéiques très

variés, les protéines pouvant être affectées par

le stress, mais également par le stade de

développement ou la durée du stress. Une étude

antérieure a déjà pu mettre en évidence une

relation entre un stress osmotique et la balance

de composés organiques / inorganiques chez

Linum usitatissimum L. (Quéro et al., 2013). En

effet, les profils protéiques obtenus sur les

différents gels présentent de nombreuses

différences significatives. Le stress hydrique a

donc bien un effet sur le protéome du lin.

Résultats et discussion de l’analyse

transcriptomique sur puces à ADN

Résultats

Après sélection des données à analyser, nous

avons choisi de nous concentrer sur un total de

43 gènes (liste complète dans les heatmaps). Le

tableau ci-dessous montre le nombre de gènes

les plus différentiellement exprimés selon les

conditions et les organes.

Tableau 3 : Liste dénombrant les gènes les plus différencielle-

ment exprimés, ne sont considérés induits ou réprimés unique-

ment les gènes dont le ratio (Stressé Cy5)/(Contrôle Cy3) est supérieur à 2 ou inférieur à 0,5).

Nombre d’unigènes surexprimés Conditions

14 S J4 F

9 C T4 F

15 S J4 T

6 C J4 T

29 S J4 R

3 C J4 R

A partir de l’analyse des données, nous avons

classé les gènes sélectionnés en 2 grands

groupes fonctionnels pouvant être divisés en

plusieurs sous-groupes. Les résultats sont

visibles dans les heatmaps ci-dessous (figures 9

et 10).

12

Figure 9 : HeatMap montrant les niveaux d'expression des gènes de réponse à la déshydratation

Figure 10 : HeatMap montrant les niveaux d'expression des gènes de croissance cellulaire

et de développement de la plante en réponse à un stress hydrique

13

Interprétations

Les réponses des plantes aux stress biotiques ou

abiotiques sont visibles au niveau du génome et

du transcriptome comme l’ont précédemment

démontré Hirayama et Shinozaki (2010).

L’analyse des puces réalisées a permis de

mettre en évidence l’implication de divers

gènes dans le stress hydrique, ces derniers

pouvant être classés dans deux grands groupes

fonctionnels : gènes de réponse à la déshydra-

tation, et gènes de développement ou de

croissance.

Gènes de réponse à la déshydratation :

On peut citer de nombreuses réponses au stress

hydrique. Les aquaporines forment des pores

transmembranaires perméables à l’eau et à de

petits solutés (Kaldenhoff and Fischer, 2006).

Certaines aquaporines sont connues pour être

impliquées dans le stress hydrique chez le riz

(Lian et al., 2004) et chez Medicago truncatula

(Chen et al., 2008). Dans notre étude, elles sont

surexprimées en condition de stress dans les

tiges et les racines. Ceci pourrait s’expliquer

par le fait que la plante cherche à absorber un

maximum d’eau. En revanche, elle n’a pas

intérêt à transporter cette eau dans les feuilles,

c’est pour cela qu’on ne retrouve pas cette

surexpression au niveau des feuilles. Trois

gènes LEA (Late Embryogenesis Abundant

protein) sont également surexprimés en cas de

stress hydrique, LEA 14 est surexprimée dans

tous les tissus alors que les deux autres gènes

présentent des profils différents. Les protéines

LEA agissent comme des chaperonnes (Reyes

et al., 2005). Elles ont été retrouvées dans de

nombreuses plantes comme chez Arabidopsis

thaliana (HongBo et al., 2005). Ces

chaperonnes ont pour rôle de se fixer aux

diverses protéines afin de les protéger de

dysfonctionnements (Xiong and Zhu, 2002)

pouvant conduire à une perte d’activité. Une

fonction similaire a été observée pour une

protéine de choc thermique HSP (Heat Shock

Protein) (Al-Whaibi et al., 2011) également

surexprimée en condition de stress. Les HPS

sont connues pour être synthétisées en réponse

à de nombreux stress (De Maio A., 1999). Le

principe est le même pour les protéines induites

par le froid, l’une d’entre elle se retrouve

surexprimée dans chacun des tissus dans la

condition stressée.

