DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO METROPOLITANA DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp112859.pdf ·...
Transcript of DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO METROPOLITANA DE …livros01.livrosgratis.com.br/cp112859.pdf ·...
INSTITUTO OSWALDO CRUZ Doutorado em Biologia Parasitária
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR
DE Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii
DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ.
SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA
Rio de Janeiro/RJ
2008
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO EVANGELISTA COSTA
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ
Tese apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz como
parte dos requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências, área de concentração em
Biologia.
Orientadores: Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ) Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)
RIO DE JANEIRO 2008
Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ
C837 Costa, Solange do Perpétuo Socorro Evangelista
Isolamento e caracterização molecular de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii de fontes ambientais na região metropolina de Belém, Pará / Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa. – Rio de Janeiro, 2008.
xviii, 161 f. : il. ; 30 cm.
Tese (doutorado) – Instituto Oswaldo Cruz, Pós-Graduação em Biologia Parasitária, 2008.
Bibliografia: f. 116-142
1.Cryptococcus neoformans. 2. Cryptococcus gattii. 3. Fontes ambientais. 4. Mating type. 5. Caracterização molecular - Pará. I. Título.
CDD 619.811 5
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-graduação em Biologia Parasitária
SOLANGE DO PERPÉTUO SOCORRO
EVANGELISTA COSTA
ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii DE FONTES AMBIENTAIS NA REGIÃO
METROPOLITANA DE BELÉM, PARÁ
ORIENTADOR (ES): Prof. Dr. Bodo Wanke (IPEC/FIOCRUZ)
Prof Dr. José Luiz Martins do Nascimento (ICB/UFPA)
Aprovada em: 03/10/2008 EXAMINADORES Profª. Dra. Tânia Maria Pacheco Schubach – Presidente e Revisora (Laboratório de Pesquisa Clínica em Dermatozoonoses em Animais Domésticos/ IPEC/Fiocruz) Profª. Dra Cíntia de Moraes Borba - Membro (Departamento de Micologia/IOC/Fiocruz) Prof. Dr. Ricardo Pereira Igreja - Membro (Faculdade de Medicina/UFRJ) Profª. Dra. Rita Catarina Medeiros de Sousa - Suplente (Hospital Universitário João de Barros Barreto/UFPA)
Profª. Dra. Luciana Trilles - Suplente (Laboratório de Micologia/IPEC/Fiocruz)
Rio de Janeiro, 03 de outubro de 2008
iv
Aos meus pais queridos
Hilson e Raimunda
pelas oportunidades que propiciaram a todos os filhos,
priorizando a educação e pelo
carinho e apoio incondicional
Ao meu esposo Rosildo Paiva,
por sua compreensão, companheirismo, incentivo
e incansável apoio durante esta jornada.
A Rafael e Rodrigo,
filhos amados, pelo carinho e compreensão
dos momentos ausentes para realização deste trabalho.
Carinhosamente dedico.
v
AGRADECIMENTOS
Às famílias que com muita boa vontade permitiram acesso a seus
domicílios, e permissão para coleta das amostras imprescindíveis para realização do
estudo.
Ao Dr. Bodo Wanke, orientador, que com sabedoria, paciência, estímulo e
valiosas críticas e sugestões tornou possível a realização deste trabalho. A Dra.
Márcia dos Santos Lazéra, grande colaboradora deste estudo pelas valiosas críticas
e sugestões. Agradeço a ambos pelos ensinamentos, apoio e amizade que recebi
em todos os momentos.
Ao Dr. José Luiz Martins do Nascimento, orientador que me apoiou e
incentivou à realização desta pós-graduação e coordenou o Programa de
Qualificação Interinstitucional.
À Dra. Rita Catarina Medeiros Sousa, incentivadora e colaboradora na
indicação de pacientes. E ao Dr. Maurício Perez da UFRJ pela orientação estatística.
À coordenadora do Curso de Curso de Pós-graduação em Biologia
Parasitária Dra. Ana Maria Coimbra Gaspar, à secretária Luciane Vieira
Wandermurem e demais funcionários pelo apoio e preciosas orientações recebidos
no decorrer desta pós-graduação.
À direção do Instituto de Ciências Biológicas (UFPA) que me liberou das
atividades acadêmicas em vários períodos para realização desta pós-graduação e a
Pró-reitoria de Pesquisa da Universidade Federal do Pará (UFPA) pelo suporte
administrativo do programa PQI.
À Dra. Paula Beatriz de Araújo (UFRS) que gentilmente identificou o
espécime do artrópode.
Aos funcionários do Museu Paraense Emílio Goeldi, Sr. Antônio Sérgio
Lima pela gentileza na identificação do espécime botânico e ao Sr. Marcelo Thales
pela elaboração do mapa apresentado neste trabalho.
Aos professores da UFPA Dr. Cristovam Picanço Diniz, Dr. José Luiz
Martins do Nascimento, Dr. Luís Carlos Silveira e Dra. Maria da Conceição Pinheiro,
e ao Dr. Cláudio Tadeu Daniel Ribeiro e Dr. Ricardo Lourenço (Fiocruz), pelo
empenho na realização desta pós-graduação.
Aos professores do Curso de pós-graduação pelos ensinamentos e
incentivo.
vi
À Dra. Liane de Castro do Laboratório de Imunodiagnóstico (IPEC/Fiocruz),
e ao grupo do Laboratório de Virologia (IPEC/Fiocruz) pelas facilidades ao acesso e
utilização de espaço físico e equipamentos destes laboratórios.
À Dra. Marília Martins Nishikawa (INCQS/Fiocruz), sempre disposta a
ajudar; pela amizade e apoio imprescindível na identificação bioquímica dos
isolados.
À equipe do Laboratório de Micologia Ambiental (IPEC), Bernardina P.
Morales e Luciana Trilles pela valiosa colaboração no estudo molecular, Cláudia
Fauci Bezerra, Regina Célia Macedo e Gláucia G. Barbosa pelo apoio em várias
etapas do estudo ambiental. E aos demais funcionários e estagiários do IPEC
responsáveis pelo suporte técnico deste estudo.
Às estudantes de iniciação científica Gabriela Ramalho e Érica pelo apoio
a secretária Zélia Magalhães Silva pelo apoio administrativo.
Aos colegas de turma do doutorado, Aldo Valente, Ana Maria Ventura, Ana
Iecê, Eliete Araújo, Éster Miranda, Elizabeth Salbé T. da Rosa, Sâmia Demachi,
Vânia Noronha, pelo apoio e aos colegas Gionovaldo Lourenço e Wallace Santos
com os quais compartilhei várias etapas de trabalho nesta maravilhosa área de
estudo que é a Micologia.
Aos colegas do Laboratório de Micologia (UFPA) Dr. Antonio Hernández
Gutiérrez e ao biólogo José Carlos de Azevedo que me auxiliou em algumas coletas,
pelo suporte durante minha ausência ao longo das etapas deste estudo.
Aos meus irmãos, cunhados, sobrinhos e sogros pelo carinho e incentivos
constantes. E aos amigos e colegas de trabalho pelo apoio.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), pelo apoio financeiro concedido através de bolsa de estudo e passagens
durante as missões de estudo.
A todos que de forma direta ou indireta contribuíram com dados
fundamentais para a construção deste trabalho.
A Deus, pelo dom da vida, saúde fé e esperança em dias sempre
melhores.
Minha gratidão
vii
SUMÁRIO
RESUMO xviii
ABSTRACT xix
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO DE LITERATURA 5
2.1 HISTÓRICO 5
2.2 O FUNGO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E TAXONOMIA 9
2.3 EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE E ECOLOGIA DE SEUS
AGENTES.
14
2.3.1 Em relação à distribuição geográfica 14
2.3.2 Em relação aos sorotipos 19
2.3.3 Epidemiologia Molecular 23
2.3.4 Ecologia dos agentes 28
2.4 VIRULÊNCIA EM C. neoformans E C. gattii 36
2.5 CRIPTOCOCOSE 42
2.5.1 Aspectos Clínicos 43
2.5.2 Agentes Antifúngicos 46
3. RELEVÂNCIA 52
4. OBJETIVOS 54
5. MATERIAIS E MÉTODOS 55
5.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE
ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES NA ÁREA URBANA DE BELÉM
55
5.2 ESTUDOS DE FONTES AMBIENTAIS A PARTIR DE DOMICÍLIOS
DE PACIENTES COM CRIPTOCOCOSE
55
5.2.1 Seleção dos domicílios 55
5.2.1.1 Critérios de Inclusão 56
5.2.1.2 Critérios de exclusão 56
5.3 ÁREA DE ESTUDO 56
5.4 VISITA AO DOMICÍLIO E COLETA DAS AMOSTRAS 59
5.4.1 Entrevista 59
5.4.2 Ficha Ambiental 59
5.4.3 Coleta das Amostras 59
5.5 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS 60
5.5.1 Isolamento das colônias 60
viii
5.5.2 Identificação fenotípica 61
5.5.2.1 Síntese de melanina (atividade fenoloxidase) 61
5.5.2.2 Termotolerância 61
5.5.2.3 Sensibilidade à cicloheximida 61
5.5.2.4 Sorotipagem 61
5.5.2.5 Assimilação de compostos de Carbono e Nitrogênio 62
5.5.2.6 Meio CGB 62
5.5.3 Identificação Molecular 63
5.5.3.1 Extração de DNA 63
5.5.3.2 Determinação do mating type. 64
5.5.3.3 Tipagem Molecular 65
6 RESULTADOS 66
6.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE
ÁRVORES E EXCRETAS DE AVES EM DOIS BAIRROS DE
BELÉM/PA
66
6.2 ESTUDO DE FONTES SPRÓBIAS RELACIONADAS AOS CASOS-
INDICE SELECIONADOS
68
6.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS COLETADAS 70
6.4 DESCRIÇÃO DOS CASOS-ÍNDICE DE CRIPTOCOCOSE, SEUS
DOMICÍLIOS E RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO DOMICILIAR
POR C. neoformans E OU C. gattii.
74
6.4.1 Caso índice 1 74
6.4.2 Caso-índice 2 74
6.4.3 Caso índice 3 76
6.4.4 Caso índice 4 81
6.4.5 Caso índice 5 81
6.4.6 Caso índice 6 81
6.4.7 Caso índice 7 82
6.4.8 Caso índice 8 84
6.5 ANÁLISE DOS ISOLADOS QUANTO À FONTE DE ISOLAMENTO,
DISTRIBUIÇÃO
84
6.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS 87
6.7 ANÁLISE MOLECULAR 89
6.7.1 Tipo sexuado 89
6.7.2 Análise da tipagem molecular 91
ix
7 DISCUSSÃO 95
8 CONCLUSÕES 112
9 PERSPECTIVAS 115
REFERÊNCIAS 116
APÊNDICES 143
APÊNDICE 1 144
APÊNDICE 2 149
ANEXOS 156
ANEXO 1 157
ANEXO 2 159
ANEXO 3 160
ANEXO 4 161
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 6.1 - Número e caracterização de isolados oriundos de fontes
ambientais da cidade de Belém/PA.
66
Tabela 6.2 - Dados meteorológicos de Belém/PA, referentes ao período de
coleta.
67
Tabela 6.3 - Perfil e procedência dos casos selecionados para o estudo
ambiental.
66
Tabela 6.4 - Distribuição das amostras analisadas de acordo com os
casos-índice e seus domicílios e controles
71
Quadro 6.1 - Características gerais dos domicílios de pacientes e controles
dos quais foram obtidos isolados de C. neoformans (Cn) e C.
gattii (Cg) e das amostras coletadas contaminadas.
73
Tabela 6.5 - Distribuição de Cryptococcus neoformans de acordo com o
tipo de substrato, e UFC/g relativos ao caso-índice 2.
76
Tabela 6.6 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii obtidos
do domicílio do caso-índice 3 e domicílios controles, de acordo
com o tipo de substrato, domicílio (paciente ou
controle)/ambiente, espécie isolada, UFC/g e número de
colônias analisadas.
80
Tabela 6.7 - Número de isolados e densidade de colônias fenoloxidase
positivas, de acordo com o tipo de substrato, relativos ao
caso-índice 7.
83
Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de
substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.
84
Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de
substrato, espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.
79
Tabela 6.9 - Freqüência de Isolamento de Cryptococcus neoformans e C.
gattii de acordo com o material analisado.
86
Tabela 6.10 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii identificados pelo
teste de CGB de acordo com os casos-indice.
88
Tabela 6.11 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii quanto
ao tipo sexuado e caso-índice.
89
Tabela 6.12 - Distribuição do tipo sexuado de acordo com a fonte de
isolamento.
91
xi
Tabela 6.13 - Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos
moleculares analisados por PCR-RFLP.
92
Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice. 92
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 5.1 - Mapa de localização da Região Metropolitana de Belém. 57
Figura 6.1- Figura 6.1- Eletroforese em gel de agarose ilustrando a
identificação do tipo sexuado com primers MATα1- MATα2 e
MAT a1- MAT a2 dos isolados ambientais de C. neoformans e
C. gattii de uma área da cidade de Belém/Pará, por PCR.
Linhas – 1 e 11: Peso molecular 100pb; 2: LMM 1082; 3: LMM
1083; 4: LMM 1084; 5: LMM1088; 6: LMM 1089; 7: LMM 1090;
8: ATCC 28957 padrão MATα ; 9: ATCC 28958 padrão MATa;
10: Controle negativo.
67
Figura 6.2 - Figura 6.2 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a
identificação do tipo molecular (VNI e VGII) dos isolados
ambientais de uma área da cidade de Belém. Linhas – 1: LMM
1082; 2: LMM 1083, 3: LMM 1084, 4: LMM 1087, 5: LMM
1088, 6: LMM 1089, 7: LMM 1090. Isolados padrões, de 8 a
11 (VNI-VNIV) de 12 a 15 (VGI-VGIV); 16: controle negativo;
M: peso molecular 100pb. Isolados 1 a 6 correspondem a C.
neoformans VNI e o isolado 7 corresponde a C. gattii VGII.
68
Figura 6.3 - Tatuzinhos de jardins (Arthropoda), coletados em peridomicílio
relativo ao caso-índice 2.
75
Figura 6.4 - A e B: Aspecto de colônias de C. neofromans isoladas em
placas de Petri após processamento dos tatuzinhos.
75
Figura 6.5 - Aspecto externo do peridomicílio relativo ao caso-índice 3. 77
Figura 6.6 - Aspecto externo de casa da mãe e vizinha à casa da paciente
(caso-índice 3) com positividade para C. neoformans e C. gattii.
77
Figura 6.7 - Detalhe da porta de entrada do domicílio da paciente (caso-
índice 3), presença de basidioma.
78
Figura 6.8- Entrada da vila onde foram obtidos isolados ambientais de C.
neoformans e C. gattii relativos ao caso-índice 3.
78
Figura 6.9 - Aspecto externo junto ao domicílio do paciente (caso-índice 7),
observar presença de basidiomicetos.
82
Figura 6.10 - Aspecto externo de domicílio de paciente (caso-índice 7) com
criptococose neoformans, ao fundo, cuja poeira foi positiva
xiii
para C. neoformans e C. gattii. 83
Figura 6.11 - Aspecto de colônias fenoloxidase positivas (marrons),
sugestivas de C. neoformans ou C. gattii.
87
Figura 6.12- Percentual de amostras positivas com isolamento de C.
neoformans e/ou C. gattii.
88
Figura 6.13 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii, de acordo com o
caso-índice identificados pelo teste de CGB.
89
Figura 6.14 - Distribuição do tipo sexuado dos isolados de acordo com o
caso-índice.
90
Figura 6.15 - Percentual de C. neoformans e C. gattii de acordo com o tipo
sexuado.
90
Figura 6.16 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo
sexuado com primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 de seis
isolados ambientais de C. neoformans da região metropolitana de
Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso molecular; 2: PA11; 3:
PA6; 4: PA36; 5: ATCC 28957 padrão MATα; 6: ATCC 28958
padrão MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle
negativo
91
Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular. 92
Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de
isolamento.
93
Figura 6.19 - Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a
identificação do tipo molecular (VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados
ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C. gattii da região
metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-
VNIV e VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a
LMM 801.
93
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
AIDS/SIDA: Síndrome de Imunodeficiência Adquirida
AFLP: amplifield fragment lengt polymorphism
ATCC: American Type Cuture Collection
ºC: graus Celsius
CCP: criptococose cutânea primária
CGB: Ágar Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol
CIM:: concentração inibitória mínima
CLSI: Clinical and Laboratory Standarts Institute
CO2: dióxido de carbono
DNA: ácido desoxirribonucléico
dNTP: de desoxirribonucleosídeo(s) Trifosfato(s)
EDTA: ácido etilenodiaminotetraacético
FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz
g: grama
GalXM: Galactoxilomanana
GXM: Glucuroxilomanana
h: hora
HAART: hight active antiretroviral therapy
HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana
HUJBB: Hospital Universitário João de Barros Barreto
IBGE: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IGS: seqüência espaçadora intergênica
INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade e Saúde
IPEC: Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas
ITS: seqüência espaçadora interna
IV: intravenosa
Kb: kilobases = 1000 bases
LCR: líquor céfalo-raquidiano
LES: lúpus eritematoso sistêmico
M: Molar
MB: megabases = 106 bases
MgCl2: cloreto de Magnésio
min: minuto
xv
mL: mililitro
mm: milímetro
mM: milimolar
N: Norte
NCCLS: National Committee for Clinical Laboratory Standarts
NE: Nordeste
ng: nanograma
NaOH: Hidróxido de sódio
NaCl: cloreto de sódio
NSA: niger seed agar - ágar Níger
pb: pares de base
PCR: polymerase chain reaction – reação em cadeia da polimerase
pH: potencial hidrogeniônico
PLB: fosfolipase B
P/V: peso/volume
RAPD: Randon Amplification of Polymorphic DNA- amplificação randômica de DNA
polimórfico
RFLP: Restriction Fragment Length Polimorphism – fragmentos de DNA gerados por
enzima de restrição
RMB: região metropolitana de Belém
rpm: rotações por minuto
S: Sul
SC: Sabouraud com cloranfenicol
SDS: dodecilsulfato de sódio
SNC: Sistema nervoso central
sp: espécie
TBA: agar azul tripano
Tris: 2-amino-2hidroxidometilpropano-1,3-diol
U: unidade de atividade
UFC: unidade formadora de colônia
UFPA: Universidade Federal do Pará
UV: ultravioleta
var: variedade
VO: via oral
xvi
µm: micrômetro
µL: microlitro
µg: micrograma
µM: micromolar
xvii
RESUMO
Os agentes da criptocococose são atualmente reconhecidos como duas espécies do gênero Cryptococcus: C. neoformans e C. gattii. Enquanto C. neoformans é uma levedura haplóide de distribuição universal, ecologicamente associada à excretas de aves, notadamente pombos e guano de morcegos; apresenta-se geralmente como agente oportunista e causa meningoencefalite em hospedeiros imunocomprometidos, C. gattii é em geral restrito a regiões tropicais e subtropicais, com habitat predominantemente associado a vegetais em decomposição, comporta-se como agente primário e como tal atinge em sua maioria pacientes imunocompetentes. Ambas as espécies são capsuladas e apresentam predileção pelo Sistema Nervoso Central (SNC), constituindo-se na principal causa de meningite por fungos. No Brasil, a criptococose neoformans ocorre em todas as regiões, enquanto a criptococose gattii surge como importante endemia nas regiões Norte e Nordeste. O objetivo deste estudo foi investigar fontes sapróbias dos agentes de criptococose na região metropolitana de Belém/PA (RMB) com ênfase em ambientes domiciliares relacionados a casos de criptococose diagnosticados no Hospital Universitário João de Barros Barreto (HUJBB), no período de 2004 a 2005 para avaliar possíveis relações do ciclo de vida deste fungo com as infecções humanas. Nos domicílios e peridomicílios investigados foram coletadas 186 amostras constituídas principalmente de poeira intradomiciliar, fragmentos de madeira e raspados de ocos vegetais. Após processamento das amostras foram obtidos 220 isolados de C. neoformans e/ou C. gattii identificados com base em características fenotípicas e moleculares. Também foram analisadas amostras de oco de árvores ornamentais e excretas de gaiolas de aves de uma loja na área urbana de Belém. Maior positividade foi observada em poeira intradomicliar, seguida de madeira em decomposição e artrópodes. Isoladamente, C. neoformans foi obtido de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina), raspado de madeira, poeira intradomiciliar e C. gattii foi isolado de poeira intradomiciliar. Em conjunto, ambas as espécies foram isoladas de poeira intradomiciliar em várias ocasiões. A amplificação do gene do feromônio revelou predominância de isolados MATα sobre isolados MATa, sendo C. neoformans MATα (45%) C. neoformans MATa (32,8%), C. gattii MATα (22,7%) e MATαa (0,5%). A PCR/RFLP do gene URA5 agrupou a maioria dos isolados no tipo molecular VNI (45%), seguido de VNIV (32%) e VGII (23%). O estudo de ocos vegetais e excretas de aves em área urbana de Belém permitiu detectar a presença de C. neoformans (VNI) em excretas de aves e C. neoformans (VNI) e C. gattii (VGII) foram isolados de rapados de oco de Senna siamea, onde compartilhavam o mesmo nicho ecológico. Aspectos clínicos e informações do ambiente domiciliar e peridomicílio do paciente foram descritos e discutidos no trabalho. Os resultados obtidos revelam achados inéditos, como a ocorrência de C. gattii em poeira intradomiciliar, e compartilhamento de ambas as espécies em oco vegetal, na cidade de Belém. Revelam a presença de isolados MATα e MATa, na Amazônia Oriental e, além disto, acrescentam novas informações às poucas disponíveis sobre a ecologia e biologia molecular de C. neoformans e C. gattii na região norte do Brasil.
xviii
ABSTRACT
The principal agents of cryptococcosis are now identified as two species of the genus Cryptococcus: C. neoformans and C. gattii. While C. neoformans is an haploid yeast, cosmopolitan, ecologically associated with avian droppings, principally pigeons and bat guano, behaves as an opportunistic agent, major cause of fungal meningoencephalitis in immunocompromised patients, C. gattii is usually restricted to tropical and subtropical regions, predominantly associated decomposing wood of trees and usually behaves as a primary agent, consequently attaining immunocompetent individuals. Both species present as capsulated yeasts and have a predilection for the central nervous system (CNS), constituting the principal etiologic agent of fungal meningitis. In Brazil, opportunistic cryptococcosis occurs in all the regions, while the primary infection prevails as a systemic endemic mycosis in the North and Northeastern regions. The aim of this study was to investigate saprobic sources of these agents in the Metropolitan Area of Belém, emphasizing the dwellings and their sourroundings related to cases of cryptococcosis diagnosed at the University Hospital João de Barros Barreto (UHJBB), during the period of 2004 to 2005 to analyzing possible correlation between environmental isolations of this fungus with human infections. One hundred and eighty six environmental samples were collected in and around eight selected dwellings, constituted mainly of indoor dust, wood debris and scrapings of hollow trees. After sample processing, 220 isolates were obtained, identified on the basis of phenotypic and molecular characteristics. Samples of hollows of ornamental trees and caged psittacine bird droppings of avian stores in the urban area of Belém were also studied. The most contaminated environmental samples were indoor dust, followed by decaying wood and arthropods. Cryptococcus neoformans was isolated alone from snow bugs, planed wood and indoor dust and C. gattii was also isolated alone from indoor dust. Both species were isolated together from indoor dust in several occasions. Amplification of the pheromone gene revealed predominance of mating type α isolates, with C. neoformans MATα (45 %), C. neoformans MATa (32,8 %) and C. gattii MATα (23,7 %) and MATαa (0,5%). PCR/RFLP of the URA5 gene grouped the majority of the isolates into the molecular type VNI (45%), followed by VNIV (32%) and VGII (23%). The study of hollow trees and psittacine bird droppings in the urban area of Belém revealed the occurrence de C. neoformans VNI in the psittacine bird droppings and both species, C. neoformans VNI and C. gattii VGII, in a hollow tree of a Senna siamea, sharing the same ecological niche. Clinical aspects of the patients and informations on their dwellings and respective surroundings were described and discussed. These results revealed unprecedented findings, as the occurrence of C. gattii in indoor dust. Also the occurrence of MATα and MATa isolates and the presence of both species in a common hollow tree in the Belém city are noteworthy. Furthermore, we add new information about the ecology and molecular biology of C. neoformans and C. gattii in the North region of Brazil.
1
1. INTRODUÇÃO
Os fungos são organismos eucariontes, heterotróficos, com nutrição por
absorção e exibem marcada habilidade para utilizar praticamente qualquer tipo de
fonte de carbono como alimento. Estão amplamente distribuídos no ambiente,
estando presentes nos diferentes ecossistemas terrestres e aquáticos, dispersando-
se sob a forma de esporos e/ou fragmentos de hifas, por diversas vias, entre as
quais, o ar, a água e numerosos vetores como insetos, pássaros e o homem. Seu
diversificado aparato enzimático os capacita a colonizar diversos tipos de substratos
de origem animal, vegetal, e até compostos sintéticos como plástico.
A estratégia de nutrição permite classificá-los em três modos básicos de vida:
os sapróbios, que obtêm nutrientes de organismos mortos, desempenhando
importante papel ecológico como recicladores da matéria orgânica; os parasitas,
que obtêm seus nutrientes de organismos vivos, e aqueles que vivem em
associação simbiótica, como os fungos liquenizados, que mantêm associação com
algas ou cianobactérias, as micorrizas, resultantes da associação entre fungos e
raízes da maioria das plantas, e ainda os fungos endofíticos, presentes em folhas e
caules de plantas saudáveis (ALEXOPOULOS et al., 1996).
Estima-se que existam em torno de 1,5 milhões de espécies de fungos
(HAWKSWORTH, 1991), das quais aproximadamente 100 000 espécies estejam
descritas (HAWKSWORTH, 2004). A enorme discrepância entre o número de
espécies conhecidas versus o de espécies estimadas parece estar relacionada a
métodos de amostragens inadequados em várias partes do mundo, especialmente
nas regiões tropicais e subtropicais (ALEXOPOULOS et al., 1996), onde grande
parte da diversidade biológica pode ser extinta antes mesmo de ser conhecida.
Enquanto as fitopatologias micóticas são atribuídas à grande número de
espécies de fungos, as patologias micóticas em animais são causadas por
relativamente poucas espécies. Segundo Perfect (2006), das espécies descritas,
cerca de 270 são reconhecidas como causadoras de doenças em vertebrados e
humanos. Podem causar infecções que variam desde sistêmicas e potencialmente
fatais a infecções com localização superficial, cutânea e subcutânea.
Classicamente, os fungos causadores de micoses humanas são divididos em
dois grupos: 1) patógenos primários, capazes de infectar indivíduos saudáveis, e
2) patógenos oportunistas. Entre os patógenos primários se notabilizam os
agentes de micoses sistêmicas, capazes de infectar indivíduos saudáveis, incluem
2
espécies termotolerantes, dimórficas, com habitat restrito e distribuição geográfica
limitada a regiões endêmicas, e as infecções geralmente são adquiridas via
inalação. Incluem espécies causadoras da paracoccidioidomicose, histoplasmose,
coccidioidomicose e blastomicose e a infecção é referida como micose sistêmica,
pela capacidade do fungo disseminar-se no hospedeiro, infectando um ou diversos
órgãos. Segundo Lazéra et al., (2005) a criptococose por Cryptococcus gattii,
apesar de não ser um fungo dimórfico, tem comportamento de patógeno primário.
Entre os patógenos oportunistas se notabilizam fungos que causam lesões sob
certas circunstâncias, em pacientes com susceptibilidade alterada, ou após
implantação traumática do fungo. Tais fungos são ubíquos ou endógenos,
termotolerantes, em geral monomórficos, cuja via de infecção é variada, produzindo
manifestações cutâneas, subcutâneas ou sistêmicas, conforme a porta de entrada e
sua disseminação no hospedeiro. Exemplificando, podem ser citados Candida spp,
Aspegillus spp, Zygomycetes e Cryptococcus neoformans.
Duas espécies patogênicas do gênero Cryptococcus causam a criptococose:
C. neoformans e C. gattii. Esta micose é de distribuição universal, atinge humanos e
uma grande variedade de animais, tem evolução subaguda ou crônica, e pode ser
fatal quando não diagnosticada e tratada corretamente. Até a década de 1980 a sua
incidência era considerada baixa, ocorrendo principalmente em pacientes com
neoplasias hematológicas (linfomas, leucemias), colagenoses (principalmente lúpus
eritematoso sistêmico-LES), transplantados e indivíduos em uso de corticosteróides.
Com o advento da aids, o número de casos aumentou significativamente,
principalmente devido à imunodepressão do hospedeiro (KWON-CHUNG &
BENNETT, 1992; CASADEVALL & PERFECT, 1998).
A criptococose por C. neoformans destaca-se pela sua relação oportunista
com indivíduos imunocomprometidos, sendo importante causa de infecção e risco de
vida em pacientes com aids (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Entretanto, o
diagnóstico de meningoencefalite criptocócica em indivíduos sem comprometimento
imunológico é relevante em áreas tropicais e subtropicais (CORRÊA et al., 1999;
CAVALCANTI, 1997; SANTOS, 2000; MARTINS, 2003). Além disso, observações
mais recentes mostraram que a criptococose por C. gattii pode ocorrer em regiões
de clima temperado, inclusive com surtos epidêmicos (KIDD et al., 2004) na cidade
de Vancouver, British Columbia, Canadá.
As duas espécies atualmente reconhecidas como agentes da criptococose, C.
neoformans e C. gattii, representam sua forma anamórfica, caracterizadas por
3
leveduras capsuladas, com reprodução por brotamento e identificadas por um
conjunto de características fisiológicas e bioquímicas (KWON-CHUNG & BENNETT,
1992; KWON–CHUNG et al., 2002). A reprodução sexuada (estado teleomorfo)
destes basidiomicetos foi obtida in vitro através de pareamento de isolados
haplóides (KWON-CHUNG, 1975). O ciclo sexuado é realizado através de
conjugação das células haplóides MATαααα e MATa, seguida da produção de hifa
dicariótica com grampo de conexão, septo tipo doliporo sem parentossomos. Os
esporos produzidos, denominados basidiosporos, são uninucleados, com diferenças
morfológicas entre as espécies (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
A epidemiologia da criptococose reflete o comportamento ecológico distinto
das duas espécies. Cryptococcus neoformans tem distribuição geográfica universal,
com ampla disseminação em ambientes urbanos relacionados a habitats de aves,
principalmente pombos e psitacídeos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992;
PASSONI et al., 1998; FILIÚ et al., 2002). Também já foram descritas outras fontes,
como madeira em decomposição e poeira domiciliar (LAZÉRA et al., 1996;
PASSONI, 1999). Cryptococcus gattii tem distribuição geográfica mais restrita,
prevalecendo em regiões tropicais e subtropicais. Todavia, recentemente esta
espécie foi demonstrada em região de clima temperado, causando um prolongado
surto epidêmico (KIDD et al., 2004) na cidade de Vancouver, Canadá, atingindo
humanos e vários animais silvestres e domésticos.
A aplicação de técnicas moleculares na identificação destas espécies tem
oferecido novas informações para estudos taxonômicos e epidemiológicos,
fornecendo características sobre a distribuição e o grau de relacionamento dentro de
uma população, permitindo, por exemplo, distinguir entre uma recidiva e re-infecção,
(HAYNES et al., 1995).
A Região Metropolitana de Belém (RMB), constituída pelos municípios de
Belém, Ananindeua, Marituba, Benevides e Santa Bárbara do Pará, está situada no
estado do Pará, região norte do Brasil, junto à foz do majestoso rio Amazonas.
Caracterizada por clima tropical, com umidade relativa do ar de 85%, propício ao
desenvolvimento da biodiversidade fúngica. Casos de criptococose na região são
continuadamente diagnosticados e registrados no Hospital Universitário João de
Barros Barreto (HUJBB), embora na literatura científica pouco se tenha divulgado,
tanto em aspectos clínicos dos pacientes quanto de aspectos ecológicos dos
agentes, destacando-se o relato de 19 casos de criptococose em crianças, das quais
4
9 foram causadas por C. gattii, sugerindo que o estado do Pará constitui uma região
de alta endemicidade da criptococose por esta espécie (CORRÊA et al., 1999).
O conhecimento da ecologia dos fungos patogênicos aos humanos torna-se
cada dia mais relevante para melhor entendimento da patogenia e controle das
infecções que causam, motivando a realização deste estudo.
5
2. REVISÃO DA LITERATURA 2.1 HISTÓRICO Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin foi identificado como
patógeno humano há pouco mais de 110 anos, quando os médicos alemães, Busse
em 1894 e Buschke em 1895, separadamente, descreveram o caso de uma paciente
do sexo feminino de 31 anos com uma lesão na tíbia e isolaram o agente em cultivo.
Busse denominou o organismo isolado da lesão de Saccharomyces hominis e a
infecção de saccharomycosis hominis enquanto Buschke descreveu o
microrganismo como um coccídio. Estes médicos descreveram pela primeira vez
aspectos da clínica, patologia e micologia da criptococose e seu agente. Na mesma
época, em 1894, na Itália, Sanfelice isolou uma levedura capsulada de suco de
pêssego, denominada por este de Saccharomyces neoformans. No final do século
XIX três relevantes observações tinham sido reconhecidas: 1) a recuperação do
microrganismo a partir de lesões em humanos e animais, estabelecendo seu
potencial patogênico; 2) o isolamento do microrganismo a partir de fonte ambiental,
estabelecendo seu ciclo sapróbio, de vida livre; e 3) o cultivo do microrganismo in
vitro, demonstrando sua patogenicidade para animais de laboratório (CASADEVALL
& PERFECT, 1998).
No início de 1900 foram descritos muitos relatos de infecções por C.
neoformans atingindo vários órgãos, principalmente cérebro, pulmões e pele. A
histopatologia da infecção em humanos foi descrita em detalhe, ressaltando-se em
alguns casos a ausência de resposta inflamatória. A ausência de uma terapia efetiva
contribuía para um prognóstico desfavorável. Muitos relatos clínicos incluíam
experimentos com animais de laboratório na busca de evidências sobre a via de
infecção e eficácia de drogas, sem sucesso. O isolamento de C. neoformans de
lesão pulmonar de um cavalo (FROTHINGHAM, 1902 apud CASADEVALL &
PERFECT, 1998), revelou seu caráter zoopatogênico. A primeira observação do
fungo em meninges humana foi detectada em 1905 por Von Hansemann (apud
KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), o qual descreveu a doença como tuberculose
com leveduras em cistos gelatinosos. Em 1931 Freeman (apud CASADEVALL &
PERFECT, 1998) publicou uma revisão com informações clínicas, patológicas e
microbiológicas e propôs o trato respiratório como rota mais comum da infecção
humana. Desde a descoberta desta micose, vários nomes para o fungo e para a
infecção haviam sido propostos, quando Vuillemin (apud KWON-CHUNG &
6
BENNETT, 1992) em 1901 reclassificou a levedura isolada por Busse como
Cryptococcus hominis e a de Sanfelice como C. neoformans. Estes microrganismos
não formavam ascosporos e nem fermentavam açúcares como aqueles
pertencentes ao gênero Saccharomyces. Em 1935, Benham (apud KWON-CHUNG
& BENNETT, 1992) realizou um estudo com 22 leveduras isoladas de humanos,
onde concluiu que todos os isolados humanos provavelmente pertenciam à espécie
chamada Cryptococcus hominis, com duas variedades. Em 1950 Benham propôs a
denominação criptococose ao invés de torulose e Cryptococcus neoformans como
nomen conservandum (apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), resolvendo assim
uma grande confusão que havia em torno desta terminologia. Neste período, o termo
C. neoformans foi rapidamente absorvido na literatura médica e micológica e a
criptococose havia sido descrita em infecções humanas e animais. Nos anos
subseqüentes, significantes avanços foram registrados no conhecimento da biologia,
ecologia e patologia do agente (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
O primeiro isolamento de C. neoformans a partir de fontes ambientais foi
reportado por Emmons em 1951, que isolou o fungo de solo contaminado com
excretas de aves, em particular de pombos, fundamentando o conceito de que a
infecção é adquirida a partir de ambiente contaminado. Estes achados suscitaram
uma série de estudos sobre fontes sapróbias de C. neoformans, pois, até então, o
isolamento provinha de tecidos e fluidos orgânicos do homem e de animais
suscetíveis. Desde então, o isolamento de C. neoformans tem sido reportado
mundialmente. Importante contribuição foi apresentada em 1962, por Staib (apud
KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), com a descrição de colônias marrons
produzidas por C. neoformans quando cultivado em meio contendo sementes
Guizotia abyssinica, conhecidas como sementes de níger, possibilitando o
desenvolvimento de um meio seletivo para esta levedura e, conseqüentemente,
estimuou a proliferação de estudos buscando conhecer o habitat e ecologia do
fungo.
O aumento de casos de criptococose levou ao reconhecimento deste
organismo como agente oportunista. A introdução da cortisona como terapia para
várias doenças, principalmente linfoproliferativas, como linfomas e leucemias, foram
associadas com o risco de adquirir a criptococose (CASADEVALL & PERFECT,
1998).
Estudos de anatomia patológicas (BACKER, 1952, apud CASADEVALL &
PERFECT, 1998; BACKER & HAUGEN, 1955, apud CASADEVALL & PERFECT,
7
1998) em pacientes com ou sem criptococose meníngea, evidenciaram uma rota
pulmonar para infecção, sugerindo que uma pneumonia criptocócica assintomática
seria uma infecção comum em pacientes normais.
Introduzida no final de 1950 a anfotericina B, foi a primeira droga eficaz contra
C. neoformans. Mais tarde foi descoberta a 5-fluorocitosina que, em conjunto com a
anfotericina B, revolucionaram a terapia da criptococose, reduzindo a mortalidade de
100% para aproximadamente 25 a 30%. No final da década de 80, a introdução de
um novo antifúngico de uso oral, o fluconazol, simplificou o tratamento da
criptococose (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Em 1935 Benham publicou estudo sobre caracterização morfológica e
antigênica, o que conduziu à descrição dos sorotipos A, B, e C por Evans e
colaboradores (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Em 1968 foi descrito o sorotipo
D (WILSON et al., 1968 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998).
No início da década de 70, importante estudo realizado por Shadomy
(1970 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998) relatou a presença de hifa com
grampo de conexão em dois isolados de cepas de C. neoformans. Grampos de
conexão são estruturas distintivas do filo Basidiomycota, cuja função é manter a
condição dicariótica de hifas férteis denominadas dicarióticas. Embora C.
neoformans tenha sido isolado em 1894, seu ciclo completo só foi descrito em 1975,
quando Kwon-Chung descobriu que C. neoformans apresentava dois tipos sexuados
(mating type), denominados α e a, e através do cruzamento entre cepas compatíveis
produziu o estado teleomorfo da levedura, que foi descrita no gênero Filobasidiella.
A aplicação de métodos moleculares no estudo de C. neoformans iniciou-se
no final da década de 1980 e início da década de 1990 sendo tais métodos
intensamente utilizados nas investigações subseqüentes. Estas novas ferramentas
permitiram a identificação, clonagem e caracterização de muitos genes, entre os
quais: produtores da melanina (WILLIAMSON, 1994) de cápsula (CHANG & KOWN-
CHUNG, 1994), genes relacionados ao tipo sexuado e virulência, (MOORE &
EDMAN, 1993), genes ribossomais, entre outros. Com o aumento da incidência da
criptococose, centenas de cepas clínicas foram isoladas e, em seguida, analisadas
por tipagem molecular, revelando grande diversidade genética entre estas
(CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Embora o primeiro isolamento de Cryptococcus neoformans a partir de fontes
ambientais fosse reportado por Emmons em 1951, tratava-se da var. neoformans.
Somente em 1990 foi descrito o isolamento de C. neoformans var. gattii associado a
8
restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis na Austrália (ELLIS & PFEIFFER,
1990a). A identificação de árvores de eucalipto como nicho ecológico natural de C.
neoformans possibilitou um melhor entendimento do relacionamento das variedades,
o ambiente e a patogênese. Em 1970 Vanbreuseghem e Takashio (apud
CASADEVALL & PERFECT, 1998) estudaram uma cepa atípica de C. neoformans
então proposta como C. neoformans var. gattii. No entanto, esta variedade não foi
amplamente aceita, devido sua descrição ter se baseado somente na morofologia, o
que pôde ser comprovado através dos estudos sobre compatibilidade entre os tipos
sexuados (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
A importância médica de C. neoformans aumentou drasticamente em
conseqüência da pandemia da aids. A associação da criptococose com infecção e
imunossupressão do HIV, estimulou o estudo da imunologia e patogênese desta
micose. Antígenos polissacárides foram associados com uma variedade de efeitos
deletérios sobre o sistema imune do hospedeiro e estudos focalizaram a interação
célula-hospedeiro. No final de 1990 a criptococose tornou-se uma infecção comum
em muitas partes do mundo (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Cientistas do Instituto de Pesquisa Genômica (TIGR) e do Centro de
Tecnologia do Genoma da Universidade de Standford, Califórnia, em colaboração
com outros centros de pesquisa, iniciaram o projeto de seqüenciamento do genoma
de C. neoformans. Conforme Kwon-Chung et al. (2000), o projeto iniciou em maio de
2000 e a cepa JEC21 também denominada B-4500 foi selecionada para ter o
genoma sequenciado por ser o único isolado MATα de um par isogênico que pode
ser usado para análises de genética clássica, e a técnica utilizada foi o
seqüenciamento por shotgun. Em 2005, Loftus et al., anunciam que o genoma de
duas cepas de C. neoformans, sorotipo D, MATα, registradas como JEC21 e B-3501
foi completado. A seqüência de nucleotídeos de 14 cromossomos, compreendendo
um total de ~20 Megabases de DNA, foi determinada para estas duas cepas. Loftus
et al. (2005) identificaram um total de 6572 genes codificadores de proteínas e
observam que a organização gênica de C. neoformans é consideravelmente mais
complexa que aquela dos Ascomycetes, cujas seqüências genômicas estão
disponíveis e comparáveis àqueles observados em Arabadopsis thaliana ou
Caenorhabdis elegans. Revelam ainda que o genoma é rico em transposons (~ 5%
do genoma), a maioria destes agrupados em cada cromossomo em blocos únicos
que abrangem de 40 a 100 kb e que podem representar seqüências independentes
na região centromérica. Transposons também estão agrupados em região contígua
9
ao rDNA e dentro do locus MAT. Segundo os autores, a presença de transposons
pode levar à instabilidade cariotípica e a variação fenotípica. Embora as duas cepas
analisadas sejam consideravelmente diferentes o estudo mostrou que há pouca
diferença em seu conteúdo genético. As cepas JEC21 e B-3501 compartilham 50%
de seus genomas, enquanto os 50 % restantes contem aproximadamente 0,5% de
polimorfismo.
O conhecimento do genoma de C. neoformans promove nova percepção
deste importante patógeno. Para Loftus et al. (2005) com estes resultados foi
estabelecida uma plataforma gênica para um estudo posterior deste patógeno
visando explorar as bases moleculares de sua virulência e revelar diferenças entre
as estratégias de virulência de C. neoformans e outros fungos patogênicos. Segundo
Idnurm et al., (2005) a seqüência genômica de C. neoformans é um elo final que
permite uma análise completa da função e evolução do gene. E assim, a
comunidade científica tem agora um mandato para determinar por que e como o
fungo mantém sua patogenicidade, como se propaga e como entender sua biologia
no sentido mais amplo de suas relações parentais próximas e distantes.
2.2 O FUNGO: ASPECTOS MORFOLÓGICOS E TAXONOMIA
Nas primeiras décadas após a sua descoberta, muitas sinonímias foram
usadas tanto para a micose quanto para seu agente, o que gerou muita controvérsia
no meio científico. O nome C. neoformans dado para a forma anamórfica da
levedura foi considerado como binômio válido baseado na prioridade, pois Sanfelice
foi o primeiro a propor o nome específico em 1895. Em 1950 Benham propôs a
denominação criptococose ao invés de torulose e Cryptococcus neoformans como
nomen conservandum (apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992), resolvendo assim
a grande confusão em torno desta terminologia. A utilização de técnicas
moleculares tem contribuído para uma visão mais esclarecedora sobre a taxonomia
de Cryptococcus e outros fungos.