Le lin synthétise divers osmoprotectants pour

tenter de résister au stress hydrique. Un gène

codant pour la proline se trouve surexprimé

dans tous les tissus. Cet acide aminé joue un

rôle important dans de divers stress, et permet

notamment de résister au stress salin chez

l’orge (Ueda et al., 2007). L’accumulation de

proline permettrait dans certains cas, d’induire

une légère tolérance au stress osmotique

(Verdoy et al., 2006). L’enzyme de synthèse

P5CS (pyrroline - 5 - carboxylate synthetase)

est surexprimée dans les racines, ce qui signifie

que la proline est synthétisée uniquement au

niveau des racines puis transportées dans les

différentes parties de la plante. Le raffinose est

aussi un osmoprotectant, il permet de diminuer

le potentiel osmotique des cellules pour ne pas

que l’eau s’en échappe (Dos Santos et al.,

2013). Le gène codant pour cette molécule est

exprimé en condition de stress dans la tige et les

racines, ce qui montre une fois de plus que la

plante essaie de se protéger à ces endroits.

En condition de stress hydrique, des gènes de

défense contre les pathogènes peuvent être mis

en évidence (Chen et al., 2008). C’est le cas des

cystéines protéases, ce sont des hydrolases qui

clivent au niveau des cystéines. Elles sont

impliquées dans de nombreux processus phy-

siologiques et permettent d’arrêter la croissance

des champignons. Un comportement similaire

est retrouvé pour le gène codant un précurseur

edgp, il s’agit d’une glycoprotéine pariétale

14

permettant également de lutter contre les

champignons. Au cours du stress, l’entrée des

pathogènes est facilitée par une altération de la

paroi, c’est pourquoi la plante cherche à se

défendre par la synthèse de ces molécules.

Des gènes de réponse au stress oxydatif se

trouvent également surexprimés, comme ceux

de la glutathion peroxydase, la glutathion s-

transferase et l’ascorbate peroxidase. Le stress

hydrique peut engendrer des stress secondaires

comme le stress oxydatif, c’est pour cette

raison que ces molécules sont produites (Parent

et al., 2008). Elles font partie d’un cycle

permettant de détoxifier les espèces réactives à

l’oxygène (ROS) qui sont présentes en de plus

grandes quantités lorsque la plante est stressée

à cause du remaniement des parois cellulaires.

La surexpression de ces gènes est à mettre en

corrélation avec la diminution de la photosyn-

thèse que nous verrons dans le deuxième

groupe fonctionnel, qui entraine également la

production de ROS. La protéine 14-3-3 est

surexprimée dans les racines, il s’agit d’une

kinase. Elle est capable de phosphoryler de

nombreuses protéines donc agit sur divers

processus physiologiques (Moorhead et al.,

1999). Elle permet de moduler des voies de

transduction et donc d’induire ou non une

réponse physiologique en réponse à un stress

donné.

Gènes impliqués dans la croissance

Des gènes agissant sur la paroi ont été mis en

évidence pendant le stress, comme celui de la

béta-galactosidase pbg. Ce phénomène a déjà

été rapporté chez le pin pour un stress identique

(Perdiguero et al., 2011). La béta galactosidase

est notamment localisée au niveau des

membranes cellulaires et vacuolaires, elle est

capable d’hydrolyser les polysaccharides de la

paroi (Konno et al., 2002). Le principe est le

même pour la béta xylosidase 1, ce qui a pu être

démontré chez A. thaliana (Minic et al., 2006).

Chez le lin, ces 2 gènes sont surexprimés dans

toutes les parties de la plante en condition de

stress. On assiste à un remaniement de la paroi.

En effet en dégradant les polysaccharides, la

plante pourrait y trouver un moyen rendre des

sucres disponibles pour sa nutrition, la

photosynthèse étant devenue insuffisante.

Les cinnamyl alcohol deshydrogenases (CAD)

interviennent dans la voie de biosynthèse des

phénylpropanoïdes et permettent donc la

formation de la lignine (Russel et al., 2000).

Elles sont spécifiquement surexprimées dans

les racines lorsque les plants de lin ont été

stressés. Cette surexpression est signe d’une

augmentation de la synthèse des précurseurs de

lignine, et donc probablement de la lignifica-

tion. Une hyper-lignification permettrait de

rendre les racines plus aptes à supporter le

stress, par exemple en évitant la perte d’eau

mais également en les protégeant des

prédateurs, les remaniements de la paroi

rendant les cellules plus sensibles. De même, la

caffeate 3-O-méthyl transferase (C3OMT) est

d’avantage exprimée au niveau des racines. Il a

déjà été démontré qu’elle intervenait dans le

stress hydrique chez Medicago truncatula

(Chen et al., 2008) ainsi que chez le maïs

(Vincent et al., 2005). Elle fait aussi partie de la

voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes et

aurait le même rôle que les CAD. La 4-couma-

rate ligase-like protein (4CL) est impliquée

dans la même voie de biosynthèse donc elle

entrainerait des modifications identiques. La

différence est qu’elle est surtout surexprimée

au niveau des feuilles, comme la cinnamoyl-

coA réductase. Ces données montrent que la

plante essaie également de se protéger au

niveau des feuilles en augmentant la lignifica-

tion, limitant ainsi l’évapotranspiration et

l’introduction de pathogènes.

D’autres protéines ayant un lien avec la paroi

des plantes sont réprimées par le stress

15

hydrique. C’est le cas de l’hydroxyproline-rich

glycoprotein (RSH). Elle est indispensable au

développement morphologique normal chez

Arabidopsis, elle interviendrait dans le

positionnement de la plaque équatoriale au

cours de la division cellulaire (Hall and Can-

non, 2002). La répression de cette protéine

dans toutes les parties de la plante est signe de

dysfonctionnements cellulaires. La periplasmic

beta-hydrolase est capable d’hydrolyser des

composés glycosylés, ce qui est aussi le cas de

l’α-arabinofuranosidase β-xylosidase. Cette

dernière est une enzyme apoplastique impli-

quée spécifiquement dans la dégradation des

xyloglucanes (Iglesias et al., 2006). Le gène

codant pour cette enzyme est réprimé dans les

feuilles, ce qui montre que le remaniement de

la paroi est moins évident à ce niveau. Cette

hypothèse se confirme avec la répression d’une

protéine de la famille des xylose-isomérases

dans les feuilles lorsque la plante est stressée.

Les xylose-isomérases catalysent l’isomérisa-

tion du D-xylopyranose en D-xylulose

(Hochster and Watson, 1954).

Les gènes de photosynthèse pouvant être mis en

évidence dans le stress hydrique sont activés

dans les racines et/ou inhibés au niveau des

tiges et des feuilles. Plusieurs gènes qui codent

pour des protéines liant les chlorophylles (a/b)

peuvent être cités. Ces molécules sont liées aux

photosystèmes I et II (Boichenko et al., 2007),

et permettent d’optimiser le fonctionnement

des chloroplastes (Kim et al., 2009). La

protéine green flesh est normalement exprimée

dans les tissus verts, sa teneur dans les plantes

augmentent avec l’intensité lumineuse (Rong et

al., 2013) . En condition de stress hydrique, elle

est réprimée dans les tiges et les feuilles. La

rubisco est l’enzyme qui permet la fixation du

CO2 dans la plante, initiant ainsi le cycle de

Calvin. Elle est connue pour être inhibée dans

divers stress, notamment en cas de stress

hydrique chez le blé (Nagy et al., 2013) et de

stress salin chez le soja (He et al., 2014).

L’inhibition de ces gènes niveau des tiges et des

feuilles montre l’arrêt de la photosynthèse dans

ces zones. A l’inverse, leur activation dans les

racines laisse penser que la plante essaie de

faire de la photosynthèse racinaire après 4 jours

de stress. Nous pouvons imaginer qu’après 10

jours, ces gènes seraient totalement réprimés,

les racines n’ayant pas accès à la lumière.