Baseado em reação de aglutinação dos antígenos capsulares a soros
hiperimunes, quatro fenótipos básicos foram identificados e denominados sorotipos
A, B, C e D (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992) e um híbrido AD. Em 1975, Kwon-
Chung descreveu a reprodução sexuada (teleomorfo) de C. neoformans, conseguida
in vitro através do cruzamento entre isolados haplóides compatíveis (MATα e
MATa). A espécie heterotálica foi denominada Filobasidiella neoformans (KWON-
CHUNG, 1976a). Com base na morfologia dos basidiosporos, foi descrita a espécie
10
F. bacillispora (KWON-CHUNG, 1976) e em seguida seu anamorfo C. bacillisporus
(KWON-CHUNG et al., 1978b), sendo considerado C. neoformans anamorfo de F.
neoformans. A descoberta do ciclo sexuado permitiu classificar o fungo no filo
Basidiomycota, onde também estão incluídos macromicetos conhecidos como
cogumelos, orelhas-de-pau, entre outros e patógenos de plantas conhecidos como
ferrugens e carvões. Posteriormente, foi descrita uma variedade distinta, C.
neoformans var. gattii (DE VROEY & GATTI, 1989), a partir de isolado obtido de
líquido cefalorraquidiano de um menino na África Central. Foi verificado que a
morfologia e fisiologia de C. neoformans var. gattii era idêntica a de C. bacillispora
mas diferente de C. neoformans. Em 1982b, em reavaliação taxonômica de
Filobasidiella e seus anamorfos, Kwon-Chung et al. propõem a redução de duas
para uma espécie, mantendo duas variedades: C. neoformans (Sanfelice) Vuillemin
var. neoformans (sorotipos A, D, AD) e seu teleomorfo F. neoformans var.
neoformans, e C. neoformans (Sanfelice) Vuillemin var. gattii Vanbreuseghem et
Takashio (synonimia: C. bacillisporus Kwon-Chung et Bennett) e seu teleomorfo F.
neoformans var. bacillispora. Os critérios que sustentaram esta proposta basearam-
se em diferenças morfológicas, bioquímicas, fisiológicas, ecológicas e de virulência,
tendo como principal marcador o meio de canavanina, glicina e bromotimol (CGB)
(KWON-CHUNG et al., 1982a) utilizado na diferenciação das variedades.
Com base em algumas evidências fenotípicas e genotípicas Franzot et al.
(1999), propuseram uma terceira variedade, denominada C. neoformans var. grubii,
para incluir somente o isolado sorotipo A, mantendo C. neoformans var. neoformans
para os isolados sorotipos D. Esta proposta não foi completamente aceita por vários
micólogos, necessitando de maiores investigações. Diaz et al. (2000), ao analisar
seqüências moleculares do espaço intergênico (ITS) do rDNA, concluíram que,
embora as cepas apresentem alto grau de relacionamento entre genótipos e
sorotipos, este relacionamento não foi exclusivo, assim como o sorotipo não foi
restrito a um particular grupo genotípico, e sugerem que C. neoformans var. grubii
não deva ser considerada uma variedade separada.
Em recente revisão filogenética, diferentes genes (URA5, CNLAC1, CAP59,
CAP64, IGS e ITS rRNA, mtLrRNA) de ambas as variedades foram analisados e
árvores filogenéticas foram construídas. Independente do marcador utilizado, C.
neoformans var. gattii mostrou ser grupo monofilético distinto e claramente
divergente de C. neoformans var. neoformans. Estudos de polimorfismo de DNA por
AFLP (amplified fragment lenght polimorphism) diferenciam C. neoformans var. gattii.
11
(BOEKHOUT et al., 2001, KWON-CHUNG et al., 2002, GAMS, 2005). Segundo
KWON-CHUNG et al. (2002) os resultados obtidos nestes estudos indicam que as
variedades são suficientemente distintas e devem ser consideradas como espécies
separadas.
Atualmente são reconhecidas duas espécies: Cryptococcus neoformans
(sorotipos A, D e AD) e Cryptococcus gattii (sorotipos B e C). Com base nas
características fenotípicas e genéticas de seus teleomorfos estes agentes estão
classificados no filo Basidiomycota, Classe Hymenomycetes, Ordem Tremellales,
família Tremellaceae, Gênero Filobasidiella (ALEXOPOULOS et al., 1996).
Anteriormente estavam classificados na ordem Filobasidialles e família
Filobasidiaceae (BOEKHOUT et al., 1998), entretanto, estudos de sistemática
molecular, por análise seqüencial da região D1/D2 do rDNA, suportam que
Filobasidiella neoformans var. neoformans e F. neoformans var. bacillispora (hoje
consideradas as espécies Filobasidiella neoformans e F. bacillispora) constituem um
grupo distinto, claramente divergente dentro de Tremellales, na ordem de 100%
(FELL et al., 2000). Assim, a ordem Tremellales inclui espécies que: (1) exibem ciclo
de vida dimórfico no qual há uma fase haplóide leveduriforme e uma fase dicariótica,
micelial e com grampo de conexão; (2) possuem septo doliporo; (3) produzem
basídio tremelóide; e (4) exibem um sistema de mating bifatorial modificado
(ALEXOPOULOS et al., 1996).
O gênero Cryptococcus inclui pelo menos 34 espécies cujos teleomorfos,
quando conhecidos, estão distribuídos nos gêneros Filobasidium, Filobasidiella,
Cystofilobasidium e outros gêneros teleomórficos dos Tremellales e Filobasidiales
(FELL & STAZELL-TALLMAN, 1998). A forma de levedura, de células globosas,
ovais ou apiculadas, é a forma assexual, cuja reprodução ocorre por brotamento. O
estágio sexual ou perfeito é caracterizado pela formação de basidiosporos, que são
produzidos através de cruzamento entre isolados com tipos sexuados compatíveis e,
até o momento, observado apenas in vitro.
A identificação do gênero Filobasidiella apresentado por Kwon-Chung & Fell
(1984) descreve o gênero como: na forma anamórfica apresentam-se como
leveduras haplóides, com reprodução assexuada por brotamento de células
globosas, ovaladas ou apiculadas, pseudomicélio ou micélio verdadeiro ausentes em
culturas haplóides, com crescimento em meio sólido geralmente mucóide, com
ausência de pigmentos carotenóides visíveis. As células são capsuladas e a
espessura da cápsula varia de acordo com o isolado e com fatores ambientais. Já
12
Casadevall & Perfect (1998) acrescentam que o tamanho da cápsula varia de acordo
com a cepa e as condições de cultura. Em isolados clínicos a cápsula varia de 50 a
100µm. A maioria das cepas produz cápsulas maiores nos tecidos que in vitro e este
fenômeno está relacionado à maior tensão de CO2 nos tecidos (GRANGER et al.,
1985, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998) e/ou fatores nutricionais (LITMAN,
1958, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998). O método mais comum para
visualização da cápsula é examinar o microrganismo em suspensão com tinta da
China.
Quando semeado em meios sólidos comuns, C. neoformans e C. gattii
produzem colônias de cor branca a creme, brilhantes, de textura mucóide, margem
lisa e inteira (KWON-CHUNG & FELL, 1984). Em meios de cultura contendo extrato
de semente de níger (Guizotia abyssinica) estas espécies produzem melanina,
originando colônias de coloração marrom escura (STAIB, 1962 apud KWON-CHUNG
& BENNETT, 1992). A difenoloxidase produzida por estas espécies é uma lacase,
relembra outras lacases em sua habilidade de oxidar substratos como difenol
aromático, grupo amino e catecolaminas nas posições orto, meta e para, mas não
em grupos monofiléticos como fenol, tiamina ou tirosina (POLACHECK et al., 1982,
WILLIAMSON, 1994).
O ciclo sexuado é realizado através de conjugação de células haplóides
compatíveis. A maioria dos isolados é auto-estéril e produz basidiosporos após
cruzamento com isolados sexualmente compatíveis. O heterotalismo é controlado
por um locus e dois alelos (MATαααα e MATa), surgindo após inoculação de células αααα e
a em meio extrato de ágar malte, ágar suco V8, ágar infusão de feno, ou ágar
extrato de levedura incubado à temperatura entre 25 e 37ºC. Hifa dicariótica com
grampo de conexão, septo tipo doliporo, sem parentossomos, são formados. A hifa
dicariótica produz célula basidiogênica denominada holobasídio, onde ocorre
cariogamia e meiose. Hifas haustorióides, irregularmente ramificadas, são
freqüentemente produzidas. Os basidiosporos produzidos em cadeia medem
aproximadamente 1,8 a 3 x 2 a 5 µm de diâmetro, são uninucleados, ovalados,
elípticos, cilíndricos, piriformes a globosos, com uma parede levemente rugosa.
Cada cadeia de basidiosporos pode conter mais que 20 esporos. Inicialmente os
esporos são secos e a cápsula não é visível até o esporo aumentar até duas vezes o
tamanho original e iniciar a multiplicação vegetativa por brotamento em profusão. O
brotamento dos basidiosporos resulta em colônias mucóides de células
13
representativas de αααα, a ou raramente ααααa (são células auto-férteis). Este processo
pode ser observado dentro de 1 a 2 semanas (KWON-CHUNG, 1998).
Morfologicamente as duas espécies exibem semelhanças na forma de
levedura ou anamórfica. Entretanto, diferenças fenotípicas são evidentes na fase
teleomórfica. Os basidiosporos de F. neoformans são esféricos, oblongos a elípticos
ou cilíndricos, com parede finamente rugosa, enquanto que em F. bacillispora são
baciliformes e de parede lisa (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Entre outras características fenotípicas, estas leveduras não fermentam,
assimilam D-glucoranato e myo-inositol, mas não assimilam nitrato. Compostos
amilóides são produzidos. Reação de urease e azul de diazônio (diazonium blue) B
são positivas.
Outra característica muito utilizada para caracterizar as espécies é através do
teste de sorotipagem. A classificação sorológica baseia-se nas diferenças
antigênicas entre as cepas de C. neoformans e C. gattii. Os sorotipos A, B e C foram
descritos por Evans e Evans & Kessel (apud CASADEVALL & PERFECT, 1998)
utilizando reação de aglutinação e precipitação capsular com antissoro de coelho. O
sorotipo D foi descrito por Wilson et al. em 1968 (apud CASADEVALL & PERFECT,
1998). Em 1985 foi descrito o sorotipo AD, onde os determinantes antigênicos são
os mesmos encontrados nos sorotipos A e D (IKEDA et al., 1985, apud
CASADEVALL & PERFECT, 1998). Sorotipos A e D são detectados em C.
neoformans e sorotipos B e C compõem C. gattii. Raros isolados com ou sem
cápsula, não tipáveis, podem ser encontrados (MITCHELL & PERFECT, 1995).
Uma classificação baseada em oito antígenos, denominados de 1 a 8, cuja
identificação de cada sorotipo está baseada na presença de um ou mais dos 8
fatores antigênicos definidos pelos fatores séricos de reatividade, foi apresentada
por Ikeda (1982). Os reagentes sorológicos são produzidos e comercializados pelo
Laboratório Iatron, Tókio, Japão.
Cabe ressaltar que neste trabalho será adotada a taxonomia proposta por
Kwon-Chung et al., (2002), ou seja, C. neoformans com seu teleomorfo Filobasidiella
neoformans e C. gattii com seu teleomorfo Filobasidiella bacillispora. Assim, C.
neoformans var. grubii e C. neoformans var. neoformans, sorotipos A e D
respectivamente, serão referidos como C. neoformans, e C. neoformans var. gattii
(sorotipos B e C), será referido como C. gattii.
14
2.3. EPIDEMIOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE E ECOLOGIA DE SEUS AGENTES.
2.3.1 Em relação à distribuição geográfica
A criptococose não é uma doença de notificação compulsória, o que dificulta
uma estimativa precisa de sua incidência. No Brasil, dados publicados pelo
Ministério da Saúde no período de 1980 a 2000 mostram que 4,4 % das infecções
oportunistas associadas à aids são por criptococose (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2000), sendo que estes dados se referem apenas aos casos definidores de aids.
A prevalência da infecção por C. neoformans em uma população parece
correlacionar com o número de indivíduos imunocomprometidos e o grau de
exposição ao patógeno (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Até a metade do século 20 a criptococose era reportada esporadicamente,
tornando-se mais comum a partir do final de 1970 (CASADEVALL & PERFECT,
1998). Entre 1965 e 1975 o número médio de casos reportados nos Estados Unidos
foi de 104 por ano (KAUFMAN & BLUMER, 1977 apud CASADEVALL & PERFECT,
1998).
A partir de 1981 a incidência da criptococose em alguns países aumentou
dramaticamente em decorrência da pandemia da aids. Desde então a infecção pelo
vírus HIV tem sido relacionada com mais de 80% dos casos de infecção por
Cryptococcus (DROMER et al., 1996; HAJJEH et al., 1999 apud VIVIANI et al.,
2002). Nos Estados Unidos, a maioria dos estudos registrava prevalência da
criptococose em pacientes HIV positivos na ordem de 5 a 10 % (CASADEVALL &
PERFECT, 1998); na Europa Ocidental variou de 2-10%, enquanto que na África
Central e Sudeste da Ásia ficou em cerca de 5% (DROMER et al., 1996;
DISMUKES, 1988 apud VIVIANI et al. 2002). Achados neuropatológicos em
pacientes com aids revelaram um percentual de 3 a 14 % de indivíduos com lesões
cerebrais (MARTINEZ et al., 1995, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Durante a década de 1990 a prevalência declinou progressivamente,
primeiramente devido ao uso generalizado do fluconazol (NEWTON et al. 1995 apud
VIVIANI et al., 2002) e mais tarde com a introdução de eficiente terapia anti-retroviral
(HAART) que resultou no aumento significante no total de células CD4 e
reconstituição imune em pacientes que receberam este tratamento (KAPLAN et al.,
2000 apud MIRZA et al., 2003; MCNAUGTEN et al., 1999 apud MIRZA et al., 2003).
Em pesquisa conduzida no período de 1992 a 2000 em duas grandes áreas
metropolitanas dos Estados Unidos mostrou redução marcante da incidência da
criptococose. Na cidade de Atlanta a incidência anual entre pacientes com aids
15
sofreu um decréscimo de 66 por 1000 pacientes em 1992 para 7 casos por 1000
pacientes em 2000; em Houston a incidência variou de 23,6 casos por 100.000 em
1993 para 1,6 caso por 100.000 habitantes em 2000. Considerando o total de
pacientes pesquisados (1.491), 89% dos casos ocorreram em pessoas infectadas
pelo vírus HIV (MIRZA et al., 2003).
Desde o advento da aids a criptococose tem sido reportada mundialmente.
Em levantamento realizado no estado do Alabama no período de 1992-1994 foram
registrados 153 casos, dos quais 55% eram HIV - positivos 44% HIV - negativos e
um caso não identificado. A taxa global anual foi de 1,89 por 1.000.000 da
população (THOMAS et al., 1998) comprovando o vírus da imunodeficiência humana
(aids) como o mais importante fator de risco para a criptococose, embora outras
doenças subjacentes também tenham sido registradas, porém em menor proporção.
Hajjeh et al. (apud THOMAS et al., 1998) em vigilância conduzida nos estados de
São Francisco, Atlanta e Houston, detectaram a taxa de 5,26 por 100.000
habitantes.
A criptococose também tem sido reportada na Europa, Ásia e África com
prevalência equivalente aos Estados Unidos. Recentemente foi reportado um estudo
prospectivo da criptococose no continente europeu (VIVIANE et al., 2006), reunindo
655 casos provenientes de 17 países, onde 77% dos casos eram associados a
paciente HIV - positivo. Na França, Dromer et al. (1996) detectou uma freqüência de
4,8 a 7,5%. Na Itália, em pesquisa epidemiológica realizada no período de
Julho/1997 a Dezembro/1999 foram detectados 156 casos de criptococose, incluindo
24 recorrências reportadas por 20 hospitais em nove das 20 regiões italianas
estudadas. A maioria (94,2%) dos casos registrados foi em pacientes HIV positivos,
somente nove casos ocorreram em paciente HIV negativos sendo 147 casos
relacionados a pacientes infectados pelo HIV. Entre os não-europeus (10%), metade
eram africanos e metade da América Central e do Sul, todos HIV - positivos (VIVIANI
et al., 2002). No Reino Unido, estudo comparativo mostrou que a incidência da
criptococose teve aumento significativo de 83 casos no período de 1953 a 1981 para
322 entre 1982 a 1991, dos quais 201 associados a aids (KNIGHT et al., 1993).
Na região do sudoeste asiático e África a criptococose associada à aids
parece ser mais comum que na Europa e Estados Unidos. Na Tailândia foi
encontrada a taxa de 19% de criptococose associada à aids no período de 1994 a
1998 (CLARIYALERTSAK et al., 2001 apud BICANIC & HARRISON, 2005). Revisão
realizada por Holmes et al., 2003, revela que a prevalência da meningite criptocócica
16
em pacientes HIV - positivos foi de 25% na Etiópia, 12 a 50% na África do Sul e 6%
no Congo. Segundo Bicanic & Harrison, (2005), parece provável que a alta
incidência em partes da Ásia e África reflete diferenças na exposição em vez da
susceptibilidade do hospedeiro. Em conseqüência do aumento da criptococose
associada a aids tem ocorrido mudança na epidemiologia. Meningite criptocócica é
agora a principal causa de meningite adquirida por esta população à frente da
tuberculose e meningite bacteriana (HAKIN et al., GORDON et al., (2000) apud
BICANIC & HARRISON, 2005).
Na Oceania um estudo prospectivo realizado no período de 1994 a 1997
revelou uma incidência anual de 6,6 por 106 de habitantes na Austrália (8,0 no ano 1,
4,8 no ano 2 e 5,7 no ano 3) e 2,2 por 106 na Nova Zelândia (2,2 no ano 1, 1,9 no
ano 2 e 2,5 no ano 3). Dos 350 casos analisados, 98,3% apresentaram fator de
risco, com 60,8% associados a aids (CHEN et al., 2000). Esta investigação mostrou
importante variação regional na distribuição geográfica e epidemiologia de infecção
por C. neoformans registrando alta incidência nas regiões Northern Territory e
Queensland, dos quais a maioria relacionada a hospedeiros HIV-negativos,
levantando a possibilidade de exposição a fontes ambientais desconhecidas nestas
regiões.
Na América da Sul, Bava et al. (1997), em análise epidemiológica de 253
casos de criptococose diagnosticados em hospital de Buenos Aires (Argentina),
detectaram que a criptococose era rara no período de 1983 a 1988, duplicando no
segundo período (1989-1991) e no período de 1992 a 1993 teve um discreto
aumento enquanto que o número de casos não associados a aids manteve-se entre
0 a 3 durante o período estudado. Dos casos registrados, 198 estavam associados à
aids.
O primeiro caso de criptococose no Brasil foi registrado em 1941 por Almeida
& Lacaz (apud LACAZ et al., 2002b). Desde então outros casos começaram a ser
relatados esporadicamente. Como em outros países, a partir de 1980, coincidente
com o advento da aids, o número de casos aumentou vertiginosamente. Gonçalves
et al., (1986 apud LACAZ, 2002b) registraram 28 casos no Rio de Janeiro,
ressaltando que esta infecção estava em franca expansão. Análise retrospectiva de
308 casos publicados na literatura brasileira no período de 1981 a 1992 evidenciou
um acréscimo significativo no período. Doença predisponente foi relatada em 153
casos, confirmando a aids como principal fator predisponente com 110 casos.
Setenta por cento dos casos publicados provinham da região Sudeste, segundo os
17
autores decorrentes da maior densidade demográfica e facilidades diagnósticas
(OLIVEIRA NETTO et al., 1993). No estado do Pará, Corrêa et al., (1999),
registraram 78 pacientes diagnosticados com criptococose no Hospital Universitário
João de Barros Barreto no período de 1992 a 1998, chamando a atenção para 19
(24,3%) dos casos que ocorreram em crianças (pacientes com menos de 13 anos de
idade).
Os estudos epidemiológicos conduzidos na era pré-aids já indicavam que C.
neoformans apresentava distribuição mundial. Por outro lado, a criptococose por C.
gattii só foi descrita em 1972, em menino com meningoencefalite e sem evidência de
imunodepressão, na África Central. A partir de então, mostrou-se prevalente apenas
em regiões tropicais e subtropicais. Alta prevalência foi observada no sudeste
asiático, Zaire (atualmente República Democrática do Congo, África), Austrália,
sudeste da Califórnia, Brasil e Venezuela (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
Incidência de C. gattii extremamente alta foi registrada na Austrália, onde a maioria
dos isolados era oriundo de pacientes aborígenes de zona rural (Northern Territory).
Do total 45 amostras clínicas mais de 80 % dos isolados foram C. gattii. Diferença
entre as regiões foi observada. C. gattii foi encontrado no percentual de 65% no sul
da Austrália e 95% no Território Norte. Trinta e um isolados foram recuperados de
indivíduo sem evidência de imunossupressão, dos quais 87% eram C. gattii (ELLIS,
1987). Mais recentemente, uma pesquisa prospectiva foi realizada em nível nacional
na Austrália e Nova Zelândia, regiões onde ambas as espécies são endêmicas,
reforçando achados anteriores. Na Austrália, C. gattii foi significantemente mais
comum em áreas rurais e semi-rurais. Imunodeficiência foi o maior fator de risco
para criptococose neoformans enquanto criptococose gattii esteve associada à
paciente imunocompetente (CHEN et al., 2000). Lui et al. (2006) analisaram 46
casos de criptococose diagnosticados em dois hospitais de Hong Kong (China)
durante 1995-2000, dos quais 20 (43,5%) eram pacientes aparentemente
imunocompetentes. De oito isolados destes pacientes imunocompetentes, três foram
C. gattii. Estudo retrospectivo no México revelou C. gattii em 75% dos 20 casos
analisados (LÓPEZ-MARTINEZ et al., 1996) e em outro estudo realizado no período
de 1989-1998 foram detectados 10,4% por C. gattii em 211 casos avaliados
(CASTAÑON-OLIVARES, et al. 2000). Ainda no México Garza-Garza et al. (1995)
examinaram 60 isolados de pacientes com aids, no período de 1991-1992, 51 eram
C. neoformans e 9 C. gattii.
18
Casos esporádicos de criptococose por C. gattii têm sido reportados de
alguns países de clima temperado como Áustria, Alemanha, Grécia e França
(VIVIANI et al., 2006), mas predominantemente de países de clima tropical ou
subtropical tais como, Espanha (COLOM et al., 2005); Argentina (BAVA et al., 1997),
Índia (JAIN et al., 2005), Botswana, Malawi (LIVINTSEVA et al., 2005), África do Sul
(MORGAN et al., 2006), Colômbia (ORDÓÑEZ & CASTAÑEDA, 2001; ESCANDÓN
et al., 2006) e, desta forma, C. gattii apresenta-se como espécie de distribuição mais
restrita a regiões de clima tropical e subtropical.
Porém, relatos recentes surpreenderam a comunidade científica com a
descrição de um prolongado surto de criptococose por C. gattii no Canadá, uma vez
que a região atingida apresenta clima temperado, na ilha de Vancouver, Canadá,
contrastante ao que tem sido descrito até o momento para esta espécie. Este surto
acometeu 38 casos humanos (92,1%) entre 1999 e 2001, a maioria
imunocompetente, sendo 58% do sexo masculino, 72% com lesão pulmonar, 26%
com lesão de SNC e letalidade e em torno de 10% (KIDD et al. 2004). Ainda em
relação ao surto de Vancouver, a micose foi também diagnosticada em 45 animais,
incluindo 18 gatos, 17 cães, seis golfinhos, dois furões e duas lhamas (STEPHEN et
al., 2002). Até a descrição deste surto, C. gattii era considerado de distribuição
geográfica restrita a regiões tropicais e subtropicais. A emergência desta espécie em
área temperada, com incidência relativamente alta é incomum, particularmente em
mamíferos marinhos evidenciando mudanças ecológicas e climáticas, e
conseqüentemente, também da distribuição geográfica de C. gattii (KIDD et al.,
2004). O aumento acelerado e global da temperatura no planeta no último século
sugere que o clima em algumas regiões do Canadá tornou-se favorável e permitiu a
colonização de C. gattii (KIDD et al., 2004). É possível que a ativação do ciclo
sexuado tenha propiciado recombinantes, surgimento de variantes virulentas,
dispersão através de propágulos sexuados (basidiosporos) e expansão geográfica
para novos habitats (FRASER et al., 2005). Além disso, a criptococose gattii passou
a ser doença de notificação compulsória no Canadá para a vigilância desta infecção
que continua a ocorrer em Vancouver, sugerindo que possa tornar-se endêmica (BC
CENTRE FOR DISEASE CONTROL, 2007). Embora o surto de criptococose
ocorrido em Vancouver seja o único com registro em humanos, surtos em animais já
haviam sido descritos, como pneumonia em cabras na Espanha (BARÓ et al., 1998)
e forma disseminada em psitacídeos de diferentes espécies em aviário no interior do
estado de São Paulo, onde 7 aves morreram (RASO et al., 2004).
19
No Brasil, estudos epidemiológicos e clínicos conduzidos em várias regiões
do país têm apresentado um perfil de predominância de C. gattii nas regiões Norte e
Nordeste. A criptococose da região conhecida como Meio Norte, estados do Piauí e
Maranhão, foi estudada por Cavalcanti (1997) no período de 1986 a 1995 onde 124
pacientes foram analisados clinicamente e 45 amostras foram isoladas do líquor e
analisadas. A pesquisa revelou que 88% dos casos foram observados em
hospedeiros sem evidência de imunodepressão, nativos e residentes na região, cuja
análise mostrou o predomínio de C. gattii com 71,1 % (32) e alta letalidade (40,6%).
Associados a aids foram encontrados 8% enquanto 4% apresentaram outras
condições predisponentes, estes com predomínio de C. neoformans com 28,9% (13)
e taxa de letalidade de 46,2%. Posteriormente, Martins (2003), em outro estudo na
mesma região, investigou 90 isolados clínicos, dos quais 45 eram C. neoformans e
41 eram C. gattii, chamando a atenção para a expressiva ocorrência da criptococose
infantil, sem associação com aids, concluindo que no Meio Norte esta apresentação
não é rara. Na região Norte merece destaque o estudo da criptococose infantil no
estado do Pará, com relato de 19 casos em pacientes sem evidência de
imunodepressão, causada por C. gattii, sugerindo que o estado constitui uma região
de alta endemicidade da criptococose por esta variedade (CORRÊA et al., 1999).
Um outro estudo, prospectivo e retrospectivo, realizado no Amazonas, descreveu 75
casos, dos quais 45 (60%) em indivíduos imunocompetentes e 25 (33,3%) em
crianças, a maioria imunocompetentes (SANTOS, 2000). No Centro-Oeste 123
casos de criptococose foram registrados no período de 1995 a 2005. Destes, 104
(84,5%) eram pacientes HIV positivos, 19 (15,4%) HIV negativos e 6 com outras
condições predisponentes. Em 77 casos foram identificados 69 (89,6%) C.
neoformans e 8 (10,4%) C. gattii (LINDENBERG, et al., 2008).
2.3.2 Em relação aos sorotipos
A distribuição geográfica dos sorotipos e das espécies é particularmente
interessante do ponto de vista eco-epidemiológico.
Em relação à distribuição dos sorotipos de origem clínica, um estudo de 725
isolados oriundos dos cinco continentes ressalta as diferenças epidemiológicas entre
as espécies. Os resultados mostraram o predomínio de C. neoformans sorotipo A,
variando de 50 a 94%, conforme a região geográfica. Dentre os isolados asiáticos a
prevalência do sorotipo A foi maior no Japão (95%) e menor no sudeste asiático
(50%). A exceção de alta prevalência do sorotipo A foi na África, onde apenas 1 em
20
cada 3 isolados obtidos anterior a 1970 era sorotipo A. Cryptococcus neoformans
sorotipo D foi mais comum na Dinamarca, Itália e Suíça (50%), moderadamente
comum na Alemanha (29%) e raramente encontrada em outras regiões (3 a 8 %),
ressaltando a alta prevalência na Europa, contrastando com sua raridade em outras
regiões. Entre os isolados de C. gattii, o sorotipo B foi 4,5 vezes mais prevalente que
o sorotipo C (KOWN-CHUNG & BENNETT, 1984 apud KOWN-CHUNG & BENNET,
1992).
Enquanto evidenciava-se o predomínio global do sorotipo A, por outro lado
também se observava a prevalência significativa do sorotipo B em muitas áreas
tropicais e subtropicais, como na Austrália, Brasil, Venezuela, sudeste asiático e sul
da Califórnia e a freqüência do sorotipo D na Europa. Em pesquisa prospectiva da
criptococose na Europa (Julho/1997 a Dezembro/1999) 311 isolados de C.
neoformans foram sorotipados, dos quais sorotipo A foi o mais representativo (51%),
seguido do sorotipo D (30%) e sorotipo AD (19%) (VIVIANI, et al., 2006)
DROMER et al. (1993, apud DROMER et al. 1994) através de estudo
nacional realizado na França analisaram 273 casos de criptococose entre 1990 e
1992 e foi possível detectar 17% das cepas eram sorotipo D, com distribuição
irregular nas regiões estudadas. Dos casos analisados, acima de 80% dos pacientes
eram HIV positivos. Na Espanha, estudo de 115 isolados clínicos concluiu que o
sorotipo A predominou em pacientes HIV positivos (59,3%), seguido do sorotipo D
(28,4%) e AD (12,3%). Os autores ressaltam o fato de que sorotipos D e AD foram
freqüentes no país, além do que o sorotipo D foi predominante em algumas regiões
como Valencia, com 100% (n=11) das cepas. Adicionalmente foram também
analisados 6 isolados de animais, os quais todos os sorotipos B e 33 ambientais,
das quais 79% (n=26) sorotipo A, 15% (n=5) sorotipo D e 6% (n=2) sorotipo AD
(BARÓ et al., 1999). O sorotipo D também apresentou elevada freqüência em Nova
York (USA), onde a análise de 40 isolados clínicos mostrou 39 tipáveis com taxas de
85% sorotipo A, 12,5% sorotipo D, e 2,5% sorotipo AD (STEENBERGEN &
CASADEVALL, 2000). Na Alemanha, o estudo de 25 isolados ambientais e clínicos
revelou que 13 dos isolados foram sorotipo A (62%), 5 sorotipo D (24%) e 3 sorotipo
AD (14%) (MISHRA, et al.1981). Dromer et al., (1994) relataram que na França
cerca de 17% dos pacientes são infectados com sorotipo D e na Itália um estudo
com 207 pacientes no período de 1972- 1995 mostrou prevalência de 71% (147
isolados) de isolados sorotipo D seguido de 24,6% (51) sorotipo A e 3,4% (7)
sorotipo AD (TORTRANO et al., 1997).
21
Pfeiffer & Ellis (1993 apud LACAZ et al., 2002b) estudaram 460 isolados
clínicos e ambientais de regiões da Austrália registraram o predomínio do sorotipo B
(274) seguido do sorotipo A (167) e sorotipo D (2), e ainda 17 não tipáveis,
confirmando a importância do sorotipo B nesta região.
Na Colômbia, Ordoñez & Castañheda (1994 apud LACAZ et al., 2002a),
registraram pela primeira vez o sorotipo C na América do Sul, a partir de um estudo
de 163 amostras clínicas. O sorotipo A representou 92% dos isolados clínicos
analisados (n=163) e 10% de fontes ambientais (n=23). Vinte e nove isolados
clínicos foram identificados como C. gattii, dos quais 11 sorotipo B e um sorotipo C.
Adicionalmente em outra investigação de 370 isolados clínicos, obtiveram 351
isolados C. neoformans sorotipo A e 1 sorotipo D. Entre os isolados de C. gattii 17
sorotipo B e 1 sorotipo C (ORDOÑEZ & CASTAÑHEDA, 2001).
No Brasil, Lacaz & Rodrigues (1983 apud LACAZ et al., 2002b) sorotiparam
25 isolados clínicos revelando o predomínio do sorotipo A com 56% (14), seguido do
sorotipo B com 36% (6) e sorotipo D com 8% (3).
Em ambiente urbano o sorotipo A pode ser considerado um poluente aéreo,
onde infecções e re-infecções exógenas são bastante comuns, atingindo grande
parte da população. No entanto, os casos clínicos da doença são raros em
indivíduos imunocompetentes, que demonstram elevada resistência natural a esta
variedade essencialmente oportunista. Casos humanos da micose causada por C.
gattii sorotipo B predominam nas regiões tropicais e subtropicais em indivíduos sem
evidência de imunodepressão, comportando-se como patógeno primário, sendo a
micose de ocorrência endêmica e focal (PASSONI, 1999).
Um dos mais completos estudos de sorotipagem foi realizado por Nishikawa
et al. (2003), demonstrando que a prevalência das espécies/sorotipos diverge de
acordo com as regiões brasileiras. Um total de 467 isolados de amostras clínicas e
ambientais foi examinado. Os autores verificaram que sorotipo A é prevalente nas
regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste enquanto que sorotipo B predominou no Norte
e Nordeste. No Sudeste o sorotipo A foi detectado em 98,3% de pacientes com aids
(172/175) e na região Nordeste 87,5% (28/31), enquanto que em pacientes sem
aids, no Sudeste detectou-se ~53% (8/15) e no Nordeste 9,75% (3/31). Por outro
lado, o sorotipo B esteve associado com aids em 12,5% (2/16) dos pacientes da
região Nordeste e apenas 1,7% (3/175) da região Sudeste. Houve predomínio forte
do sorotipo B em relação ao paciente sem aids com 87,5% (28/31) na região
Nordeste e 47% (7/15) na região Sudeste. Assim, evidencia-se a prevalência do
22
sorotipo B na região Nordeste, em paciente HIV negativo. Outros dados relevantes
foram a descoberta de um isolado sorotipo C, de paciente HIV-negativo do Rio de
Janeiro, além de uma alta taxa de sorotipo AD (1,3%) em relação ao sorotipo D
(0,4%). Não tipáveis representaram 1,93%.
Posteriormente, Casali et al., (2003) examinaram 105 amostras clínicas do
Rio Grande do Sul, sendo 93 (88,6%) de paciente HIV positivo. Destas, 91 foram
sorotipo A, juntamente com mais 4 isoladas de pacientes sem fator de risco. Entre os
isolados sorotipo B, dois foram recuperados de paciente HIV positivo e 11 de
pacientes imunocompetentes.
A raridade do sorotipo C parece ser mundial. Há poucos relatos na literatura,
sendo a maioria proveniente do sul da Califórnia (KWON-CHUNG & BENNETT,
1984 apud KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). No Brasil tem sido registrado
esporadicamente, somente em cepas clínicas (LACAZ & RODRIGUES, 1983 apud
LACAZ et al., 2002a; NISHIKAWA et al., 2003; BARRETO DE OLIVEIRA, et al.
2004). Recentemente, dois estudos realizados na África mostraram prevalência de
C. gattii sorotipo C de 13,7% (22/176) em Botswana e 13,3% (2/15) em Malawi,
todos isolados de amostras de pacientes com aids (LIVINTSEVA et al., 2005). Na
África do Sul, Morgan et al., (2006) analisaram 46 isolados de C. gattii recuperados
de pacientes atendidos no período de março/2002 a fevereiro/2004, dos quais 19
eram sorotipo B e 22 sorotipo C (50% de pacientes com aids e 50% de pacientes
sem comprovação de estado HIV positivo ou negativo).
Isolados híbridos ocorrem em uma freqüência apreciável tanto em isolados
clínicos quanto ambientais. Na América do Norte, híbridos AD ocorreram em 7,1 %
no ambiente e 2,4% em clínicas (LINTVINTSEVA et al., 2005), no Brasil 1,3%
(NISHIKAWA et al., 2003) e na Europa 19% (VIVIANI et al., 2006), cuja análise com
PCR fingerprinting representou um aumento significante de 30 % das cepas híbridas,
pois alguns isolados que foram sorotipados como sorotipos A e D eram de fato AD, o
que demonstra diferenças entre os métodos utilizados. Isto indica que
possivelmente a ocorrência de híbridos deva ser maior do que até o momento foi
evidenciado e que os métodos devem ser reavaliados. Considere-se ainda que
vários isolados não têm sido caracterizados (COGLIATI et al., 2001; NISHIKAWA et
al., 2003), os quais são definidos como não tipáveis. A maioria dos isolados híbridos
é AD, o que está condizente com o fato dos sorotipos A e D serem cosmopolita.
23
A busca das fontes naturais da infecção demonstra um perfil similar à
distribuição dos sorotipos dos isolados obtidos de pacientes na mesma região. Estes
dados são apresentados no tópico 2.3.4.
2.3.3 Epidemiologia Molecular
A utilização de técnicas de biologia molecular tem contribuído sobremaneira
para a compreensão da estrutura populacional, taxonomia, eco-epidemiologia,
patogenicidade, mecanismos de infecção e tratamento de infecções fúngicas.
Nas últimas três décadas modelos de análise molecular para eucariotos têm
sido desenvolvidos em alguns fungos, tais como Saccharomyces cerevisiae,
Neurospora crassa e Aspergillus nidulans (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Estes
estudos moleculares para fungos proporcionaram um avanço notável no
conhecimento da biologia molecular de C. neoformans, a ponto de ser utilizado como
um sistema modelo para estudo molecular de outros fungos patogênicos.
Atualmente várias técnicas de tipagem molecular têm sido utilizadas para
análise de um número limitado de isolados clínicos e ambientais. Estas técnicas
incluem análise de fragmentos de ácidos nucléicos gerados por enzimas de restrição
(RFLP – Restriction Fragment Length Polimorphism) (CURRIE et al., 1994; JAIN et
al., 2005), hibridização por Southern blot com sondas de DNA baseado em
seqüência de DNA repetitivo (VARMA et al., 1995), cariotipagem (PERFECT et al.,
1993), seqüenciamento de DNA (CASADEVALL et al., 1992), PCR-fingerprinting
(MEYER et al., 2003; MEYER et al., 1999, ESCANDÓN et al., 2006) análise de DNA
polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD – Random Amplification of
Polimorphic DNA) (YAMAMOTO et al., 1995; SORRELL et al., 1996; MEYER et al.,
2003; MEYER et al., 1999; JAIN et al., 2005) e, mais recentemente, análise de
polimorfismo de tamanho de fragmentos amplificados (AFLP - Amplified fragment
Length polimorphisms) (BOEKHOUT et al., 2001; TRILLES et al., 2003; BARRETO
DE OLIVEIRA et al., 2004). Estas metodologias têm evidenciado a heterogeneidade
genética entre isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans. A
existência de variabilidade genética é importante porque pode traduzir-se em
variabilidade fenotípica, tais como diferenças antigênicas, virulência ou na
susceptibilidade aos agentes terapêuticos (FRANZOT et al., 1997). Resultados
prévios referidos por Ellis et al. (2000) evidenciaram alta variação dentro de isolados
de C. neoformans oriundos dos Estados Unidos.
24
Cariotipagem por eletroforese de campo pulsado tem sido usado para separação de
cromossomos de C. neoformans e demonstraram significante variação no tamanho
de cromossomos polimórficos entre os isolados (PERFECT et al., 1989; PERFECT
et al., 1993). Estes achados sugerem que C. neoformans não tem se expandido
clonalmente a partir de um isolado, mas que tem estado sob alguma pressão
evolucionária, para a instabilidade do cariótipo e que estas leveduras desenvolveram
mecanismos que permitem o rearranjo cromossômico. Apesar da heterogeneidade
dos padrões cromossômicos entre vários isolados alguns podem manter um padrão
estável durante repetidas passagens in vitro por muitos anos e in vivo em modelos
animais durante curto tempo (PERFECT et al., 1989). Freqüentes deleções e
rearranjos cromossômicos têm sido associados não apenas com fungos, mas
também com protozoários, durante seu ciclo de vida, sugerindo que estas alterações
possam ocorrer com C. neoformans, quando em condições de estresse ou certas
pressões seletivas. Não se sabe se esta instabilidade é deletéria ou útil para a
sobrevivência da levedura, mas poderia explicar a diversidade cariotípica em C.
neoformans (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Estudos revelaram que 90% dos
isolados clínicos de C. neoformans têm um único cariótipo (PERFECT et al., 1993).
Franzot et al. (1998) observaram pequenas diferenças no tamanho do cromossomo
em dois isolados da mesma linhagem (ATCC 24067), mantidas em condições
laboratoriais em diferentes laboratórios e supõem que C. neoformans é capaz de
alterações rápidas in vitro, provavelmente como resultado de adaptação de
condições laboratoriais.
Varma & Kwon-Chung (1992), utilizando a técnica de hibridização de RFLP
com sonda UT-4p, que tem sido usada para discriminar a diversidade de C.
neoformans, mostraram que 21 dos 26 isolados tinham um padrão único de DNA e
que o fingerprint dos isolados dentro de um mesmo grupo de sorotipo foram mais
similares que aqueles de diferentes sorotipos. Os autores demonstraram a
habilidade desta sonda discriminar entre isolados em uma população bem como
dentro de um sorotipo.
O uso de tecnologia de PCR combinada com o uso de primers aleatórios
permite identificar fingerprints de DNA de diferentes isolados de fungos. Estes
procedimentos têm sido refinados e adaptados para o uso em C. neoformans
(HAYNES et al., 1995; MEYER et al., 1999). Quando realizados em laboratórios com
experiência nesta tecnologia e com controle correto de genotipagem pode distinguir
um isolado de outro em mais de 95% dos isolados. A técnica foi refinada e o uso de
25
oligonucleotídideos que são específicos para minissatélites (M13) e microssatélites
(GACA)4 ou para seqüências repetitivas simples designadas para hibridização
fingerprint convencional. PCR fingerprint combina a especificidade do fingerprint
convencional baseado na hibridização do DNA com a eficiência da PCR e tem sido
usada para amplificar seqüências de DNA repetitivas hipervariáveis de C.
neoformans. PCR fingerprint com primers oligonucleotídeos (GACA)4 e fago M13
têm sido usadas com sucesso (CASADEVALL & PERFECT, 1998; ELLIS et al.,
2000).
Estudos realizados por Meyer et al. (1999, 2003) utilizando métodos de PCR-
fingerprinting (RAPD-PCR com iniciador M13) e RFLP do gene URA5, permitiram
identificar os 8 tipos moleculares designados de VN (I, II, III, IV) para C. neoformans
e VG (I, II, III, IV) para C. gattii. Utilizando a técnica de AFLP, Boekhout et al. (2001),
identificaram genótipos de C. neoformans e C. gattii. Comparados, estes dois
métodos mostram correspondência entre si, bem como relação com sorotipos. Deste
modo, C. neoformans corresponde aos genótipos: VN1/AFLP1, sorotipo A;
VNII/AFLP1A, sorotipo A; VNIII/AFLP3, sorotipo AD; e VNIV/AFLP2, sorotipo D; e C.
gattii corresponde aos genótipos: VG1/AFLP4, sorotipo B; VGII/AFLP6, sorotipo B;
VGIII/AFLP5, sorotipo B; e VGIV/AFLP7, sorotipo C. Estes genótipos moleculares
têm sido encontrados em grupos (clusters) de acordo com a origem geográfica e
também com variável distribuição global (KIDD et al. 2003). Observa-se que
correspondência com sorotipos restringe-se ao predomínio observado nas séries
analisadas, mas não há padrão molecular específico de sorotipo, principalmente
para C. gattii (LAZÉRA et al., 2007).
Os tipos VNI e VGI predominam no mundo como agentes de criptococose,
mas na América Latina a distribuição e ocorrência de tipos moleculares de C. gattii
apresenta perfil diferente dos demais continentes (MEYER et al., 2003; TRILLES et
al., 2003; BOEKHOUT, 2001). Estudos moleculares de agentes patogênicos
contribuem para a compreensão da epidemiologia da criptococose no Brasil.
Isolados clínicos e ambientais no Brasil mostram considerável diversidade genética
de ambas as espécies, demonstrando ocorrência simultânea de diferentes
tipos/genótipos (VNI/AFLP1, VNIV/AFLP2 e VGII/AFLP6) em ocos de árvores; e que
diferentes gêneros de árvores e substratos de madeira, bem como tocas de animais,
podem ser fontes de infecções humanas. Estudo retrospectivo dos tipos moleculares
de C. neoformans e C. gattii circulantes no Brasil sugere diferenças regionais na
distribuição destes genótipos. Assim, as regiões Sul e Sudeste do Brasil apresentam
26
como tipo molecular predominante VNI, atingindo, sobretudo pacientes
imunocomprometidos, principalmente os com aids (CASALI et al., 2003; IGREJA et
al., 2004; MATSUMOTO et al., 2007). Diferentemente, no N e NE do Brasil o agente
mais comum é o tipo VGII sorotipo B, demonstrando ser endêmico na região,
causando doença principalmente em pacientes imunocompetentes. O mesmo tipo
molecular VGII foi o responsável pela epidemia no Canadá, identificado na grande
maioria dos isolados clínicos humanos, veterinários e ambientais (KIDD et al., 2004).
Franzot et al. (1997) através da técnica de RFLP com elementos repetitivos CNRE-1
e seqüência do gene URA5 compararam a diversidade genética de isolados
brasileiros e de Nova Iorque, sugerindo a origem clonal dos isolados brasileiros para
explicar a baixa diversidade genética entre os 51 isolados coletados no Rio de
Janeiro e Belo Horizonte. No estudo alguns isolados brasileiros apresentaram uma
relação estreita condizente com a dispersão global de certos isolados patogênicos.
Embora seja um método mais demorado, o seqüenciamento de genes
específicos tem sido usado para detectar polimorfismo de C. neoformans e, portanto,
diferenças entre os isolados. Uma única cópia do gene URA5 mostrou a existência
de substituições extensivas de pares de bases em isolados individuais e entre
espécies, alcançando 6% dos nucleotídeos da seqüência codificadora
(CASADEVALL et al., 1992). Estas substituições geralmente são encontradas na 3ª
posição do códon ou nos introns, portanto as proteínas não sofrem alteração
(CASADEVALL et al., 1992).
A técnica de PCR com primers específicos para os genes STE12α e MFα de
C. gattii foi utilizada para determinar mating types de C. gattii presente em várias
regiões da Austrália (HALIDAY et al.,1999). Os resultados mostraram diferenças
geográficas na distribuição dos alelos de mating type. A maioria dos isolados
ambientais foram MATα, porém MATa foi encontrado em duas áreas separadas, o
que evidenciou o contraste com C. neoformans uma vez que ambos mating types
foram encontrados em algumas populações de C. gattii inclusive em uma destas
áreas numa distribuição aproximada de 1:1 como esperado para uma recombinação
sexual.
Utilizando abordagem tradicional (cruzamento in vitro) e molecular (PCR com
primers específicos STE12α e STE20) Yan et al. (2002) analisaram 358 isolados
oriundos de quatro áreas geográficas dos Estados Unidos; todos os isolados
sorotipos A, B e C foram MATα e de 19 isolados sorotipo AD 14 foram AaDα, sendo
13 de São Francisco (EUA), demonstrando proporção significante de isolados auto-
27
férteis, diferente das de outras áreas. Análises de mating type entre os híbridos
indica que a maioria dos isolados AD são αADa e aADα (BARRETO DE OLIVEIRA
et al., 2004; CHATURVERDI et al., 2002; LINTVINTSEVA et al., 2005). Híbridos BD
têm sido produzidos em condições laboratoriais (KWON-CHUNG et al., 1982b) e,
embora se especule sobre sua ocorrência natural (CHATURVEDI et al., 2002), isto
não havia sido observado até recentemente quando Bovers et al., (2006)
descreveram a ocorrência natural de híbridos entre C. neoformans e C. gattii BD,
isolados de pacientes. Os autores discutem que todos os híbridos de C. neoformans
e C. gattii têm sorotipo D do isolado parental, sugerindo que isolados sorotipos D
sejam sexualmente mais compatíveis com outros genótipos que os outros genótipos
de C. neoformans e C. gattii e ressaltam que a hibridização inter-espécies pode
formar um super-patógeno, resultante da combinação das características de ambas
as espécies.
O predomínio do tipo sexuado MATα sobre o MATa foi inicialmente reportado
por Kwon-Chung & Bennett (1978) quando analisou 338 isolados (233 clínicos e 05
ambientais numa proporção de 30:1 entre os isolados clínicos e de 40:1 entre os
isolados ambientais. Somente em 2000 Lengeler et al. identificaram o primeiro
isolado de C. neoformans sorotipo A MATa, que até então se acreditava extinto.
Este isolado é estéril e é menos virulento que sorotipo A MATα. O sorotipo D,
freqüente na Europa Central (VIVIANI et al., 2006) apresenta os dois tipos sexuados
e tem sido a base para estudos de genética clássica da espécie, embora MATa seja
pouco freqüente. Em relação a C. gattii sorotipo B, endêmico em regiões tropicais,
subtropicais e recentemente em região temperada de Vancouver, a maioria dos
isolados têm sido MATα, com raros isolados MATa. A supremacia de isolados MATα
sobre MATa é corroborada por diversos estudos (CASALI et al., 2003; TRILLES et
al.,2003; JAIN et al., 2005; CARVALHO et al., 2007), e têm sido considerado de
maior virulência em modelos animais (KWON-CHUNG et al., 1992b). Em contraste
com esta afirmação Nielsen et al. (2003), analisando isolados sorotipos A MATα e
MATa, observaram virulência equivalente em modelos animais, pontuando que é
possível que isolados MATα possam ser mais virulentos em humanos e que, devido
às diferenças entre estes e os organismos estudados, esta diferença não tenha sido
detectada. Isto indica que mais estudos são necessários para explicar estes
contrastes.
Outra tecnologia usada recentemente é o Luminex xMAP, que tem sido
adaptada visando detecção de genótipos de C. neoformans e C. gattii (DIAZ et al.,
28
2005) que se baseia em microsferas codificadas em cores que permite detectar
aproximadamente 100 diferentes espécies em uma única reação. Esta tecnologia
tem sido usada para detecção de várias espécies de fungos e bactérias com
grandes possibilidades de se tornar um método eficiente de diagnóstico com alta
especificidade na identificação de C. neoformans e C. gattii (BOVERS et al., 2007).
Técnicas moleculares também têm sido utilizadas para caracterização dos
sorotipos como PCR-multiplex (ITO-KUWA et al., 2007; CARVALHO et al.., 2007),
PRC fingerprinting mostrou aumento na identificação de híbridos AD (VIVIANI et al.,
2006) em relação ao usual Crypto Check Kit. PCR-restriction enzyme analysis e
length polymorphism analysis foram descritos por Enache-Angoulvant et al., (2007),
ambos baseados na seqüência de um fragmento do gene CAP59 cujos resultados
demonstraram serem métodos confiáveis.
O uso de técnicas moleculares no estudo de C. neoformans e C. gattii tem
contribuído para um melhor entendimento da patogenicidade, epidemiologia,
mecanismos de transmissão e permitem estudos de análise da diversidade intra e
interespecífica, distinguir entre infecção por novas linhagens ou recidivas,
caracterizar sorotipos bem como isolados resistentes a antifúngicos.
2.3.4 Ecologia dos agentes
A natureza saprobiótica de C. neoformans é conhecida desde 1894 quando
Sanfelice isolou o agente a partir de suco de pêssego fermentado (CASADEVALL &
PERFECT, 1998). Novo relato desta natureza só foi acontecer em 1951 quando
Emmons, pesquisando Histoplasma capsulatum em amostras de solo da região da
Virgínia (EUA), incidentalmente isolou C. neoformans de 4 amostras ambientais
dentre 716 pesquisadas (EMMONS, 1951). Em 1955, o mesmo autor demonstrou
que cepas virulentas de C. neoformans foram comuns e abundantes em amostras de
excretas e restos de ninhos de pombos (EMMONS, 1955 apud PASSONI, 1999).
Como descritos em outro tópico, concomitantemente isolados clínicos de C.
neoformans também são reportados em vários países de todos os continentes,
confirmando a distribuição universal deste agente.
Os relatos de Emmons suscitaram dezenas de estudos sobre o tema e, desde
então, a literatura mundial tem reportado o isolamento de C. neoformans de
diferentes fontes naturais nos vários continentes, evidenciando sua ampla
distribuição em zonas tropicais e temperadas tais como: na África (AJELLO, 1956),
Ásia (TAYLOR & DUANGMANI, 1968; HSU et al., 1994) Oceania (FREY & DURIE,
29
1964), Europa (MISHRA et al., 1981) América do Norte (KOZEL & HERMERATH,
1984) e América do Sul (LAZÉRA et al., 1993; RUIZ et al., 1989; GRANADOS &
CASTAÑEDA, 2005; QUINTERO et al., 2005; CURO et al., 2005). Em paralelo,
infecções por C. neoformans também têm sido reportadas em todos os continentes.
Entretanto, dentro dos continentes, há regiões com maior concentração de C.
neoformans, resultando em maior prevalência local de criptococose, como por
exemplo, nos Estados Unidos acredita-se que a infecção é mais comum nos estados
do sudeste (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Excretas de pombos e detritos encontrados em seu habitat representam o
substrato natural mais comumente associado a C. neoformans, (PAL, 1997;
MONTENEGRO & PAULA, 2000; BERNARDO et al., 2001; REOLON et al., 2004;
CERMEÑO et al., 2006). Entretanto, excretas de outras aves também têm sido
reportados, incluindo canários (GRISEO et al., 1995 apud CASADEVALL &
PERFECT, 1998; FILIÚ et al., 2002) papagaios (LOPEZ MATINEZ & CASTANON-
OLIVARES, 1995 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; ABEGG et al., 2006)
periquitos (FILIÚ et al., 2002; ABEGG et al., 2006) galinhas (SWINNE et al., 1986
apud CASADEVALL & PERFECT, 1998), várias espécies Psitacine e Passerine
(LUGARINI et al., 2008) entre outros.
O fungo é mais evidente em excretas de pombos acumuladas por vários anos
em espaços urbanos abrigados, como em torres, prédios antigos, cúpulas, sacada
de janelas, além de estábulos em áreas rurais (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992).
O solo também tem sido freqüentemente reportado como nicho ecológico de
C. neoformans (EMMONS, 1951; AJELLO, 1956; AJELLO, 1958); entretanto, a
maioria das investigações que detectaram C. neoformans em solo refere-se a
amostras coletadas em celeiros, aviários ou de áreas potencialmente contaminadas
com excretas de aves (AJELLO, 1956; AJELLO, 1958; MACHADO et al., 1993;
CURO et al., 2005; BARONI et al., 2006).
A presença do fungo em excretas de pombos e de aves tem sido explicada
pelo fato de que estas servem de meio seletivo para C. neoformans na natureza, por
conter alto conteúdo de substâncias nitrogenadas, tais como a creatinina (STAIB,
1962 apud, KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Cryptococcus neoformans utiliza
creatinina como fonte de nitrogênio, enquanto outras espécies deste gênero não o
fazem, exceto C. gattii que, embora não ocorra (ao menos não tem sido encontrado)
em excretas de pombos, in vitro utiliza creatinina melhor que C. neoformans
(POLACHECK & KWON-CHUNG, 1980). A enzima cretinina-deiminase encontrada
30
em ambas as espécies é responsável pelo catabolismo da creatinina, promovendo
sua conversão em metil-hidantoína e amônia. Diferenças na regulação desta enzima
podem influenciar na incapacidade de C. gattii colonizar excretas de aves. A
deiminase responsável pelo metabolismo da creatinina em C. neoformans é
reprimida pela amônia enquanto que em C. gattii não há esta repressão. Esta
regulação pode estar envolvida na conservação de energia e na obtenção de
metabólitos necessários à sobrevivência (POLACHECK & KWON-CHUNG, 1980). O
metabolismo da creatinina em C. neoformans resulta no acúmulo de amônia e
aumento do pH. A inibição da creatinina deiminase por amônia provavelmente
previne alcalinização não controlada do ambiente, o que poderia inibir o crescimento
(CASADEVALL & PERFECT, 1998). A sobrevivência e a multiplicação em excretas
de pombos dependem de vários fatores, incluindo o pH, umidade, temperatura, luz
solar e outros fatores bióticos (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Umidade elevada
restringe sua multiplicação e o fungo resiste à dessecação. Excretas secas e antigas
podem conter até 5x107 células fúngicas (EMMONS, 1962).
Tem sido postulado que C. neoformans não causa infecção em pombos,
provavelmente devido à elevada temperatura corporal (41,5 a 43,3ºC). Entretanto,
infecção disseminada foi descrita em pombo selvagem, bem como infecção
subcutânea em região ocular, onde a temperatura pode ser mais baixa (KWON-
CHUNG & BENNETT, 1992). Sorrell & Ellis (1997) consideram improvável que
pombos sejam a principal fonte de Cryptococcus spp. na natureza, pois somente
pequenas concentrações do microrganismo são encontradas em bico, patas e swab
retal; além disso, a temperatura corporal inibe a multiplicação; a alta concentração
de amônia nas excretas frescas também inibe o crescimento. Em contraste,
elevadas concentrações da levedura são encontradas em excretas envelhecidas de
pombos, cujo ambiente é desfavorável para a maioria dos outros microrganismos.
Com base na descoberta de certas espécies de eucalipto servirem de
nicho/habitat natural de C. gattii tem sido proposto que também o nicho natural de C.
neoformans seja um vegetal, cuja madeira em decomposição protegeria os
microrganismos das intempéries, permanecendo viáveis por vários anos. Diversos
mamíferos e aves em associação com tais plantas hospedeiras poderiam passar as
células de Cryptococcus spp. através de seu intestino e depositar células capsuladas
em suas excretas (ELLIS & PFEIFFER, 1990b). Achados consistentes de C.
neoformans em ocos de várias espécies vegetais no Rio de Janeiro reforçaram esta
idéia (LAZÉRA et al., 1996). Neste estudo o fungo foi recuperado de cássia rosa
31
(Cassia grandis), ficus (Ficus microcarpa), e cássia amarela (Senna multijuga) o que
subsidiou os autores a sugerirem que C. neoformans não está associado a um só
gênero ou espécie de árvore, mas com um nicho especializado resultante de
biodegradação natural da madeira resultando em substrato favorável para seu
desenvolvimento. Além disso, é possível que o estado teleomórfico possa ocorrer
neste tipo de habitat. Achado importante obtido por Lazéra et al. (2000) na cidade de
Teresina/Piauí foi o encontro de C. neoformans e C. gattii compartilhando o mesmo
oco (Cassia grandis), indicando um nicho comum para ambas espécies e sugerindo
uma possível ligação entre seus ciclos de vida na natureza. Baseados neste achado,
associado à capacidade de C. neoformans produzir lacase, uma enzima envolvida
na degradação da lignina por outros Basidiomycetes e na relação filogenética de C.
neoformans com Tremella, um gênero que apresenta algumas espécies associadas
à degradação da madeira e ao micoparasitismo, Lazéra et al. (2000) propuseram ser
este um nicho primário para este fungo.
Em diferentes regiões brasileiras, C. neoformans foi isolado de madeira em
decomposição, em árvores tropicais, nativas ou introduzidas no Brasil, como
jambolão (Sygygium jambolana), cacaueiro (Theobroma cacao), cabori (Miroxylum
peruiferum), Eucalyptus camaldulensis, sibipiruna (Caesalpinia peltophoroides), e
Anadenanthera peregrina (LAZÉRA et al., 1993; 2000; RESTREPO et al., 2000;
MONTENEGRO & PAULA, 2000, REIMÃO et al., 2007).
Menos freqüentemente C. neoformans tem sido isolado de outros substratos
tais como: de colônias de abelha (Apis mellifera) (ERGIN et al., 2004), sótão de casa
abandonada habitada por morcego (LAZÉRA et al., 1993) e poeira intradomiciliar
(PASSONI et al., 1998). Neste último estudo, Passoni e colaboradores analisaram
824 amostras de poeira intradomiciliar, solo e excretas de aves, coletadas em
domicílios, isolando C. neoformans de poeira intra e peridomiciliar e de gaiolas de
pássaros domésticos, com 13% de positividade, cujo principal fator associado com
contaminação domiciliar por C. neoformans foi a presença de aves no ambiente
doméstico ou próximo a casa. Em outro estudo, realizado em Burundi (África
Central), Swinne et al., (1989) isolaram C. neoformans do ambiente doméstico de 7
dos 20 domicílios de paciente com criptococose associada com HIV, demonstrando
que nesta região o paciente infectado pelo HIV é freqüentemente exposto a este
fungo. Através da exposição de placas de Petri com meio de cultura ou pela coleta
de ar com aparelhos coletores Andersen tem sido detectada a presença de C.
neoformans no ar atmosférico (RUIZ & BULMER, 1981; RUIZ et al., 1981;
32
PEDROSO et al., 2007), demonstrando que materiais muito particulados, frouxos e
secos podem ser prontamente aerossolizáveis e representar grande potencial de
risco para a saúde. Outro interessante estudo refere o isolamento de C. neoformans
do trato digestivo de baratas (SWINNE et al., 1991 apud CASADEVALL &
PERFECT, 1998).
Na Índia, Randhawa et al. (2003) reportaram o isolamento de C. neoformans
de amora preta indiana (Syzygium cumini) e Ficus religiosa, enquanto Nawange et
al. (2006) detectaram C. neoformans sorotipo A em Tamarindus indica, Mangifera
indica, e S. cumini.
Partículas viáveis de C. neoformans isoladas de excretas ressecadas de
pombos, do ar e do solo freqüentemente são menores que dois µm, tamanho
suficiente para se depositar nos alvéolos (NEILSON et al., 1977; RUIZ & BULMER,
1981). A partir do solo o fungo se dissemina através das correntes de ar ou distúrbio
mecânico. O isolamento de C. neoformans do ar (RUIZ & BULMER, 1981) e
evidências clínicas de que muitos casos de criptococose necropsiados têm um foco
primário no pulmão reforçam a idéia de que a infecção inicia pela inalação do fungo
(KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Durante a fase de reprodução sexual, ambas
as espécies produzem pequenos basidiosporos, os quais provavelmente podem ser
mais facilmente dispersados pelo ar que as células de leveduras e, portanto, talvez
sejam os mais importantes propágulos infectivos (SWINNE & DE VROEY, 1997).
Em suma, C. neoformans está presente em focos urbanos, associados a aves
em seus habitats, adaptados às construções humanas, como pombos, aves em
parques, lojas comerciais e domicílios, como periquitos e canários (PASSONI et al.,
1998; FILIÚ et al., 2002; BARONI et al., 2006) e ocos de árvores. Este agente
mostra-se amplamente adaptado ao viver humano, capaz de reproduzir-se por
expansão clonal e sobreviver em substratos secos, protegidos da iluminação direta.
É ubíquo e de fácil inalação através de formas dessecadas das leveduras presentes
no meio ambiente e, possivelmente, também de basidiosporos. O sorotipo A também
é encontrado em ambientes rurais e já foi encontrado em cacaueiro e árvore nativa
de mata amazônica, indicando habitats naturais em áreas preservadas ou com
pouca intervenção humana, provavelmente seu nicho ecológico primário (LAZÉRA
et., 2000; LAZÉRA et al., 2005). Estudo recente no Campus da FIOCRUZ no Rio de
Janeiro mostrou que pode sobreviver por muitos anos em oco de árvore em
ambientes urbanos (BARBOSA et al., 2007).
33
A presença de isolados do sorotipo AD sugere que os sorotipos A e D de C.
neoformans possam interagir no meio ambiente, reproduzir e produzir recombinantes
ou híbridos AD. Tanto o sorotipo D quanto o AD são encontrados em menor
freqüência do que o sorotipo A em habitats como ocos de árvores, excretas de
pombos e outras aves. De forma correspondente, estes sorotipos D e AD podem
também ser oportunistas, ocorrendo em diferentes regiões do Brasil (NISHIKAWA et
al., 2003; TRILLES et al., 2003; CASALI et al., 2003).
O fungo tem sido isolado do solo, embora não faça parte da microbiota normal
deste substrato (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). Também tem sido isolado de
vários hospedeiros animais inferiores, como insetos e seus habitats (insect frass), e
amebas. Tem sido sugerido que Acanthamoeba polyphaga, uma ameba do solo,
possa interagir com C. neoformans no solo. Ruiz et al., (1982) demonstraram que
estes protozoários ingerem e matam o fungo. Trofozoítas de amebas, ácaros,
baratas (Periplaneta americana) e tatuzinhos de jardins (Metoponorthus pruinosus)
isolados de excretas de pombos ingerem C. neoformans e são descritos como
fungívoros (RUIZ et al., 1982; CASADEVALL & PERFECT, 1998; STEENBERGEN &
CASADEVALL, 2003). A associação entre C. neoformans e hospedeiros é
consistente com a ordem Tremellales, muitos dos quais são micoparasitas
(ALEXOPOULOS et al., 1996; KWON-CHUNG et al., 1995), sugerindo um possível
papel expandido como parasita na natureza (LIN & HEITMAN, 2006). RUIZ et al.
(1982) investigaram fatores bióticos que podem interferir na ecologia de C.
neoformans e demonstraram que bactérias isoladas de excretas de pombos,
notadamente Pseudomonas aeruginosa e Bacillus subtilis, exibem atividade anti-C.
neoformans em meios artificiais, sugerindo que certas bactérias encontradas nestes
substratos têm potencial apropriado de exercer um aparente efeito letal sobre a
população residente do fungo. Outro estudo demonstra que Escherichia coli e
Bacillus subtilis podem excretar toxinas que pode ser usada para o aumento da
imunidade local na árvore respiratória (WILLIAMS et al., 2004) ou sintetizam
antibiótico com atividade antifúngica (FAMEHIRO et al., 2002). FRASES et al. (2006)
demonstraram que Klebsiella aerogenes é capaz de prover C. neoformans com
precursores requeridos para síntese de melanina.
Estes achados sugerem que interações com hospedeiros naturais e outros
organismos no ambiente, podem influenciar a persistência, reprodução, morfologia e
distribuição de C. neoformans na natureza (RUIZ et al., 1982; LIN & HEITMAN,
2006).
34
Recentes estudos têm utilizado vários organismos ou grupos de organismos
tais como amebas (Achantmoeba castellanni) (STEENBERGEN, et al., 2001),
nematóides (Caenorbaditis elegans) (MYLONAKIS et al., 2002; TANG et al., 2005)
fungo mucilaginoso (Dictyostelium discoideum) (STEENBERGEN, et al., 2003),
mosca de fruta (Drosophyla melanogaster) (APIDIANAKIS et al., 2004) e lagarta
(Galleria mellonela) (MYLONAKIS et al., 2005) como hospedeiros do fungo para
estudos da virulência e relação patógeno-hospedeiro.
Pesquisadores australianos foram pioneiros no estudo da ecologia de C.
gattii. Ellis & Pfeiffer foram os primeiros a detectar o habitat natural de C. gattii
associado à Eucalyptus camaldulensis árvore nativa na Austrália, em 1990a, quando
foi isolado do ar, madeira, cascas, folhas, e restos vegetais situados sob a copa de E.
camaldulensis em floração. Segundo estes autores a distribuição global de E.
camaldulensis parece coincidir com a distribuição da micose por C. gattii (ELLIS &
PFEIFFER, 1990a). Posteriormente o fungo foi detectado em E. camaldulensis no sul
da Califórnia (PFEIFFER & ELLIS, 1991) e em ocos de E. tereticornis, também na
Austrália (PFEIFFER & ELLIS, 1992). Novos registros de árvores hospedeiras do fungo
incluíram Syncarpia glomulifera, E. microcorys, E. grandis, E. rudis, E. gomphocephala
e E. blakelki, nas diversas regiões da Austrália (KROCKENBERG et al., 2002; VILCINS
et al., 2002). Considerando que E. camalulensis foi extensivamente exportada da
Austrália para o Havaí, sudeste da Califórnia, México, Brasil, África e Ásia, levantou-se
a hipótese de que C. gattii tenha sido exportado para tais regiões em sementes
infectadas (PFEIFFER & ELLIS, 1990b).
A princípio, sugeriu-se que C. gattii tinha um hospedeiro específico pertencente
às angiospermas e que os propágulos do fungo estavam dispersos no ambiente por
um curto período de tempo (ELLIS & PFEIFFER, 1990a). O isolamento de C. gattii
também tem sido referido de árvores de Eucalyptus de outros países como Colômbia
(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005), México (LICEA et al., 1999) Brasil
(MONTENEGRO & PAULA, 2000), Índia (CHAKRABARTI et al., 1997) e Egito
(MAHMOUD, 1999), bem como Ficus soatensis, Croton bogotanus, Croton funkianus,
Coussapoa sp., Cupressus lusitanica, Pinus radiata, Acacia decurrens e Terminalia
catapa na Colômbia (CALEJAS et al., 1998; GRANADOS & CASTAÑEDA, 2005).
Investigações realizadas com amostras das regiões norte e nordeste do Brasil
demonstraram a ocorrência de C. gattii em oco de Moquilea tomentosa (oiti), Cassia
grandis (cássia rosa) e Ficus microcarpa (ficus) coletados em Teresina/Piauí, e de
Guettarda acreana, em floresta pluvial tropical na Amazônia Ocidental, no estado de
35
Roraima (LAZÉRA et al., 1998; LAZÉRA et al., 2000; FORTES et al., 2001). Também
foi encontrado na Colômbia, em algodoeiro de praia (CALLEJAS et al., 1998) e no
Canadá, em árvores como elmo, cedro, pinheiro e carvalho, mas não em eucalipto
(KIDD et al. 2004). A associação de C. gattii com madeira em decomposição tem
sido relatada em vários estudos o que sugere uma relação endofítica em comum
com outros fungos causadores da podridão da madeira (SORRELL, 2001).
Estes estudos mostram a contundente associação que há entre C. gattii e
vegetais, mas, como concluíram Lazéra et al. (2000), não há habitat ou associação
específica de C. gattii com árvores-hospedeiras, mas sim, padrões geográficos de
ocorrência do fungo em madeira em decomposição, substrato, onde ambas as
espécies, C. gattii e C. neoformans, podem estar presentes, isoladas ou juntas, em
diferentes proporções.
Recentemente Kidd et al., (2007) referiram pela primeira vez o isolamento de
C. gattii de amostras de água doce e salgada em pesquisa realizada no Canadá,
região onde tem sido freqüentemente reportado infecção por C. gattii. O estudo
obteve positividade em 27 de 132 amostras de água doce e em 4 das 19 amostras
de água salgada, representando 20% e 21%, respectivamente. Foi também
observada maior freqüência em água de lago que em rios e riachos, possivelmente
devido à menor dispersão na água parada, facilitando a obtenção de níveis
detectáveis do fungo. Ensaios para testar o potencial de sobrevivência de C. gattii
em água doce e salgada também foram realizados, demonstrando que água do mar,
filtrada ou não, sustenta maior taxa de sobrevivência do fungo, acima de um ano.
Ensaios de água do mar submetidos à temperatura ambiente e a 4º C demonstraram
que C. gattii sobrevive neste ambiente que simula as condições naturais das águas
de Vancouver. Para os autores estes achados indicam que C. gattii pode ser
transportado em corpos d’água, o que poderia explicar os mecanismos de
transmissão para os recentes casos de criptococose gattii em mamíferos ocorridos
no estreito de Geórgia em Vancouver (STEPHEN et al., 2002). Outras fontes
ambientais foram investigadas por Kidd et al. (2007) demonstrando a ocorrência de
C. gattii em amostras de solo e do ar.
Ocasionalmente, a ocorrência de C. gattii também tem sido demonstrada em
outros substratos tais como em poeira de sótão, relacionada com excretas de
morcego, no estado do Rio de Janeiro (LAZÉRA et al., 1993), bem como de
fragmentos de ninho de vespas (Polybia occidentalis) no Uruguai (GEZUELE et al.,
1993).
36
Restrepo et al. (2000), analisando estudos sobre fontes ambientais de C.
neoformans em várias regiões brasileiras, discutem que o ciclo de vida deste
microrganismo envolve uma origem em madeira em decomposição, com sucessivas
adaptações a diferentes espécies de árvores, e que mais tarde dispersaram-se e
adaptaram-se em ambientes com interferência humana, concluindo que distúrbios e
ação antrópica representam um papel importante na epidemiologia da criptococose
bem como na ecologia deste agente etiológico.
A epidemiologia da criptococose reflete o comportamento ecológico distinto
de C. neoformans, com distribuição geográfica universal e ampla disseminação em
ambientes urbanos relacionados a habitats de pombos e outras aves, principalmente
psitacídeos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992; PASSONI et al., 1998; FILIÚ, et al.
2002). Além disso, já foram descritas outras fontes como madeira em decomposição
e poeira domiciliar (LAZÉRA et al. 1996; PASSONI, 1999).
Finalmente, é importante ressaltar que ambas as espécies, com diferentes
sorotipos, podem ocorrer separadamente ou simultaneamente compartilhando o
mesmo habitat, relacionado a processos de decomposição da madeira, um aspecto
novo do ciclo biológico destes agentes (LAZÉRA et al., 2005).
2.4 VIRULÊNCIA EM C. neoformans E C. gattii
A descrição dos fatores de virulência de um patógeno é de capital
importância. Em sua mais simples definição descrevem a infectividade relativa de
um microrganismo e sua habilidade de vencer as defesas naturais do hospedeiro.
Em fungos, a definição de certos fatores de virulência e dos genes correspondentes
pode ser mais complexa e menos bem definida que para bactérias (CASADEVALL &
PERFECT, 1998). Steele (1991) apud Casadevall & Perfect (1998) enfatiza que os
patógenos eucariotas geralmente não são transmissíveis de pessoa a pessoa e sua
evolução não tem necessariamente alcançado habilidades específicas para infectar
ou invadir o hospedeiro humano. A infecção fúngica geralmente decorre de um
encontro acidental no ciclo de vida do fungo. Para uma infecção fúngica o
hospedeiro pode estar em estado de imunodepressão ou não, dependendo da
particularidade do fungo e/ou da magnitude do inóculo (CASADEVALL & PERFECT,
1998).
A maioria dos fungos vive como sapróbios. Entretanto, entre os sapróbios
permanece um subgrupo de fungos patogênicos que podem causar infecções
37
agudas e crônicas em humanos. São sabróbios facultativos, portanto; raríssimos
fungos são parasitas obrigatórios para humanos.
Existe um conjunto de genes que compõem a virulência destes fungos
patogênicos e, provavelmente, são complexos, inter-relacionados e às vezes
específicos para gênero, espécie ou cepa (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
Diferentemente das potentes toxinas bacterianas, os agentes da criptococose não
parecem produzir produtos tóxicos que contribuam diretamente para sinais e
sintomas da criptococose (KOZEL, 1995).
Em geral, os fatores de virulência de Cryptococcus spp. têm sido
caracterizados usando C. neoformans como modelo patogênico. Segundo
Stteenbergen & Casadevall (2003) C. neoformans tem fatores de virulência bem
definidos que satisfazem os seguintes critérios: (1) propriedade associada ao
patógeno; (2) a inativação do gene diminui a virulência; e, (3) a complementação ou
restauração do gene ou produtos do gene restaura a virulência fúngica.
Cápsula polissacarídica
A cápsula é uma estrutura marcante que envolve a parede celular da célula
de C. neoformans conferindo-lhe uma morfologia distintiva em relação a outras
leveduras patogênicas. A cápsula é composta por pelo menos três componentes:
manoproteína, galactoxilomanana e glucuronoxilomanana (GMX). A GMX que
representa 90% dos componentes da cápsula e consiste de ligações lineares de (1-
3) α–D-manopironose com β-D-xilopiranosil, β-D-glucupiranosil-ácido urônico e
substituintes 6-О-acetil. Os sorotipos são determinados pela quantidade de xilose e
manose e o grau de О-acetilação (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). Pelo
menos 4 genes capsulares individuais foram identificados, caracterizados e
nomeados como CAP64, CAP60, CAP59 e CAP10. Porém, os determinantes
genéticos da diferenciação dos sorotipos não são conhecidos (CHANG & KWON-
CHUNG, 1994, 1998, 1999; CHANG et al., 1996). A deleção ou mutagênese de
algum destes genes resulta em cepa mutante acapsulada e avirulenta. A
reintrodução de uma cópia funcional de um dos genes da cápsula mutante restaura
a produção da cápsula e a virulência (CHANG & KWON-CHUNG, 1999).
A cápsula polissacarídica desempenha um importante papel na agressão ao
hospedeiro. Dentro dos macrófagos libera polissacarídeos de sua cápsula dentro de
vesículas ao redor do fagossoma do macrófago tanto in vivo quanto in vitro. As
vesículas com polissacarídeos se acumulam no citoplasma dos macrófagos e podem
causar disfunção e morte celular (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
38
Especula-se que pode proteger a levedura da dessecação ou reduz sua habilidade
para ser ingerida e destruída por amebas do solo (NEILSON et al., 1978). Existe
uma correlação direta entre a quantidade de polissacarídeos no soro e a severidade
e conseqüência da doença. Tem sido postulado que alto nível de antígeno
polissacarídico de Cryptococcus no fluido cérebro-espinhal contribui para danos no
hospedeiro e manifestações por alteração do metabolismo da água no SNC, levando
ao aumento da pressão intracranial, resultando em cefaléia, alteração visual e
eventualmente à morte (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
Muitos fatores ambientais influenciam no tamanho da cápsula de C.
neoformans. Fontes de carbono e ausência ou presença de certos aminoácidos e
vitaminas modificam o tamanho da cápsula in vitro. A presença não apenas de
tiamina, L-prolina ou asparagina, mas também baixa concentração de glucose,
manose, xilose ou sucrose induz cápsulas largas. Ao contrário, altas concentrações
de glucose ou de NaCl reprime a biossíntese. Em relação ao estágio de crescimento,
a cápsula é maior na fase estacionária quando comparada à fase exponencial.
Concentrações baixas de Ferro e presença de componentes séricos são fortemente
indutores da biossíntese da cápsula (JANBÓN, 2004).
A cápsula de C. neoformans normalmente não é visível em suspensões
aquosas quando examinadas em microscopia óptica. Porém, pode ser facilmente
visualizada em preparações com tinta da China, onde as partículas da tinta são
excluídas pela cápsula, formando um halo claro ao redor da célula da levedura
(OKABAYASHI et al., 2007)
Lacase e Melanina
Melaninas são polímeros multifuncionais encontrados em representantes de
todos os Reinos biológicos. Tipicamente, são pigmentos escuros, de alto peso
molecular, carregados negativamente e produzidos por uma lacase através da
polimerização oxidativa de compostos fenólicos. A melanina é um radical livre
estável, insolúvel em solventes fisiológicos, e resistentes à degradação ácida.
Também parece que C. neoformans e C. gattii são únicos no gênero a produzir
melanina rotineiramente a partir de compostos difenólicos via uso da enzima
fenoloxidase a 37ºC, embora haja relatos esporádicos de melanização em outras
espécies (HAMILTON & HOLDOM, 1999). Assim, ao contrário de outros fungos, C.
neoformans não possui tirosina, mas sim a enzima fenoloxidase, identificada como
uma lacase, que pode sintetizar melanina a partir de precursores, tais como L-
DOPA, dopamina, epinefrina (HAMILTON & HOLDOM, 1999; WILLIAMSON, 1997
39
apud STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). Culturas de C. neoformans
crescendo na presença destes precursores apresentam coloração marrom a preta.
O pigmento está localizado na parede celular do fungo e pode contribuir para a
sobrevivência deste e manutenção da integridade da parede (WILLIAMSON, 1997
apud STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
Existem vários mecanismos pelos quais a melanina contribui para a
virulência. A lacase protege as células de C. neoformans da explosão oxidativa nos
macrófagos alveolares (LIU et al., 1999), sendo proposto que o Fe2+, produto da
redução do ferro pode reduzir H2O2 a radicais hidroxil protegendo assim a célula
fúngica de danos oxidativos. A presença da melanina pode significantemente
proteger C. neoformans de compostos antifúngicos como anfotericina B e
caspofungina através da ligação aos antifúngicos, o que reduz sua disponibilidade e
eficácia (VAN DUIN et al., 2002 apud NOSANCHUCK & CASADEVALL, 2003). A
propriedade da melanina de ligar-se a proteínas confere a C. neoformans a
capacidade de suprimir possíveis efeitos tóxicos causados por peptídeos
(DOERING, 2000; JACOBSON, 2000)
O neurotropismo de C. neoformans pode ser explicado em parte, pela
habilidade do fungo em converter catecolaminas em melanina. Catecolaminas
incluem moléculas como epinefrina, norepinefrina e dopamina que funcionam como
neurotransmissores do SNC (CASADEVALL et al., 2000). Estudos genéticos
suportam a associação de virulência com a produção de fenoloxidase. Polacheck et
al. (1990) mostraram que uma mutante desprovida de fenoloxidase foi morta pelo
sistema oxidativo da epinefrina na presença de um íon de metal e peróxido de
oxigênio, enquanto a cepa selvagem foi resistente, sugerindo que fenoloxidase pode
consumir epinefrina e proteger C. neoformans do sistema oxidativo no SNC.
Como fator de virulência em hospedeiros mamíferos foi provavelmente
cooptada pelo seu uso de C. neoformans em seu ambiente natural, é possível que
em seu nicho ambiental, C. neoformans tem usado melanina para proteger-se dos
danos oxidativos da irradiação ultravioleta do sol ou de extremos de temperatura, ou
ainda mantendo a integridade da parede celular contra alterações osmóticas no
ambiente (WANG & CASADEVALL, 1994; ROSAS & CASADEVALL, 1997;
CASADEVALL & PERFECT, 1998).
A melanina de C. neoformans protege contra os efeitos fungicidas de
peptídeos microbicidas como as defensinas, potegrinas e magaininas, através da
interação e seqüestro destes peptídeos (ROSAS et al., 2000). ROSAS &
40
CASADEVALL (2000) demonstraram in vitro que a melanização diminui a
susceptibilidade de C. neoformans contra enzimas hidrolíticas, sugerindo que a
melanina tem um potencial papel na proteção contra a degradação por
microrganismos antagonistas do ambiente.
Williamson (1994) purificou e identificou esta lacase e descreveu a seqüência
do gene CnLAC1. Posteriormente, foi revelado um segundo gene (ZHU &
WILLIAMSON, 2004). O gene LAC2 é adjacente ao LAC1 e LAC2 também contribui
para a polimerização de moléculas difenólicas para formação da melanina, mas em
menor extensão que o LAC1.
Fosfolipase
As fosfolipases são enzimas capazes de promover a hidrólise de uma ou mais
ligações éster em glicerofosfolipídios e auxiliam na degradação e desestabilização
da membrana da célula hospedeira e lise celular (GHANNOUM, 2000). CHEN et al.
(1997a, 1997b) reportaram atividade de fosolipase B (PLB) lisofosfolipase (LFP) e
lisofosfolipase-transacilase (LPTA) de C. neoformans crescendo em ágar gema de
ovo. De 50 isolados testados, 49 apresentaram atividade devido à fosfolipase B
secretada na cultura. Análise de 4 cepas com diferentes níveis de atividade
fosfolipase indicaram a correlação entre atividade fosfolipase e virulência em
camundongo BALB/c (CHEN et al., 1997a). Os autores sugerem que a atividade
fosfolipase produzida por C. neoformans pode destruir membrana celular de
mamíferos e permitir a penetração da levedura no tecido hospedeiro.
Urease
Urease hidrolisa uréia a amônia e carbamato, resultando em aumento
localizado do pH que pode ser usado na identificação como resultado de alterações
colorimétricas. A grande maioria dos isolados clínicos de C. neoformans é urease
positiva (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003). O gene CnURE1, que codifica a
urease, foi clonado e o produto gênico caracterizado. Estudos de patogenicidade em
coelho infectados com mutante ure1 e cepa selvagem não demonstraram diferenças
significativas na contagem das colônias recuperadas do fluido cefalorraquidiano,
entretanto diferenças significativas foram detectadas em um modelo murino, com
animais inoculados intravenosamente e por inalação com mutante ure1 e linhagem
selvagem. A sobrevida foi maior nos camundongos infectados com o mutante ure1.
A complementação do mutante ure1 com o gene selvagem (URE1) resultou em tipos
transformantes que foram significativamente mais patogênicos do que o mutante
ure1 (COX et al., 2000).
41
Proteinases
Proteinases têm sido demonstradas importantes para a virulência de bactérias
e fungos patogênicos. Isolados clínicos e ambientais de C. neoformans tem atividade
proteinase. Atividade proteinase de C. neoformans degrada proteínas do
hospedeiro, tais como colágeno, elastina, fibrinogênio, imunoglobulinas e fatores de
complemento. Proteinases de C. neoformans podem causar danos no tecido,
provendo nutrientes para o patógeno e proteção do hospedeiro. Esta degradação
dos componentes do hospedeiro pode proteger C. neoformans contra a resposta
imune do hospedeiro, bem como possível auxílio no mecanismo de escape da célula
fúngica dos compartimentos fagossomais (STEENBERGEN & CASADEVALL, 2003).
Mating type
Cryptococcus neoformans e C. gattii apresentam um sistema de mating
bipolar com um único locus MAT contendo dois alelos α e a. Há uma diferença
significativa em relação à ocorrência MATα e MATa de isolados clínicos e
ambientais de C. neoformans, uma vez que isolados MATα são 30 a 40 vezes mais
freqüentes que isolados MATa. Kwon Chung et al. (1992) demonstraram que a
progênie do tipo α é mais virulenta que o tipo a, sugerindo que isolados MATα
apresentam vantagem seletiva na sobrevivência ambiental. Em C. neoformans var.
grubii (=C. neoformans sorotipo A) a maioria dos isolados clínicos são MATα.
Nenhuma diferença na virulência foi observada entre cepas α e a congênica a,
entretanto, durante co-infecção cepas MATα e MATa são equivalentes em tecido
periférico, mas as células α têm uma predileção acentuada para penetrar no SNC.
Isto pode explicar a marcante prevalência de MATα em isolados clínicos (NIELSEN
et al., 2005).
Temperatura
Um dos mais importantes fatores de virulência para fungos patogênicos é a
temperatura; C. neoformans e C. gattii podem crescer e se multiplicar à temperatura
corporal dos mamíferos (37-39ºC) e esta característica é essencial para a virulência
destes agentes patogênicos. Raros isolados de outras espécies de Cryptococcus
são capazes de crescer a 37ºC. Mutantes incapazes de crescer a 37ºC não são
virulentos, ainda que tenham capacidade de formar cápsula ou melanina em meios
difenólicos (KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). São conhecidos isolados de C.
neoformans particularmente sensíveis a temperaturas acima de 39ºC, que
demonstram um significante decréscimo na taxa de crescimento naquelas
temperaturas, com desenvolvimento de padrões de brotamento incomuns, formação
42
de pseudohifas e proeminente vacuolização no citoplasma. Estas alterações
estruturais demonstram uma grave reação de estresse dentro da levedura e sua
maquinaria de replicação (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
2.5 CRIPTOCOCOSE
Historicamente a criptococose foi descoberta, descrita e estudada através de
sua face oportunística, associada a sarcoma, linfomas, uso de corticóides, uso de
drogas imunossupressoras em hospedeiros transplantados e atualmente é uma das
principais co-morbidades associadas à aids. Epidemiologicamente mostra-se como
um marcador de hospedeiros com imunodeficiência celular (LAZÉRA et al., 2005).
Constitui-se em uma infecção sistêmica, adquirida através da inalação de
propágulos infectantes oriundos de diversas fontes ambientais. Tem sido proposto
que células de leveduras desidratadas e/ou basidiosporos são as unidades
infectantes, uma vez que são suficientemente pequenas (< 3µm de diâmetro)
capazes de se depositarem nos alvéolos pulmonares após inalação (RUIZ &
BULMER, 1981; SORRELL & ELLIS, 1997). Cryptococcus neoformans isolados de
excretas de pombos existem exclusivamente na forma de levedura e são
predominantemente ou exclusivamente MATαααα. Entretanto, células capsuladas
apresentam pouca viabilidade em condições de baixa umidade e escassez de
nutrientes, enquanto basidiosporos são muito pequenos (< dois µm de diâmetro) e
resistentes à dessecação, sendo facilmente dispersados pelo ar. Em meio de cultura
desenvolvem-se como leveduras e são patogênicos para camundongos (RUIZ &
BULMER, 1981; KWON-CHUNG & BENNETT, 1992). A criptococose não é
contagiosa e a transmissão inter-humana é rara e parece estar relacionada a um
único caso, um evento iatrogênico; transmissão animal-homem, não tem sido
documentada e muito raramente C. neoformans vive como comensal humano; e,
infecção nosocomial não tem sido convincentemente descrita. Os casos
documentados de transmissão homem-homem estão relacionados a transplante de
órgão infectado e acidente com sangue contaminado (CASADEVALL & PERFECT,
1998; BEYT & WALTMAN, 1978 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; GLASER
& GARDEN, 1985 apud CASADEVALL & PERFECT, 1998; OOI et al., 1981). Em
relação à transmissão animal-homem, Lagrou et al., (2005) reportaram um caso de
meningite criptocócica em paciente imunocompetente com exposição a pet magpie
com a micose, sugerindo transmissão zoonótica.
43
Lazéra et al. (2005) reconhecem duas entidades clínicas distintas para esta
micose: criptococose oportunista, cosmopolita, associadas a condições de
imunodepressão celular, causada por C. neoformans e criptococose primária,
endêmica em áreas tropicais e subtropicais, ocorre em hospedeiros aparentemente
normais, imunocompetentes, causada por C. gattii. Ambas causam
meningoencefalite, de evolução grave fatal, acompanhada ou não de lesão pulmonar
evidente, fungemia e focos secundários para pele, ossos, rins, supra-renal, entre
outros.
O gênero Cryptococcus compreende várias espécies, mas tradicionalmente
apenas C. neoformans e C. gattii são considerados causadores de criptococose.
Muito raramente algumas outras espécies têm sido relacionadas à infecção.
Espécies diferentes de C. neoformans e C. gattii têm sido isoladas de várias fontes
ambientais e com ampla distribuição geográfica, incluindo Caribe, Antártida e
Himalaia (KHWCHAROENPORN et al., 2007). Em revisão realizada por estes
autores, sobre outras espécies de Cryptococcus envolvidas em infecções são
reportadas as seguintes espécies: C. laurentii, C. albidus, C. adeliensis, C. curvatus,
C. humicolus, C. luteolus, C. macerans e C. unigutullatus, cujos sítios mais comuns
são circulação sanguínea e sistema nervoso central.
2.5.1 Aspectos Clínicos
De acordo com Perfect & Casadevall (2002) existe dois sítios primários da
criptococose: o pulmão e o sistema nervoso central (SNC). Algumas diferenças da
criptococose são observadas em pacientes com ou sem infecção HIV, tais como:
maior envolvimento do SNC e extra-pulmonar; maior taxa de positividade em
exames com tinta da China e hemocultura; e poucas células inflamatórias no fluido
cérebro-espinhal nos pacientes infectados pelo HIV.