Néanmoins, ce phénomène montre une

nouvelle manière pour la plante de se défendre

contre le stress imposé.

Des gènes spécifiques de certaines hormones

présentent une expression modifiée au cours du

stress hydrique. L’auxin-induced protein, qui

est impliquée dans la formation des racines

latérales et des poils absorbants chez la tomate

(Fang et al., 2014), est réprimée dans les

racines. L’auxin-repressed protein est respon-

sable de l’arrêt de la croissance et de la division

cellulaire, elle est également réprimée dans les

racines. Ces deux constatation nous permettent

de dire que la plante favoriserait la croissance

de ses racines primaires pendant le stress,

probablement pour aller chercher de l’eau plus

en profondeur. L’ethylene-responsive factor

fait partie de la famille des protéines harpines

et est impliquée dans la réponse à de nombreux

stress biotiques et abiotiques (Chuang et al.,

2010). Plus précisément dans la transmission

du stress, c’est pourquoi chez le lin, 3 gènes

codant pour ces protéines sont exprimés au

cours du stress hydrique, chacun dans une

partie de la plante spécifiquement. A l’inverse,

le récepteur de gibbérellines est réprimé dans

toutes les parties de la plante en condition de

stress. Les gibbérellines sont responsables

d’une partie du développement de la plante,

incluant l’élongation des tiges et le développe-

ment foliaire (Li et al., 2013). Son inhibition

indique un arrêt de la croissance et de l’expan-

sion foliaire. Ce résultat se confirme avec l’in-

hibition au niveau des feuilles et des tiges d’un

16

récepteur aux brassinostéroïdes (BRI1). Les

brassinostéroïdes sont connues pour permettre

une certaine tolérance au stress manganèse

(Mn) chez le maïs (Wang et al., 2009). Ils régu-

lent négativement la voie de la mort cellulaire,

et positivement la croissance. Chez le lin, ces

récepteurs sont réprimés dans les feuilles et les

tiges donc la mort cellulaire est stimulée dans

ces zones. Nous pouvons mettre en évidence

que ces récepteurs ne sont pas réprimés dans les

racines, ce qui signifie que la plante cherche à

les préserver. D’après une étude de Wang et al.

(2011), la protéine 14-3-3 pourrait se fixer à

l’inhibiteur du récepteur BRI1 pour l’inhiber à

son tour en présence de brassinostéroïdes. C’est

probablement ce qu’il se passe dans les racines

en condition de stress : 14-3-3 qui est surexpri-

mée se fixe à l’inhibiteur, le récepteur BRI1

libre est alors actif et la croissance des racines

est possible (Figure 11).

Figure 11 : Schéma montrant le lien entre le récepteur aux Brassinostéroides et la protéine 14-3-3 (Wang et al., 2001).

Il est connu qu’un stress peut engendrer une

modification de l’horloge circadienne de la

plante, et donc changer le moment de sa florai-

son (Shimakawa et al., 2012). Chez le lin, une

protéine de contrôle de la floraison se retrouve

surexprimée dans les racines en condition de

stress. Cette constatation nous permet de

supposer que la fleur active des gènes de

floraison dans le but de produire des graines au

plus vite et assurer une reproduction avant de

dépérir.

Résultats et discussion des analyses

histologiques

Résultats

Les photos ci-après montrent les coupes

transversales réalisées avec les différentes

colorations, à 48 ou 100 jours.