As manifestações clínicas da criptococose tendem a se sobrepor entre
pacientes com aids e pacientes gravemente imunocomprometidos por outras causas
(indivíduos transplantados ou em uso de altas doses de corticosteróides), mas sem
aids. Entretanto, alguns achados são mais comuns em hospedeiros com aids que
em não-aids.
O pulmão é a porta de entrada mais comum da infecção. As principais
manifestações clínicas da criptococose são respiratórias e pelo SNC. A doença
pulmonar é mais freqüente em indivíduos imunocompetentes e os sintomas são
muito variáveis, desde oligossintomáticos a pneumonias graves com insuficiência
44
respiratória. Por outro lado, infecção do cérebro e meninges é a mais comum
manifestação clínica da criptococose é também a mais letal (KWON-CHUNG &
BENNETT, 1992). Lazéra et al. (2005) enfatizam sobre a colonização da árvore
traqueobrônquica, evidenciada pelo isolamento repetitivo do fungo de espécimes do
trato respiratório baixo e com ausência de lesão pulmonar, endobrônquica ou de
outros sítios e com base no quadro clínico, apresentam a seguinte classificação para
a criptococose:
Criptococose pulmonar regressiva: a infecção é assintomática e as lesões
pulmonares são primárias ou de reinfecção exógena. O diagnóstico decorre do
encontro casual de exame histopatológico de nódulos residuais pulmonares,
geralmente periféricos e sem calcificação.
Criptococose pulmonar progressiva: com manifestações clínicas e alterações
radiológicas pulmonares diversas. A sintomatologia é inespecífica e escassa, muitas
vezes resultante de um achado casual. Pode ocorrer tosse, escarro mucóide, sendo
pouco freqüente os hemoptóicos. Em pacientes imunocomprometidos a infecção
tende à invasão, fungemia e disseminação para múltiplos órgãos e sistemas
especialmente o SNC.
Criptococose disseminada: São os quadros extrapulmonares. A meningoencefalite
subaguda ou crônica é a mais freqüente manifestação da forma disseminada e
principal causa de óbito. A forma crônica se caracteriza por manifestações que
surgem e desaparecem, intercaladas por períodos totalmente assintomáticos.
Conforme Mitchell & Perfect (1995) a maioria dos pacientes (70 a 90%) apresentam
sinais e sintomas de meningite ou meningoencefalite subaguda tais como cefaléia,
febre, letargia, perda de memória, acima de 2 a 4 semanas. Os sinais e sintomas de
meningite em pacientes com e sem aids são similares. Entretanto, pacientes com
aids podem apresentar alguma diferença entre as quais: (1) a duração de sintomas e
sinais pode ser menor devido à alta carga de microrganismos e pobre resposta
inflamatória, (2) desenvolvem mais comumente um segundo sítio de infecção que é
facilmente detectado e (3) têm maior probabilidade de desenvolver outra infecção
oportunista.
Discute-se se as espécies influenciam na apresentação clínica da micose. De
acordo com Bicanic & Harrison (2005) Cryptococcus neoformans pode afetar
qualquer órgão, mas há uma predileção pelo pulmão por ser a principal porta de
entrada e também pelo SNC, fato este ainda não totalmente esclarecido. No pulmão
os sintomas variam de colonização assintomática a grave pneumonia. Infecção do
45
espaço subaracnóide é acompanhada por envolvimento do parênquima cerebral e,
portanto, meningoencefalite deve ser o termo mais apropriado. Para estes autores a
meningite criptocócica deve estar sempre incluída no diagnóstico diferencial das
meningoencefalites subaguda ou crônica, visto que as características clínicas não
são específicas. Geralmente os pacientes apresentam cefaléia, febre, mal estar e
estado mental alterado após várias semanas. Sinais freqüentemente estão
ausentes, mas podem incluir meningismo, papiloedema, acometimento de pares
cranianos, déficits focais neurológicos e nível de consciência deprimido. As
complicações são comuns, podendo citar: hipertensão intracraniana na ausência de
dilatação ventricular, que pode causar profunda perda da acuidade visual e auditiva.
Menos comumente, pacientes podem sofrer prejuízo cognitivo e ataxia no andar
devido dilatação ventricular com hidrocefalia obstrutiva. Em paciente com aids, a
micose está associada com profunda imunossupressão, geralmente associada com
contagem de células CD4 < 100 cel/µL. Há maior probabilidade de envolvimento
extra-neural e recaída se a terapia antifúngica for descontinuada precedente à
terapia anti-retroviral. Comparada com pacientes HIV-negativos, a apresentação
tende a ser mais aguda e associada com altos títulos de antígenos séricos
criptocócico e pobre resposta inflamatória. Por outro lado, C. gattii causa infecção
em indivíduos aparentemente imunocompetentes, especialmente em áreas tropicais.
Lesões focais pulmonares e de SNC, com formação de “massas” (criptococomas),
são mais comuns, e a duração dos sintomas mais prolongada e a febre é menos
comum nestes grupos.
Além dos pulmões e SNC, a pele é o terceiro sítio anatômico mais prevalente
da infecção criptocócica, caracterizando uma forma de disseminação que ocorre em
cerca 10 % dos casos. Naka et al. (1995, apud CASADEVALL & PERFECT, 1998)
sugeriram que C. neoformans sorotipo D teria mais propensão para infectar a pele,
mas C. gattii também tem sido relatado (HAMANN, et al., 1997 apud CASADEVALL
& PERFECT, 1998; SEVERO et al., 2001; LACAZ et al., 2002b; DORA et al., 2006).
Apresentam-se como lesões acneiformes, púrpura, pápulas, vesículas, nódulos,
tumores abscessos, ulcerações, granulomas, placas, celulite e também lesões que
simulam molusco contagioso (PERFECT & CASADEVALL, 2002; PEMACK et al.,
apud PERFECT & CASADEVALL, 2002; CONCUS et al., 1988 apud PERFECT &
CASADEVALL, 2002). Em geral, as lesões cutâneas são secundárias, em
decorrência da criptococose sistêmica. Entretanto, lesões cutâneas resultantes de
inoculação direta do fungo têm sido reportadas como um evento incomum
46
(CASADEVALL & PERFECT, 1998). Neuville et al. (2003), em revisão de 28 casos
de criptococose cutânea primária (CCP) no French National Register, revelam
evidências de inoculação direta do fungo em qualquer parte do corpo, com injúrias
de pele normal ou em lesões pré-existentes (75% dos pacientes), bem como a
atividades ou hobbies que predispõem a ferimentos (61% dos pacientes). Segundo
estes pesquisadores, lesões de pele associadas com CCP diferem das observadas
em criptococose disseminada. As lesões de CCP eram solitárias e confinadas a
áreas limitadas e localizadas em áreas descobertas. Em pacientes HIV - positivos a
maioria dos pacientes gravemente imunocomprometidos, as lesões cutâneas
indicam uma lesão sentinela da criptococose disseminada (CASADEVALL &
PERFECT, 1998).
Outras localizações mais raras são o globo ocular e a próstata. Na próstata a
infecção geralmente é assintomática, podendo determinar quadros de prostatite e há
indícios de que a próstata possa representar um potencial reservatório para recidiva
da doença em pacientes HIV - positivo (MITCHELL & PERFECT, 1995). A
localização ocular foi de grande importância antes da pandemia da aids, encontrada
em até 45% dos casos de meningite criptocócica. A endoftalmite criptocócica pode
levar à cegueira e a ocorrência de lesão primária é rara (LAZÉRA et al., 2005).
Outros sítios acometidos em decorrência da criptococose sistêmica são seios
paranasais, esôfago, glândulas adrenais, ossos, coração, fígado, linfonodos,
articulações, músculos, rins e placenta (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
A criptcococcemia pode apresentar-se com febre alta, tremores e calafrios,
aparentemente sem sítio secundário. A grande maioria dos pacientes com
criptococcemia tem alta carga de microrganismos no pulmão, SNC ou outros sítios
(LAZÉRA et al., 2005).
Embora C. neoformans seja considerado oportunista, há relatos de infecção
por esta espécie em indivíduos aparentemente hígidos (LUI et al., 2006). Do mesmo
modo, C. gattii considerado patógeno primário também tem sido relatado em
pacientes imunocomprometidos (ROZENBAUM et al., 1990). Entre as doenças de
base relacionadas além da aids estão: linfomas, sarcoidose, hemopatias diversas e
pacientes transplantados (LACAZ et al., 2002a).
2.5.2 Agentes Antifúngicos
As drogas antifúngicas surgiram bem mais tarde que os agentes
antibacterianos, em decorrência dos fungos apresentarem célula eucariótica, similar,
47
portanto, à célula do hospedeiro. Conseqüentemente, muitas substâncias
antifúngicas, causam ações deletérias em células do hospedeiro, podendo acarretar
uma série de efeitos colaterais (ROCHA & SIDRIM, 2004).
Considerado um agente antifúngico potente de amplo espectro de atuação,
porém bastante tóxico, a anfotericina B foi licenciada em 1959 e têm sido bastante
utilizada para infecções fúngicas sistêmicas. Subseqüentemente, outras drogas
foram introduzidas na terapia antifúngica, porém, a anfotericina B tem permanecido
como um tratamento de grande utilidade. Esta droga é um polieno natural obtido da
bactéria Streptomyces nodosus, que se liga ao principal componente da membrana
celular do fungo, o ergosterol, aumentando a permeabilidade celular a prótons e
cátions monovalentes, tais como o potássio (HERREROS & MATÍA, 2006). Os mais
freqüentes efeitos adversos estão relacionados à infusão e nefrotoxicidade. Metade
dos pacientes tratados com anfotericina B sofre reações adversas imediatas
relacionadas à infusão tais como: febre, calafrios, mialgia e/ou náusea. A
nefrotoxicidade, definida com o aumento de duas vezes mais o nível basal de
creatinina sanguínea, ocorre em mais de 30% dos pacientes (BATES et al., 2001).
Induz vasoconstrição na arteríola renal aferente, desequilíbrio e descompensação na
permeabilidade tubular, causando redução da filtração glomerular, acidose tubular e
perda de potássio e magnésio (HERREROS & MATÍA, 2006).
Na década de 90 três formulações lipídicas foram introduzidas no mercado:
anfotericina B complexo lipídico (1995), anfotericina B dispersão coloidal (1996) e
anfotericina B lipossomal (1997), as quais apresentam menor toxicidade para o
paciente, com a vantagem adicional de poderem ser administradas em tempo muito
menor que a anfotericina B convencional (ROCHA & SIDRIM, 2004).
A 5-fluocitosina (5FC) foi introduzida na década de 70, apresentando potente
atividade contra C. neoformans. No entanto, devido à constatação de cerca de 5 %
de isolados serem primariamente resistentes e ao aparecimento de resistência no
decurso do seu uso, esta droga somente pode ser utilizada em associação à
anfotericina B (BLOCK et al., 1973). Esta associação propicia uma ação sinérgica,
permitindo reduzir o tempo de tratamento e melhorando o prognóstico.
Lamentavelmente, esta droga não está mais disponível no mercado brasileiro
(LAZÉRA et al., 2005). Trata-se de uma pirimidina fluorada sintética que age por
inibição da síntese de DNA (ROCHA & SIDRIM, 2004; HERREROS & MATÍA, 2006).
Na década de 1980, surgiram os derivados azólicos, os quais formam um
grupo de compostos sintéticos com amplo espectro de atividade antifúngica e com
48
estrutura química semelhante. São classificados de acordo com o número de átomos
de Nitrogênio no anel azólico em imidazóis, com dois (ex. miconazol e cetoconazol)
e triazóis com três átomos de Nitrogênio (ex. itraconazol, fluconazol e voriconazol)
(MAERTENS, 2004). Interferem na síntese do ergosterol, bloqueando a enzima
lanosterol-14 α-demetilase, interrompendo a conversão do lanosterol em ergosterol.
Esta propriedade dos azóis altera a função da membrana celular aumentando sua
permeabilidade (ROCHA & SIDRIM, 2004; HERREROS & MATÍA, 2006). Em geral,
os triazóis demonstram amplo espectro de atividade antifúngica e reduzida
toxicidade quando comparados com os imidazóis (MAERTENS, 2004). O fluconazol
é altamente solúvel em água e pode ser administrado por via endovenosa em
pacientes gravemente doentes. Após administração oral a absorção é
essencialmente completa (~ 90% de biodisponibilidade) e não influenciado pelo pH
gástrico (BRAMER et al., apud MAERTENS, 2004). Tanto o itraconazol quanto o
flucanazol demonstraram excelente atividade antifúngica no tecido cerebral. O
fluconazol, por atravessar bem a barreira hemato-encefálica e assim atingir uma boa
concentração no sistema nervoso central, particularmente no líquor, o que o tornou
preferido em relação ao itraconazol, além do que este último não está disponível na
formulação para uso venoso (LAZÉRA et al., 2005).
A escolha do esquema terapêutico deve considerar a disponibilidade dos
agentes antifúngicos, o sítio anatômico da infecção e o estado imune do hospedeiro.
Para hospedeiros imunocompetentes com doença pulmonar isolada, observação
cuidadosa deve ser assegurada (GRAYBIL et al., 2000). Segundo Lazéra et al.
(2005) os casos de colonização, onde o fungo é isolado a partir do escarro, porém
sem lesão pulmonar e extra pulmonar devem ter acompanhamento cuidadoso. Nos
casos de pacientes imunodeprimidos é prudente que se faça o tratamento
antifúngico, devido à possibilidade de invasão e disseminação do fungo.
Conforme o Ministério da Saúde, Coordenação Nacional de DST/AIDS o
tratamento recomendado é com a anfotericina B na dose de 0,5 – 1,0 mg/kg/dia,
(IV), geralmente até a negativação das culturas ou até a dose total de 2,5g. Os
imidazóis têm sido substituídos pelos triazóis no tratamento. A associação com
fluocitosina embora apresente melhores resultados em pacientes não infectados
com HIV, aumenta a freqüência de efeitos adversos em hospedeiros com aids.
Visando reduzir os efeitos colaterais da anfotericina B, novas formulações foram
desenvolvidas. Estas formulações são conhecidas como complexos lipídicos da
anfotericina B, sendo divididas em três apresentações. Uma das apresentações não
49
lipossomal e duas liposomais, a saber: anfotericina B em dispersão coloidal (não
lipossomal, ABCD ou Amphocil®), anfotericina B lipossomal com fosfolipídios
unilamelares (lipossomal, LAB ou AmbBisome® e anfotericina B lipossomal também
com fosfolipídios (liposomal, ABLC ou Abelcet®. Todas estas formulações
apresentam um perfil de tolerabilidade muito melhor, com redução importante dos
efeitos adversos agudos e crônicos, entretanto apresentam como fator limitante o
preço elevado. Uma quarta formulação embora não recomendada ou não autorizada
pelos fabricantes é feita em ambiente hospitalar através da manipulação da
anfotericina B convencional e solução lipídica para nutrição parenteral (intralipid®
20%).
Ainda segundo o Ministério da Saúde, o fluconazol pode ser utilizado como
segunda escolha na dose de 400-800 mg/dia, durante seis a dez semanas (VO ou
IV). Para evitar recidivas é imprescindível que a terapia de manutenção seja com
anfotericina B (IV) ou fluconazol (VO) (COORDENAÇÃO NACIONAL DE DST/AIDS,
2008).
Um dos problemas que começa a emergir no debate do tratamento
antifúngico é aumento de dados mostrando a resistência a drogas, principalmente os
azóis. A resistência clínica é definida como a persistência ou progressão de uma
infecção apesar da administração de tratamento apropriado. A susceptibilidade
antifúngica dos fungos isolados é apenas um dos elementos que contribuem para a
resistência; outros fatores incluem a farmacocinética dos antifúngicos, fatores do
hospedeiro, sítios de infecção e o próprio patógeno. Em geral, fungos podem ser
intrinsecamente resistentes a antifúngicos, configurando a resistência primária,
como no caso das equinocandinas, que exibem prévia resistência a C. neoformans
ou desenvolver resistência em resposta a exposição à droga durante o tratamento,
então denominada de resistência secundária, o que é comumente observado com
a 5-fluocitosina (PEREA & PATTERSON, 2002).
Inicialmente, quando 5-fluocitosina foi usada como agente monoterápico para
tratamento de meningite criptocócica, a resistência primária ao tratamento era raro.
Entretanto, o freqüente desenvolvimento de resistência secundária durante o
tratamento indicou que se deva suprimir o uso deste como único antifúngico
(WHELAN, 1987 apud PEREA & PATTERSON, 2002).
A resistência a azóis tem sido documentada devido ao aumento da população
com aids durante o tratamento de candidíase orofaríngea com o uso de azóis tais
como o fluconazol (PERFECT & CASADEVALL, 2002). Entretanto, em relação a
50
isolados de Cryptococcus, os resultados são controversos. Estudos in vitro de C.
neoformans isolados de pacientes com recidivas de meningite criptocócica não
detectaram evidências de resistência a azóis (BRANDT et al., 1996). Por outro lado,
outras investigações têm mostrado o aumento do número de recidivas de meningite
criptocócica em pacientes com aids associados com o aumento de resistência a
drogas (SPITZER et al., 1992 apud CASADEVALL et al., 1993). Resistência
primária a fluconazol em paciente HIV-negativo foi relatada por Assing et al. (2003).
Casadevall et al. (1993) analisando isolados de C. neoformans originados de
pacientes com recidivas detectaram redução na susceptibilidade in vitro, bem como
ampla variação da concentração inibitória mínima (CIM) entre os isolados, porém
atribui a recorrência (recidiva) da meningite ao regime de deterioração do sistema
imune. Outras investigações têm demonstrado tendência oposta. A susceptibilidade
antifúngica de 368 isolados clínicos (1992 a 1994) mais 364 (1996 a 1998) dos
Estados Unidos não mostrou significante alteração nos CIM de anfotericina B e
fluconazol para C. neoformans, não obstante o uso generalizado destes antifúngicos
em pacientes com aids. Os autores atribuíram os baixos níveis de resistência a azóis
ao uso infreqüente destes agentes na população investigada (BRANDT, et al.,
2001). Na Espanha, um estudo de 70 isolados clínicos também não apresentou
alterações significativas entre 1994-1996 e 1997-2005. Os CIMs de fluconazol
permaneceram estáveis e os autores concluíram que a resistência ao fluconazol in
vitro decresceu em 11 anos (TORRES-RODRÍGUEZ et al. 2008).
Pfaller et al. (2005) realizaram estudo de susceptibilidade antifúngica in vitro
de 1811 isolados clínicos, obtidos de 100 laboratórios provenientes de 5 regiões
geográficas. Os resultados mostraram que entre 98 a 100% foram susceptíveis a
anfotericina B (CIM ≤1µ/ml), independente da região. Por outro lado susceptibilidade
a fluocitosina (CIM ≤4µ/ml) variou de 35% na América do Norte a 68% na América
Latina. Em relação ao fluconazol somente 75% dos isolados norte-americanos foram
susceptíveis (CIM ≤8µ/ml), quando comparados com 94% a 100% das outras
regiões, demonstrando assim variação da susceptibilidade destas cepas em relação
à origem geográfica.
A maioria das publicações mostra que a anfotericina B mantém excelente
atividade contra C. neoformans de origem clínica e ambiental (BRANDT et al., 2001;
TAY et al., 2005), entretanto, existe um caso bem documentado de resistência
primária (POWDERLY et al., 1992 apud CASADEVALL, et al., 1993) em paciente
com aids. E de acordo com PEREA & PATTERSON (2002), relatos de resistência
51
secundária têm sido esporádicos (WITT et al., 1996 apud PEREA & PATTERSON,
2002; ALLER , 2000).
No Brasil, alguns estudos demonstram a existência de isolados menos
susceptíveis a itraconazol e fluconazol (PAPPALARDO & MELHEM, 2003;
MONTENEGRO & PAULA, 2000). A maioria dos trabalhos sobre susceptibilidade
antifúngica não discrimina entre espécies e sorotipos de Cryptococcus, mas os
poucos trabalhos têm evidenciado menor susceptibilidade in vitro de C. gattii em
relação a C. neoformans (TRILLES et al., 2004; MORGAN et al. 2006; TORRES-
RODRÍGUEZ, 2008).
Novas drogas estão sendo avaliadas e destas merece destaque o triazol
albaconazol com potencial atividade contra C. neoformans (MILLER et al., 2004).
Um dos obstáculos ao estudo de susceptibilidade antifúngica refere-se à falta
de padronização de testes para tal. Existem ainda sérias limitações que interferem
na credibilidade destes testes, mesmo utilizando métodos recomendados. Até o
presente momento os métodos para testes de susceptibilidade antifúngica para
leveduras são comparáveis aos utilizados para bactérias. Métodos têm sido
desenvolvidos e aprovados pelo Clinical and Laboratory Standarts Isntitute (CLSI,
antigamente National Committee for Clinical Laboratory Standarts) Subcommittee on
Anifungal Susceptibility Testing tais como: teste de diluição em caldo (CLSI aprovou
a norma M27-A2) teste de difusão em disco (CLSI aprovou diretrizes M44-A), os
quais têm sido considerados reprodutíveis, precisos e acessíveis para uso em
laboratórios clínicos (ALEXANDER & PFALLER, 2006; PFALLER et al. 2004;
PFALLER et al., 2005). Outros, entretanto, observam que não há consenso sobre o
ponto de corte para definir sensibilidade e resistência frente aos diferentes
compostos antifúngicos (LAZÉRA et al., 2005; VADENBOSSCHE et al., 2002;
JOHNSON, 2008). VADENBOSSCHE et al. (2002) consideram que o desempenho
dos testes de susceptibilidade antifúngica de acordo com métodos do NCCLS em
larga escala é tecnicamente difícil. O E-test é uma alternativa muito aceitável. O
método da difusão em disco, com valores em diâmetro, proposto por Rosco, produz
muitos erros.
52
3. RELEVÂNCIA
O estado do Pará está situado na região Norte do Brasil, é cortado pela linha
do Equador, localizado entre os paralelos 2 N e 5 S e meridianos 56 e 48 W de
Greenwich, abrangendo uma área de 1.253.164,5 km2 (AMBIENTE BRASIL, [2007]).
Predomina no estado clima equatorial, quente e úmido, e detém grande parte da
floresta Amazônica. A Região Metropolitana de Belém (RMB) está constituída dos
municípios de Belém (capital), Ananindeua, Marituba, Benevides e Santa Bárbara do
Pará. A população estimada da RMB é de 1.795.536 habitantes, sendo que Belém
concentra 68,95% da população da RMB e abrange uma área de 1.827,7 Km2.
(IBGE, [2008]).
A criptococose é uma micose de ocorrência universal, tendo sido registrados
diversos casos no estado do Pará. Considerada como uma importante infecção
oportunista, nos casos de aids é a terceira em freqüência, com elevada letalidade.
No entanto, na sua forma primária, em indivíduos hígidos, imunocompetentes,
apresenta aspectos de ecologia, epidemiologia, patogenia, manifestações clínicas e
de imagem menos conhecidos e pouco relatados. Assim, no estado do Pará, bem
como em outros estados das regiões N e NE (Amazonas, Roraima, Maranhão e
Piauí) a criptococose em crianças, não relacionada à aids, têm sido relatada em
cerca de 1/5 dos casos (CAVALCANTI, 1997, CORRÊA et al., 1999; SANTOS, 2000;
MARTINS, 2003).
Recentemente foi diagnosticada, um caso grave e fatal de meningoencefalite,
em criança HIV-negativa, com hepatite crônica, procedente de e residente em
Itaituba, Pará, causada por ambos os sorotipos A e B de Cryptococcus spp., caso
inédito na literatura (MARTINS et al., 2003). Árvores tropicais colonizadas por
ambos os sorotipos A e B já foram descritas em Roraima e no Piauí, e podem
representar fontes ambientais para infecção humana (FORTES, 2001; LAZÉRA et
al., 1998). No Pará, ainda não há relato de estudos ambientais desta natureza.
Considerando que a Amazônia tem características fisiográficas próprias e eco-
epidemiologia distinta daquela descrita para a criptococose e seu agente em outras
regiões no mundo, como por exemplo, na Austrália, onde tem sido estudada em
profundidade, e onde as características climáticas são propícias ao desenvolvimento
ótimo de fungos, buscou-se esta linha de pesquisa que envolve um fungo
patogênico.
53
Em resumo, muitos aspectos sobre a fonte ambiental e a forma de infecção
deste fungo ainda não estão bem esclarecidos em nossa região. Estudos sobre a
ocorrência de Cryptococcus spp. em diferentes substratos de espécimes vegetais e
outros, descritos ou não na literatura, podem fornecer subsídios para um melhor
entendimento do mecanismo de aquisição desta micose, bem como ampliar a visão
ecológica sobre este agente de grande interesse médico numa região onde as
informações sobre o mesmo são escassas ou inexistentes.
Neste contexto, justifica-se o presente estudo, para fornecer dados inéditos
acerca de fontes ambientais da infecção por Cryptococcus spp. na RMB, bem como
a caracterização molecular dos isolados obtidos nesta região do Brasil.
54
4. OBJETIVOS
Objetivo Geral
Investigar fontes sapróbias de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii na
Região Metropolitana de Belém do Pará, Brasil.
Objetivos Específicos
1. Investigar fontes sapróbias de C. neoformans e C. gattii relacionadas a ocos de
árvores e excretas de aves na área urbana de Belém/PA.
2. Realizar estudo descritivo do ambiente domiciliar e peridomiciliar de pacientes
com criptococose diagnosticados no estado do Pará.
3. Determinar a contaminação domiciliar e peridomiciliar por Cryptococcus spp.
patogênicos.
4. Determinar as espécies, sorotipos e tipo sexuado (mating type) dos isolados de
Cryptococcus spp. patogênicos obtidos.
5. Estimar a quantidade de unidades formadoras de colônias (UFCs) de
Cryptococcus spp. patogênicos presentes nas amostras do ambiente domiciliar e
peridomiciliar.
6. Caracterizar tipos moleculares (VNI-VNIV e VGI-VGIV) dos isolados por técnica
de PCR/RFLP.
55
5. MATERIAIS E MÉTODOS
5.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE ÁRVORES E
EXCRETAS DE AVES NA ÁREA URBANA DE BELÉM
Antes de iniciar o estudo dos domicílios foi realizada uma investigação em
dois bairros da cidade de Belém, onde foram coletadas onze amostras sendo sete
amostras do oco de árvores aleatoriamente selecionadas nas ruas do bairro do
Umarizal e quatro de excretas secas de aves em cativeiro de lojas de venda de aves
situadas no bairro de São Braz, local este onde é notória a presença de pombos
sobrevoando o local e em grande quantidade. O processamento foi realizado como
descrito no item 5.6.
Colônias fenoloxidase positivas foram isoladas em meio de SC e
caracterizadas quanto à termotolerância a 37ºC e sensibilidade à ciclohexamida. O
meio GCB foi utilizado para determinação das espécies. O estudo bioquímico dos
isolados foi determinado pelo método automatizado Vitek 32-BioMerieux System
(Vitek ICB, bioMeriux, Durham, USA), conduzido no Setor de Fungos de Referência
do Laboratório de Materiais de Referência do departamento de microbiologia do
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde (INCQS).
A determinação dos sorotipos dos isolados foi realizada, utilizando o teste de
aglutinação em lâmina, com o kit Crypto Check Iatron RM 304-K® (Iatron Labs,
Tokyo, Japão). Para manutenção estes isolados foram transferidos para Skim Milk e
armazenados a -20ºC.
A identificação do tipo sexuado e a tipagem molecular foi realizada conforme
descrito no item 5.6.3.
5.2 ESTUDOS DE FONTES AMBIENTAIS A PARTIR DE DOMICÍLIOS DE
PACIENTES COM CRIPTOCOCOSE.
5.2.1 Seleção dos domicílios
O estudo foi conduzido de acordo com a indicação do endereço de pacientes
diagnosticados com criptococose, no período de 2004 a 2005, registrados no
Hospital Universitário João de Barros Barreto, que é um centro de referência para
Doenças Infecciosas e Parasitárias (DIP) para o estado do Pará, onde os casos
suspeitos de meningite são submetidos a investigação clínica e laboratorial, como
análise bioquímica do líquor e exame direto do sedimento na busca de presença de
56
fungos. Como a demanda do hospital é constituída de pacientes dos diversos
municípios paraenses, além de alguns estados vizinhos, a coleta de material ficou
circunscrita à Região Metropolitana de Belém (RMB).
Um paciente com suspeita de criptococose é normalmente referenciado para
o HUJBB, que é referência em Doenças Infecto-parasitárias. A confirmação dos
casos suspeitos é realizada por equipe médica do Hospital em conjunto com o
Serviço de Apoio ao Diagnóstico, através dos seguintes exames: 1) Exame
microscópico direto de líquor em preparações com tinta Nanquim; 2) Prova de
aglutinação com Látex no líquor; 3) cultivo em meios de Sabouraud com
cloranfenicol. Após consulta aos prontuários, foram selecionados endereços de
pacientes diagnosticados com criptococose, residentes e domiciliados na RMB.
5.2.1.1 Critérios de Inclusão
Foram considerados como alvo do estudo domicílios de pacientes e de
vizinhos circunscritos à RMB (PA).
5.2.1.2 Critérios de exclusão
Não foram consideradas residências de trânsito do paciente quando em
busca do serviço médico.
5.3 ÁREA DE ESTUDO
A RMB inclui os municípios de Belém, Ananindeua, Marituba, Benevides e
Santa Bárbara do Pará (Figura 1). O sítio físico da RMB é caracterizado por porções
continentais e insulares, com um relevo pouco acidentado, é uniforme e com poucas
variações. O Rio Guamá, ramificação do rio Pará e baía do Guajará na altura do
município de Belém conformam a principal formação fluvial, completada por uma
série de pequenos furos, igarapés e paranás, que no interior das áreas urbanas são
transformados em canais de drenagem. O alto índice pluviométrico também contribui
para a alta umidade, notadamente no período de dezembro a março. A temperatura
média é 26ºC. (OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]).
Embora efetivamente a RMB apresente apenas os municípios de Belém e
Ananindeua conurbados, o processo de periferização nos demais – Marituba,
Benevides e Santa Bárbara do Pará é acompanhado de um processo de
transformação de terra rural em terra urbana, por meio de invasões e loteamentos,
na maioria das vezes clandestinos.
57
A região apresenta uma área de 1.827,7Km2 e concentra 1.795.536 de
habitantes, representando 29% da população do estado, sendo que Belém detém
68,95% da população da RMB. Em 2000, a RMB apresentava 416.176 domicílios
particulares permanentes, situados majoritariamente em Belém (71,17%) e entre os
municípios com níveis de integração na dinâmica metropolitana, Ananindeua, com
integração muito alta com a capital, possui 22,23%, Martituba e Benevides com
baixo índice de integração 4,09 e 1,93%, respectivamente e Santa Bárbara, 0,57%.
(OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]).
Figura 5.1 - Mapa de localização da Região Metropolitana de Belém. O ecossistema amazônico dota a RMB de áreas de floresta tropical úmida,
embora alterada em função do desmatamento acelerado nos cinco municípios.
Belém possui 39 ilhas, os demais municípios também possuem ilhas, onde ainda
existe uma fauna importante para a preservação. Algumas manchas de vegetação
58
intacta ainda estão presentes em Santa Bárbara do Pará e em algumas ilhas do
município de Belém (OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES, [c2006-2008]). O
relevo da RMB é bastante uniforme, de plano a suave ondulado. Morfologicamente
pertence a formas erosivas constituídas pelas superfícies pediplanadas e plena
planície fluvial, caracterizado por um emaranhado de canais, furos, igarapés,
paranás e lagos com partes sujeitas a inundações periódicas, quer pelas águas da
chuva quer pelas águas da maré diária ou de equinócio. No município de Belém a
topografia é pouco variável e baixa, atingindo 25 m na ilha de Mosqueiro, ponto de
altitude máxima, com as cotas mais baixas chegando a 4 m. Em Ananindeua
observam-se pouquíssimas oscilações altimétricas, ficando a cota média em torno
de 16 m. Benevides apresenta variações inexpressivas com altitude em torno de
45m e em áreas mais elevadas atinge 57m. (PARÁ, 1997)
Belém, a capital paraense (01°27’20”S e 48°30’15”W), ocupa uma área de
505,8231 Km2. A vegetação dos mangues e sirubais acompanha as porções fluviais
e semi-litorâneas do setor estuarino, enquanto a floresta ombrófila domina as
margens dos cursos d’água e as baixadas, onde prevalecem formações herbáceas,
subarbustivas e arbustivas. A cobertura vegetal com vegetação composta de floresta
secundária ou capoeiras que substituíram a antiga floresta densa, cujos
remanescentes podem ser ainda encontrados em Mosqueiro, Caratateua e áreas
adjacentes. O clima é quente e úmido com precipitação anual média de 2.834 mm e
temperatura média de 25°C em fevereiro e 26°C em novembro, localizando-se em
zona climática Afi (classificação de Köppen), coincidente com clima de floresta
tropical permanentemente úmido, com ausência de estação fria, cuja temperatura do
mês menos quente está acima de 18ºC (PREFEITURA MUNICIPAL DE BELÉM,
2006).
No município de Ananindeua o clima é megatérmico úmido com temperaturas
elevadas em torno de 25ºC com pequena amplitude térmica. O regime pluviométrico
oscila entre 2.250 a 2500 mm com chuvas regulares e a umidade relativa do ar está
em torno de 85% (PREFEITURA MUNICIPAL DE ANANINDEUA, 2007). Em
Benevides o clima também é megatérmico com temperaturas elevadas durante o
ano com média de 25ºC e pequena amplitude térmica. O regime pluviométrico chega
a ultrapassar os 2.500 mm, com período mais chuvoso de janeiro a julho (PARÁ,
1997).
59
5.4 VISITA AO DOMICÍLIO E COLETA DAS AMOSTRAS
No período de março 2004 a abril de 2005 foram realizadas visitas ao
domicílio de 8 pacientes com diagnóstico comprovado de criptococose. As visitas
foram realizadas após contacto prévio com o paciente e/ou seu responsável. Na
residência foi explicado o objetivo da visita e solicitado leitura e assinatura de termo
de consentimento (Anexo 1).
Para controle, de cada domicílio de paciente foram incluídos no estudo três
domicílios próximos, sem ocorrência de caso de criptococose, selecionados de
acordo com a proximidade do domicílio-índice e a acessibilidade.
5.4.1 Entrevista
Uma vez selecionados, os pacientes foram contatados e informados sobre a
pesquisa ambiental. Após esclarecimentos quanto ao objetivo do estudo ao nível
educacional da população, aqueles que aceitaram participar, ou seus representantes
legais, assinaram termo de consentimento. Com relação aos domicílios-controle, foi
utilizado o mesmo método de abordagem.
Também foi utilizado um questionário em aberto, visando obter informações
sobre os hábitos do paciente.
5.4.2 Ficha Ambiental
Características do domicílio e peridomicílio foram registradas em formulário
específico (Anexo 2), incluindo os seguintes parâmetros: tipo de construção,
presença e tipo de animais domésticos, de criação e silvestres, presença e tipo de
vegetação no domicílio e peri-domicílio. Após, foram realizadas coletas de material
nos ambientes pré-definidos, a saber: a) Intradomicílio: poeira do assoalho e outras
amostras de matéria orgânica observada nas visitas. b) Peridomicílio (ambiente no
entorno da casa, jardim ou equivalente): coleta também dirigida pela inspeção,
direcionada a ocos de árvores, criadouros de pássaros, habitats de morcegos e
locais de acúmulo de matéria orgânica diversa. c) Coletas em domicílios controle
(casa ao lado) usando idêntica metodologia.
Seguindo estes parâmetros foram realizadas coletas em quantidade variável,
de acordo com as características encontradas e possibilidade de acesso.
5.4.3 Coleta das Amostras
A coleta de poeira do ambiente intradomiciliar foi realizada utilizando-se a
vassoura da própria casa. Amostras do ambiente peridomiciliar incluíram materiais
60
diversos entre os quais: madeira em decomposição, ocos de árvores vivas ou
mortas, insetos e artrópodes que foram coletados diretamente em frascos estéreis.
Todas as amostras foram acondicionadas em frascos coletores estéreis, os quais
foram identificados, com o tipo de material, local procedência e data e armazenadas
sob refrigeração no Laboratório de Micologia da UFPA até o processamento,
realizado no Laboratório de Micologia do IPEC/FIOCRUZ.
5.5 PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
O processamento das amostras foi realizado seguindo metodologia descrita
por Lazéra et al. (1996), com algumas variações, no Laboratório de Micologia
Ambiental, do Instituto de Pesquisa Clínica Evandro Chagas (IPEC/FIOCRUZ), Rio
de Janeiro/RJ.
5.5.1 Isolamento das colônias
O material coletado foi homogeneizado em gral e pistilo de porcelana estéreis
e diluído (1:50 P/V) em solução salina fisiológica a 0,9%, acrescida de 0,2 mg/l de
cloranfenicol. O material foi submetido à agitação vigorosa durante 5 minutos, e em
seguida, colocado em repouso durante 30 minutos.
Com auxílio de uma seringa de insulina descartável, alíquota de 0,1 ml do
sobrenadante foi semeada em cada placa de Petri contendo meio de cultura com
sementes de níger (niger seed agar-NSA), num total de 10 (dez) placas por amostra
ambiental. As placas semeadas foram incubadas à temperatura ambiente (± 25ºC) e
observadas diariamente por um período de cinco a sete dias. Colônias de coloração
marron escura observadas em meio NSA, fenol-oxidade positivas, foram isoladas em
meio de agar-Sabouraud com cloranfenicol (SC). Os isolados foram preservados em
skim milk a -20ºC ou em glicerol a -70ºC e depositadas na coleção de Culturas do
Laboratório de Micologia do IPEC/FIOCRUZ.
A densidade de colônias fenoloxidase positivas foi estimada através da
quantificação do número de unidades formadoras de colônias (UFC) em 1:50 (P/V)
da suspensão inoculada em meio NSA e expressa em UFC/g.
Para o processamento de amostras de tatuzinhos foi realizada desinfecção
superficial com álcool a 70% durante 5 minutos. A seguir os mesmos foram
macerados em 2 ml de solução fisiológica com cloranfenicol e 0,1 ml foi transferido
para as placas de Petri estéreis até esgotamento da suspensão.
5.5.2 Identificação fenotípica
61
5.5.2.1 Síntese de melanina (atividade fenoloxidase)
Para revelar a capacidade de produção de melanina foi utilizado o cultivo em
meio NSA. O microrganismo foi semeado por estrias na superfície do meio em uma
placa de Petri, incubada à temperatura ambiente (± 25ºC) durante 5 dias, para a
observação do pigmento.
5.5.2.2 Termotolerância
Para teste de termotolerância todos os isolados foram repicados em meio SC
e incubados a 25ºC e 37ºC, por um período de 48-72 horas, e realizadas
observações diárias. Ambas as espécies, C. neoformans e C. gattii crescem a 37ºC.
5.5.2.3 Sensibilidade à cicloheximida
Para realização do teste de sensibilidade à cicloheximida os isolados foram
inoculados em Agar Sabouraud suplementado com cloranfenicol e cicloheximida
(Mycosel) e incubados à temperatura ambiente (± 25ºC) por 48 horas. A maioria dos
isolados de C. neoformans e C. gattii são sensíveis à ≤ 12 µg/ml de cicloheximida
(KWON-CHUNG, 1998).
5.5.2.4 Sorotipagem
A determinação dos sorotipos foi realizada, utilizando o teste de aglutinação
em lâmina, com o kit Crypto Check Iatron RM 304-K® (Iatron Labs, Tokyo, Japão)
que identifica 5 sorotipos: A, D e AD para C. neoformans e B e C para C. gattii. Este
kit é constituído de anticorpos policlonais, monoespecíficos o que garante a
especificidade e sensibilidade da reação. O kit utiliza 5 fatores antigênicos,
discriminados como fatores 1, 5, 6, 7 e 8. O fator 1 confirma o gênero Cryptococcus,
o fator 5 indica o sorotipo B, o fator 6 o sorotipo C, o fator 7 o sorotipo A o fator 8 o
sorotipo D e os fatores 7 e 8 associados identificam o sorotipo AD.
Para o teste foi utilizado colônias com 48 horas de crescimento em meio SC
incubadas à temperatura ambiente (± 25ºC). Em lâmina própria para aglutinação que
acompanha o kit, foi colocado uma gota de cada fator sérico nos cículos
correspondentes (F1, 5, 6, 7 e 8) e a seguir com auxílio de uma alça microbiológica
foi transferida uma pequena quantidade de massa fúngica sobre cada fator sérico.
As lâminas foram homogeneizadas manualmente e feito a leitura após observação
direta de pequenos grumos formados frente a cada fator e os sorotipos identificados
conforme explicitado no parágrafo acima.
62
5.5.2.5 Assimilação de compostos de Carbono e Nitrogênio
O estudo bioquímico dos isolados foi determinado pelo método automatizado
Vitek 32-BioMerieux System (Vitek ICB, bioMeriux, Durham, USA), conduzido no
Setor de Fungos de Referência do Laboratório de Materiais de Referência do
departamento de microbiologia do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde (INCQS).
Uma suspensão de leveduras (crescimento de 48 h), padronizado no tubo 2
da escala de McFarland foi transferida para cartelas VITEK, utilizando-se o aparelho
VITEK. Após sucção retirou-se as cartelas e incubou-se a 30°C, durante 48h ou até
72 horas, quando necessário.
Após período de incubação, foi realizada a leitura no aparelho VITEK,
acoplado a um computador, o qual possui programa específico para leitura,
permitindo a emissão dos resultados com a identificação específica em valores
percentuais.
Os reagentes utilizados foram: glicose, galactose, lactose, sacarose, maltose,
celobiose, α-metil-D-glicosídeo, xilose, arabinose, trealose, melizitose, rafinose, N-
acetil-D-glicosamina, xilitol, dulcitol, adonitol, ciclo-heximida, sorbitol, melibiose,
inositol, nitrato de potássio, 2-keto-D-gluco, uréia, eritol.
5.5.2.6 Meio CGB
Cryptococcus neoformans pode ser diferenciado de C. gattii utilizando-se o
meio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) proposto por Kwon-Chung et
al., (1982b). Os isolados foram semeados em meio de CGB e incubados à
temperatura ambiente (± 25ºC), durante 5 dias, realizando-se observações com
48h, 72h e 5 dias. Cryptococcus gattii hidrolisa a glicina, assimilando-a como fonte
de carbono e nitrogênio e é resistente a L-canavanina. O meio CGB tem pH 5,8 e
apresenta uma coloração amarelo-esverdeada. Com o crescimento do fungo o pH
do meio aumenta, o que é revelado pelo azul de bromotimol que altera a coloração
do meio de amarelo esverdeado para azul cobalto. Alguns isolados de C.
neoformans são capazes de assimilar a glicina, mas são sensíveis à L-canavanina,
não havendo, portanto crescimento e nem alteração da coloração do meio.
5.5.3 Identificação Molecular
5.5.3.1 Extração de DNA
63
O DNA genômico foi extraído por dois métodos mecânicos: 1) protocolo
modificado de Ferrer et al. (2001), e 2) método CETAB, utilizando pérolas de vidro,
conforme O´Donnel et al. (1997).
Seguindo o protocolo modificado de Ferrer et al., 2001, colônias dos isolados
foram cultivados em meio de SC durante 48 horas à temperatura ambiente. A
massa fúngica foi removida com o auxílio de alça microbiológica e transferida para
um tubo tipo Eppendorf e armazenado a -20ºC, durante a noite. Após
armazenamento foi adicionado 500 µl de solução de lise (Tris-HCl 1M, EDTA, NaCl,
SDS) e 5 µl de 2-mercaptoetanol. A suspensão foi homogeneizada por agitação
vigorosa em agitador tipo vortex e incubada a 65ºC durante 1 h, com duas agitações
durante este período, de 30 em 30 min. A seguir adicionou-se 500 µl de
fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (v:v:v 25:24:1) e misturado em agitador durante
2min para obter uma suspensão homogênea. Após homogeneização centrifugou-se
a 14000 rpm por 15 min. A fase aquosa foi removida e misturada com igual volume
de isopropanol para precipitação dos ácidos nucléicos. O DNA foi precipitado a –
20ºC durante uma noite. Após centrifugação a 14000 rpm por 15 min a 4ºC o
sobrenadante foi eliminado e o sedimento lavado com etanol 70%. Após uma leve
mistura manual e centrifugação a 14000 rpm por 15 min, removeu-se o etanol e o
sedimento foi seco à temperatura ambiente (± 25) . O sedimento seco foi
ressuspenso em 100 µl de água bi-destilada estéril e conservado em geladeira. A
integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro, depois
diluído a uma concentração de 10 ng/µl e armazenado em alíquotas a -20ºC, os
quais foram utilizados para análises. O processo de extração foi realizado em capela
de fluxo laminar vertical (Veco), após irradiação prévia com U.V., utilizando-se
materiais de consumo novos e estéreis.
Seguindo o método CETAB (O’DONNEL et al, 1997) foi realizada conforme
descrição a seguir. Após ruptura das leveduras com pérolas de vidro, uma colônia de
C. neoformans foi inoculada em meio de SC por esgotamento e incubada à
temperatura ambiente por 48 horas. A massa fúngica foi transferida para um tubo
tipo eppendorf de 1,5 ml, armazenado a -70ºC, para posterior liofilização.
Aproximadamente 150 µl do liófilo foram transferidos para um tubo de 1,5 ml onde
se adicionou 50 µl de pérolas de vidro de 0,1 mm. Após pulverização manual com
pistilo, adicionou-se 800 µl de tampão CTAB (Solução CETAB:
hexadecyltrimethylammonium bromide, NaCl, pH 8,0 + Solução TE: TrisHCl 1M,
64
EDTA 0,5M) e pulverizou-se novamente e agitou-se em vortex por 20 segundos,
incubando-se durante 15 minutos a 65ºC. Este passo foi repetido mais duas vezes
seguida de outra agitação. A suspensão foi centrifugada a 14000 rpm, por 30
minutos a 4ºC. O sobrenadante foi transferido para um tubo de 1,5 µl, onde se
adicionou tampão CTAB até um total de cerca de 700 µl. A seguir, acrescentou-se
700 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1 v/v). A suspensão foi misturada por
cerca de 20 segundos e centrifugada a 14000 rpm por 20 min a 4ºC cuja fase
aquosa foi transferida para outro eppendorf acrescentado de 500 µl de clorofórmio-
álcool isoamílico. A suspensão foi misturada por cerca de 20 segundos e
centrifugada a 14000 rpm, por 10 minutos a 4ºC, e a fase aquosa foi transferida para
tubo de 1,5 ml com adição de 150 µl de tampão CTAB. E mais 300 µl (0,6 v) de
isopropanol a -20ºC. Esta suspensão foi misturada manualmente por inversão e
centrifugada a 14000 rpm, por 10 minutos a 4ºC, para obtenção do precipitado de
DNA. A seguir o sobrenadante foi removido com pipetas de 1 ml e 100 µl de etanol a
70% a -20ºC, misturando-se brevemente e centrifugado a 14000 rpm por 5 minutos a
4ºC. O sobrenadante foi removido com pipeta de 100 µl e seco ao ar por cerca de 10
minutos. Ao sedimento seco foi adicionado 100 µl de tampão TE (Tris.HCl 1M, EDTA
0,5M) estéril pH 7,6 mais 4 µl de RNAse na concentração de 10mg/ml, incubando-se
em seguida a 37ºC por até 20 minutos e estocado e conservado em geladeira. A
integridade do DNA extraído foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%
corado com brometo de etídio. O DNA foi quantificado em espectrofotômetro, depois
diluído a uma concentração de 10 ng/µl e armazenado em alíquotas a -20ºC, os
quais foram utilizados para análises. O processo de extração foi realizado em cabine
de segurança biológica, classe II (Veco), após irradiação prévia com U.V., utilizando-
se materiais de consumo novos e estéreis.
5.5.3.2 Determinação do mating type
Seqüências específicas, codificadoras do gene do feromônio de cada tipo
sexuado (MAT α, e MAT a) foram detectadas através de técnica de PCR, de acordo
com Chaturvedi et al., (2000). Para determinação do mating type, foram utilizados
os pares de primers α1 (MAT αααα: 5’-CTTCACTGCCATCTTCACCA-3) e α2 (5’-
GACACAAAGGGTCATGCCA-3’), específicos para o mating type α e a1 (5’-
CGCCTTCACTGCTACCTTCT-3’) e a2 (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’),
específicos para mating type a que originam produtos de amplificação de 101 pb e
117 pb, respectivamente. As reações de amplificação foram realizadas a um volume
65
final de 25 µl contendo 5 µl do DNA (10ng/µl) extraído, suspenso numa mistura de
9,5 µl de água MilliQ, 6,25 µl de DNTP (diluição a 8 mM em tampão Taq 10X e
água), 1,5 de MgCl2 (2,5mM de cloreto de Magnésio), 1,25 µl de cada primer (10
pmol/µl) e 0,25ml da enzima Taq Polimerase (Invitrogen). A reação de polimerase
em cadeia (PCR) foi realizada por um aquecimento inicial das amostras seguindo a
seguinte programação: 1 ciclo de 95ºC por 3 minutos; 30 ciclos de 94ºC por 1
minuto, 57,5ºC por 1 minuto, 72ºC por 1 minuto; seguido de 1 ciclo a 72ºC por 7
minutos em um termociclador (Eppendorf e/ou MiniCycler, MJ Research). Os
produtos da amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 2%
corado com brometo de etídio. Foram utilizados controles negativos (sem DNA) e
cepas padrão (ATCC 28957 e ATCC 28958) como controle positivo.
5.5.3.3 Tipagem Molecular
Os isolados foram caracterizados através da análise do gene URA-5,
utilizando-se a técnica de Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP).
A PCR do gene URA-5 foi realizada conforme descrito por Meyer et al. 2003 a
um volume final de 25 µl. Cada reação contendo 50 ng de DNA genômico , tampão
PCR 1X ( 200mM Tris p\h 8,4, 500 mM KCl), 0.2 mM de dATP, dCTP, dGTP e dNTP
(Biotools, Espanha) ), 2 mM MgCl,, 2,5 U Taq DNA polymerase (Invitrogen, São
Paulo, Brasil), e 25 ng de cada primer URA5
(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') e SJ01
(5’'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3'). As reações foram realizadas em 35
ciclos na seguinte programação: 35 ciclos de 94ºC por 5’ de desnaturação inicial, de
94ºC por 45” de desnaturação, de 63ºC por 1’ de anelamento, de 72ºC por 2’ de
extensão e um ciclo final de 72ºC por 10’ de extensão final; em termociclador
(Eppendorf e/ou MiniCycler, MJ Research). Os produtos de PCR foram separados
por eletroforese em gel de agarose a 3% corado com brometo de etídio. Foram
utilizados controles negativos (sem DNA) e padrões (LMN 794 – VNI, LMM 795-
VNII, LMM 796 – VNIII, LMM 797 – VNIV, LMM 798 – VGI, LMM 799 - VGII, LMM
800 - VGIII, LMM 801 - VGIV) como controle positivo. Amplificação dos produtos de
PCR foi verificado por eletroforese em gel de agarose a 1% e em dupla digestão
com enzimas, Sau96I (10 U/µl) and HhaI (20 U/µ l) durante 3h no mínimo e
separados por eletroforese em gel de agarose a 3%, a 100 V. O resultado de RFLP
foi fotografado e comparado com os padrões (VNI - VNIV e VGI - VGIV).
66
6. RESULTADOS
6.1 ESTUDO DE FONTES SAPRÓBIAS RELACIONADAS A OCO DE ÁRVORES E
EXCRETAS DE AVES EM DOIS BAIRROS DE BELÉM/PA.
A partir de onze amostras ambientais processadas, duas foram positivas para
Cryptococcus spp (Tabela 6.1). De uma amostra constituída de excretas de
periquitos foram isoladas cinco colônias de C. neoformans e de uma amostra de oco
de árvore viva (Senna siamea) foram isoladas duas colônias, sendo uma C.
neoformans e outra C. gattii, perfazendo um total de sete isolados. Quanto a tipo
sexuado os sete isolados foram caracterizados como MATα e em relação à tipagem
molecular todos os isolados C. neoformans apresentaram genótipo VNI enquanto C.
gattii foi caracterizado como VGII.
Tabela 6.1 - Número e caracterização de isolados oriundos de fontes ambientais da
cidade de Belém/PA.
ISOLADO SUBSTRATO ESPÉCIE SOROTIPO
TIPO SEXUADO
GENÒTIPO
LMM 1082 Poeira com excretas de pássaros.
C. neoformans A α VNI
LMM 1083 Poeira com excretas de pássaros.
C. neoformans A α VNI
LMM 1084 Poeira com excretas de pássaros.
C. neoformans A α VNI
LMM 1087 Poeira com excretas de pássaros.
C. neoformans A α VNI
LMM 1088 Poeira com excretas de pássaros.
C. neoformans A α VNI
LMM 1089 Oco profundo de Senna siamea
C. neoformans A α VNI
LMM 1090 Oco profundo de Senna siamea
C. gattii B α VGII
A Tabela 6.2 apresenta dados meteorológicos observados no período das
coletas, demonstrando elevada temperatura e umidade.
67
Tabela 6.2 - Dados meteorológicos de Belém/PA, referentes ao período de coleta.
Ano Mês
Temp.
máxima
Temp.
mínima
Temp.
média
Umidade
Relativa
Umidade
relativa
Brilho
solar
2002 Mai 32,4 23,8 26,7 85 197,4 206
Média/ano 32,3 23,4 26,6 84 2798,5 2410,5
2003 Mar 30,7 23,7 26,1 89 494,9 104,2
Média/ano 32,2 23,6 26,6 84,2 2749 2424,9
Fonte: EMBRAPA/Amazônia Oriental
Na figura 6.1 está demonstrado o perfil eletroforético dos isolados ambientais
Mat α obtidos de amostras ambientais de uma área urbana de Belém/PA.
Figura 6.1- Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo sexuado com
primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 dos isolados ambientais de C. neoformans e C.
gattii de uma área da cidade de Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso molecular
100pb; 2: LMM 1082; 3: LMM 1083; 4: LMM 1084; 5: LMM1088; 6: LMM 1089; 7: LMM
1090; 8: ATCC 28957 padrão MATα ; 9: ATCC 28958 padrão MATa; 10: Controle negativo.
O perfil eletroforético obtido por PCR/RFL dos isolados de C. neoformans e C.
gattii das amostras coletadas aleatoriamente em dois bairros de Belém está
representado na Figura 6.2.
68
Figura 6.2 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo molecular (VNI
e VGII) dos isolados ambientais de uma área da cidade de Belém. Linhas – 1: LMM 1082; 2:
LMM 1083, 3: LMM 1084, 4: LMM 1087, 5: LMM 1088, 6: LMM 1089, 7: LMM 1090.
Isolados padrões, de 8 a 11 (VNI-VNIV) de 12 a 15 (VGI-VGIV); 16: controle negativo; M:
peso molecular 100pb. Isolados 1 a 6 correspondem a C. neoformans VNI e o isolado 7
corresponde a C. gattii VGII.
6.2 ESTUDO DE FONTES SPRÓBIAS RELACIONADAS AOS CASOS-INDICE
SELECIONADOS.
Trata-se de um estudo seccional, descritivo, aprovado pelo Comitê de Ética
do Hospital João de Barros Barreto (HUJBB) pertencente à Universidade Federal do
Pará (UFPA) (Anexo 3).
A partir de consulta realizada no Departamento de Arquivo Médico e
Estatística (DAME) do HUJBB, foi fornecida uma lista de pacientes diagnosticados
com criptococose, da qual selecionamos oito casos, denominados de casos-índices.
Após contato com paciente ou responsável foi realizada coleta em domicílio e
peridomicílio. Na tabela 6.3 estão registrados os casos com domicílio-índice,
informando idade, gênero, sorologia HIV, procedência, agentes e evolução clínica.
69
Tab
ela
6.3
- P
erfil
e p
roce
dê
ncia
dos
cas
os
sele
cio
nad
os p
ara
o e
studo a
mbie
nta
l. C
AS
O-Í
ND
ICE
/
PA
CIE
NT
E
IDA
DE
G
ÊN
ER
O
HIV
P
RO
CE
DÊ
NC
IA
AG
EN
TE
E
VO
LU
ÇÃ
O
CLÍ
NIC
A
1
13
F
Neg
ativ
o M
osq
ueiro
Cryptococcus s
p.
alta
2
11
M
Neg
ativ
o A
nanin
deua
C. gattii
alta
3
33
F
Neg
ativ
o B
elé
m
C. gattii
óbito
4
46
M
Neg
ativ
o A
nanin
deua
Cryptococcus s
p.
alta
5
60
F
Neg
ativ
o A
nanin
deua
C. gattii
óbito
6
28
F
Posi
tivo
Belé
m
C. neoform
ans*
óbito
7
65
M
Neg
ativ
o B
elé
m
C. neoform
ans*
óbito
8
31
M
Posi
tivo
Belé
m
C. neoform
ans*
óbito
Fon
te:
HU
JBB
. *
Da
dos
ob
tido
s pe
lo P
rof.
Wal
lace
Sa
nto
s
70
6.3 ANÁLISE DAS AMOSTRAS COLETADAS
Conforme a tabela 6.4, cento e três amostras foram coletadas em domicílio e
entorno do paciente, e oitenta e três em domicílios controle, cuja maior positividade
foi detectada em amostras provenientes do caso-índice 3, com 42,11%. A média de
amostras por domicílio-índice foi de 12,88, enquanto do domicílio-controle foi 4,
considerando um total de 21 domicílios controle. Vale ressaltar que em relação aos
domicílios 1, 2, 3 e 5, foram realizadas duas visitas. No domicílio 8, a casa do
pacinete estava fechada e não se teve acesso ao interior do mesmo, embora se
tenha coletado duas amostras no seu entorno. No total foram processadas cento e
oitenta e seis (186) amostras. O número de amostras por residência variou conforme
o tamanho da edificação e a quantidade de material suspeito disponível, com uma
média de 6,41 amostras por domicílio.
Os agentes da criptococose foram encontrados em três dos oito domicílios de
pacientes. Em relação aos domicílios-controle no caso-índice 7 não se obteve
amostras; e positividade para colônias fenoloxidase foi detectada em quatro
domicílios-controles relativos ao caso índice 3 e em um de paciente cujo domicílio
não foi investigado, mas duas amostras do entorno foram negativas.
Considerando os domicílios positivos, a característica marcante foi o
predomínio de casas de poucos cômodos, às vezes com dois pavimentos e
edificadas em madeira. Os casos em sua maioria, mesmo os que não foram
selecionados situam-se em áreas de invasão em precárias condições de
saneamento.
71
Tab
ela
6.4
- D
istr
ibuiç
ão
das
am
ost
ras
analis
ad
as d
e a
cord
o c
om
os
caso
s-ín
dice
e s
eus
dom
icíli
os
e c
ontr
ole
s
CA
SO
S
ÍND
ICE
AM
OS
TR
AS
DO
MIC
ÍLIO
PA
CIE
NT
E
AM
OS
TR
AS
DO
MIC
ÍLIO
CO
NT
RO
LE
TO
TA
L
Nº
Nº
PO
S
Nº
PO
S
Nº
PO
S
%
1 23
0
18
0 41
0 0,0
0
2 23
3
9 0
32
3 9,3
8
3 15
5
23
11
38
16
42,1
1
4 4
0 6
0 10
0 0,0
0
5 14
0
11
0 25
0 0,0
0
6 11
0
2 0
13
0 0,0
0
7 11
2
0 0
11
2 18
,18
8 2
0 14
1 16
1 6,2
5
TO
TA
L 10
3 10
83
12
186
22
11,8
3
MÉ
DIA
12,
88
23,
25
PO
S=
pos
itivo
72
O quadro 6.1 destaca os domicílios positivos dos quais se isolou o fungo,
discriminando as suas características gerais, e descreve o tipo de amostras
positivas, onde se observa que poeira intradomiciliar, madeira em decomposição e
artrópodes foram os materiais com positividade. As características comuns são a
predominância das casas em madeira, muitas com aparente deterioração das
paredes.
73
Qu
adro
6.1
- C
ara
cterí
stic
as g
era
is d
os
dom
icíli
os
de
paci
ente
s e c
ontr
ole
s d
os
qua
is f
ora
m o
btid
os is
ola
dos
de C
. neoform
ans
(Cn)
e C
. gattii
(Cg)
e d
as
am
ostr
as c
oleta
das
conta
min
ada
s.
C
AS
O-
ÍND
ICE
MU
NIC
ÍPIO
C
AR
CT
ER
ÍST
ICA
S
AM
OS
TR
AS
PO
SIT
IVA
S (
Cn, C
g)
2
Ananin
deua
Casa
de tijo
lo/m
adeira, pa
redes
em a
lvenar
ia,
pis
o c
iment
ado, co
bert
a co
m te
lha d
e bar
ro e
sem
forr
o.
AM
BIE
NT
E D
OM
ICIL
IAR
: M
al i
lum
inada
e p
ouc
a v
entil
açã
o; c
ozi
nha d
e m
adeira
em
const
ruçã
o.
PE
RID
OM
ICÍL
IO:
quin
tal c
om á
rvore
s se
m c
erca
, muita
madeira e
mpilh
ada,
padar
ia a
o
lado.
Art
rópodes
Rasp
ado m
adei
ra
3
Belé
m
Casa
madei
ra, co
m d
ois
pavi
ment
os,
par
edes
em
madeir
a (a
lgum
as
tábuas
em
deco
mposi
ção),
pis
o em
tábua, co
bert
a c
om telh
a de a
mia
nto, se
m forr
o.
AM
BIE
NT
E D
OM
ICIL
IAR
: m
al i
lum
inado
e s
em v
entil
açã
o,
com
acú
mulo
de p
oeira
e r
est
os
de m
atérias
com
o fe
zes
de r
ato. P
rese
nça
de b
asid
iom
a na e
ntra
da.
Casa
fech
ada.
PE
RID
OM
ICÍL
IO:
Aglo
mera
do d
e ca
sas
( m
aio
ria
de
mad
eira)
no
ent
orn
o, se
m c
erca
,
pre
sença
de
basi
dio
mas.
Ausê
nci
a d
e á
rvor
es,
pre
sen
ça d
e a
nim
ais
. Á
rea
pró
xim
a ao
rio
Guam
á, s
uje
ita a
ala
gam
ento
. V
árias
madeireiras
nas
pro
xim
idades
.
Poeira in
tradom
icili
ar
Madeira d
eco
mposi
ção
7
Belé
m
Casa
de m
adeira, co
m d
ois
pavi
mento
s, p
are
des
em m
adeira
(alg
umas
tábuas
ext
erna
s em
deco
mposi
ção),
pis
o em
tábua, co
bert
a c
om telh
a de b
arro
,sem
for
ro.
AM
BIE
NT
E D
OM
ICIL
IAR
: boa h
igie
ne, ve
ntila
ção e
ilum
inaçã
o r
azo
áve
l.
PE
RID
OM
ICÍL
IO:
Quin
tal c
om c
erc
a de m
adeira,
co
m m
ato
e r
est
os d
e m
adeira e
m
deco
mposi
ção, so
lo m
uito
úm
ido.
Pre
senç
a d
e gat
o e
inse
tos.
Poeira in
tradom
icili
ar
do a
ndar
superior
8
Belé
m
Casa
de m
adeira, pare
de e
m m
adeira
, pis
o d
e tá
bua,
cober
ta c
om te
lha d
e barr
o.
AM
BIE
NT
E D
OM
ICIL
IAR
: ve
ntila
ção e
ilum
inaç
ão r
uin
s: c
asa
fech
ada
(nã
o a
cess
ível).
PE
RID
OM
ICÍL
IO:
Vár
ias
casa
s de m
adeira
ao r
edor
com
part
ilhand
o o
mes
mo q
uint
al.
Poeira in
tradom
icili
ar
de d
omic
ílio c
ontr
ole
74
6.4 DESCRIÇÃO DOS CASOS-ÍNDICE DE CRIPTOCOCOSE, SEUS DOMICÍLIOS
E RESULTADOS DA INVESTIGAÇÃO DOMICILIAR POR C. neoformans E OU C.
gattii.
6.4.1 – Caso índice 1
Caso 1. Paciente do sexo feminino, 13 anos, residente em Mosqueiro, acometida de
meningite criptococócica, em 2003 cuja pesquisa para fungos foi realizada através
de exame do LCR com diagnóstico positivo para Cryptococcus. Após tratamento
recebeu alta. Casa de alvenaria “crua” constituída de dois cômodos, piso
acimentado, telhado de barro sem forro. No entorno muitas árvores frutíferas e/ou de
porte alto, domicílios vizinhos espaçados, sem cercado, maioria de madeira,
próximos a área de mata e um campo em frente. Presença de basidiomas em
abundância no entorno. A paciente se recuperou sem seqüela aparente. Foram
processadas 41 amostras, a maioria constituída de raspados de madeira
constituintes de uma casa destruída pertencente à família e de raspados de ocos de
vegetais diversos. Domicílio e peridomicílio negativos para Cryptococcus. Domicílios
controle igualmente negativos para Cryptococcus.
6.4.2 – Caso-índice 2
Caso 2. Paciente do sexo masculino, 11 anos, acometido por meningite por C. gattii,
em fevereiro de 2004. Após tratamento recuperou-se com alta em março/2004.
Residente no bairro do Icuí-Guajará, no município de Ananindeua. Área de invasão.
O paciente é proveniente de Santa Isabel do Pará. Mora no local estudado
aproximadamente há dois anos. O diagnóstico apontou meningite fúngica por C.
gattii, tendo se recuperado aparentemente sem seqüelas. A casa atual, com três
cômodos para 5 pessoas, constituída na parte da frente em tijolo e o restante em
madeira. Piso cimentado, telhado de barro, sem forro, boa ventilação e iluminação,
úmida situada em rua sem asfaltamento ao lado de uma padaria. No momento da
coleta, foi observado muita madeira empilhada no fundo do quintal e junto à padaria
mais madeira para uso na fabricação do pão. No quintal tanto do domicílio do
paciente quanto dos vizinhos, havia árvores frutíferas e/ou ornamentais, algumas
destas foram derrubadas. Presença de insetos e animais domésticos, gato e
cachorro; relatado a presença de morcegos à noite. A coleta em sua maioria
consistiu de materiais oriundos de troncos vegetais em decomposição raspados ou
pedaços de madeira, onde normalmente se encontravam formigas, aranhas,
75
tatuzinhos de jardim, entre outros artrópodes. Das 32 amostras coletadas, 2
amostras constituídas de tatuzinhos (Tabela 6.5 e Figura 6.3), positivas para C.
neoformans e mais uma amostra do raspado de uma das tábuas onde andavam
vários tatuzinhos e aranhas, igualmente positiva para C. neoformans. Estas
amostras surpreenderam pela enorme quantidade de colônias formadas (Figura 6.4)
bem como pelo fato de que nas primeiras 48 horas não se observava outros agentes
contaminantes nas placas, parecendo culturas puras.
Figura 6.3 - Tatuzinhos de jardins (Arthropoda), coletados em peridomicílio
relativo ao caso-índice 2.
Figura 6.4 - A e B: Aspecto de colônias de C. neofromans isoladas em placas de
Petri após processamento dos tatuzinhos.
Devido o processamento ter sido modificado para estas amostras, não foi
possível o cálculo de UFCs/g. Entretanto o processamento de 2 animais (tatuzinhos
A B
76
A) em 2 ml de solução fisiológica resultou na contagem de 3.099 UFCs com média
de 238,38 UFCs por placa. O processamento de 3 animais (tatuzinhos B) em 2 ml de
solução fisiológica resultou na contagem de 3.215 UFCs com média de 247,31 por
placa. Na Tabela 6.5 evidencia-se o substrato e densidade de colônias estimadas
neste caso índice. Os tatuzinhos foram identificados como Cubaris murina Brandt,
1833, pertencente ao Filo Arthropoda, classe Crustacea, Ordem Isopoda, família
Armadillidae.
Tabela 6.5 - Distribuição de Cryptococcus neoformans de acordo com o tipo de
substrato, e UFC/g relativos ao caso-índice 2.
TIPO DE AMOSTRAS Nº DE ANIMAIS Nº DE COLÔNIAS
ISOLADAS
DENSIDADE
UFC/G
Tatuzinho A 2 6 238,38*
Tatuzinho B 3 31 247,31*
Raspado de madeira - 9 2,74 x 104
*Média UFC/placa
6.4.3 Caso índice 3
Caso 3: Paciente do sexo feminino, 33 anos, militar, com criptococose por C. gattii,
proveniente do bairro do Jurunas em Belém, morando no local há 25 anos. A
paciente era portadora de lúpus eritematoso sistêmico (LES), diagnosticado em
2003, em tratamento com altas doses de corticosteróides. Esteve internada em
vários períodos a partir de novembro de 1985. A identificação do fungo C. gattii foi
obtida em janeiro/2004. Relatou que participava de missões em áreas de mata
invadida, no sul do Estado do Pará. O local de seu domicílio impressionava pelo
aglomerado de casas de poucos cômodos, predominantemente de madeira,
contíguas e muito próximas (Figuras 6.5 a 6.8) em ambiente extremamente úmido.
Na realidade a sua residência está inserida em uma comunidade que pode ser
caracterizada como uma favela na proximidade de portos e muitas madeireiras.
Tratada com antifúngicos no HUJBB a paciente recuperou-se com seqüelas graves,
para continuar o tratamento do LES em regime ambulatorial. Algum tempo após as
nossas visitas ao domicílio veio a falecer.
77
Figura 6. 5 - Aspecto externo do peridomicílio relativo ao caso-índice 3.
Figura 6.6 - Aspecto externo de casa da mãe e vizinha à casa da paciente (caso-
índice 3) com positividade para C. neoformans e C. gattii.
78
Figura 6.7 - Detalhe da porta de entrada do domicílio da paciente (caso-índice 3),
presença de basidioma.
Figura 6.8 - Entrada da vila onde foram obtidos isolados ambientais de C.
neoformans e C. gattii relativos ao caso-índice 3.
79
Dezesseis das 37 amostras ambientais processadas (43%) foram positivas.
Entretanto, devido ao elevado nível de contaminação por fungos filamentosos, em
apenas 11 foi conseguido isolamento de colônias puras (Tabela 6.6). Foi obtido o
isolamento de C. neoformans de alguns ambientes a partir de madeira em
decomposição e poeira de mais dois domicílios próximos (controle). Ambas as
espécies, C. neoformans e C. gattii, foram isoladas do mesmo ambiente, em poeira
intradomiciliar de dois domicílios vizinhos (controle), sendo um destes da mãe da
paciente. Cryptococcus gattii também foi encontrado isoladamente em poeira
intradomiciliar coletada no primeiro andar do domicilio da mãe da paciente (domicílio
controle).
80
Tab
ela
6.6
- D
istr
ibuiç
ão
dos
isola
dos
de C
. neoform
ans e
C. gattii
obtid
os
do d
om
icíli
o d
o c
aso
-índ
ice 3
e d
om
icíli
os
contr
ole
s, d
e
aco
rdo
com
o
tipo
de
subst
rato
, d
omic
ílio
(paci
ente
ou
co
ntr
ole
)/am
bie
nte
, es
péci
e
isola
da,
UF
C/g
e
núm
ero
d
e co
lôn
ias
analis
adas
.
CÓ
DIG
O
AM
OS
TR
A
TIP
O D
E S
UB
ST
RA
TO
D
OM
ICÍL
IO /
LO
CA
L D
E
CO
LE
TA
ES
PÉ
CIE
IS
OL
AD
A
UF
C/g
IS
OL
AD
OS
AN
AL
ISA
DO
S
3-4
M
adeira
em
deco
mpos
ição
Paci
ente
/dor
mitó
rio
C. neoform
ans
5,1
95x1
04
10
3-5
M
adeira
em
deco
mpos
ição
Paci
ente
/dor
mitó
rio
C. neoform
ans
2,1
7x1
04
14
3-6
P
oeira
intr
adom
icili
ar
Paci
ente
S
em is
ola
ment
o
3,5
x104
0
3-1
1
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 4
/D
MC
4
C. neoform
ans
4,0
x102
2
3-1
5
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 1
/ D
MC
1
C. neoform
ans e C. gattii
3,7
x10
3
25
3-1
7
Poeira
em
pare
de
de
mad
eira
Viz
inho 1
/ D
MC
1
C. neoform
ans
5,0
x10
1
3-2
2
Poeira
intr
adom
icili
ar
Paci
ente
/dor
mitó
rio f
ilhos
S
em is
ola
ment
o
2 x
102
0
3-2
4
Poeira
intr
adom
icili
ar
Paci
ente
– c
ozi
nha
C. neoform
ans e C. gattii
1,5
x102
2
3-3
1
Madeira
em
deco
mpos
ição
Viz
inho 4
/quin
tal-
DM
C4
Sem
isola
ment
o
5,0
x10
0
3-3
2
Poeira
+ c
upim
V
izin
ho 1
/ D
MC
1
C. neoform
ans e C. gattii
2,1
x 1
03
17
3-3
3
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 4
/ a
ltos
– D
MC
4
C. neoform
ans e C. gattii
7,5
x 1
03
62
3-3
4
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 4
/andar
de
baix
o -D
MC
4
C. gattii
1,4
x 1
03
3
3-3
5
Poeira in
tradom
icili
ar
Viz
inho 2
/ D
MC
2
Sem
isola
ment
o
1,5
x 1
02
0
3-3
6
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 1
/ D
MC
1
C. neoform
ans
5,0
x 1
02
2
3-3
7
Madeira
em
deco
mpos
ição
Viz
inho 1
/ D
MC
1
C. neoform
ans e C. gattii
5 x
102
10
3-3
8
Poeira
intr
adom
icili
ar
Viz
inho 3
/ D
MC
3
Sem
isola
ment
o
3 x
102
0
DM
C=
dom
icíli
o c
ont
role
.
81
6.4.4 Caso índice 4
Caso 4: Paciente do sexo masculino, 47 anos, eletricista, residente no bairro de
Coqueiro, município de Ananindeua, há três anos. Apresentou qudro de meningite
em dezembro de 2002 sendo diagnosticado através de pesquisa de fungos em LCR
e látex. Após tratamento recebeu alta em 2003. Residência em alvenaria com piso
em cerâmica, sem forro, seis cômodos. Condomínio fechado, de classe média. O
paciente fazia vistoria técnica da companhia de eletricidade em vários bairros, e
relatou a presença de pombos próximos ao local de trabalho no centro da cidade de
Belém e no domicílio chegou a criar pombos por aproximadamente 15 anos na
antiga residência. Recuperou-se com seqüelas (perda de visão e audição). Tem sítio
com muitas árvores em balneário próximo a Belém. Domicílio bem cuidado, limpo,
boa ventilação e iluminação. Domicílios vizinhos consistiram de um terreno com
mato, casa e obra em alvenaria. Domicílios e peridomicílios (caso e controles)
negativos para Cryptococcus.
6.4.5 Caso índice 5
Caso 5: Paciente do sexo feminino, 59 anos, residente no bairro do Coqueiro,
município de Ananindeua. Originária de Quatipuru reside em Ananindeua há mais de
13 anos. A paciente é diabética, hipertensa e portadora de LES e adoeceu de
meningite em 2003, cujo fungo foi isolado e identificado como C. gattii. Após várias
internações, evoluiu para óbito. Casa de alvenaria, quatro cômodos, piso em
cerâmica com cozinha cimentada, localizada em rua asfaltada. Ventilação e
iluminação ruim, sem janelas laterais. Presença de árvores frutíferas no quintal,
caixa d’água e cercado de madeira. Domicílios vizinhos em madeira. Domicílios e
peridomicílios (caso e controles) negativos para Cryptococcus.
6.4.6 Caso índice 6
Caso 6: Paciente do sexo feminino, 28 anos, HIV+, bairro Montese, em Belém. Deu
entrada no HUJBB em maio/2004 evoluindo para óbito e o diagnóstico foi realizado
através de pesquisa de fungos em LCR com teste do látex no LCR também foi
positivo. Pesquisa paralela permitiu o isolamento do fungo que foi identificado como
C. neoformans. A paciente morava com mãe na época da doença. Casa em
madeira 2 pavimentos com 8 cômodos,uma parte de piso em cerâmica e outra em
terra., Telhado de amianto, sem forro, localizado em área de invasão, ruas sem
asfaltamento, condições de saneamento inadequadas. A mãe acha que ela contraiu
82
meningite no hospital. Presença de galinha, cachorro e coelho. Domicílios e
peridomicílios (caso e controles) negativos para Cryptococcus.
6.4.7 Caso índice 7
Caso 7: Paciente do sexo masculino, 65 anos, marceneiro, com meningite por C.
neoformans, residente no bairro Batista Campos, em Belém. Deu entrada no HUJBB
em feveriro/2004 evoluindo para óbito. Diagnóstico foi realizado através de pesquisa
de fungos em LCR. Casa de dois pavimentos, com cinco cômodos, construída em
madeira, algumas paredes externas com deterioração (Figuras 6.9 e 6.10). Piso de
tábua, sem forro e telhado de barro, aparentemente limpa, porém com ventilação e
iluminação razoáveis. A filha relatou que o mesmo tinha uma marcenaria, onde vivia
em permanente contato com poeira constituída principalmente de raspas de madeira
e pó de serra. Foram coletadas no local 13 amostras, constituídas de restos de
madeira, e tatuzinhos que estavam junto à madeira empilhada. Duas amostras
sendo uma de madeira em decomposição e outra de poeira intradomiciliar
mostraram colônias fenoloxidades positivas, porém só de uma amostra de poeira
intradomiciliar foi obtido isolamento de C. neoformans e C. gattii (Tabela 6.7).
Figura 6.9 - Aspecto externo junto ao domicílio do paciente (caso-índice 7), observar
presença de basidiomicetos.
83
Figura 6.10 - Aspecto externo de domicílio de paciente (caso-índice 7) com
criptococose neoformans, ao fundo, cuja poeira foi positiva para C.
neoformans e C. gattii.
Tabela 6.7 - Número de isolados e densidade de colônias fenoloxidase positivas, de
acordo com o tipo de substrato, relativos ao caso-índice 7.
FONTE DE ISOLAMENTO COLÔNIAS
ISOLADAS
DENSIDADE
UFC/g
Madeira em decomposição 0 5,0 x 10
Poeira intradomiciliar 16 5,25 x 103
84
6.4.8 Caso índice 8
Caso 8: Paciente do sexo masculino, 31 anos, HIV+, com meningite por C.
neoformans, diagnosticado por pesquisa de fungos positiva em LCR. Foi internado
em outubro/2003 evoluindo para óbito, residente no bairro da Pedreira em Belém. O
domicílio estava fechado desde o falecimento do paciente. Casa de madeira, piso de
tábua, telha de barro. Não foi possível o acesso ao interior da casa. Domicílios
vizinhos compartilhando o mesmo terreno, e pelo menos dois deles pertencentes a
familiares do paciente. Uma casa na frente de alvenaria e as outras de madeira.
Foram coletadas duas amostras da parte externa do domicílio do paciente e o
restante dos domicílios vizinhos, constituídas de poeira e madeira. A partir de uma
amostra de poeira intradomiciliar da casa de um primo (domicílio controle) foi isolado
C. neoformans (Tabela 6.8). Os demais domicílios-controle foram negativos para
Cryptococcus.
Tabela 6.8 - Distribuição de Cryptococcus spp. de acordo com o tipo de substrato,
espécie isolada e UFC/g relativos ao caso-índice 8.
FONTE DE ISOLAMENTO ESPÉCIE
ISOLADA
COLÔNIAS
ISOLADAS
DENSIDADE
UFC/g
Poeira intradomiciliar de
domicílio controle
C. neoformans 10 6,0 x 103
6.5 ANÁLISE DOS ISOLADOS QUANTO À FONTE DE ISOLAMENTO,
DISTRIBUIÇÃO
A freqüência de contaminação domiciliar e/ou peridomiciliar dos substratos
ambientais dos quais foi isolado o fungo, estão representados na Tabela 6.9.
Cryptococcus neoformans foi isolado de: i) quatro amostras de poeira intradomiciliar;
ii) duas amostras de artrópodes (Cubaris murina), denominados vulgarmente como
tatuzinhos de jardins; e iii) três amostras de madeira em decomposição, perfazendo
um total de 9 amostras ambientais, correspondente a 4,84 % do total de amostras
processadas. Cryptococcus gattii foi isolado de uma amostra de poeira
intradomiciliar, representando 1,89 % de positividade de amostras desta natureza e
0,54 % do total de amostras processadas. Por outro lado, ambas as espécies, C.
neoformans e C. gattii, compartilhando um mesmo substrato, foram isoladas de: i)
cinco amostras de poeira intradomiciliar, correspondendo a 9,43 % das amostras
85
deste material; e ii) uma amostra de madeira em decomposição, correspondente a
1,03% de amostras desta natureza. Amostras de cascas, ocos e troncos de árvores
em decomposição, fragmentos vegetais e algumas amostras de excretas animais
não apresentaram positividade.
86
Tab
ela
6.9
- F
reqüê
ncia
de
Isola
ment
o de Cryptococcus neoform
ans e
C. gattii
de
aco
rdo
com
o m
ate
rial
analis
ado.
AM
OS
TR
AS
PO
SIT
IVA
S
AM
OS
TR
AS
AM
BIE
NT
AIS
Nº
DE
AM
OS
TR
AS
C. neoform
ans
C. gattii
C. neoform
ans e C. gattii
TO
TA
L
N
%
N
%
N
%
N
%
Poei
ra in
trad
om
icili
ar
* 53
4
7,5
5 1
1,8
9 5
9,4
3
10
18,
87
Art
róp
odes
9 2
22,2
2
0 0,0
0 0
0,0
0
2
22,
22
Ma
deir
a em
deco
mpo
siçã
o
97
3
3,0
9 0
0,0
0 1
1,0
3
4
4,1
2
Árv
ore
s (c
asca
, tr
onc
o)
17
0
0,0
0 0
0,0
0 0
0,0
0
0
0,0
0
Oco
de á
rvor
e
9 0
0,0
0 0
0,0
0 0
0,0
0
0
0,0
0
Exc
reta
s d
e galin
ha
1 0
0,0
0 0
0,0
0 0
0,0
0
0
0,0
0
TO
TA
L 18
6 9
4,8
4 1
0,5
4 6
3,2
3
16
8,6
0
* In
clui
subst
rato
s div
ers
os
N=
núm
ero
de a
mos
tras
posi
tivas
87
6.6 CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DOS ISOLADOS
Embora 22 (11,8%) das 186 amostras ambientais coletadas nos domicílios
produzissem colônias fenoloxidase positivas (Figura 6.11), suspeitas de C.
neoformans ou C. gattii, conseguiu-se o isolamento de colônias puras, de apenas 16
(8,6%) das amostras. Algumas foram processadas 2 vezes, mas a presença de
outros fungos contaminantes, notadamente Zygomycetes, não permitiram o
isolamento.
Figura 6.11 - Aspecto de colônias fenoloxidase positivas (marrons), sugestivas
de C. neoformans ou C. gattii.
Na figura 6.12 observa-se que das 16 amostras positivas com isolamento, a
fonte ambiental com maior positividade foi poeira intradomiciliar, com 62% (n=10) do
total de amostras positivas, seguido de madeira em decomposição, 25% (n=4).
88
4; 25%
10; 62%2; 13%
Poeira intradomiciliar Artrópodes Madeira em decomp.
Figura 6.12- Percentual de amostras positivas com isolamento de C. neoformans
e/ou C. gattii.
No total foram isoladas 220 colônias, positivas para síntese de melanina,
sensíveis a cicloheximida e termotolerantes a 37ºC. Todos os isolados foram
submetidos ao teste de CGB, cujos resultados estão demonstrados na Tabela 6.10 e
Figura 6.13, onde se destaca o predomínio de C. neoformans com 169 isolados
sobre C. gattii com 51 isolados. Maior número de isolados tanto de C. neoformans
quanto de C. gattii foram recuperadas de amostras ambientais oriundas do caso
índice 3.
Tabela 6.10 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii identificados pelo teste de
CGB de acordo com os casos-indice.
CASO-
ÍNDICE
C. neoformans C. gattii TOTAL DE
ISOLADOS
%
2 46 0 46 20,91
3 105 43 148 67,27
7 8 8 16 7,27
8 10 0 10 4,55
TOTAL 169 51 220 100
89
Figura 6.13 - Freqüência de C. neoformans e C. gattii, de acordo com o caso-índice identificados pelo teste de CGB.
6.7 ANÁLISE MOLECULAR
6.7.1 Tipo sexuado
Todos os isolados foram estudados quanto ao tipo sexuado, cujos resultados
são apresentados na Tabela 6.11 e Figura 6.14. De um total de 169 isolados de C.
neoformans 99 pertencem ao tipo sexuado MAT α, e 70 são MAT a, enquanto dos
isolados de C. gattii 1 foi MAT αa e o restante foram MAT α (n=50). Observa-se
ainda que C. neoformans MAT α foi isolado de amostras ambientais referentes aos
casos-índice 3, 7 e 8; C. neoformans MAT a de amostras referentes aos casos-
índice relativos 2 e 3 e C. gattii MAT α referentes aos casos-índices 3 e 7 e MAT αa
do caso-indice 3. Em percentuais foram 45% de C. neoformans MAT α, seguido de
C. neoformans MAT a com 31,8%%, C. gattii MAT α com 22,7% e C. gattii MAT αa
com 0,5% do total de isolados (Figura 6.15).
Tabela 6.11 - Distribuição dos isolados de C. neoformans e C. gattii quanto ao tipo sexuado e caso-índice.
C. neoformans C. gattii TOTAL CASO ÍNDICE MAT α MAT a MAT α MAT αa
2 0 46 0 0 46
3 81 24 42 1 148
7 8 0 8 0 16
8 10 0 0 0 10
TOTAL 99 70 50 1 220
46
0
105
43
8 8 10 0
0
20
40
60
80
100
120
2 3 7 8
C neoformans
C gattii
90
Figura 6.14 - Distribuição do tipo sexuado dos isolados de acordo com o caso-
índice.
Figura 6.15 - Percentual de C. neoformans e C. gattii de acordo com o tipo sexuado
Em relação à fonte de isolamento, a Tabela 6.12, mostra que C. neoformans
MAT α foi isolado de poeira domiciliar (n=98) e madeira em decomposição (n=1), C.
neoformans MAT a de artrópodes (n=37) e raspado de madeira ou madeira em
decomposição (n=33) e C. gattii MAT α de poeira intradomiciliar (n= 41) e madeira
em decomposição (n=9) e um isolado MAT αa de poeira intradomiciliar. Na figura
6.16 está demonstrado o perfil eletroforético de alguns isolados ambientais MAT α e
MAT a.
0
46
0 0
81
24
42
1
8
0
8
0
10 0 0
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
2 3 7 8
C neoformans Matα
C neoformans Mat a
C gattii Matα
C. gattii Matαa
45,0%
31,8%
22,7%
0,5%
C neoformans Matα
C neoformans Mat a
C gattii Matα
C. gattii Matαa
91
Tabela 6.12 - Distribuição do tipo sexuado de acordo com a fonte de isolamento. TIPO SEXUADO N (%) FONTE DE
ISOLAMENTO C. neoformans
MAT α
C. neoformans
MAT a
C. gattii
MAT α
C. gattii
MAT αa
TOTAL
Poeira
intradomiciliar*
98 (45,55) 0 41(18,64) 1 (0,45) 140
Artrópodes 0 37 (16,82) 0 0 37
Madeira em
decomposição
1 (0,45) 33 (15) 9 (4,09) 0 43
TOTAL 99 70 50 1 220
*Inclui diversos substratos
N= número de isolados
Figura 6.16 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo sexuado
com primers MATα1- MATα2 e MAT a1- MAT a2 de seis isolados ambientais de C.
neoformans da região metropolitana de Belém/Pará, por PCR. Linhas – 1 e 11: Peso
molecular; 2: PA11; 3: PA6; 4: PA36; 5: ATCC 28957 padrão MATα; 6: ATCC 28958 padrão
MATa; 7: PA 134; 8: PA 102; 9: PA 158; 10: Controle negativo.
6.7.2 Análise da tipagem molecular
Os isolados foram analisados por PCR-RFLP, para determinação do tipo
molecular. A Tabela 6.13 apresenta os dados resultantes da análise, onde se verifica
que 3 tipos moleculares foram determinados VNI, VNIV e VGII.
92
Tabela 6.13 – Perfil dos isolados ambientais após caracterização dos tipos
moleculares analisados por PCR-RFLP.
CASO-ÍNDICE E
AGENTE ETIOLÓGICO
C. neoformans C. gatti Tipagem molecular
2 (C. gattii) 46 0 VNIV
3 (C. gattii) 105 43 VNI, VNIV e VGII
7 (C.neoformans) 8 8 VNI e VGII
8 (C.neoformans) 10 0 VNI
Os genótipos determinados em 220 isolados corresponderam a 99 (45%) de
VNI, 70 (32%) de VNIV e 51 (23%) de VGII, conforme Tabela 6.14 e Figura 6.17.
Tabela 6.14 - Distribuição dos genótipos identificados por caso-índice.
GENÓTIPO CASO-
ÍNDICE VNI VNIV VGII
TOTAL
2 0 46 0 46
3 81 24 43 148
7 8 0 8 16
8 10 0 0 10
TOTAL 99 70 51 220
Figura 6.17 - Percentual dos isolados analisados conforme tipo molecular.
Em relação à fonte de isolamento o genótipo VNI foi recuperado de poeira
intradomiciliar e madeira em decomposição, VNIV foi isolado de madeira em
45%
32%
23%
VNI
VNIV
VGII
93
decomposição e tatuzinhos, e VGII de poeira intradomiciliar e madeira em
decomposição (Figura 6.18).
Figura 6.18 - Distribuição dos genótipos de acordo com a fonte de isolamento.