Figure 12 : Vue d'ensemble d'une coupe transversale de

tige de lin (48 jours) colorée au TBO

Figure 13 : Coupe transversale de tige de lin (100 jours)

colorée au TBO montrant des fibres organisées en faisceaux

17

Figure 14 : Coupe transversale de tige de lin (48 jours) colo-

rée au Phlorogluciol HCl montrant le xylème et les fibres

Figure 15 : Coupe transversale de tige de lin (100 jours) colo-rée au Phloroglucinol HCl montrant le xylème et les fibres

Interprétations

Lors d’un stress hydrique, la plante répond et

tente de résister. La paroi, qui protège le

contenu de la cellule, est alors mise à rude

épreuve, nous avons précédemment vu que

celle-ci subit alors des remaniements. En effet,

elle doit s’adapter à la perte d’eau de manière à

limiter les effets du stress (Moore et al., 2008).

Une étude antérieure a montré l’effet de divers

stress sur la quantité et la qualité de lignine dans

les parois cellulaires (Moura et al., 2010).

Au cours de notre étude histologique, nous

nous sommes uniquement intéressés à l’aspect

et à la composition des fibres chez des plants de

lin non stressés.

Nous avons utilisé deux colorants différents :

- Le TBO, un colorant polychromatique

- Le Phologlucinol HCl, plus spécifique

des polyphénols donc de la lignine

La vue d’ensemble de la tige de lin en coupe

transversale (Figure 12) montre une organisa-

tion circulaire en 3 zones : la moelle au centre,

constituée de parenchyme ; les tissus

conducteurs composés en grande partie de

xylème secondaire hétéoxylé (le phloème et le

cambium vasculaire ne sont visibles qu’à très

fort grossissement) ; la zone plus corticale où

l’on retrouve les fibres de lin, le chlorenchyme

et l’épiderme. Les fibres sont organisées en

faisceaux. Ce sont de grosses cellules très

allongées, elles présentent une paroi épaisse.

La coloration au TBO met en évidence la com-

position chimique des parois cellulaires en les

colorants de deux manières différentes. Les

parties rose-fuchsia montrent les pectines et les

composés acidiques. Les parties colorées en

bleu-vert montrent les polyphénols donc la

lignine notamment. La figure 13 met en

évidence la localisation des fibres au sein de la

tige, elles sont organisées en faisceaux situés

entre le xylème et le chlorenchyme. Le xylème

est coloré en bleu-vert, ce qui montre que les

parois sont constituées de beaucoup de lignine.

Les fibres sont plutôt colorées en rose (figure

13). En effet, la cohésion des faisceaux de

fibres est assurée par des pectines accumulées

au niveau des parois primaires et des jonctions

intercellulaires (Morvan et al., 2003). Sur nos

coupes, la différence de coloration entre le

xylème et les fibres n’est pas évidente à fort

grossissement. Cependant, nous pouvons tout

de même remarquer que le bleu des fibres est

différent de celui du xylème, ce qui permet de

dire que leur composition serait sensiblement

différente. Pour y voir un peu plus clair, nous

18

avons réalisé une deuxième coloration, plus

spécifique de la lignine.

La coloration au phloroglucinol HCl montre le

xylème bien rouge au microscope (figures 14 et

15), il est constitué de beaucoup de lignine.

En revanche, les fibres ne sont presque pas

colorées, ce qui indique que leur paroi ne se

compose pas (ou peu) de lignine. En effet, elle

serait composée de 1,5 à 4,2% de lignine (Day

et al., 2005).

Nos études étant uniquement qualitatives, les

coupes à 48 jours sont difficilement

comparables avec celles à 100 jours. Néan-

moins, nous pouvons remarquer que le xylème

secondaire semble plus développé dans les

plantes à 100 jours, et les fibres paraissent plus

nombreuses.

Conclusion

Le stress hydrique entraine de nombreuses

réponses chez le lin. Ces réponses affectent la

plante entière, elles sont à la fois physiques,

histologiques, transcriptomiques et protéo-

miques. Les effets du stress sont visibles très

rapidement (J1), les réponses adaptatives

entrent en jeu plus tardivement (J4).

Dans les parties aériennes la photosynthèse est

arrêtée, elles changent alors de couleur et sont

de moins en moins vertes. Après 4 jours de

stress, la plante fait une tentative de photosyn-

thèse racinaire. Cependant, les racines n’ayant

pas accès à la lumière, nous pouvons imaginer

qu’elle y renoncera rapidement. Afin de

compenser l’arrêt d’apport de produits de la

photosynthèse, la plante dégrade les polysac-

charides présents dans les parois cellulaires.