O perfil eletroforético obtido por PCR/RFLP de alguns isolados de C.
neoformans e C. gattii são representados na Figura 6.19.
Figura 6.19 - Eletroforese em gel de agarose ilustrando a identificação do tipo molecular
(VNIV, VGII e VNI) de alguns isolados ambientais (PA 16 a PA 214) de C. neoformans e C.
gattii da região metropolitana de Belém/Pará, obtidos por PCR/RFLP. Padrões (VNI-VNIV e
VGI-VGIV) estão representados pelos isolados LMM 794 a LMM 801.
98
0
42
0
37
0 1
33
9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Poeira intradomiciliar Artrópodes Madeira em decomp.
VNI
VNIV
VGII
94
No apêndice 1 são apresentados dados referentes ao substrato, tipo sexuado
e tipo molecular de cada isolado, identificados por códigos utilizados nas figuras 6.16
e 6.19.
95
7. DISCUSSÃO
A criptococose e seus agentes têm sido bastante estudados no decorrer das
últimas décadas em virtude do advento da aids o que provocou um aumento drástico
das infecções oportunísticas entre as quais a criptococose, notadamente a causada
pela espécie C. neoformans. Diversas investigações têm sido reportadas
contribuindo para uma melhor compreensão do comportamento eco-epidemiológico
de ambas as espécies: C. neoformans e C. gattii, mas muitos aspectos de sua
ecologia, mecanismo de infecção, fatores de virulência, sexualidade e estrutura
populacional ainda permanecem obscuros.
Em relação às amostras ambientais coletadas aleatoriamente em lojas de
venda de pássaros e algumas árvores ornamentais de ruas da cidade de Belém,
alguns aspectos merecem destaque.
Não obstante a investigação ter sido realizada com um número pequeno de
amostras, os resultados obtidos foram relevantes devido à escassez de informações
referentes a estes importantes agentes na região Norte do Brasil. Os resultados
registraram pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans sorotipo A, MATα,
genótipo VNI em excretas de aves, bem como C. neoformans sorotipo A, MATα,
genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MATα, VGII compartilhando o mesmo oco de
Senna siamea na cidade de Belém.
A ubiqüidade de C. neoformans sorotipo A é bem documentada e tem sido
isolado da maioria dos casos de aids no Brasil (ROZENBAUM et al., 1992, CASALI
et al., 2003) e no mundo (MITCHELL & PERFECT, 1995; BICANIC & HARRISON,
2005). Todos os isolados deste trabalho foram MATα e mostram concordância com
literatura mundial que relata a ocorrência de isolados MATα com marcante
predomínio sobre os isolados MATa, clínicos ou ambientais (KWON-CHUNG &
BENNETT, 1978).
Estudo global com cepas de diversos países mostrou que os tipos
moleculares VNI e VGI são os genótipos mundialmente predominantes (MEYER et
al., 1999; BOEKHOUT et al., 2001), embora a América Latina apresente perfil
diferente para C. gattii (MEYER et al., 2003; ESCANDÓN et al., 2006). No Brasil,
Lugarine et al. (2008) identificaram predominância de VNI em excretas de aves
(Passerine e Psittacine) no Paraná. No Rio Grande do Sul, Casali et al. (2003)
registraram VNI em excretas de pombos e VNIV em amostras de Eucaliptus spp.
96
O primeiro registro de C. gattii de origem ambiental na região Norte foi
documentado por Fortes et al. (2001), isolado a partir de Guetarda acreana, em uma
área de mata virgem no estado de Roraima. O isolamento de C. neoformans e C.
gattii compartilhando o mesmo oco foi registrado pela primeira vez em Teresina/PI
em Cassia grandis, sugerindo um possível elo entre seus ciclos biológicos na
natureza (LAZÉRA et al., 2000). Também Fortes (2001) relata o isolamento de
ambas as espécies a partir de oco de Adenanthera pavonina, em Boa Vista/RR. Este
evento não tem sido comumente registrado na literatura e, portanto, chama a
atenção que estes relatos tenham sido observados nas regiões Norte e Nordeste do
Brasil, as quais têm demonstrado diferenças epidemiológicas reveladas pela elevada
prevalência de C. gattii, em pacientes destas regiões (CORRÊA et al., 1999;
CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003, NISHIKAWA et al. 2003), em contraste com
os relatos das regiões Sul e Sudeste, onde predomina C. neoformans.
O papel das árvores no ciclo biológico de C. neoformans ou C. gattii não está
devidamente esclarecido, mas a consistente associação de C. gattii com madeira em
decomposição tem sido demonstrada o que levou a sugestão de uma existência
endofítica em comum com outros Basidiomycetes degradadores da madeira (Sorrell,
2001). Entendemos que a presença de C. gattii e C. neoformans em oco de árvore
viva demonstra uma relação saprobiótica e conforme postula Lazéra (2000) C.
neoformans ou C. gattii e seus teleomorfos estão possivelmente associados com
madeira em decomposição e participando na sucessão ecológica dos agentes
decompositores de substratos lignificados. Esta interpretação é consistente com a
classificação do fungo na ordem Tremellales e a presença da enzima lacase
produzida por estas espécies. Segundo Sorrell, (2001) a lacase dos Basidiomycetes
degrada e mineraliza a lignina dentro da superfície interna da madeira em
decomposição que se comunica com o cerne rígido da árvore viva.
É interessante observar que as nossas amostras ambientais do oco de árvore
foram coletadas no mês de maio/2002, cujas médias de temperatura e umidade
corresponderam a 26,7ºC e 85%, respectivamente, e as amostras de habitats de
pássaros foram coletadas no mês de março/2003, com médias de 26,1ºC e 89%,
respectivamente. Estes resultados não permitem sugestões conclusivas sobre a
influência das condições climáticas, mas sugerem que ambas as espécies estão
bem adaptadas às condições de temperatura e umidade altas. Estudos realizados
em várias regiões da Colômbia sugerem que fatores climáticos, principalmente
umidade, temperatura, evaporação e radiação solar podem afetar a ocorrência dos
97
diferentes sorotipos de Cryptococcus spp. em diferentes espécies de árvores
(GRANADOS & CASTAÑEDA, 2006).
As excretas de aves são consideradas o substrato natural mais comumente
associado a C. neoformans, mas o papel das aves na disseminação do fungo no
ambiente ainda não está bem esclarecido, mesmo com um número considerável de
investigações sobre o tema. Pombos e outras aves podem transportar C.
neoformans em seus bicos, garras, pernas e penas (KOWN-CHUNG & BENNETT,
1992). Swinne-Desgain, 1994 apud Casadevall & Perfect, (1998) estudando pombos
na Bélgica isolaram C. neoformans de papos de 50% destas aves e concluíram que
os mesmos são reservatórios do fungo. Os pombos são resistentes à infecção por
inoculação via gastrintestinal e intramuscular, mas a infecção pode ser induzida por
via intracerebral ou ocular. Esta resistência pode ser em função da alta temperatura
corporal, inibidora de C. neoformans (41 a 43ºC) e a presença da microbiota
bacteriana intestinal (CASADEVALL & PERFECT, 1998). Por outro lado, Sorrell &
Ellis (1997) consideraram improvável que os pombos sejam a principal fonte de C.
neoformans na natureza, pois são encontrados em baixa concentração em vários
sítios anatômicos pesquisados. As informações disponíveis sugerem que, embora
infectados em seus papos, os pombos sejam resistentes à infecção disseminada. No
entanto, podem contribuir para a propagação do fungo por possibilitarem ao mesmo
um meio rico e propício ao seu desenvolvimento na forma de excretas e podem
transportá-los em seus bicos e pés (CASADEVALL & PERFECT, 1998).
A presença de C. neoformans e C. gattii nos habitats apresentados pode
indicar uma contaminação externa e transitória, entretanto, conforme ressaltam
Lazéra et al. (1993), estes microambientes não representam apenas uma proteção
contra a luz solar, mas também são fontes de matéria orgânica, constituindo um
habitat adequado para a sobrevivência e colonização destes fungos.
No presente estudo foram analisadas amostras ambientais de domicílios e
peridomicílios relacionadas à pacientes com criptococose e residentes na região
metropolitana de Belém. A partir da análise de 186 amostras ambientais, sendo 103
coletadas em domicílio de pacientes e 83 em domicílios vizinhos (controle), 22
apresentaram positividade para C. neoformans e/ou C. gattii, com isolamento de 220
colônias. Considerando a relação casos-índice versus positividade observou-se que
dos oito casos-índice selecionados, (em um destes só se efetivou coletas no entorno
e domicílios controles), obteve-se positividade em 4 (50%) dos casos-índices
estudados. Este percentual relativamente alto é relevante considerando-se que o
98
número de domicílios estudados foi pequeno; além disso, é superior ao encontrado
por outros autores, inclusive em número de isolados. Assim, em estudo de 824
amostras ambientais coletadas em 154 domicílios de pacientes residentes na região
metropolitana do Rio de Janeiro/RJ, Passoni et al. (1998) isolaram 37 colônias de C.
neoformans em 20 (13%) domicílios. Em outro estudo similar Cavalcanti (1997)
estudou 39 domicílios, encontrando positividade em 8 (21%), para C. neoformans e
C. gattii, sendo 4 domicílios em Teresina (PI), 1 em Açailândia (MA), 1 em Barra da
Corda (MA) e 1 em Coroatá (MA). Machado et al. (1993), após inquérito com
pacientes sobre possível contato com pombos, analisaram 59 amostras de solo
misturadas com excretas de pombos, penas e material orgânico proveniente de 16
sítios apontados pelos pacientes e detectaram positividade em 5 (8,5%). Em um dos
casos, o sorotipo A de C. neoformans isolado de LCR foi coincidente com o sorotipo
das amostras isoladas do centro de Porto Alegre, local apontado pelo paciente como
possível fonte de infecção.
A relação entre domicílio contaminado por C. neoformans e pacientes com
aids e criptococose foi mencionada por Passoni et al. (1998), que detectaram maior
positividade em domicílios de pacientes com criptococose associado a aids (15,6%),
ao passo que nos domicílios de pacientes sem criptococose e com aids detectou
8,9% e nos domicílios de pacientes sem criptococose e sem aids a positividade foi
14,3%. No presente estudo, dois domicílios de pacientes com aids não
apresentaram positividade, mas o fungo foi detectado em amostras provenientes de
domicílios vizinhos de um destes casos. Na África Central, onde a prevalência da
criptococose associada a aids é elevada (BICANIC & HARRISON, 2005; MITCHELL
& PERFECT, 1995) C. neoformans foi isolado de 7 domicílios de 20 pacientes com
criptococose associada a aids (SWINNE et al., 1989), sugerindo a importância do
acompanhamento do paciente “curado”, que facilmente pode ser re-infectado após a
alta hospitalar e seu retorno a casa.
O principal fator associado com contaminação domiciliar por C. neoformans
apontado por Passoni et al. (1998) foi a presença de criação de aves no ambiente
domiciliar. O papel das aves na ecologia de C. neoformans tem sido bastante
discutido em várias investigações, embora muitos aspectos ainda permaneçam
obscuros. Muitos estudos mostram a associação direta do fungo com as excretas de
aves, predominantemente de pombos. A elevada concentração de C. neoformans
em excretas de pombos (RUIZ et al., 1981) e a alta prevalência de pombos em
grandes centros urbanos demonstram consistentemente a possibilidade de
99
continuada exposição humana ao fungo. Entretanto, apesar de todas as evidências
disponíveis, faltam provas definitivas quanto à aquisição da infecção a partir deste
substrato.
Na tentativa de correlacionar os isolados ambientais com isolados obtidos de
pacientes têm sido utilizadas diversas técnicas de tipagem molecular. O primeiro
estudo foi desenvolvido por Currie et al. (1994) que, através da técnica de RFLP,
analisaram isolados clínicos e ambientais de Nova York e identificaram duas
linhagens de origem clínica e ambiental com relação genética. Yamamoto et al.
(1995) utilizando o método de RAPD, detectaram em duas localidades de Nagasaki
dois isolados ambientais fortemente relacionados com dois isolados clínicos,
sugerindo que a mesma linhagem pode ser encontrada em amostras clínicas e
ambientais em determinada área geográfica. Franzot et al., (1997) utilizaram RFLP
com elementos repetitivos CNRE-1 e outros métodos de tipagem molecular que
demonstraram evidências de ligação entre alguns isolados brasileiros obtidos de
excreta de pombos e de pacientes. Contrastante com estes dados, Varma et al.
(1995), através da técnica de RFLP com sonda UT-4p, não detectaram nenhuma
correlação entre cepas de pacientes com aids e sem aids e ambientais. Nos
domicílios analisados em nosso estudo não foi registrada a presença de pombos,
nem foi evidenciada a presença de excretas destas aves, ainda que na região
metropolitana de Belém e em outros centros urbanos (MONTENEGRO & PAULA,
2000; REOLON et al., 2004), principalmente nas áreas mais antigas, apresentem
grandes conglomerações destas e outras aves. Casadevall & Spitzer (1995)
sustentam que a utilização de técnicas moleculares como RFLP com elementos
repetitivos CNRE-1 e sonda UT-4p bem como cariotipagem eletroforética são
altamente discriminatória para métodos de tipagem molecular e seu uso por diversos
autores tem sugerido que a recorrência da criptococose nos casos estudados foi
devido à persistência do isolado inicial, ou seja, uma reativação.
O presente estudo mostra que, embora o substrato predominantemente
coletado tenha sido madeira em decomposição (n=97), foi da poeira intradomiciliar
(n=53) que se obteve maior positividade para Cryptococcus spp., com 10 amostras
positivas. É preciso considerar que esta positividade é subestimada, visto que mais
quatro amostras de poeira intradomiciliar apresentaram colônias fenoloxidase
positivas, entretanto, o alto grau de contaminação não permitiu o seu isolamento e
subseqüente perfeita caracterização fenotípica e genotípica. Muitas das amostras
apresentavam grande contaminação por espécies de Mucorales e Trichoderma spp.
100
O isolamento de C. neoformans de poeira domiciliar associada ou não à
presença de aves domésticas tem sido reportado por muitos autores. Além de
Passoni et al. (1998), um estudo epidemiológico registrou o isolamento de C.
neoformans a partir de poeira doméstica em 54% de domicílios de pacientes com
aids e 20% de domicílios aleatoriamente selecionados em Bumjumbura, Burundi
(SWINNE et al., 1991). Cavalcanti (1997) isolou C. neoformans de 5 amostras
constituída de poeira + solo intradomiciliar. Os dados aqui apresentados mostram
que a partir de 53 amostras de poeira intradomiciliar C. neoformans foi isolado de 4
amostras, C. gattii de uma amostra e ambas as espécies foram isoladas de outras 5
amostras. De acordo com o que foi encontrado na literatura, este parece ser o
primeiro registro de C. gattii neste tipo de substrato, bem como o primeiro relato de
compartilhamento de ambas as espécies em poeira intradomiciliar. De uma maneira
geral, as amostras de poeira consistiam de vários substratos, uma vez que foram
obtidas da varrição do domicílio no momento da visita. Em geral, estes substratos
consistiam de areia, às vezes pêlos de animais, cabelo, cupins, formigas e outros
detritos. Cabe ressaltar que todas estas amostras foram coletadas em residências
de madeira, muitas vezes com partes da edificação em decomposição. Estes
achados representam um novo aspecto no estudo da ecologia de C. gattii e
evidenciam que indivíduos podem estar em exposição contínua com o agente no
próprio ambiente domiciliar, o que impõe uma maior preocupação pela presença do
fungo em material facilmente aerossolizável e ao alcance de hospedeiros
suscetíveis.
O segundo tipo de substrato com maior positividade era constituído de restos
de madeira em decomposição, coletados em alguns casos do próprio domicílio do
paciente e/ou de domicílio controle. Diferente do esperado nas amostras de madeira
observou-se predominância de C. neoformans. Apenas uma amostra continha as
duas espécies neste substrato. Por outro lado, estes resultados reforçam a hipótese
de Lazéra et al. (2000) de que o nicho primário, tanto de C. neoformans quanto de
C. gattii, é de origem vegetal em decomposição.
A maioria dos estudos descreve C. gattii associado a vegetais e, embora
tenha habilidade para utilizar creatinina como fonte de Nitrogênio, esta levedura não
tem sido isolada de excretas de aves. Em nosso estudo C. gattii foi isolado de 6
amostras de poeira intradomiciliar, sendo 5 referentes ao caso índice 3 e uma
referente ao caso índice 7. Esperava-se a ocorrência de C. gattii em detritos de
madeira, no entanto, foi mais freqüentemente isolado de amostras de poeira
101
intradomiciliar. Por outro lado, como já foi ressaltado, as residências com poeira
positiva eram todas construídas em madeira.
Há um consenso geral de que a maioria das infecções por Cyptococcus spp.
são adquiridas por inalação de propágulos infectivos. Células da levedura
capsuladas do tipo encontrada em culturas laboratoriais são consideradas
excessivamente grandes para uma eficiente inalação (PERFECT & CASADEVALL,
2002). Porém, leveduras desidratadas e acapsuladas e/ou basidiosporos
apresentam diâmetro suficientemente pequeno para inalação e deposição alveolar.
Em estudo conduzido por Ruiz & Bulmer (1981) C. neoformans foi isolado a
partir do ar em um edifício (torre) desocupado e contaminado com excretas de
pombos em Oklahoma/EUA, através da exposição de placas de Petri com meios de
cultura específicos, durante 15 min, bem como de detritos do chão e excretas de
pombo. O número e tamanho das células de C. neoformans contidas no ar foram
analisados com coletor de ar da marca Anderson. O ar continha uma média de 45
UFC em 100 l de ar e 60% das células com menos de 4,7 µm de diâmetro. Amostras
do chão foram coletadas antes e após varrição. A varrição resultou na
aerossolização de um grande número de células de 4,7 a 11 µm em diâmetro. Um
minuto após a varrição 4,4% de células viáveis de C. neoformans eram menores que
1,1 µm (0,65 – 4,7 µm), um tamanho compatível com a deposição alveolar
(NEILSON et al. 1977). Baseado nestes achados foi estimado que a exposição
humana a esta atmosfera durante uma hora poderia resultar na deposição de 41
células de C. neoformans nos pulmões. Aproximadamente 106cél/ g de C.
neoformans foi cultivado de excretas de pombos (RUIZ & BULMER, 1981). Em outra
investigação em ambiente similar ao anterior Ruiz et al., (1981), avaliaram a
distribuição e o tamanho das células de C. neoformans em amostras de excretas de
pombos acumuladas e, portanto, mais compactadas e com amostras compostas de
material particulado relativamente finos e dispersadas pelo chão, revelando que
excretas envelhecidas compactadas continham menos células viáveis de C.
neoformans que aquelas com material seco livremente espalhado pelo chão. O
material fino espalhado pelo chão continha 300 vezes mais células viáveis que as
excretas acumuladas e mais compactas.
No presente estudo, a contagem de colônias de Cryptococcus spp. em
amostras de poeira intradomiciliar variou entre 1,5 x 102 até 75 x 102 UFC/g.
Em relação ao número de colônias produzidas, chamou atenção substrato
coletado no domicílio do caso índice 2, situado na cidade de Ananindeua na RMB,
102
considerada a segunda maior cidade do estado. Artrópodes conhecidos
popularmente como “tatuzinhos de jardins” apresentaram elevadíssimos índices de
UFC, com média de 238,38 e 247,31 UFC por placa. Nas primeiras 48 horas a
maioria das placas apresentava-se como colônias marrom escuras puras, fenol
oxidase positivas. Todos os isolados foram C. neoformans e os tatuzinhos foram
identificados como Cubaris murina. Embora o paciente deste domicílio tivesse sido
acometido por C. gattii, este resultado demonstrou que tais artrópodes podem
também transportar estas leveduras e, possivelmente, dispersá-las no ambiente,
uma vez que material raspado da madeira onde os tatuzinhos andavam também
estavam contaminados com C. neoformans. Estes dados estão de acordo com Ruiz
et al. (1982), que em seus experimentos detectaram C. neoformans em tatuzinhos
de jardins identificados como Methoponorthus pruinosus. Os autores recuperaram o
fungo também de placas com meio de cultura onde os tatuzinhos foram colocados
para andarem. Através de cortes histológicos observaram a presença de leveduras
não capsuladas que foram sugeridas como sendo C. neoformans. É importante
ressaltar que em nosso estudo o procedimento utilizado para análise destes
artrópodes foi diferente dos demais substratos, o que pode ter influenciado na
enorme quantidade de colônias produzidas, pois os mesmos foram macerados em 2
ml de solução salina. As duas amostras foram coletadas no mesmo ambiente, mas
em recipientes separados, por isto foram processadas separadamente.
A associação de C. neoformans com invertebrados foi estudada em vários
aspectos por Ruiz et al. (1982), demonstrando que fatores bióticos influenciam na
sobrevivência de C. neoformans, incluindo bactérias, amebas, ácaros e tatuzinhos
de jardins. Algumas bactérias, entre quais Pseudomonas aeruginosa e Bacillus
subtilis, apresentaram propriedade anti-C. neoformans e ácaros que foram
observados em placas contendo ágar azul tripano (TBA) apresentavam células de
leveduras azuis (células de C. neoformans apresentam-se azuis sobre TBA) dentro
do trato digestivo dos ácaros. O experimento com amebas (Achantamoeba
palestinensis) isoladas de excretas de pombos demonstrou que estas, na forma de
trofozoítas, podem ingerir e matar as 99, 9% de células de C. neoformans após sete
dias de incubação. A formação de pseudohifas, observadas em outro estudo, parece
ser uma forma de resistência ao ataque (massacre) das amebas, sugerindo que esta
forma fúngica possa persistir em locais habitados por amebas (NEILSON et al.,
1978). Recentemente Kidd et al., (2003) relataram o primeiro isolamento de C. gattii
de insect frass (produto resultante de uma colônia de insetos, vivos e/ou mortos,
103
sobre substrato vegetal, igualmente vivo ou morto) coletado de uma cavidade
sombreada na casca de uma árvore viva (Eucalyptus tereticornis) na Austrália. Estes
detritos permitiram identificar o inseto como pertencente à ordem Lepidoptera.
Análise com PCR fingerprinting identificou os tipos moleculares VGI e VGII de C.
gattii.
A potencial associação entre Cryptococcus spp. e hospedeiros diversos são
consistentes com a classificação do fungo na ordem Tremellales, a qual inclui fungos
micoparasitas (KWON-CHUNG et al., 1995), sugerindo uma possível relação de
parasitismo na natureza (LIN & HEITMAN, 2006). Pelo exposto, deve-se considerar
outras relações ecológicas, como comensalismo e predação, uma vez que no
experimento com ameba, C. neoformans mostrou-se fonte de alimentação. Na
realidade, evidencia-se um complexo ciclo de interação onde várias funções
ecológicas podem ser relacionadas.
Outro aspecto que vem sendo abordado é a possibilidade do fungo adquirir
virulência no ambiente em decorrência da interação com hospedeiros não
mamíferos. Os registros de associação de Cryptococcus spp. com grande variedade
de hospedeiros sustenta a hipótese de que a virulência do fungo pode estar
relacionada e mantida por via de seleção imposta pela exposição a predadores
naturais. Amebas como Achantamoeba castelannii (STEENBERGEN et al., 2001),
nematóides (MYLONAKIS et al., 2002) e o fungo mucilaginoso Dictyostelium
discoideum, entre outros, têm sido utilizados em modelos de estudo de virulência.
Em um destes estudos, Steenbergen et al. (2001) relataram que linhagens
acapsuladas de C. neoformans não sobrevivem quando incubadas com amebas,
porém, a melaninização protege a levedura contra o ataque (killing) da ameba,
sugerindo que a virulência de C. neoformans é conseqüência de adaptações que
desenvolveram para proteção contra predadores no ambiente. Observaram ainda
que todas as leveduras testadas foram ingeridas pela ameba, no entanto, linhagens
acapsuladas e linhagens com pseudohifas foram ingeridas mais rapidamente que as
formas capsuladas, mostrando que a cápsula tem papel anti-fagocítico. Após
ingestão, as células resistem e replicam-se dentro de vacúolos fagocíticos. Vacúolos
contendo polissacarídeos são deletérios para a célula (FELDMESSER et al., 2000).
Por fim, o estudo demonstrou que muitas linhagens virulentas de C. neoformans
podem causar a lise da ameba.
No presente estudo, a determinação do tipo sexuado por PCR com primers
específicos e do tipo molecular através da técnica de PCR/RFLP do gene URA5,
104
revelou que todos os 37 isolados dos tatuzinhos e de uma amostra de raspas de
madeira onde os tatuzinhos foram encontrados pertencem ao tipo sexuado MATa,
tipo molecular VNIV. Provavelmente todos estes isolados resultaram de uma
expansão clonal, indicando possível associação comensal entre os fungos e os
tatuzinhos, provavelmente transitória. Para melhor compreensão destes achados
são necessárias novas buscas em diversos ambientes para verificar se este é um
evento ocasional ou freqüente. Estudos histológicos podem comprovar a presença
interna da levedura. E estudos controlados em laboratórios poderão melhor definir o
tipo de associação ecológica entre os fungos e tatuzinhos de jardim.
Em relação ao tipo de domicílio positivo para Cryptococcus spp. deve ser
ressaltado o fato de a maioria dos casos selecionados e mesmo os não
selecionados situarem-se em áreas de invasão, com precárias condições de
saneamento e cujas edificações são construídas de forma desordenada e
predominantemente em madeira. Muitos dos domicílios visitados encontravam-se
em aparente decomposição. Em alguns destes foi registrada a presença de
basidiomas de Basidiomycetes, denotando a participação deste grupo na
degradação da madeira.
Dos oito domicílios de casos-índice estudados destacam-se dois: i) O caso-
índice 3, de uma paciente portadora de LES e residente em área de invasão próximo
a portos e madeireiras. Cryptococcus neoformans foi isolado do domicílio da
paciente, do domicílio da mãe da paciente e de dois domicílios vizinhos.
Cryptococcus gattii foi isolado da poeira intradomiciliar após varrição no andar de
baixo da residência da mãe. As duas espécies foram encontradas em poeira
intradomiciliar de dois domicílios vizinhos, bem como do andar de cima da residência
da mãe da paciente e ainda da cozinha da paciente. Estas residências foram
construídas de forma contígua, ou seja, uma parede separa duas casas. As casas
em frente mantêm diminuta distância, podendo-se considerar como se fosse um
único ambiente. Durante a coleta não foi observada a presença de pombos, mas sim
muitas madeireiras próximas, sugerindo que material proveniente do manejo da
madeira seja disperso pelo ambiente; ii) O caso-índice 7, de um paciente do sexo
masculino, HIV negativo, de 65 anos de idade e que foi a óbito devido criptococose
por C. neoformans. O paciente era marceneiro e, portanto, em freqüente exposição a
detritos de madeira. A sua residência era em madeira, mas localizada no limite, em
área mais bem estruturada do que no caso-índice 3. Também se observou pelo lado
externo da casa uma parede em decomposição, mas as amostras coletadas não
105
foram positivas. No domicílio foram detectadas duas amostras positivas das 11
coletadas. Uma das amostras apresentou baixa densidade de colônias e rápida
contaminação, não se conseguindo seu isolamento para identificação e
caracterização precisa. Somente de uma amostra de poeira intradomiciliar coletada
no andar de cima do domicílio foram recuperados 16 isolados, identificados como C.
neoformans e C. gattii na proporção de 1:1.
O caso índice 8 refere-se a um paciente HIV positivo. Por questões familiares,
não permitiram nossa entrada no domicílio do paciente, fechado desde a sua morte.
Embora o domicílio seja em madeira, situa-se em um bairro mais estruturado, com
ruas largas e residências próximas construídas em alvenaria. Uma amostra de
poeira intradomiciliar coletada em domicílio-controle, pertencente a um parente do
paciente, foi positiva para C. neoformans. Todos os isolados foram VNI, MATα,
compatíveis com os isolados da maioria dos casos de aids.
É interessante ressaltar que na maioria das amostras ambientais, C.
neoformans sempre esteve presente em maior proporção ou pelo menos foi isolado
em maior proporção, o que pode representar maior poder de competitividade e/ou
capacidade de rápida reprodução.
Se a criptococose é causada por uma infecção aguda ou reativação de uma
infecção latente é um tema ainda em discussão. Evidências sugerem que a
reativação de infecção latente seria mais comum (LIN & HEITMAN, 2006). É
provável que as manifestações da criptococose sejam devidas à reativação mais do
que uma re-infecção (BRANDT et al., 1996). Garcia-Hermoso et al., (1999)
analisaram 9 pacientes que moraram na África durante 110 meses antes de se
mudarem para a Europa. Perfis de RAPD mostraram que os isolados clínicos dos
pacientes africanos diagnosticados na França eram significativamente diferentes dos
isolados clínicos europeus, sugerindo que a infecção por C. neoformans havia sido
adquirida na África, suportando a idéia de uma fase dormente seguida da reativação
do fungo. Através da avaliação de um grupo de viajantes que estiveram em
Vancouver foi sugerido para C. gattii um período de incubação de 2 a 11 meses,
indicando que a infecção por C. gattii é mais consistente com infecção primária
(MacDOUGALL & FYFE, 2006).
No Brasil, estudos clínico-epidemiológicos mostram a importância da
criptococose gattii de SNC em adultos jovens de ambos os sexos e crianças nas
regiões N e NE, com letalidade de 35% a 40% (CAVALCANTI 1997, CORRÊA et al.
1999, SANTOS 2000, DARZÉ et al. 2000, NISHIKAWA et al. 2003, MARTINS 2003,
106
LAZÉRA et al. 2005). É notório que a maioria é diagnosticada quando há
manifestações do SNC, não se diagnosticando formas pulmonares mais leves, o que
parece indicar um importante fator de sub-diagnóstico da doença nestas regiões.
No estado do Pará os registros hospitalares mostram alta incidência de
criptococose, embora pouco documentada na literatura. Há registro de um caso de
criptococose cutânea de paciente masculino de 29 meses, residente em casa tipo
palafita, ocorrido em 1981, cujo diagnóstico foi obtido por exame histopatológico e
seu tratamento realizado pela remoção da lesão, não ocorrendo recidiva (AUAD,
1993). Em estudo mais recente, Corrêa et al., (1999) registram criptococose gattii em
crianças e jovens no Pará e Santos et al. (2005) apresentaram em congresso um
estudo que mostra o predomínio da criptococose gattii sobre a criptococose
neoformans em centro de referência em Belém do Pará onde a maioria absoluta
apresenta lesão de SNC.
A percepção da importância da criptococose gattii é crescente; se antes era
vista como problema restrito a grupos populacionais rurais ou nativos, atualmente
identifica-se sua ocorrência em diversas regiões onde surjam condições laboratoriais
para o diagnóstico e discriminação das espécies de Cryptococcus (LAZÉRA et al.,
2007).
Tais achados sugerem a possibilidade de infecção humana indoor, isto é, a
infecção seria adquirida dentro das residências. É, portanto, de fundamental
importância ampliar este estudo para verificar se o próprio ambiente domiciliar em
Belém do Pará e outros domicílios em condições similares podem representar fontes
cotidianas para a infecção humana, o que traz um novo conceito de risco na
criptococose, particularmente aquela causada por C. gattii que atinge crianças e
jovens aparentemente normais em Belém do Pará, bem como nas regiões Norte e
Nordeste do Brasil em geral.
É reconhecida a predominância do tipo sexuado MATα sobre MATa em
isolados de C. neoformans e C. gattii independente da origem clínica ou ambiental.
Kwon-Chung & Bennett (1978) encontraram uma proporção de 30:1 entre os
isolados clínicos e 40:1 entre os isolados ambientais de C. neoformans. Todos os
isolados C. gattii sorotipo B de Vancouver foram MATα e a grande maioria fértil
(FRASER et al., 2003). Não está claro o porquê deste predomínio, embora o tipo
sexuado MATα seja referido como mais virulento (KWON-CHUNG et al., 1992b), o
que lhe conferiria maior competitividade. Wickes et al. (1996), ao demonstrar in vitro
que isolados do tipo sexuado MATα são capazes de produzir hifas e basidiosporos
107
na ausência de mating, sob determinadas condições (limitação de nitrogênio e
água), sugere que esta associação possa explicar a preponderância deste mating
type na natureza. O dimorfismo refere-se à capacidade de algumas espécies se
apresentarem ora na fase micelial ora na fase leveduriforme, dependente de
determinados fatores como temperatura, nutrientes e tensão de CO2, observados em
várias espécies de fungos patogênicos, notadamente os causadores de infecções
sistêmicas. Embora a presença de hifas seja descrita em C. neoformans e C. gattii,
estes não têm sido referidos como dimórficos, porque a fase micelial é transitória e
observada durante a fase sexual (WICKES et al. 1996)
A determinação do mating type em 220 isolados analisados neste estudo
mostrou concordância com a literatura em relação a maior freqüência de isolados
MATα. Entretanto diferentemente do estudo de Kwon-Chung & Bennett (1978) os
isolados obtidos neste trabalho revelaram predomínio de MATα, na proporção ~2:1.
Halliday et al., (1999) analisando isolados clínicos e ambientais da Austrália também
detectaram a maioria de isolados MATα, porém em isolados de uma determinada
área geográfica a proporção de MATα foi de 27:2 enquanto que numa segunda área
esta proporção foi de 50:50, o esperado para uma recombinação sexual. Nosso
estudo revelou que o tipo sexuado MATa só foi detectado em isolados de C.
neoformans. Mas, o que chamou mais atenção foi a ocorrência de ambos os tipos
sexuados em um mesmo ambiente em domicílios diferentes. C. neoformans MATa
foi recuperado de duas amostras de restos de madeira em decomposição retirada da
própria parede do domicílio de uma paciente (caso índice 3) enquanto de amostras
de poeira doméstica isolou-se C. neoformans MATα e C. gattii MATα de um
domicílio situado em frente. Um segunda coleta, realizada 4 meses depois, revelou a
presença de C. neoformans e C. gattii MATα do domicílio desta paciente. A
presença de isolados de MATα e MATa no mesmo espaço geográfico reforça
evidências de ocorrência do ciclo sexuado na natureza, possivelmente ligado a
ambientes com a presença de substratos de origem vegetal em decomposição,
como já foi sugerido por Lazéra et al. (2000). Cruzamento entre isolados ambientais
coletados em Roraima demonstraram fertilidade in vitro, entretanto mostraram
ausência de autofertilidade (FORTES, 2001).
Considerando que os primers utilizados para este estudo foram originalmente
construídos com base no feromônio de isolados C. neoformans sorotipo D, chamou
atenção uma amostra de C. gattii em que o marcador molecular revelou bandas
compatíveis com MATαa. A PCR foi repetida mais de uma vez com o mesmo
108
resultado. Sendo assim este isolado merece ser mais bem estudado quanto à sua
ploidia e seqüenciamento genético para confirmação do tipo sexuado e verificação
se trata de isolado recombinante ou híbrido, uma vez que há possibilidade de
híbridos inter-espécies e estes são extremamente raros na natureza. Isolados αa
são característicos do ciclo sexual clássico destas leveduras. Embora apenas um
isolado αa, tenha sido detectado é possível especular que há uma grande
possibilidade da existência do ciclo sexuado nestes habitats, visto que isolados
MATα e MATa foram recuperados de um mesmo ambiente. Além disto, cepas
haplóides foram demonstradas, capazes de desenvolver um ciclo monocariótico
(WICKES et al., 1996) indicando a necessidade de continuar esta linha de pesquisa
que poderá resultar no encontro de híbridos ou recombinantes.
O estudo do ciclo sexuado não foi objeto deste estudo, porém resultou no
isolamento de colônias que devem ser testadas para verificar sua fertilidade e
possível recombinação ou hibridização gênica entre C. neoformans e C.gattii.
Em estudo de plantas e animais os termos hibridização e híbrido são
utilizados para descrever o processo ou produto do processo no qual uma progênie
é gerada a partir do cruzamento de duas linhagens parentais geneticamente
divergentes, como por exemplo, linhagens de diferentes raças, variedades,
subespécies espécies ou gêneros (Xu et al., 2002). Linhagens de sorotipo A e D são
referidas como variedades por alguns autores, devido às diferenças sorotípicas entre
estas. Por isto, mating type entre linhagens sorotipo A e D tem sido referidos como
híbridos (XU et al., 2002). A recombinação refere-se à formação de uma nova
combinação de genes observada na progênie e não nos parentais resultante de
crossing over e segregação, independente ou durante a meiose. Não foi possível
obter a sorotipagem de todos os isolados devido a indisponibilidade comercial do kit
Crypto Iatron. Entretanto estes isolados MATa foram caracterizados como VNIV, e
este genótipo mostra correspondência com sorotipo D. A maioria dos isolados
híbridos relatados na literatura são AD, compatíveis com a distribuição cosmopolita
destes sorotipos. Híbridos BD, oriundos do cruzamento entre as espécies são raros.
A sua ocorrência natural foi registrada por Bovers et al. (2006).
Outros isolados MATa foram obtidos das amostras de tatuzinhos coletados
em quintal do domicílio do paciente caso índice-2. Estes achados foram discutidos
acima.
109
No Brasil, o tipo sexuado MATa foi registrado por Trilles et al. (2003) em
alguns isolados do Piauí, do Rio de Janeiro e do Amazonas. Raros isolados αa
foram registrados por Casali et al. (2003) e Barreto de Oliveira et al. (2004).
A distribuição dos tipos moleculares pelo método de PCR/RFLP do gene
URA5, evidenciou a ocorrência de três tipos moleculares em isolados ambientais na
RMB. O genótipo mais freqüente foi VNI (45 %), seguido pelo genótipo VNIV (32 %)
e VGII (23 %). Estes resultados estão em concordância com estudos prévios que
estabeleceram o genótipo VNI como o mais freqüente entre os isolados de C.
neoformans (MEYER et al., 1999; MEYER et al., 2003). Os genótipos VNI e VGI
foram considerados os tipos moleculares mundialmente predominantes (MEYER et
al., 1999, BOEKHOUT, et al., 2001), sendo que a maioria dos isolados clínicos de
pacientes com aids são VNI (ELLIS et al., 2000). Por outro lado, estudos posteriores
mostraram perfil diferente para isolados da América Latina. Isolados de origem
clínica, veterinária e ambiental provenientes de 9 países iberoamericanos foram
estudados por Meyer et al. (2003) e revelaram o predomínio do genótipo VNI
(68,2%) e, em menor proporção, VNII (5,6%), VNIII (4,1%), VNIV (1,8%), VGI (3,5%),
VGII (6,2%), VGIII (9,1%) e VGIV (1,5%). Notou-se a ocorrência de todos os
genótipos e, entre os isolados de C. gattii, prevaleceu o genótipo VGIII; porém, entre
os isolados brasileiros somente o genótipo VGII foi registrado. Estudo de 247
isolados ambientais de várias regiões da Colômbia agrupou a maioria no genótipo
VNI (98,1%) e VGII (100%) (ESCANDÓN et al., 2006).
Em nossa investigação ambiental não foi detectado o genótipo VGIII,
prevalente nas cepas ibero-americanas; porém, quando se avaliam somente as
cepas brasileiras, estes resultados coincidem com o estudo de Meyer et al. (2003).
No Rio Grande do Sul o estudo de cepas clínicas e ambientais (CASALI et al., 2003)
mostrou VNI (83,9%) de C. neoformans como o mais freqüente tipo molecular, de
origem clínica e ambiental. Entre os isolados C. gattii (8,9 %) todos foram VGIII
embora de origem clínica, mostram divergência em relação aos observados neste
estudo onde todos os isolados foram VGII. Estes achados estão de acordo com o
observado em outra análise de sorotipos, que também revelou marcante diferença
em relação a C. gattii quando se comparam a sua ocorrência nas regiões
Norte/Nordeste e Sul/Sudeste (NISHIKAWA et al., 2003).
Neste trabalho o genótipo VNIV foi isolado de tatuzinhos de jardins e raspado
de madeira relacionado, bem como de raspados de madeira em decomposição de
110
um domicílio, revelando-se todos do tipo sexuado MATa . Todos os isolados
oriundos de Eucaliptus spp. analisados por Casali et al., (2003) apresentaram este
genótipo, mas diferentemente, todos foram MATα . É interessante este achado uma
vez que também foram isolados em madeira em decomposição e pode-se afirmar
que não era de Eucaliptus spp. Embora não possamos afirmar, nosso achado
sugere que o fungo estivesse presente na madeira e que, ao serem ingeridos pelos
tatuzinhos, de alguma forma conseguem sobreviver por algum mecanismo de
escape e multiplicar-se em seu interior. Estes achados necessitam de novas buscas
e novas abordagens para um melhor entendimento desta relação.
Trilles et al. (2003) pelo método de AFLP identificaram 3 isolados do Piauí
como AFLP2, correspondente ao genótipo VNIV. Destes, dois foram isolados de solo
de toca de tatu e um de oco de árvore, e todos eram MATa. Analisando estes dados
em conjunto, observa-se que todos os genótipos VNIV das regiões N e NE eram
MATa, o tipo sexuado menos freqüente no mundo, enquanto que na região Sul
prevaleceram isolados MATα. Todos estes achados parecem mostrar uma relação
entre C. neoformans VNIV com vegetais e animais, uma vez que tatus têm sido
considerados possíveis reservatórios de vários patógenos (WANKE et al., 2007).
A ocorrência do genótipo VNIV no norte do Brasil adiciona um novo dado à
literatura, uma vez que até recentemente era considerado restrito a Índia e África do
Sul (ELLIS et al., 2000).
A ocorrência de isolados VGII neste estudo representa um achado importante,
uma vez que este genótipo foi o responsável pelo surto iniciado em 1999 na ilha de
Vancouver, Canadá, onde foi demonstrado que a concentração de propágulos foi
significantemente maior nos meses mais quentes e secos do ano (KIDD et al., 2007)
e alta fertilidade (FRASER et al., 2003). Dois subtipos foram identificados por Kidd et
al., (2004) nomeados VGIIa e VGIIb. A maioria destes isolados é considerada hiper-
virulenta e tem um idêntico genótipo, compatível com o único genótipo do Pacífico
Nordeste. A minoria é significantemente menos virulenta e compartilha genótipo
idêntico aos isolados férteis da população recombinante da Austrália (FRASER et
al., 2005). Considerando que C. gattii acomete principalmente hospedeiros
imunocompetentes, com elevada prevalência em crianças e jovens, tanto no estado
Pará (CORRÊA et al., 1999) quanto no Piauí (CAVALCANTI, 1997; MARTINS, 2003)
e Amazonas (SANTOS, 2000), este estudo confirma a presença de C. gattii VGII em
111
fontes ambientais da RMB e se revela preocupante, dado a elevada presença de
construções em madeira. As sobras das madeireiras constituem um material
abundante, barato e acessível para construção de habitações rústicas em áreas
alagadas na maior parte do ano e sem saneamento.
Estes achados mostram um ciclo biológico complexo dos agentes da
criptococose, adaptados a ambiente domiciliar localizado em área onde a pobreza
impera, cuja população usa madeira de refugo para a maioria de suas construções,
sob regime de alta pluviosidade e elevada umidade relativa do ar, em alguns casos
situadas próximas a rios ou igarapés muitas vezes sofrendo inundações provocadas
pelo regime de marés muito fortes nesta região do Brasil. Nestas condições,
observa-se acelerado processo de decomposição de substratos de madeira não
tratada, propiciando íntimo contato homem-fungo e atingindo todas as faixas etárias,
incluindo as crianças. Portanto, é bem provável que propágulos de leveduras
dessecadas e até mesmos basidiosporos possam ser produzidos por C. neoformans
e/ou C. gattii e sejam inalados no cotidiano destes domicílios, causando infecção
pulmonar assintomática, pneumonia ou disseminando para o sistema nervoso
central e outros órgãos. É importante ampliar os estudos sobre a criptococose e
seus agentes no Norte e Nordeste do Brasil, bem como identificar tipos moleculares
predominantes em infecções humanas, em animais e no meio ambiente, para um
melhor entendimento da estrutura populacional e diferenças geográficas destes
importantes agentes e identificar possíveis mecanismos de infecção nesta região.
A falta de condições de planejamento das construções e saneamento
contribui para um ambiente de pouca luminosidade e ventilação, menos limpo,
propiciando o desenvolvimento e multiplicação destes patógenos.
O presente estudo contribui pioneiramente para o conhecimento de fontes
ambientais e caracterização molecular de C. neoformans e C. gattii, oriundas da
região Norte do Brasil, adicionando novos genótipos e aspectos ecológicos
concernentes a estes dois agentes de relevante importância médica para a região,
bem como poderá servir de subsídio para novas pesquisas que visem identificar
possível elo genético entre isolados clínicos e ambientais.
112
8 – CONCLUSÕES Os resultados aqui apresentados permitem as seguintes conclusões:
1. Em relação às amostras coletadas em ocos de árvores ornamentais em área
urbana de Belém, registrou-se pela primeira vez a ocorrência de C. neoformans
sorotipo A, MATα, genótipo VNI e C. gattii sorotipo B, MAT α, genótipo VGII
compartilhando o mesmo oco de Senna siamea na cidade de Belém/PA, sugerindo
provável interação entre estas.