Ces derniers deviennent alors disponibles pour

sa nutrition, on assiste à un remaniement des

parois. En condition de stress, certains polysac-

charides pariétaux seraient dégradés par des

enzymes spécifiques, alors que d’autre non

(Konno et al., 2002). Les parois des fibres

deviennent plus fines et irrégulières. Le

remaniement des parois rend plus sensibles les

cellules aux attaques des pathogènes, c’est

pourquoi un système de défense contre les

champignons est par exemple mis en place. La

plante arrête également l’élongation de ses

tiges et le développement foliaire. Cependant,

la croissance des racines n’est pas inhibée. Au

cours du stress, les racines deviendraient alors

la « tête pensante » de la plante. Contrairement

aux parties aériennes qui sont progressivement

détruites, les racines restent protégées. En effet,

la lignification y est accrue. L’auxine y est

synthétisée en grande quantité afin de permettre

une croissance en longueur, probablement dans

le but d’aller chercher de l’eau plus profondé-

ment dans le sol. Le stress hydrique peut

déclencher des stress secondaires, notamment

un stress oxydatif. C’est pour cette raison que

la plante se défend également contre les espèces

réactives de l’oxygène (ROS). Le cycle de vie

de la plante est aussi impacté. En effet, cette

dernière raccourcie son temps de floraison dans

l’espoir d’avoir le temps de disséminer ses

graines avant de dépérir.

Les phénomènes explicités ci-dessous montrent

une tentative d’adaptation de la plante au stress

imposé. Certaines réponses au stress hydrique

peuvent être perçues comme des mécanismes

inductibles pouvant être rapprochés des

mécanismes constitutifs des plantes tolérantes à

la sécheresse. Nous pouvons notamment citer la

photosynthèse transitoire, le développement du

système racinaire, et la floraison précoce. Dans

leur milieu naturel, l’induction de stress est

causée par l’environnement. Ce dernier peut

alors induire ou réprimer des gènes. Si ces

modifications perdurent plusieurs années, des

générations futures pourront avoir fixé ces

gènes de manière constitutive. C’est de cette

manière que certaines espèces évoluent et

deviennent tolérante.

19

Dans notre étude les plants de lin ont été soumis

à un stress hydrique. En conditions réelles, il

peut arriver que les plantes soient victimes de

plusieurs stress biotiques ou abiotiques

simultanément. Une étude a montré que les

réponses de plantes d’A. thaliana soumises à

une combinaison de stress hydrique et

thermique sont différentes des réponses des

plantes soumises uniquement à un stress

hydrique ou thermique (Rizhsky et al., 2004).

Les projets de ce type peuvent donc aller encore

plus loin et révéler bien des surprises.

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Annexe 1 : Composition des solutions utilisées

pour l’électrophorèse 2D

Solution de réhydratation :

Urée 7M

Thiourée 2M

Chaps 2%

Biolytes pH 3-10 2%

Bleu de Bromophénol

+ Ampholites 2% (v/v)

DTT 2% (w/v)

Solution d’équilibration :

Urée 6M

Tris HCl, pH 8,8, 0,375M

SDS 2%

Glycérol 20%

Pour la solution d’équilibration I : + DTT 130M + Bleu de Bromophénol 16mg/mL

Pour la solution d’équilibration II : + DTT 135M + Bleu de Bromophénol 16mg/mL

Gel de seconde dimension :

Acrylamide / bis-acrylamide 30% 12,5%

Tris HCl, pH 8,8, 0,375M

SDS 0,1% (w/v)

APS 0,1% (w/v)

TEMED 0,14% (v/v)

Attention, après avoir ajouté le TEMED, couler les gels dans les 10 minutes.

Tampon de migration :

Tris base 250mM

Glycine 1,92M

SDS 1%