2. Metade dos domicílios dos casos-índice pesquisados (3/8 mais 1 domicílio
controle) apresentou contaminação por Cryptococcus neoformans e/ou
Cryptococcus gattii, demonstrando a ocorrência dos agentes da criptococose dentro
de e/ou no entorno de domicílios de pacientes da região.
3. A identificação dos isolados ambientais revelou o predomínio de C. neoformans
sobre C. gattii.
4. Em relação ao substrato investigado, detectou-se maior contaminação em poeira
intradomiciliar, demonstrando a ocorrência do fungo em material facilmente
aerossolizável.
5. Pela primeira vez foi demonstrada a ocorrência de C. gattii em ambiente
intradomiciliar, bem como a ocorrência de ambas as espécies compartilhando o
mesmo ambiente domiciliar, acrescentando mais um dado ecológico sobre
comportamento destes agentes.
6. Nos substratos constituídos de madeira em decomposição, Cryptococcus
neoformans foi isolado de 3 amostras e C. gattii, em conjunto com C. neoformans, foi
isolado de uma, sustentando a hipótese de que substrato de origem vegetal em
decomposição é habitat primário de ambas as espécies.
7. Cryptococcus neoformans foi isolado de tatuzinhos de jardins (Cubaris murina),
achado inédito.
113
8. A ocorrência de C. neoformans em amostra de raspado de madeira onde os
artrópodes C. murina foram coletados sugere que os mesmos possam ser
dispersores do fungo no ambiente.
9. Em função do elevado índice de UFC de C. neoformans detectado nos
artrópodes, bem como o baixo índice de contaminação por outros fungos, sugere
que o fungo estava colonizando internamente estes artrópodes e que,
possivelmente, conseguem sobreviver e se multiplicar em seu interior.
10. A caracterização molecular mostrou que todos os isolados dos tatuzinhos de
jardins eram do tipo sexuado MATa, tipo molecular VNIV, indicando possível
estrutura populacional clonal.
11. Globalmente, a determinação do mating type mostrou predominância de isolados
MATα, sendo 45% C. neoformans MATα, 32% C. neoformans MATa e 23% C. gattii
MATα. Um isolado C. gattii MATαa foi demonstrado. A ocorrência de isolados MATα
e isolados MATa em um mesmo ambiente sugere a possibilidade de cruzamento
entre isolados ambientais, o que poderia resultar em progênie de recombinantes ou
híbridos.
12. A ocorrência de C. gattii MATαa, indica possibilidade de híbridos inter-espécies.
Todavia merece estudos mais aprofundados para comprovação do achado que é
raro na natureza.
13. A utilização de PCR/RFLP do gene URA5 revelou o predomínio do tipo molecular
VNI, seguido de VNIV e VGII. Os genótipos VNIV e VGII constituem-se em novos
registros de isolados ambientais para a região norte do Brasil. Embora registrado em
menor número, a ocorrência de VGII é marcante quando comparada com as das
regiões Sul e Sudeste do Brasil.
14. A ocorrência isolada ou combinada de C. neoformans e C. gattii em habitações
precárias, construídas predominantemente em madeira, em uma região quente e
úmida, com alta pluviosidade, favorece a possibilidade de infecção indoor.
114
15. A elevada ocorrência dos agentes da criptococose na RMB indica que este
modelo de estudo deve ser aumentado para avaliação mais abrangente da relação
entre fontes de infecção e pacientes.
115
9 - PERSPECTIVAS
O Hospital Universitário João de Barros Barreto tem registrado um índice
relativamente alto de meningite por Cryptococcus spp., inclusive recente caso
(junho/2008) de óbito de um menino em local similar em bairro próximo ao registrado
neste estudo, o que deixou a população em pânico. A ocorrência de meningite
criptoccócica por C. gattii tem sido registrada nas regiões Norte e Nordeste
notadamente em crianças e jovens aparentemente hígidos têm evidenciado elevada
morbidade e mortalidade sugerindo áreas endêmicas na região. Os resultados
obtidos no presente estudo permitem sugerir algumas linhas de pesquisa e
divulgação, a saber:
• Realizar estudos moleculares buscando caracterizar os genótipos da região e
subsidiar as equipes de saúde locais no conhecimento das possíveis fontes
ambientais da região.
• Identificar a freqüência de ocorrência de ambas as espécies (C. neoformans e
C. gattii) num mesmo biótopo na região urbana de Belém
• Estudo comparativo da presença destes agentes em áreas de florestas com
mínima ação antrópica e em áreas degradadas pela atividade humana.
• Investigar a relação entre C. neoformans e C. gattii com a biota local, como
insetos, isópodas, e amebas e outros animais.
• Utilizar estas linhas de pesquisa para treinamento de alunos de graduação e
pós-graduação visando a formação de grupo de pesquisa que possa gerar
informações da região.
• Elaborar material informativo para divulgar junto à população de áreas com
registro da infecção e outros, visando auxiliar na prevenção desta micose.
• Realizar palestras comunitárias e para a comunidade acadêmica e
profissionais da saúde visando a divulgação de informações que possam ajudar para
uma melhor diagnóstico e prevenção.
• Estes resultados iniciais indicam a importância de se ampliar os estudos para
outras regiões da Amazônia, onde a criptococose gattii é endêmica, atingindo um
grande contingente de crianças e adolescentes imunocompetentes.
Pelo exposto pretende-se dar continuidade a esta linha de pesquisa e
expandir para cidades do interior do estado onde haja registro da infecção.
116
REFERÊNCIAS
ABEGG, M. A., CELLA, F. L., FAGANELLO, J., VALENTE, P., SCHRANK, A.; VAINSTEIN M. H. Cryptococcus neoformans and C. gattii isolated from the excreta of Psitaciformes in a Southern Brazilian Zoological Garden. Mycopathologia, v. 161, p. 83-91, 2006.
AJELLO, L. Occurrence of Cryptococcus neoformans in soils. American Journal Hygiene, v.67, p. 777. 1958 1958.
AJELLO, L. Soil as natural reservoir for human pathogenic fungi. Science, v. 123 p. 876-879. 1956.
ALEXANDER, B. D.; PFALLER, M. A. Contemporary tools for the diagnosis and management of invasive mycoses. Clinical Infectious Diseases, v. 43, p. S15-27, 2006.
ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W.; BLACKWELL, M. Introductory Mycology. 4 ed.: John Wiley & Sons, Inc, p. 1- 868. New York, 1996.
ALLER, A. I.; MARTIN-MAZUELOS, E.; LOZANO, F, GOMES-MATEOS, J.; STEELE-MOORE, L.; HOLLOWAY, W. J.; GUTIÉRREZ, M. J.; RECIO, F. J.; ESPINEL-INGROFF, A. Correlation of fluconazol MICs with clinical outcome in cryptococcal meningitis. Antimicrobial Agents Chemotherapy, v. 44, n. 6, p. 1544-1548, Jun. 2000.
AMBIENTE BRASIL [2007]. Pará. Disponível em: http//www.ambiente.brasil.br. Acesso em 15.12.2007.
APIDIANAKIS, Y, RAHME, L. G.; HEITMAN, J; AUSUBEL, F. M.; CALDERWOOD, S. B.; MYLONAKIS, E. Challenge of Drosophila melanogaster with Cryptococcus neoformans and role of the innate immune response. Eukariotic Cell, v. 3, p. 413-419, 2004.
ASSING, K.; BIRGENS, H.; ARENDRUP, M. Cryptococcus neoformans var. neoformans resistance to fluconazole in na HIV-negative patient with chronic lymphocytic leukemia. Clinical microbiology Infection, v. 9, p. 441-444, Jul. 2003.
AUAD, C. T. M.; Criptococosese (torulose) cutânea pura. Pará-Médico. v. 2, p. 16-18. 1993.
117
BARBOSA, G. ALVAREZ, C.; MORALES, B, TRILLES, L.;WANKE, B.; LAZÉRA, M. Persistência de Cryptococcus neoformans sorotipo A no oco de Cassia grandis por 15 anos e associação com C. gattii. 5º Congresso Brasileiro de Micologia. Resumos, p. 311-312, 2007.
BARÓ, T. TORRES-RODRIGUEZ, J. M.; MORERA, Y.; ALÍA, C.; LÓPEZ, O. MÉNDEZ, R. Serotyping of Cryptococcus neoformans isolates from clinical and environmental sources in Spain. Journal of Clinical Microbiology. v. 37, n.4, p. 1170–1172, 1999.
BARÓ, T.; TORREZ-RODRIGUES, J. P.; HERMOSO DE MENDONZA, M.; MOREIRA, Y.; ALÍA, C. Fisrt identification of autochthonous Cryptococcus neoformans var. gattii isolated from goats with predominantly severe pulmonary disease in Spain. Journal of Clinical Microbiology, v. 36, n. 2, Feb. 1998.
BARONI, F. A; PAULA, C. R.; SILVA, E. G.; VIANI, F. C.; RIVERA, I. N. G.; BARETO DE OLIVEIRA, M. T.; GAMBALE, W. Cryptococcus neoformans strains isolated from church towers in Rio de Janeiro city, RJ, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 48, n. 2, p.7-75, 2006.
BARRETO DE OLIVEIRA, M.T.; BOEKHOUT, T.; THEELEN, B.; HAGEN, F.; BARONI, F. A.; LAZÉRA, M. S.; LENGELER, K. B.; HEITMAN, J.; RIVERA, I. N. G.; PAULA, C. R. Cryptococcus neoformans shows a remarkable genotypic diversity in Brazil. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 3, p. 1356-1359, Mar. 2004.
BATES, D. W.; SU, L.; YU, D. T. CHERTOW, G. M.; SEGER, D. Z.; GOMES, D. R. J; DASBACH, E. J; PLATT, R. Mortality and costs of acute renal failure associated with amphotericin B therapy. Clinical Infectious Diseases, v. 32, p. 686-693, 2001.
BAVA, A. J.; ROBLES, A. M.; NEGRONI, R.; ARECHAVALA, A.; BIANCHI, M. Estudio de algunos aspectos epidemiológicos de 253 casos de criptococosis. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 14, p. 111-114, 1997.
BC CENTRE FOR DISEASE CONTROL. BC Cryptococcus gattii Surveillance Summary, 1999-2006. 2007. Disponível em: http:://www.bccdc.org/download.php?item=3.
BERNARDO, F. M.; MARTINS, H. M.; MARTINS, M. L. Fontes urbanas de Cryptococcus spp – Lisboa. Revista Portuguesa de Ciência Veterinárias, v. 96, n. 539, p. 157-160, 2001.
BICANIC, T.; HARRISON, T. S.; Cryptococcal meningitis. Britsh Medical Bulletin v.72, p. 99-118. 2005.
118
BLOCK, E. R.; JENNINGS, A. E.; BENNETT, J. E. 5-Fluorocytosine Resistance in Cryptococcus neoformans. Antimicrobial Agents And Chemotherapy, v. 3, n. 6, p. 649-656, Jun. 1973.
BOEKHOUT, T.; BANDONI, R. J.; FELL, J. W.; KWON-CHUNG, K. J. Discussion of teleomorphic and anamorphic genera of heterobasidiomycetous yeasts. In: KURTZMAN, C. P. & FELL, J. W. The Yeasts. A taxonomic study. 4ª edição. Ed. Elsevier Science B. V. Amsterdam. 1998. p. 609-625.
BOEKHOUT, T.; THEELEN, B.; DIAZ, M. FELL, J. W.; HOP, W. C.J; ABELN E. C. A.; DROMER, F.; MEYER, W. Hybrids genotypes in the pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. Microbiology, v. 147, p. 891-907. 2001.
BOVERS M.; DIAZ, M. R.; HAGEN, F.; SPANJAARD, L.; DUIM, B.; VISSER, C. E.; HOOGVELD, H. L.; SCHARRINGA, J.; HOEPELMAN, I. M.; FELL, J. W.; BOEKHOUT, T. Identification of genotypically diverse Cryptococcus neoformans and C Cryptococcus gattii isolates by Luminex xMap technology. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, n. 6. p. 1874-183, Jun. 2007.
BOVERS, M.; HAGEN, F.; KURAMAE, W. E.; DIAZ, M. R.; SPAJAARD, L.; DROMER, F.; HOOGVELD, H. L.; BOEKHOUT, T.; Unique hybrid between the fungal pathogens Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. FEMS Yeast Research, v.6, p. 599-607. 2006.
BRANDT, M. E.; PFALLER, M. A.; HAJJEH, R. A.; GRAVISS, E. A.; REES, J; SPITZER, R.; PINNER, R. W.; MAYER, L. W.; THE CRYPTOCOCCAL DISEASES ACTIVE SURVEILLANCE GROUP. Molecular subtypes and antifungal susceptibilities of serial Cryptococcus neoformans isolates in human immunodeficiency virus-associated cryptococcosis. Cryptococcal Diseases Active Surveillance Group. Journal Infectious Diseases, v. 174, p. 812-820, 1996.
BRANDT, M. E.; PFALLER, M. A.; HAJJEH, R. A.; HAMILL, R. J.; PAPPAS, R. G.; REINGOLD, A. L.; RIMLAND, D.; WARNOCK, D. W.; FOR THE CRYPTOCOCCAL DISEASE ACTIVE SURVEILLANCE GROUP. Trends in antifungal drug susceptibility of Cryptococcus neoformans isolates in the United States: 1992 to 1994 and 1996 to 1998. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 45, n. 1, p. 3065-3069, Nov. 2001.
CALLEJAS, A.; ORDOÑEZ, N.; RODRIGUES, M.C.; CASTAÑEDA, E. First isolation of Cryptococcus neoformans var gatti serotype C from the environment in Colômbia. Medical Mycology, 36:341-344. 1998.
119
CARVALHO, V. G.; TERCETI, M. S; DIAS, A. L. T., PAULA, C. R; LYON, J. P. SIQUEIRA, A.M. Serotype and mating type characterization of Cryptococcus neoformans by multiplex PCR. Revista do Instituto de Medicina Tropical São Paulo, v. 49, n. 4, p. 207-210, Jul-Ago, 2007.
CASADEVALL, A, FREUNDLINCH, L. F.; MARSH, L.; SCHARFF, M. Extensive allelic variation in Cryptococcus neoformans. Journal of Clinical Microbiology, v. 30, p. 1080-1084, 1992.
CASADEVALL, A.; ROSAS, A & NOSANCHUK, J.D. Melanin and Virulence in Cryptococcus neoformans. Current Opinion in Microbiology, v. 3, p. 354-358. 2000.
CASADEVALL, A.; SOITZER, E. D.; WEBB, D.; RINALDI, M. G. Susceptibilities of serial Cryptococcus neoformans isolates from patients with recurrent cryptococcal meningitis to amphotericin B and fluconazole. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 37, n. 6, p. 1383-1386, Jun. 1993.
CASADEVALL, A.; SPITZER, E. D. Involvement of multiple Cryptococcus neoformans strains is a single episode of criptococcosis and reinfection with novel strains in recurrent infection demonstrated by random amplification of polymorphic DNA and DNA fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, v. 33 n. 6, p. 1682- 1683, Jun.1995.
CASADEVALL, A; PERFECT, J. R. Cryptococcus neoformans. Ed. ASM Press. p.1-539.Washington, 1998.
CASALI, A. K.; GOULART, L.; SILVA, L. K. R.; RIBEIRO, A. M. ; AMARAL, A. A.; ALVES, S. H.; SCHRANK, A.; MEYER, W.; VAINSTEIN, M. H.; Molecular typing of clinical and environmental Cryptococcus neoformans isolates in the Brazilian state Rio Grande do Sul. FEMS Yeast Research, v. 3, p. 405-415, 2003.
CASTAÑON-OLIVARES, L. R.; ARREGUÍN-ESPINOSA, R.; SANTOS, G. R. P.; LÓPEZ-MARTINEZ, R.; Frequency of Cryptococcus species and varieties in México and their comparison with some Latin American countries. Revista Latino Americana de Microbiologia, v. 42, p. 35-40, 2000.
CAVALCANTI, M.A.S. Criptococose e seu agente no Meio Norte, Estados do Piauí e Maranhão, Brasil. Rio de Janeiro. Tese (Doutorado em Medicina Tropical) - Instituto Oswaldo Cruz, 1997.
120
CERMEŇO, J. R.; HERNÁNDEZ, I.; CABELLO, I.; ORELLÁN, Y.; CERMEŇO, J. J.; ALBORNOZ, R.; PADRÓN, E; GODOY,G. Cryptococcus neoformans and Histoplasma capsulatum in doves’s (Columbia livia) excreta in Bolívar state Venezuela. Revista Latinoamericana de Microbiologia, v. 48, n. 1, p. 6-9, 2006.
CHAKRABARTI, A.; JATANA, M.; KUMAR, P.; CHATHA, L.; KAUSHAL, A.; PADHYE, A. A.; Isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptus camaldulensis in India. Journal of Clinical Microbiology, v. 35, p. 3340-3342. 1997.
CHANG, Y.C.; & KWON-CHUNG, K.J. Isolation of the third capsule-associated gene, CAP60, required for virulence in Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity, v. 66, p. 2230-2236, 1998.
CHANG, Y.C.; KOWN-CHUNG, K.J. Complementation of a capsule-deficient mutation of Cryptococcus neoformans restores its virulence. Molecular and Cellular Biology. v. 14, p. 4912-4919. 1994.
CHANG, Y.C.; KWON-CHUNG, K.J. Isolation, characterization, and localization of capsule-associated gene, CAP 10, of Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology, v. 181, p. 5636-5643, Sep. 1999.
CHANG, Y.C.; PENOYER, L.A.; & KWON-CHUNG, K.J. The second capsule gene of Cryptococcus neoformans, CAP64, is essential for virulence. Infection and Immunity, v. 64, p.1977-1983, 1996.
CHATURVEDI, V.; FAN, J.; STEIN, B.; BEHR, M. J.; SAMSONOFF, W. A. Molecular genetic analysis of mating pheromones reavel intervariety mating or hybridization in Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity, v. 70, p. 5225-5235, 2002.
CHATURVEDI,S.; RODEGHIER,B.; FAN, J.; McVLEILLAND, C.M.; WICKES, B.L & CHATURVEDI, V. Direct PCR of Cryptococcus neoformans MAT α and MAT a pheromones to determine mating type, ploidy and variety: a tool for epidemiological and molecular pathogenesis studies. Journal of Clinical Microbiology, 38: 2007-2009. 2000.
CHEN, L. C.; PIROFSKI, L.; CASADEVALL, A. Extracellular proteinase activity of Cryptococcus neoformans. Infection and Immunity, v. 65, p. 2599-2605, 1997a.
CHEN, S. C. A.; MULLER, M.; ZHOU, J. Z.; WRUGHT, L.; SORRELL, T. C. Phospholipase activity in Cryptococcus neoformans: a new virulence factor? Journal Infectious Diseases, v. 175, p. 414-420, 1997b.
121
CHEN, S.; SORRELL, T.; NIMMO,G.; SPEED, B.; CURIE, B.; ELLIS, D.; MARRIOT, D.; PFEIFFER, T.;PAAR, D.; BYTH, K and Australasium Cryptococcal Study Group. Epidemiology and host- and variety- dependent characteristics of infection due to Cryptococcus neoformans in Australia and New Zealand. Clinical Infectious Diseases, v.31, p. 499-508.Sep. 2000.
COGLIATI, M.; ESPOSTO, M.C.; CLARKE, D.L.; WICKES, B.L & VIVIANI, M.A.; Origin of Cryptococcus neoformans Diploid Strains. Journal of Clinical Microbiolology, v.39, n. 11, p. 3889-3894, Nov. 2001
COLOM, M. F.; FRASÉS, S.; FERRER,C.; JOVER, A.; ANDREU, M.; REUS, S.; SÀNCHEZ, M.; TORRES-RODRÍGUEZ, J. M.; First case of human cryptococcosis due to Cryptococcus neoformans var. gattii in Spain. . Journal of Clinical Microbiolology, v.43, n.7, p. 3548-3550. 2005.
COORDENAÇÃO NACIONAL DE DST/AIDS, 2008. Disponível em: www.aids.gov.br. Acesso em 13/05/2008.
CORRÊA, M. P. C. S.; OLIVEIRA, E. C.; DUARTE, R. R. B. S.; PARDAL, P. P. O.; OLIVEIRA, F. M.; SEVERO, L. C. Criptococose em crianças no estado do Pará, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 32, p. 505-508, 1999.
COX, G. M.; MUKHERJEE, J.; COLE, G. T.; CASADEVAL, A.; PERFECT, J. R. Urease as a virulence factor in experimental cryptococcosis. Infection and Immunity, v. 68, n. 2, p. 443-448, Fev. 2000.
CURO, M, I.; SALINAS, M. F.; CASQUERO, J. C. Cryptococcus neoformans en excretas de palomas, suelo y aire de los palomares del perímetro urbano de ICA, 2002. Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Publica, v. 22, n. 4, p. 262-266, 2005.
CURRIE, B.P.; FREUNDLICH, L.F.; CASADEVALL, A. Restriction fragment length polymorphism analysis of Cryptococcus neoformans isolates from environmental (pigeon excreta) and clinical sources in New York City. Journal of Clinical Microbiology, v. 32, n. 5, p. 1188-1192, May, 1994.
DARZÉ, C.; LUCENA, R.; GOMES, I.; MELO, A. Características clínicas e laboratoriais de 104 casos de meningite criptocócica. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 33, p. 21-26. 2000.
DE VROEY, J. F.; GATTI, F. Cryptococcus neoformans var. gattii Vanbreuseghem and Takashio, 1970. Mycoses, v. 32, p. 675. 1989.
122
DIAZ, M. R.; BOEKHOUT, T.; KIESLING, T.; FELL, J. W. Comparative analysis of the intergenic spacer regions and population structure of the species complex of pathogenic yeast Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research, v. 5, p. 1129-1140, 2005.
DIAZ, M.R.; BOEKHOUT, T.; THEELEN, B & FELL, J.W. Molecular sequence analyses of the intergenic spacer (IGS) associated within rDNA of the two varieties of the pathogenic yeast, Cryptococcus neoformans. Systematic and Applied Microbiology, v. 23, p. 535-545, 2000.
DOERING, T. L. How does Cryptococcus get its coat? Trends in Microbiology, v. 8, n. 12, p. 547-553, Dec. 2000.
DORA, J. M.; KELBERT, S.; DEUTSCHENDORF, C.; CUNHA, V. S.; AQUINO, V. R.; SANTOS, R. P.; & GOLDANI, L. Z.; Cutaneous Cryptococcosis gattii in immunocompetent hosts: Case report and review. Mycopathologia, v.161, p. 235-238, 2006.
DROMER, F.; MATHOULIN, S.; DUPONT, B.; LAPORTE, A and the French Crytococcosis Study Group. Epidemiology of cryptococcosis in France: a 9-year survey (1985-1993). Clinical Infectious Diseases, v. 23, p. 82-90, 1996.
DROMER, F.; VARMA, A.; RONIN, O.; MATHOULIN, S.; DUPONT, B. Molecular typing of Cryptococcus neoformans serotype D clinical isolates. Journal of Clinical Microbiololy v. 32, p. 2364-2371, 1994.
ELLIS, D. H. Cryptococcus neoformans var. gattii in Australia. Journal of Clinical Microbiology, v. 25, n. 2, p. 430-431, Fev. 1987.
ELLIS, D. H.; PFEIFFER, T. J.; Ecology, life cycle, and infectious propagule of Cryptococcus neoformans. The Lancet, v. 336, p. 923-925, 1990b.
ELLIS, D.; PFEIFFER, T. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var gattii. Journal of Clinical Microbiology, v. 28, n. 7, p. 1642-1644, 1990a.
ELLIS, D; MARRIOT, D., HAJEH, R. A.; WARNOCK, D.; MEYER, W.; BARTON, R. Epidemiology: surveillance of fungal infections. Medical Mycology, v. 38. p. 173-182, 2000.
EMMONS, C. W. Natural occurrence of opportunistic fungi. Labaratory Investigation, v. 11, n. 11, p. 1026-1032, 1962.
123
EMMONS, C. W. Isolation of Cryptococcus neoformans from soil. Journal of Bacteriology, v. 62, n. 1, p. 685-690, 1951.
ENACHE-ANGOULVANT, A.; CHANDENIER, J. SYMOENS, F; LACUBE, P. J. BOLOGNINI, J.; DOUCHET, C.; POIROT, J. L.; HENNEQUIN, D. Molecular identification of Cryptococcus neoformans serotypes. Journal of Clinical Microbiology, v. 45, n.4., p. 1261-1265, 2007.
ERGIN, C.; ILKIT, M.; KAFTANOĞLU, O. Detection of Cryptococcus neoformans var. grubii (Apis mellifera) colonies. Mycoses, v. 47, p. 431-434, 2004.
ESCADÓN, P., SÁNCHEZ, A., MARTÍNEZ, M., MEYER, W., CASTŇEDA, E. Molecular epidemiology of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans species complex reveals as high genetic diversity and presence of the molecular type VGII mating type a in Colombia. FEMS Yeast Research v. 6, p. 625-635, 2006.
FAMEHIRO, N.; OKAMOTO-HOSOYA, Y.; UBUKATA, S.; HAMADA M. Bacilysocin, a novel phospholipids antibiotic produced by Bacilus subtillis 168. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 45, p. 315-320. 2002.
FELDMESSER, M.; KRESS, Y.; NOVIKOFF, P.; CASADEVALL, A. Cryptococcus neoformans is a facultative intracellular pathogen in murine pulmonary infection. Infection and Immunity v. 68, p. 4225-4237, 2000.
FELL, J. W.; STAZELL-TALLMAN, A. Cryptococcus neoformans Vuillemin. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The Yeast. A taxonomic study. 4ª edição. Ed. Elsevier Science B. V. Amsterdam. p. 742-767, 1998. FELL, J.W.; BOEKHOUT, T.; FONSECA, A; SCORZETTI, G.; STATZELL´TALLMAN. Biodiversity and systematic of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, v. 50, p. 1351-1371, 2000.
FERRER C., COLOM F., FRASE S., MULET E., ABAD J. L., ALIO, J. L. Detection and Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S Ribosomal DNA Typing in Ocular Infections. Journal of Clinical Microbiology v. 39, n. 8, p. 2873–2879, Aug. 2001.
FILIÚ, W. F. O.; WANKE, B.; AGUENA, S. M.; VILELA, V. O.; MACEDO, R. C. L.; LAZÉRA, M. S. Cativeiro de aves como fonte de Cryptococcus neoformans na cidade de Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, v. 35, p. 591-595, 2002.
124
FORTES, S. T. Fontes sapróbias e sexualidade de isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans do estado de Roraima – Brasil. 2001, Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) – Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, Rio de Janeiro, 2001.
FORTES, S. T.; LAZÉRA, M. S.; NISHIKAWA, M. M.; MACÊDO, R. C. L.; WANKE, B. First isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from a native jungle tree in the Brazilian Amazon rainforest. Mycoses, v. 44, p. 137-140, 2001.
FRANZOT, S. P., SALKIN, L. F.; CASADEVALL, A. Cryptococcus neoformans var. grubii separate varietal status for Cryptococcus neoformans serotype A isolates. Journal of Clinical Microbiology, v. 37, p. 838-840, 1999.
FRANZOT, S. P.; HAMDAN, J. S.; CURRIE, B. P.; CASADEVALL, A. Molecular epidemiology of Cryptococcus neoformans in Brazil and the United States: Evidence for both local genetic differences and a global clonal population structure. Journal of Clinical Microbiology, v. 35, n. 9, p. 2243-2251, Sept. 1997.
FRANZOT, S.P.; FRIES, B.C.; CLEARE, W & CASADEVALL, A. Genetic Relationship between Cryptococcus neoformans var. neoformans strains of serotype A and D. Journal of Clinical Microbiology, 36:2200-2204. 1998.
FRASER, J. A.; GILES, S. S.; WENINK, E. C.; GUENES-BOYER, S. G.; WRIGTH, J. R; DIEZMANN, S.; ALLEN, A.; STAIJICH, F. S.; PERFECT, J. R. Same-sex mating and the origin of the Vancouver Island Cryptococcus gattii outbreak. Nature, v. 437, n. 27, p. 1360-1364, Oct. 2005.
FRASER, J. A.; SUBARAN, R. L.; NICHOLS, C. B.; HEITMAN, J. Recapitulation of the sexual cycle of the primary fungal pathogen Cryptococcus neoformans var. gattii: implications for n outbreak on Vancouver Island, Canada. Eukariotic Cell, v.2, n. 5, p. 1036-1045, Oct. 2003.
FRASES, S.; CHASKESS, S.; DADACHOVA, E.; CASADEVAL, A. Induction by Klebisiella aerogenes of a melanin-like pigment in Cryptococcus neoformans. Applied Environmental Microbiology, v. 72, p. 1542-1550, 2006.
FREY, D.; DURIE, B. E. The isolation of Cryptococcus neoformans (Torula histolytica) from soil in New Guinea and pingeon droppings in Sidney, New South Wales. Medical Journal of Australia, v. 1, p. 947-949. 1964.
GAMS, W. Report of the Committee for fungi: Taxon, v. 54 p. 520-522. 2005.
125
GARCIA-HERMOSO, D.; JANBON, G.; DROMER; F.; Epidemiological evidence for dormant Cryptococcus neoformans, infection. Journal of Clinical Microbiology, v.37, n.10, p. 3204-3209. 1999.
GARZA-GARZA, D.; BUENDÍA-URIBE, J. L.; MARTÍNEZ-CRUZ, E,; ARGÜERO-LICEA, B. Caracterizatión de cepas de Cryptococcus neoformans aisladas de pacientes con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Revista Latino-americana de Microbiologia, v. 37, p. 273-279, 1995.
GEZUELE, E.; CALEGARI, L.; SANABRIA, D.; DAVEL, G.; CIVILA, E. Isolation in Uruguay of of Cryptococcus neoformans var. gattii form a nest of the wasp Polybia occidentalis. Revista Iberoamericana de Micologia v. 10, p. 5-6, 1993.
GHANNOUM, M. A.; Potential role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clinical Microbiology Reviews, v. 13, n. 1, p. 122-143, Jan. 2000.
GRANADOS, D. P.; CASTAŇEDA, E. Isolation and characterization of Cryptococcus neoformans varieties recovered from natural sources in Bogotá, Colombia, and study of ecology conditions in the area. Microbial Ecology, v. 49, p. 282-290, 2005.
GRANADOS, D. P.; CASTAŇEDA, E. Influence of climatic conditions on the isolation of members of the Cryptococcus neoformans species complex from trees in the Colombia 1992-2004. FEMS, Yeast Research, v. 6, p. 636-644, 2006.
GRAYBIL, J. R.; TOLLEMAR, J.; TORRES-RODRIGUEZ, J. M.; WALSH, T. J.; ROILIDES, E.; FARMAK, E. Antifungal compounds: controversies, queries and conclusions. Medical Mycology, v. 38, Suplement I, p. 323-333, 2000.
HALYDAY, C. L.; BUI, T; KROCENBERGER, M.; MALIK, R.; ELLIS, D.H.; CARTER, D. A. Presence de α and a mating types in environmental and clinical collections of Cryptococcus neoformans var. gattii strains from Australia. Journal of Clinical Microbiology, v.37, n.9, p. 2920-2926, Sep. 1999.
HAMILTON, A. J.; HOLDOM, M. D,; Antioxidant systems in the pathogenic fungi of man and their in virulence. Medical Mycology, v. 37, p. 375-389 May.1999.
HAWKSWORTH, D. L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections. Studies in Mycology, v. 50, p. 9-18. 2004.
HAWKSWORTH, D.L. The fungal dimension of biodiversity: magnitude, significance and conservation. Mycological Research, v. 95, p. 641-645, 1991.
126
HAYNES, K. A; SULLIVAN D. J.; COLEMAN D. C.; CLARKE, J. C. K.; EMILIANUS, R.; CANN, K. J. Involvement of multiple Cryptococcus neoformans strains in a single episode of cryptococcosis and reinfection with novel strains in recurrent infection demonstrated by random amplification of polymorphic DNA and DNA fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, n. 1, p. 99-102. Jan. 1995.
HERREROS, J. M.; MATÍA, E. C. Therapeutic armamentarium against system fungal infections. Clinical Microbiology and Infectious, v. 12, Suplement 7, p. 53-64, 2006.
HOLMES, C. B.; LOSINA, E.; WALENSKI, R. P.; YAZDANPANAH, Y.; FREEDBERG, K. A.; Review of human immunodeficiency virus type 1-related opportunistic infections in sub-Saharan Africa. CID HIV/AIDS, v. 36, p. 652-661, 2003.
HSU, M. M. M; CHANG, J. C., YOKOYAMA, K., NISHIMURA, K., MIYAJI, M. Serotipes and mating types of clinical strains of Cryptococcus neoformans in Taiwan. Mycopathologia. v. 125, p. 77-81, 1994.
IDNURM, A.; BAHN, Y.-S.; NIELSEN, K.; Lin, Xiaorong, FRASER, J. A.; HEITMAN, J.; Deciphering the model pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbiology, v. 3, p. 753-764, 2005.
IGREJA, R. P. LAZÉRA, M. S. ; WANKE, B.; GALHARDO, M. C. G.; KIDD, S. E.; MEYER, W. Molecular epidemiology of Cryptococcus neoformans isolates from AIDS patients of the Brazilian city, Rio de Janeiro. Medical Mycology, v. 42, p. 229-238, Jun. 2004.
IKEDA, R.; SHINODA, T.; FUKUZAWA, Y.; KAUFMAN, L. Antigenic characterization of Cryptococcus neoformans serotypes and its application to serotyping of clinical isolates. Jounal of Clinical Microbiology v. 36, p. 22-29, 1982.
INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA [2008]. Dados demográficos. Disponível em http:www.ibge.gov.br/home/estatística/população. Acesso em 04.08.2008.
ITO-KUWA, S.; NAKAMURA, K.; AOKI, S.; VIDOTTO, V. Serotype identification of Cryptococcus neoformans by multiplex PCR. Mycoses, v. 50, p. 277-281, 2007.
JABÓN, G. Cryptococcus neoformans capsule biosynthesis regulation. FEMS Yeast Research, v. 4, p. 765-771, 2004.
127
JACOBSON, E.S. Pathogenic roles for fungal melanins. Clinical Microbiological Review, v. 13, p. 708-717, 2000.
JAIN, N.; WICKES, B. L.; KELLER, S. M.; FU, J.; CASADEVALL, A.; JAIN, P.; RAGAN, M. A.; BANERJEE, U.; FRIES, B. Molecular epidemiology of clinical Cryptococcus neoformans strains from India. Journal of Clinical Microbiology, v. 43,n. 11, p. 5733-5742, Nov. 2005. JOHNSON, E. M.; Issues in antifungal susceptibility testing. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 61, Supplement I, p. i13-i18, 2008.
KHAWCHAROENPORN, T.; APISARNTHANARAK, A.; MUNDY, L. M.; Non-neoformans cryptococcal infections: a systematic review. Infection, v.35, p. 51-58, 2007.
KIDD, S. E., SORRELL, T. C.; MEYER, W. Isolation of two molecular types of Cryptococcus neoformans var. gattii from insect frass. Medical Mycology, v. 41, p.171-176, 2003. KIDD, S. E.; HAGEN, F.; TSCHARKE, R. L.; HUYNH, M.; BARLETT, K. H.; FYFE, M.; MCDOUGALL, L.; BOEKHOUT, T.; KWON-CHUNG, K. J.; MEYER, W. A rare genotype of Cryptococcus gattii caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia, Canada). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 101, n 49, p. 7258-17263, Dec. 2004.
KIDD, S. E.; CHOW, Y.; MAK, S.; BACH, P. J.; CHEN, H.; HINGSTON, A. O.; KRONSTAD, J.W.; BARTLETT, K. H. Characterization of environmental of sources of the human and animal pathogen Cryptococcus gattii in British Columbia, Canada, and the Pacific Northwest of United States. Applied and Environmental Microbiology, v. 73, n. 5, p. 1433-1443, Mar. 2007.
KNIGHT, F. R.; MACKENZIE, D. W.; EVANS, B. G.; PORTER, K.; BARRET, N. J.; WHITE, G. C.; Increasing incidence of criptococcosis in the United Kingdom. Journal of Infection, v. 27, p. 185-191. 1993.
KOZEL, T. R.; HERMERATH, C. A. Binding of cryptococcal polissacaccharide to Cryptococcus neoformans. Infectious and Immunity, v. 43, p. 879-886. 1984.
KOZEL, T.R.; Virulence factors of Cryptococcus neoformans. Trends in Microbiolology, v.3, n. 8, p. 295-299. Aug. 1995.
128
KROCKENBERG, M. B.; CANFIELD, P. J; BARNES, J.; VOGENEST, L.; CONNOLLY, J.; LEY, C.; MALIK, R. Cryptococcus neoformans var. gattii in the koala (Phascolarctos cinereus): serological evidence for subclinical cryptococcosis. Medical Mycology, v. 40, p. 273-282, 2002.
KWON-CHUNG, K. J & BENNETT, J. E. Cryptococcosis. In: Medical Mycology, p.397-446, 1992.
KWON–CHUNG, K. J & BENNETT, J.E. Distribution of α and a mating types of Cryptococcus neoformans among natural and clinical isolates. American Journal of Epidemiology, v. 108, n. 4, p. 337-340, 1978.
KWON-CHUNG, K. J. BENNETT, J. E.; THEODORE, T. S. C., Cryptococcus bacilisporus sp nov. serotype B-C of Cryptococcus neoformans. Intternational Journal of Systematic and Bacteriology, v. 28, p. 616-620, 1978.
KWON-CHUNG, K. J.; BENNETT, J. E.; RHODES, J. C. Taxonomic studies on Filobasidiella neoformans and their anamorphs. Antonie van Leeuwenhoek, v.48, p. 25-38.1982a.
KWON-CHUNG, K. J.; POLACHECK, I.; BENNETT, J. E. Improved diagnosttic medium for separation, of Cryptococcus neoformans var. neoformans (serotypes A and D) and Cryptococcus neoformans var. gattii (serotypes B and C). Journal of Clinical Microbiology v. 15, p. 535-537, 1982b.
KWON–CHUNG, K.J. Filobasidiella Kwon-Chung. In: KURTZMAN, C. P.; FELL, J. W. The Yeasts. A taxonomic study. 4ª edição. Ed. Elsevier Science B. V. Amsterdam, p. 656-662, 1998.
KWON-CHUNG, K.J. A new genus, Filobasidiella, the perfect state of Cryptococcus neoformans. Mycologia, v. 67, p. 1197-1200. 1975.
KWON-CHUNG, K.J. A new species of Filobasidiella, the sexual state of Cryptococcus neoformans B and C serotypes. Mycologia, v. 68, p. 942-946. 1976a.
KWON-CHUNG, K.J. Morphogenesis of Filobasidiella neoformans, the sexual state of Cryptococcus neoformans. Mycologia, v. 68, p. 821-833. 1976b.
KWON-CHUNG, K.J., CHANG, Y. C.; BAUER, R. SWAN, E. C., TAYLOR, J. W.; DOEL, R. The characteristics that differentiate Filobaidiella depauperata from Filobasidiella neoformans. Studies in Mycology, v. 38, p. 67-79, 1995.
129
KWON-CHUNG, K.J., EDMAN, J.; WICKES, B. Genetic association of mating types and virulence in Cryptococcus neoformans. Infectious and Immunity, v. 60, n. 2, p. 602-605, Fev. 1992.
KWON-CHUNG, K.J.; BOEKHOUT, T.; FELL, J.; DIAZ, M. Proposal to conserve the name Cryptococcus gattii against C. hondurianus and C. bacillisporus (Basidiomycota, Hymenomycetes, Tremellomycetidae). Taxon, v. 51, p. 804-806. 2002.
KWON-CHUNG, K.J.; SORRELL, T.C.; DROMER, F.; FUNG, E.; LEVITZ, M. Cryptococcosis: clinical and biological aspects. Medical Mycology, v. 38, Supplement I, p. 205-213, 2000.
KWON-CHUNG, K.J; FELL, J.W. Filobasidiella Kwon-Chung, In: Krieger Van Rij (ed) The yeast: a taxonomic study. Elsevier Science Pulishers. Amsterdam. 3a ed, p.472-482.1984.
LACAZ, C. S.; HEINS-VACCARI, E. M.; HERNÀNDEZ-ARRIAGADA, G.L.; MARTINS, E. L.; PREARO, C. A. L.; CORIM, S. M.; & MARTINS. M.A. Primary cutaneous cryptococcosis due to Cryptococcus neofarmans var gattii serotype B, in an immunocompetent patient. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. V 44, n. 4, p. 225-228. 2002b.
LACAZ, C. S.; PORTO, E.; MARTINS, J. E. C.; HEINS-VACCARI, E. M.; MELO, N. T. Criptococose. In: Tratado de Micologia Médica, 9ª edição. Ed. Sarvier, p. 416-440, 2002a.
LAGROU, K. ; VAN ELDERE, J. ; KEULEERS, S.; HAGEN, F. ; MERCKX , R. ; VERHAEGEN, J. ; PEETERMANS, W. E. ; BOEKHOUT, T. Zoonotic transmission of Cryptococcus neoformans from a magpie to an immunocompetent patient. Journal of Internal Medicine. v. 259, p. 385–388, 2005.
LAZÉRA, M. S.; TRILLES, L.; NISHIKAWA, M. M.; WANKE, B. Criptococose – aspectos atuais. In: Micologia: avanços no conhecimento. 5º Congresso Brasileiro de Micologia, p. 344-348, 2007.
LAZÉRA, M.S.; CAVALCANTI, M.A.S.; LONDERO, A.T.; TRILLES, L.; NISHIKAWA, M.M.; WANKE, B. Possible primary niche of Criptococcus neoformans. Medical Mycology, v. 38, p. 379-383, 2000.
130
LAZÉRA, M.S.; CAVALCANTI, M.A.S.; TRILLES, L.; NISHIKAWA, M.M.; WANKE, B. Cryptococcus neoformans var. gattii in a pottery tree hollow – evidence for a natural habitat related to decaying wood. Journal of Medical and Veterinary Mycology, v. 36, p.119-122. 1998.
LAZÉRA, M.S.; GUTIERREZ-GALHARDO, M.C.; CAVALCANTI, M.A.S.; WANKE, B. Criptococose. In: COURA J. R. Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias. Vol II. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, v. 2, p.1223-1235, 2005.
LAZÉRA, M.S.; PIRES, F.D.A.; CAMILLO-COURA, L.; NISHIKAWA, M.M, BEZERRA, C.C.F.; TRILLES, L. WANKE, B. Natural Habitat of Cryptococcus neoformans var neoformans in decaying wood forming hollows in living trees. Journal of Medical & Veterinary Mycology, v. 34, p.127-131, 1996.
LAZÉRA, M.S.; WANKE, B.; NISHIKAWA, M.M. Isolation of both varieties of Cryprococcus neoformans from saprophytic sources in the city of the Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical and Veterinary Mycology, v. 31, p.449-459. 1993.
LENGELER, K. B.; WANG, P.; COX, G. M.; PERFECT, J. H.,; HEITMAN, J. Identification of the MATa mating-type locus of Cryptococcus neoformans reveals a serotype A MATa strain thought to have been extinct. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 97, n. 26, p. 14455-14460, Dec.2000.
LICEA, B. A.; GARZA, D. G.; URBIETA, V. F.; OLIVARES, R. A. C. Aislamiento y caracterización de Cryptococcus neoformans var. gattii a partir de muestras de Eucaliptus camaldulensis en la ciudade de México. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 16, n. 1, p. 40-42, 1999.
LIN, X.; HEITMAN, J. The Biology of the Cryptococcus neoformans Species Complex. Annual Review of Microbiology, v. 60, p. 69-105, 2006.
LINDENBERG, A. S. C.; CHANG, M. R.; PANIAGO, A. M. M.; LAZÉRA, M. S.; MONCADA, P. M. F.; BONFIM, G. F.; NOGUEIRA, S. A.; WANKE, B. Clinical and epidemiological features of 123 cases of cryptococcosis in Mato Grosso do Sul, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo. V. 50, n.2, p.75-78. 2008.
LITVINTSEVA, A. P.; THAKUR, R.; RELLER, B.; MITCHELL, T. G.; Prevalence of Clinical Isolates of Cryptococcus gattii serotype C among patients with AIDS in sub-Saharan Africa. The Journal of Infectious Diseases. v. 192. p. 888-892, 2005.
131
LIU, L.; TEWARI, R. P.; WILLIAMSON, P. Laccase protects Cryptococcus neoformans from antifungal activity of alveolar macrophages. Infection and Immunity, v. 67, n. 11, p. 6034-6039, Nov. 1999.
LOFTUS, B. J.; FUNG, E.; RONCAGLIA, P.; ROWLEY, D; AMEDEO, P.; BRUNO, D.; VAMATHEVAN, J.; MIRANDA, M.; ANDERSON, I. J.; FRASER, J. A.; ALLEN, J. E,; BOSDET, I. E.; BRENT, M. R.; CHIU, R.; DOERING, T. L.; DONLIN, M. J.; D’SOUZA, C. A.; FOX, D. S.; GRINBERG, V.; FU, J.; FKUSHIMA, M.; HAAS, B. J.; HUANG,J. C.; JANBON, G.; JONES, S. J. M.; KOO, H. L.; KRZYWINSKI, M. I.; KWON-CHUNG, J. K.; LENGELER, K. B.; MAITI, R.; MARRA, M. A.; MARA, R. E; MATHEWSON, A. A.; MITCHELL, T. G.; PAER, M.; RIGGS, F. R.; SALZBERG, S. L.; SCHEIN, J. E.; SHVARTSBEYN, A.; SHIN. H.; SHUMWAY, M.; SPECHT, A. A.; SUH, B. B.; TENNEY, A.; UTTERBACK, T. R.; WICKES, B. L.; WORTMANS, J.R.; WYE, N. H.; KRONSTAD, J. W.; LODGE, J. K.; HEITMAN, J.; DAVIS, R. W.; FRASE, A. M.; HYMAN, R. W. The genome of the Basidiomycetous yeast and human pathogen Cryptococcus neoformans, Science, v. 307, p. 1321-124, Feb. 2005.
LOPES-MARTÍNEZ, R.; SOTO-HERNANDEZ, J.L.; OSTOSKI-ZEICHNER, L.; CASTAÑÓN-OLIVARES, L.R.; ANGELES-MORALES, V.; SOTELO, J. Cryptococcus neoformans var. gattii among patients with cryptococcal meningitis in México. First observation. Mycophatologia, v. 134, p. 61-64. 1996.
LUGARINI, C.; GOEBEL, C. S.; CONDAS, L. A. Z.; MURO, M. D.; FARIAS, M. R.; FERREIRA, F. M.; VAINSTEIN, M. H. Cryptococcus neoformans isolated from Passerine and psitacine bird excreta in the state of Paraná, Brazil. Mycopathologia, v. 166, n. 2, p. 61-69, Aug, 2008.
LUI, G.; LEE, N.; IP, M.; CHOI, K. W.; TSO, Y. K.; LAM, E.; CHAU, S.; LAI, R.; COCKRAM, C. S.; Cryptococcosis in apparently immunocompetent patients. Q J Med, v. 99, p. 143-151, 2006.
MacDOUGALL, L.; FYFE, M. Emergence of Cryptococcus gattii in a novel environmental provides clues to its incubation period. Journal of Clinical Microbiology, v. 44, n. 5, p. 1851-1852. May, 2006.
MACHADO, C. C.; AMARAL, A. A.; SEVERO, L. C. Cryptococcus neoformans var. neoformans isolados do solo. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 35, n. 1, p. 77-79, 1993.
MAERTENS, J. A. History of the development of azole derivatives. Clinical Microbiology Infection, v.10, Supplement 1, p. 1-10, 2004.
132
MAHMOUD,Y. A.-G.; First environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans and var. gattii from the Gharbia Governorate, Egypt, Mycopathologia, v. 148, p. 83-86,1999.
MARTINS, L. M. S. Epidemiologia da Criptococose em crianças e adultos jovens e diversidade de Cryptococcus neoformans no Meio Norte do Brasil. Rio de Janeiro. Dissertação (Mestrado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz. 2003.
MARTINS, L. M. S.; LAZÉRA, M. S.; LEAL, M. J. S.; CAVALCANTI, M. A. S.; EULÁLIO, K. D.; WANKE, B. Infecção Mista por Sorotipo A e B de C. neoformans como causa de meningoencefalite em criança de Itaituba- PA: Relato de Caso. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. Suplemento I (38), Belém-PA. 2003.
MATSUMOTO, M. T.; FUSCO-ALMEIDA, A. M.; BAEZA, L. C.; MELHEM, M. S. C.; Genotyping, serotyping and determination of mating-type of Cryptococcus neoformans clinical isolates from São Paulo state, Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 49, p. n.1, p. 41-47, 2007.
MEYER, W.; CASTAÑEDA, A.;JACKSON, S. HUYNH, M; CASTAÑEDA. E.; and IberoAmerican Cryptococcal Stuy Group. Molecular typing of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerging Infectious Diseases. February, 2003, v. 9,n. 2, p. 189–195, Feb. 2003.
MEYER, W.; MARSZEWSKE, K.; AMIRNOSTOFIAN, M.; IGREJA, R.P.; HARDTKE, C.; METHLING, K.; VIVIANI, M.A; CLINDAMPORN, A.; SUCROOGREUNG, S.; JOHN, M. A.; ELLIS, D.; SORRELL, T. C. Molecular typing of global isolates of Cryptococcus neoformans by polymerase chain reaction fingerprinting and randomly amplified polymorphic DNA – a pilot study to standertize tecnhiques on wich to base a detailed epidemiological survey. Electophoresis, v. 20, p.1790- 1799, 1999.
MILLER, J. L.; SCHELL, W. A.; WILLS, E. A.; TOFFALETTI, D. L.; BOYCE, M.; BENJAMIN JR, D. K.; BARTOLI, J.; PERFECT, J. R. In vitro and in vivo efficacies of the new triazole albaconazole against Cryptococcus neoformans, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 48, n. 2, p. 384-387, Feb. 2004.
MINISTÉRIO DA SAÚDE. Programa nacional de doenças sexualmente transmissíveis, Brasília. Brasil. Bol. Epidemiol. AIDS. Ano XIII. n. 1. 2000.
133
MIRZA, S. A.; PHELAN, M.; RIMLAND, D.; GRAVISS, E.; HAMIL.; R.; BRANDT, M. E.; GARDNER, T.; SATTAH, M.; DE LEON, G. P.; BAUGHMAN, W. HAJJEH, R. A.; The changing epidemiology of cryptococcosis: an update from population-based active surveillance in 2 large metropolitan areas, HIV/AIDS CID v.36, p.789-794, 2003.
MISHRA, S. K. F.; STAIB, F.; FOLKENS, U.; FROMTLIMG, R. A. Serotypes of Cryptococcus neoformans strains isolated in Germany. Journal of Clinical of Microbiology. v. 14, p. 106-107. 1981.
MITCHELL, T. G.; PERFECT, J. R.; Cryptococcosis in the era of AIDS-100 years after the discovery of Cryptococcus neoformans. American Society for Microbiology, v.8, n.4, p. 515-548, 1995.
MONTENEGRO, H.; PAULA, C.R. Environmental isolation of Cryptococcus neoformans var gattii and Cryptococcus neoformans var. neoformans in the city of São Paulo, Brazil. Medical Mycology, v. 38, p.385-390, 2000.
MOORE, T. D.; EDMAN, J. C. The alpha-mating type locus of Cryptococcus neoformans contains a peptide pheromone gene. Molecular and Cellular Biology. v. 13, p. 1962-1970. 1993.
MORGAN, J.; McCARTHY, K. M.; GOULD, S.; FAN, K.; ARTHINGTON-SKAGGS, B.; IQBAL, N.; STAMEY, K.; HAJJEH, R. A.; BRANDT, M. E.; Cryptococcus gattii infection: Characteristics and epidemiology of cases identified in a south African province with high HIV seroprevalence, 2002-2004. HIV/AIDS CID, v.43, p.1077-1080, 2006.
MYLONAKIS, E.; IDNURM, A.; MORENO, R.; EL KHOURY, J.; ROTTMAN, J. B.; AUSUBEL, F. M.; HEITMAN, J.; CALDERWOOD, S. B. Cryptococcus neoformans Kin1 protein kinase homologue, identified through a Caenorhabditis elegans screen, promotes virulence in mammals. Molecular Microbiology, v. 54, n. 2, p. 407-419, 2002.
MYLONAKIS, E.; MORENO, R.; EL KHOURY, J. B.; IDNURM, A; HEITMAN, J.; CALDERWOOD, S. B.; AUSUBEL, F. M.; DIENER, A. Galleria mellonella as a model system to study Cryptococcus neoformans pathogenesis. Infection and Immunity, v 73, n. 7, p. 3842-3850, 2005.
NAWANGE, S. R.; SHAKIA, K.; NAIDU, J.; SINGH, S. M.; JHARI, N.; GARG, S. Decayed wood inside hollow trunks of living trees of Tamarindus indica, Syzygium cumini and Mangifera indica as natural habitat of Cryptococcus neoformans and their serotypes in Jabalpur City of Central India. Journal de Mycologie Médicale, v. 16, p. 63-67, 2006.
134
NEILSON, J., B.; IVEY, M. H.; BULMER, G. S.; Cryptococcus neoformans: pseudohyphal forms surving culture with Acanthamoeba poliphaga. Infection and Immunity, v. 20, n. 1, p. 262-266, Apr.1978.
NEILSON, J., B; FROMTLING, R. A.; BULMER, G. S. Cryptococcus neoformans: size range of infectious particule from aerosolized soil. Infection and Immunity, v. 17, n. 3, p. 634-68, 1977.
NEUVILLE, S.; DROMER, F.; MORIN, O.; DUPONT, B.; RONIN, O.; LORTHOLARY, O. Primary cutaneous cryptococcosis: a distinct clinical entity. Clinical Infectious Diseases, v. 36, p. 337-346, 2003.
NIELSEN, K., COX, G. M.; LITVINTSEVA, A. P.; MYLONAKIS, E.; MALLIARIS S. D.; BENJAMIN, D. K; GILES, S. S.; MITCHELL, T. G.; CASADEVALL, A.; PERFECT, J. R.; HEITMAN, J. Cryptococcus neoformans α strains preferentially disseminate to the Central Nervous System during coinfection. Infection and Immunity, v. 73, n. 8, p. 4922-4933, Aug. 2005.
NIELSEN, K.; COX, F. M; WANG, P.; TOFFALETTI, D. L.; PERFECT, J. R; HEITMAN, J. Sexual cycle of Cryptococcus neoformans var. grubii and virulence of congenic a and α isolates. Infection and Immunity, v. 71, n. 9, 4831-4841, Sept. 2003.
NISHIKAWA, M.M.; LAZÉRA, M.S.; BARBOSA, G.G.; TRILLES, L.; BALASSIANO, B.R.; MACEDO, R.C. L; BEZERRA, C. C. F; PÉREZ, M. A; CARDARELLI, P.; WANKE, B. Serotyping of 467 Cryptococcus neoformans isolates from clinical and environmental sources in Brazil: analysis of host and regional patterns. Journal of Clinical Microbiology, 41, p.73-74, 2003.
NOSANCHUCK, J. D.; CASADEVALL, A. Budding of melanized Cryptococcus neoformans in the presence or absence of L-dopa. Microbiology, v. 149, p. 1945-1951, 2003.
OBSERVATÓRIO DAS METRÓPOLES. [Homepage da internet]. Como anda a Rede =20 Metropolitana de Belém. Rio de Janeiro: UFRJ, [c2006-2008], [Acesso em: 09.11.2007]. Disponível em: http://www.observatoriodasmetropoles.ufrj.br/como_anda/como_anda_RM_belem=pdf. O’DONNELL, K., CIGELNIK, E., WEBER, N. S. & TRAPPE, J. M. Phylogenetic relationships among ascomycetous truffles and thetrue and false morels inferred from 18S and 28S rDNA sequenceanalysis. Mycologia, v. 89, p. 48-65, 1997.
135
OKABAYASHI, K.; HASEGAWA, A.; WATANABE, T. Microreview: Capsule-associated genes of Cryptococcus neoformans. Mycopathologia, v. 163, p. 1-8, 2007.
OLIVEIRA NETTO, I.C.O.; MACHADO, C.C.; WAGNER, M. B & SEVERO, L.C.. Meio século de criptococcose no Brasil: revisão de 308 casos (1941- 1992). Infectologia, v. 7, p. 5-14, 1993.
OOI, B.; CHEN, B. T. M.; LIN, C. H.; KHOO, O. T.; CHAN, K. T. Survival of a patient transplanted with a kidney infected with Cryptococcus neoformans. Transplantation, v. 11, p. 428-429, 1981.
ORDOŇEZ, N.; CASTAŇEDA, E. Varieties and serotypes of Cryptococcus neoformans clinical isolates in Colombia. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 18, p. 128-130, 2001.
PAL, M. First report of isolation of Cryptococcus neoformans var. neoformans from avian excreta in Kathmandu, Nepal. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 14, p. 181-183, 1997.
PAPPALARDO, M. C. S. M.; MELHEM, M. S. C.; Cryptococcosis: a review of the Brazilian experience for the disease. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 45, n. 6, p. 299-305, 2003.
PARÁ, Companhia de Habitação do Estado do Pará. Relatório ambiental da região metropolitana de Belém, 1997, 261 p.
PASSONI, L. F. C.; Wood, animals and human beings as reservoirs for human Cryptococcus neoformans infection. Revista Iberoamericana de Micologia, v.16, p. 77-81, 1999.
PASSONI, L.F.C.; WANKE, B.; NISHIKAWA, M.M.; LAZÉRA,M.S. Cryptococcus neoformans isolated from human dwellings in Rio de Janeiro, Brazil; an analysis of the domestic environment of AIDS patients with and without cryptocococcosis. Medical Mycology, v. 36, p. 305-311, 1998.
PEDROSO, R. S.; FERREIRA, J. C.; CANDIDO, R. C. The isolation and characterization of virulence factors of Cryptococcus spp. from saprophytic sources in the city of Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil. Microbiol ogical Research, 2006; (2007), doi:10.1016/j.micres.2007.01.
136
PEREA, S.; PATTERSON, T. F.; Antifungal resistence in pathogenic fungi. Antimicrobial Resistence, v.35, p. 1073-1080, 2002.
PERFECT, J. R, MAGEE, B. B.; MAGEE, P. T. Separation of chromosomes of Cryptococcus neoformans by pulsed field gel electrophoresis. Infection and Immunity, v. 57, n. 9, p. 2624-2627, Sept. 1989.
PERFECT, J. R.; Cryptococcus neoformans: the yeast that likes it hot. FEMS Yeast Research, v. 6, p. 463-488. 2006.
PERFECT, J. R.; KETABCHI, N.; COX, G. M. C.; INGRAM, C. W.; BEISER, C. Karyotyping of Cryptococcus neoformans as an epidemiological tool. Journal of Clininal Microbiology, v. 31, p. 3305-3309, 1993.
PERFECT, J.R.; CASADEVALL, A. Cryptococoses. Infectious Disease Clinics of North America, 16, p. 837-874, 2002.
PFALLER, M. A.; MESSER, S. A.; BOYKEN, L.; HOLLIS, R. J. RICE, S.; TENDOLKAR, S. DIEKMAN, D. J. In vitro activities of voriconazole, posaconazole and fluconazole against 4,169 clinical isolates of Candida spp and Cryptococcus neoformans collected during 2001 and 2002 in the ARTEMIS global antifungal program. Diagnosticic Microbiology and Infectious Disease, v. 48, n. 3, Mar, p. 201-205, 2004.
PFALLER, M. A.; MESSER, S. A.; BOYKEN, L.; RICE, C.; TENDOLKAR, S. HOLLIS, R. J.; DOERN, G. V.; DIEKMA, D. J. Global trends in the antifungal susceptibility of Cryptococcus neoformans (1990 to 2004). Journal of Clinical Microbiology, v. 43, n. 5, p. 2163-2167, May. 2005.
PFEIFFER, M.; ELLIS, D. Environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from California. Journal Infectious Diseases, v. 163, p. 8929 – 930, 1991.
PFEIFFER, T. J.; ELLIS, D. H.; Environmental isolation of Cryptococcus neoformans var. gattii from Eucalyptus tereticornis. Journal of Medical and Veterinary Mycology, v. 30, p. 407-408. 1992.
POLACHECK, I.; HEARING, V. J.; KWON-CHUNG, K. J. Biochemical studies of phenoloxidase and utilization of catecholamines in Cryptococcus neoformans. Journal of Bacteriology, v. 150, n. 3, p. 1212-1220, Jun. 1982.
137
POLACHECK, I.; KWON-CHUNG, K. J. Creatinine metabolism in Cryptococcus neoformans and Cryptococcus bacillisporus. Journal of Bacteriology, v. 142, n 1, p. 15-20, Apr. 1980. POLACHECK, I.; PLATT, Y.; ARONOVITCH, J. Catecholamines and virulence of Cryptococcus neoformans. Infections and Immunity, v. 58, p. 2919-2922, 1990.
PREFEITURA MUNICIPAL DE ANANINDEUA. Anuário Estatístico do Município de Ananindeua. Ananindeua, PA, p. 1-123, 2007.
PREFEITURA MUNICIPAL DE BELÉM. Anuário Estatístico do Município de Belém. p. 1-460, 2006.
QUINTERO, E.; CASTAŇEDA, E.; RUIZ, A. Distribuición ambiental de Cryptococcus neoformans en el departamento de Cundinamarca-Colombia. Revista Iberoamerica de Micologia, v. 22, p. 93-98, 2005.
RANDHAWA, H. S.; KOWSHIK, T.; KHAN, Z. U. Decayed wood Syzigium cumini and Ficus religiosa living trees in Delhi/New Delhi metropolitan are as natural habitat of Cryptococcus neoformans, Medical Mycology, v. 41, p. 199-209, 2003.
RASO, T.F.; WERTHER, K.; MIRANDA, E. T. MENDES-GIANNINI, M. J. S.; Cryptococcosis outbreak in psittacine birds in Brazil. Medical Mycology, v.42, p.355-362. 2004.
REIMÃO, J. Q.; DRUMMOND, E. D.; TERCETI, M. S.; LYON, J. P.; FRANCO, M. C.; DIQUEIRA, A. M. Isolation of Cryptococcus neoformans from hollows trees in the city of Alfenas, MG, Brazil, Mycoses, v. 50, p. 261-264, 2007.
REOLON, A.; PEREZ, L. R. R.; MEZZARI, A. Prevalência de Cryptococcus neoformans nos pombos urbanos da cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 40, n. 5, p. 293-298, Out. 2004.
RESTREPO, A.; BAUMGARDNER, D. J. BAGALI, E.; COOPER JR, C. R.; MCGINNIS, M. R,; LAZÉRA, M. DOS S.; BARBOSA, F. H.; BOSCO, S. M. G.; CAMARGO, Z. P. FR; COELHO, K. J. R. FORTES, S. T.; FRANCO, M.; MONTENEGRO, M. R.; SANO, A.; WANKE, B. Clues to the presence of pathogenic fungi in certain ennvironments. Medical Mycology, v. 38. Suplement I. p. 67-77, 2000.
138
ROCHA, M. F. G.; SIDRIM, J. J. C. Drogas antifúngicas utilizadas na terapêutica contemporânea. In: SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de autores contemporâneos. Guanabara-Koogan, p.50-62, 2004.
ROSAS, A. L.; CASADEVALL, A.; Melanization affects susceptibility of Cryptococcus neoformans to heat and cold. FEMS Microbiology Letters, v. 153, p. 265-272, 1997.
ROSAS, A. L.; NOSANCHUK, J. D.; FELDMESSER, M.; COX, G. M.; McDADE, H. C.; CASADEVALL, A. Synthesis of polymerized melanin by Cryptococcus neoformans in infected rodents. Infection and Immunity, v. 68, p. 2845-2853, 2000. ROSAS. A. L.; CASADEVALL, A. Melanization decreases the susceptibility of Cryptococcus neoformans to enzymatic degradation. Mycopathologia, v. 151, p. 53-56, 2000.
ROZENBAUM, R. ; GONÇALVES, A. J.; WANKE, B.; VIERA, W. Cryptococcus neoformans var. gattii in a Brazilian AIDS patient. Mycopathologia, v. 112, p. 33-34, 1990.
ROZENBAUM, R.; GONÇALVES, A.J.R.; WANKE, B CAIUBY, M. J.; CLEMENTE, H.; LAZÉRA, M. S.; MONTEIRO, P. C. F.; LONDERO, A. T. Cryptococcus neoformans varieties as agents of criptococcosis in Brasil. Mycopathologia,v. 119, p. 133-136. 1992.
RUIZ, A., FROMTLING, R. A.; BULMER, G. S. Distribution of Cryptococcus neoformans in natural site. Infection and Immunity, v. 31, n. 2, p. 560-563, Fev. 1981.
RUIZ, A., NEILSON, J. B.; BULMER, G. S. Control of Cryptococcus neoformans in nature by biotic factors. Sabouraudia, v. 20, p. 21-29, 1982.
RUIZ, A.; BULMER, G. S. Particle size of airborne Cryptococcus neoformans in a tower. Applied and Environmental Microbiology, v. 41, n. 5, p. 125-129. 1981.
RUIZ, A.; VELEZ, D.; FROMTLING, R. A. Isolation of saprophytic Cryptococcus neoformans from Puerto Rico: distribution and variety. Mycophatologia. v. 106, p. 167-170. 1989.
SANTOS, L. O. Criptococose no estado do Amazonas: estudo de 75 casos diagnosticados na Fundação de Medicina Tropical/ FMT/ IMTM (1988- 1998). Dissertação (Mestrado em Medicina Tropical) – Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ, 2000.
139
SANTOS, W. R. A.; LAZÉRA, M. S.; WANKE, B.; MORALES, B; TRILES, L; COSTA, S. P. S. E.; BARBOSA, G.; MEYER, W. Isolados clínicos de Cryptococcus neoformans distribuídos por mesorregiões do estado do Pará, região Norte do Brasil. In: Simpósio Nacional de Micologia Médica: Cromoblastomicose, Lobomicose, Paracoccidiodomicose e Criptococose. Resumos. Belém/PA, p. 61, 2005.
SEVERO, L. C.; BERTA e ZARDO, I.; LONDERO, A. T.; Cutaneous cryptococcosis due to Cryptococcus neoformans var. gattii. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 18, 200-201. 2001.
SORRELL, T. C. Cryptococcus neoformans variety gattii. Medical Mycology, v. 29, p. 155-168, Feb. 2001.
SORRELL, T. C.; ELLIS, D. H.; Ecology of Cryptococcus neoformans. Revista Iberoamericana de Micologia, v. 14, p. 42-43, 1997.
SORRELL, T.; CHEN, S. C. A.; RUMA, P.; MEYER, W.; PFEIFFER, T.; ELLIS, D. H.; BROWNLEE, A. G. Concordance of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans var. gattii by random amplification of polymorphic DNA analysis and PCR fingerprinting. Journal of Clinical Microbiology, v. 4, n. 5, p.1256-1260, May. 1996.
STEENBERGEN, J. N.; CASADEVALL, A. The origin and maintenance of virulence for the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans. Microbes and Infection, v. 5, p. 667-675, 2003
STEENBERGEN, J. N; SHUMAN, H. A.; CASADEVALL, A. Cryptococcus neoformans interactions with amoebae suggest an explanation for its virulence and intracellular pathogenic strategy in macrophages. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 98, n. 26, p.15245-15250, Dez. 2001.
STEENBERGEN, J.N & CASADEVALL, A.. Prevalence of Cryptococcus neoformans var. neoformans (Serotype D) and Cryptococcus neoformans var. grubii (Serotype A) isolates in New York City. Journal Clinical Microbiology, v.38, p.1974-1976. 2000.
STEENBERGEN, J.N.; NOSANCHUK, J. D.; MALLIARIS, S. D.; CASADEVALL, A. Cryptococcus neoformans virulence is enhanced after growth in the genetically malleable host Dictyostelium discoideum. Infection and Immunity, v.71, n. 9, p. 4862-4872, Sept. 2003.
140
STEPHEN, C.; LESTER, S.; BALCK, W.; FYFE, M, RAVERTY, S. Multispecies outbreak of criptococcosis on southern Vancouver Island, Bristih Columbia. Canadian Veterinary Journal, v. 43, p. 792-794, Oct. 2002.
SWINNE, D.; DE VROY, C. Cryptococcosis and ecology of C. neoformans in tropical countries. In: JANARDHANAN, K. K.; RAJENDRAN, C.; NATARAJAN, K; HAWKSWORTH, D. L. Tropical Mycology. Science Publisers, IC. USA, p. 304-308, 1997.
SWINNE, D.; DEPNNER, M.; LAROCHE, R.; FLOCH, J.J.; KAPEND, P. Isolation of Cryptococcus neoformans from houses of AIDS–associated cryptococosis patients in Bujumbura (Burundi): an epidemiological study. AIDS, v. 3, p.389-390, Jun. 1989.
SWINNE, D.; SWINNE D, DEPPNER M, MANIRATUNGA S, LAROCHE R, FLOCH JJ, KADENDE P. AIDS- associated cryptococcosis in Bujumbura, Burundi: an epidemiological study. Journal of Medical and Veterinary Mycology, v. 29, p. 25-30, 1991.
TANG, R. J; BREGER, J.; IDNURM, A.; GERIK, K. J.; LODGE, J. K.; HEITMAN, J.; CALDERWOOD, S. B.; MYLONAKIS, E. Cryptococcus neoformans gene involved in mammalian pathogenesis identified by Caenorhabditis elegans progeny-based approach. Infection and Immunity, v. 73, n. 12, p. 8219-8225. Dez. 2005.
TAY, S. T.; CHAI, H. C.; NA, S. L.; HAMIMAH, H.; ROHANI, M.Y.; SOO-HOO, T. S. The isolation, characterization and antifungal susceptibilities of Cryptococcus neoformans from bird excreta in Klang Valley, Malasya. Mycopathology, v. 159, p. 509-513, 2005.
TAYLOR, R. L., DUANGMANI, C. Occurrence of Cryptococcus neoformans in Thailand. American Journal of Epidemiology. v. 87, p. 318-322, 1968.
THOMAS, C. J.; LEE, J. Y.; CONN, L. A.; BRADLEY, M. E.; GILLESPE, R. W.; DILL, RS. R; PINNER, R. W.; PAPPAS, P. G. Surveillance of cryptococcosis in Alabama, 1992-1994. Annais Epidemiololy, v. 8, n. 4, p 212-216, 1998.
TORRES-RODRÍGUEZ, J. M.; ALVARADO-RAMÍREZ, E.; MURCIANO, F.; SELLART, M. MICs and minimum fungicidal concentrations of posaconazole, voriconazole and fluconazole for Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, v. 62, p. 205-210, 2008.
141
TORTRANO, A. M.; VIVIANI, M. A.; RIGNONI, A. L.; COGLIATI, M.; ROVERSELLI, A.; PAGANO, A. Prevalence of serotype D in Cryptococcus neoformans isolates from HIV positive and HIV negative patients in Italy. Mycoses, v. 40, p. 297-302, May, 1997.
TRILLES, L.; FERNÁNDEZ-TORRES, B.; LAZÉRA, M. S.; WANKE, B.; GUARRO, J. In vitro antifungal susceptibility of Cryptococcus gattii. Journal of Clinical Microbiology, v. 42, n. 10, Oct. 2004.
TRILLES, L.; LAZÉRA, M.S.; WANKE,B.; THEELEN, B.; BOEKHOUT, T. Genetic characterization of environmental isolates of the Cryptococcus neoformans species complex from Brazil. Medical Mycology, v. 41, p. 383-390, 2003.
VANDENBOSSCHE, I.; VANEECHOUTTE, M; VANDEVENNE, M.; DE BAER, T.; VERSCHRAEGEN, G. Susceptibility testing of fluconazole by the NCCLS broth macrodilution method, E-test, and disk diffusion for application in the routine laboratory. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, n. 3, p. 918-921, Mar. 2002.
VARMA, A.; KOWN-CHUNG, K. J.; DNA probe for strain typing of Cryptococcus neoformans. Journal of Clinical Microbiology, v. 30, n. 11, p. 2960-2967, Nov. 1992.
VARMA, A.; SWINNE, D.; STAIB, F.; BENNETT, J. E.; KWON-CHUNG, K. J. Diversity of DNA fingerprints in Cryptococcus neoformans. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, n. 7, p. 1807-1814, Jul. 1995.
VILCINS, I.; KROCKENBERG, M.; AGUS, A; CARTER D. Environmental sampling for Cryptococcus neoformans var. gattii from the Blue Mountains National Park, Sidney, Australia. Medical Mycology, v. 40, p. 53-60, 2002.
VIVIANI, M. A., ANTINORI, S., COCLIATI, M., ESPOSITO, M. C.; FMUA CRYPTOCOCCOSIS NETWORK. European Confederation of Medical Mycology (ECMM) prospective survey of cryptococcosis: report from Italy. Medical Mycology, v. 40, p. 507-517, 2002.
VIVIANI, M. A.; COGLIATI, M.; ESPOSITO, M. C.; LEMMER, K.; TINTELNOT, K.; VALIENTE, M. F. C.; SWINNE, D.; VELEGRAKI, A.; VELHO, R.; FMUA CRYPTOCOCCOSIS NETWORK. The European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Cryptococcosis Working Group. Molecular analysis of 311 Cryptococcus neoformans isolates from a 30-month ECMM survey of cryptococcosis in Europe. FEMS Yeast Reseach, v. 6, p. 614-619. 2006.
142
WANG, Y.; CASADEVALL, A. Growth of Cryptococcus neoformans in presence of L-dopa decreases its susceptibility to amphotericin B. Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, v. 38, p. 2648-2650. 1994.
WANKE, B.; LAZÉRA, M. S. Paracoccidiodomicose e coccidioidomicose no Brasil. In: Micologia: avanços no conhecimento. 5º Congresso Brasileiro de Micologia, p. 337-343, 2007.
WICKES, B. L.; MAYORGA, M. E.; EDMAN, U.; EDMAN, J. C. Dimorphism and haploid fruiting in Cryptococcus neoformans: association with the α-mating type. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v. 93, p. 7327-7337, Jul. 1996.
WILLIAMNS, A. E.; EDWARDS, L. HUMPHREYS, I. R.; SNELGROVE, R.; RAE, A. Innate imprinting by the modified heat-labile toxin of Escherichia coli (LTK63) provides generic protection against lung infectious diseases. The Journal of Immunology, v. 173, p. 7435-7443, 2004.
WILLIAMSON, P.R. Biochemical and molecular characterization of the diphenol oxidase of Cryptococcus neoformans: Identification as a laccase. Journal of Bacteriology. v. 176, p. 656-664. 1994.
XU, J.; LUO, G.; VILGALYS, R. J.; BRANDT, M. E; MITCHEL, T. G. Multiple origins of hybrid strains of Cryptococcus neoformans with serotype AD. Microbiology, v. 148., p. 203-212, 2002.
YAMAMOTO, Y.; KOHNO, S.; KAKEYA, H.; TOMOTO, K.; KAKU, M.; YAMAZAKI, T.; ARISAWA, M.; HARA, K. Random amplified polymorphic DNA analysis of clinically and environmentally isolated Cryptococcus neoformans in Nagasaki. Journal of Clinical Microbiology, v. 33, p. 3328-3332, 1995.
YAN, Z.; LI, X.; NXU, J. Geographic distribution of mating type alleles of Cryptococcus neoformans in four areas of the United States. Journal of Clinical Microbiology, v. 40, n. 3, Mar. 2002.
ZHU, X; WILLIAMSON, P. R. Role of laccase in the biology and virulence of Cryptococcus neoformans. FEMS Yeast Research, v. 5, p. 1-10, 2004.
143
APÊNDICE
144
APÊNDICE 1 - Dados Complementares
TABELA 1. Caracterização dos isolados ambientais da Região Metropolitana de Belém.
ISOLADOS SUBSTRATO ESPÉCIE SOROTIPO MAT URA-5 PA1 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA2 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA3 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA4 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA5 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA6 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA7 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA8 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA9 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA10 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA11 Raspado de madeira C. neoformans D Mat a VNIV PA12 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA13 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA14 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA15 Raspado de madeira C. neoformans Mat a VNIV PA16 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA17 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA18 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA19 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA20 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA21 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA22 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA23 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA24 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA25 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA26 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA27 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA28 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA29 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA30 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA31 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA32 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA33 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA34 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA35 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA36 Tatuzinho de jardim C. neoformans D Mat a VNIV PA37 Tatuzinho de jardim C . neoformans Mat a VNIV PA38 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA39 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA40 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA41 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA42 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA43 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA44 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA45 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA46 Tatuzinho de jardim C. neoformans Mat a VNIV PA47 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA48 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA49 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV
145
PA50 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA51 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA52 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA53 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA54 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA55 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA56 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA57 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA58 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA59 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA60 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA61 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA62 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA63 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA64 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA65 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA66 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA67 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA68 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA69 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA70 Madeira em decomposição C. neoformans Mat a VNIV PA71 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA72 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA73 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA74 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA75 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA76 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA77 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA78 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA79 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA80 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA81 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA82 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA83 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA84 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA85 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA86 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA87 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA88 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA89 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA90 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA91 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA92 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA93 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA94 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA95 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat αa VGII PA96 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA97 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA98 Poeira intradomicliar – parede C. neoformans Mat alfa VNI PA99 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA100 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA101 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA102 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA103 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
146
PA104 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA105 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA106 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA107 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA108 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA109 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA110 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA111 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA112 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA113 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA114 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA115 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA116 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA117 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA118 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA119 Poeira intradomiciliar C. neoformans B Mat alfa VNI PA120 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA121 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA122 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA123 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA124 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA125 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA126 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA127 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA128 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA129 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA130 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA131 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA132 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA133 Poeira intradomiciliar C gattii B Mat alfa VGII PA134 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA135 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA136 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA137 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA138 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA139 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA140 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA141 Poeira intradomiciliar C. neoformans A Mat alfa VNI PA142 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA143 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA144 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA145 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA146 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA147 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII PA148 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA149 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA150 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA151 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA152 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA153 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA154 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA155 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA156 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA157 Poeira intradomiciliar C gattii Mat alfa VGII
147
PA158 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA159 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA160 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA161 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA162 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA163 Poeira intradomiciliar C.gattii Mat alfa VGII PA164 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA165 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA166 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA167 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA168 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA169 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA170 Madeira em decomposição C. gattii Mat alfa VGII PA171 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA172 Madeira em decomposição C. gattii B Mat alfa VGII PA173 Madeira em decomposição C. neoformans Mat alfa VNI PA174 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA175 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA176 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA177 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA178 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA179 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA180 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA181 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA182 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA183 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA184 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA185 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA186 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA187 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA188 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA189 Poeira intradomiciliar C. gattii B Mat alfa VGII PA190 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA191 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA192 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA193 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA194 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA195 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA196 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA197 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA198 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA199 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA200 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA201 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA202 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA203 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA204 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA205 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA206 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA207 Poeira intradomiciliar C. gattii Mat alfa VGII PA208 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA209 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA210 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA211 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
148
PA212 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA213 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA214 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA215 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA216 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA217 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA218 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA219 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI PA220 Poeira intradomiciliar C. neoformans Mat alfa VNI
149
APÊNDICE 2
First isolation of Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii
from environmental sources in the city of Belém, Pará, Brasil.
Solange do PSE Costa11, Márcia dos S Lazéra2, Wallace RA Santos3; Bernardina
P Morales2, Cláudia CF Bezerra2, Marília M Nishikawa4, Gláucia G Barbosa2,
Luciana Trilles2, José L do Nascimento1, Bodo Wanke2.
Instituto de Ciências Biológicas/UFPA, Rua Augusto Corrêa, 01, Guamá, 66075-110, Belém, PA,
Brasil1; Laboratório de Micologia/IPEC/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil2, Instituto de
Ciências da Saúde/UFPA, Belém, PA, Brasil3, INCQS/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, RJ, Brasil4. E-
mail: [email protected]
Cryptococcus neoformans and C. gattii are important agents of
meningoencephalitis in humans. In the present study we report the occurrence of
both of these pathogenic yeasts in the city Belém, Pará, Brazil. The determination of
species, serotypes, mating type and molecular type were performed. In the 11
samples analyzed, 2 were positives, and 7 isolates were obtained, being 6 of C.
neoformans and 1 C. gattii. All C. neoformans isolates were serotype A and the only
C. gattii was serotype B. This is the first report of genotypes VNI and VGII isolated
from natural sources in the north of Brazil.
Keywords: Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii, Belém/Pará
___________________________________________________________________
Introduction
Cryptococcosis is an important life-threatening endemic systemic mycosis of
people and animals, caused by two species of Cryptococcus: C. neoformans and C.
gattii, and attains healthy and immunocompromised hosts. The infection is usually
acquired through the inhalation of viable propagules from the environment where
they grow in natural habitats. Although the lungs are the primary site of the infection,
the central nervous system is the most frequent and severe clinical manifestation in
humans. The species differ in genotype, phenotype, epidemiology, as well as in their
geographic distribution and natural habitat (Perfect & Casadevall, 2002; Kwon Chung
1 Financial support: CAPES, Fiocruz/Ipec
Corresponding author: [email protected]
150
& Varma, 2006). While C. neoformans has a worldwide distribution and is classically
found in avian guano and some tree hollows, C. gattii has a more restricted
distribution, prevailing in tropical and sub-tropical regions, associated with
decomposing wood in hollows of tropical trees (Lazéra et al., 2005).
Cryptococcus neoformans is cosmopolitan, most frequently associated with
pigeon and other avian droppings and affects mainly immunocompromised hosts. On
the contrary, C. gattii is predominantly associated with woody debris of different tree
species (Lazéra et al., 2005), occurs mostly in immunocompetent hosts and is
usually restricted to tropical and subtropical areas. Only recently an outbreak of
cryptococcosis gattii on the Vancouver Island, Canada, changed this distribution
pattern (Kidd et al., 2004).
The isolation of virulent strains of C. neoformans from decomposing manure,
old nests and roosting sites of pigeons was described in 1955 (Kwon-Chung &
Bennett 1992) and since then, several additional studies on environmental sources of
this yeast have been reported. In Brazil, C. neoformans was isolated from decaying
wood within a hollow of Sygygium jambolana tree (Lazera et al., 1993) and from
hollows of Cassia grandis, Senna multijuga and Ficus microcarpa (Lazera et al.,
1996). The association of C. gattii with Eucalyptus camaldulensis was initially related
in Australia (Ellis & Pfeiffer, 1990) and later in California (USA) (Pfeiffer & Ellis, 1991)
and Mexico (Licea et al., 1996). In Brazil, was isolated from bat guano contaminated
with animal and plant material (Lazera et el., 1993) and decaying wood of Moquilea
tomentosa (pink shower tree) (Lazéra et al., 2000), Guettarda acreana, (in the
Amazonian rainforest) (Fortes et al., 2001).
In 1999 Corrêa et al. reported on 19 cases of cryptococcosis in children in the
state of Pará, out of them 9 were caused by C. gattii. Based on this observation, the
authors considered the existence of a highly endemic area of infection by C. gattii in
Pará. Considering the relevance of this infection in the state of Pará, we investigated
the occurrence of these yeasts in environmental samples in the city of Belém, Pará,
Brazil.
Materials and Methods
The city of Belém (01°27’20”S e 48°30’15”W) is the capital of the state of Pará
and has about 1,280,614 inhabitants. Located at the mouth of the Amazonas river,
15 m above the sea level, in the North region of Brazil, near the equator line, it has a
tropical and humid climate, characterized by a rainy season from December to May
151
and a dryer season from June to November, with an annual average precipitation of
2,834 mm and average temperature of 25°C in February and 26 °C in November
(Prefeitura Municipal de Belém, 2006). Besides, it has constant high relative humidity
about 85%.
Four samples of caged psittacine dried bird excreta were collected in three
avian stores located downtown and seven wood samples of different trees were
collected by scraping the inner decomposing wood of the hollow of each tree and
packed in sterile collector flask.
Processing was done according to Lazera et al. (1996). After homogenization,
1 g of each sample was suspended in 50 ml of sterile physiological saline solution
with chloramphenicol. The suspension was shaken for 5 min and allowed to settle for
30 min. Aliquots 0,1ml of the supernatant were streaked onto 10 plates of niger seed
agar (NSA).
Positive phenoloxidase isolated colonies were tested for in thermotolerance at
37ºC and cyclohexamide sensitivy. The canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB)
medium was used to determine the species. Carbon and nitrogen compounds
assimilation was perform by employing the Vitek 32-BioMerieux System (Vitek ICB,
bioMeriux, Durham, USA). Serotyping was performed using of the Crypto check kit
(Iatron Laboratories, Tokyo, Japan). After identification the isolates were stored in
Skim Milk medium (DIFCO) at -20ºC.
DNA was extracted as modified protocol described from Ferrer et al. (2001).
Half an inoculation loop of culture was frozen at -20°C for 1 h and incubated at 65°C
for 1 h in 0.5 ml of extraction buffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, 3% sodium
dodecyl sulfate, 1% 2-mercaptoethanol). The lysate was extracted with phenol-
chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1, v:v:v). DNA was recovered by isopropanol
precipitation, washed with 70% (v:v) ethanol and diluted in sterile water.
The mating type was determined using specific PCR primer pairs for mating
type α and a, according to Chaturvedi et al (2002). The α-mating-type-specific 5’
oligonucleotide primer was 5’-CTTCACTGCCATCTTCACCA-3’ and the 3’
oligonucleotide primer was 5’-GACACAAAGGGTCATGCCA-3’. The a-mating-type-
specific 5’ oligonucleotide primer was 5’-CGCCTTCACTGCTACCTTCT-3’ and the 3’
oligonucleotide primer was 5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’. Amplification
reactions were performed in a volume of 25 µl. The PCR amplicons were
electrophoresed in 2 % agarose gels in 1 x Tris-borate-EDTA (TBE) buffer at 100 V
152
for 60 min, and stained with ethidium bromide. Two type strains, ATCC 28957 (Mat
α) and ATCC 28958 (Mat a) were used as positive control.
URA5-RFLP analysis was performed as described by Meyer et al (2003). PCR
of the URA5 gene was conducted in a final volume of 25 µL. Each reaction contained
50 ng of DNA, 1X PCR buffer, (200 mM Tris pH 8.4, 500 mM KCl), 0.2 mM of each
dATP, dCTP, dGTP, and dTTP (Biotools, Spain), 2 mM magnesium chloride, 2.5 U
Taq DNA polymerase (Invitrogen, São Paulo, Brazil), and 25 ng of each primer URA5
(5'ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG3') and SJ01
(5'TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC 3'). PCR was performed for 35 cycles at
94°C for 2-min initial denaturation, 45 s of denaturation at 94°C, 1 minannealing at
61°C, and 2-min extension at 72°C, followed by a final extension cycle for 10 min at
72°C. PCR products were double digested with Sau96I (10 U/µL) and HhaI (20 U/µl)
for 3 h, and the fragments were separated by 3% agarose gel electrophoresis at 100
V. RFLP patterns were assigned visually by comparing them with the patterns
obtained from the standard strains (VNI-VNIV and VGI-VGIV).
Results
Out of the eleven environmental samples collected (droppings, 3, dust, 1 and
hollow trees, 7) two showed Cryptococcus spp. growth, 5 isolates from one sample of
budgerigar droppings and 2 from a hollow of a Senna siamea (Kassod tree). All C.
neoformans isolates were serotype A and one C. gattii isolate was serotype B. In the
Kassod tree hollow both C. neoformans and C. gattii were isolated, sharing the same
habitat. Mating type analysis (Figure 1) showed 100% MAT α. The RFLP profiles
showed 7 of the molecular type VNI and one VGII (Figure 2).
Figure 1. PCR amplification of environmental isolates with primers MATα1, MATα2 and MATa1, MATa2. Lanes: M Molecular weight marker: 100 bp DNA ladder; 1, LMM 1082; 2, LMM 1083; 3, LMM 1084; 4, LMM 1088; 5, LMM 1088; 6, LMM 1089; 7, LMM 1090; 8, ATCC 28957; 9, ATCC 28958; 10, negative control.
153
Figure 2. Molecular typing profiles generated via RFLP analysis of URA5 from environmental isolates. Lanes: M, Molecular weight marker: 100 bp DNA ladder; 1, LMM 1082; 2, LMM 1083; 3, LMM 1084; 4, LMM 1087; 5, LMM 1088; 6, LMM 1089; 7, LMM 1090; 8, LMM 794; 9, LMM 795; 10, LMM 796; 11, LMM 797; 12, LMM 798; 13, LMM 799; 14, LMM 800, 15, LMM, 801; 16, negative control. All samples are molecular types VNI, except lane 7 which is VGII. Lanes 8 to 15 are molecular type standard strains (VNI-VNIV and VGI –VGIV).
Discussion
The eco-epidemiology of C. neoformans and C. gattii has been extensively
studied in many regions of the world, including in Brazil. However, in the north of
Brazil only a few studies have been performed. Fortes, et al. (2001) demonstrated
the occurrence of C. gattii in Guettarda acreana in wild area from Amazon rainforest.
In the present study we report for the first time the isolation of C. neoformans and C.
gattii from enviromental sources in the city of Belém, Pará. The isolation of C.
neoformans and C. gattii sharing the same hollow in a Senna siamea tree is
important for the understanding of their life cycle in nature. Lazera et al. (2000)
reported for the first time the presence of both species in the hollow of a pink shower
tree in Teresina, (PI), northeast of Brazil, suggesting a possible link to their natural
life cycle.
The fact that all C. neoformans isolates in this study were mating type α
agrees with worldwide literature that indicates the predominance of Mat α in
environment and clinical isolates.
Recently Kidd et al. (2004) reported C. gattii molecular type VGII as the
causative agent of the cryptococcosis outbreak at the Vancouver Island (British
Columbia, Canada), characterized by temperate climate. In our study the detection of
the molecular type VGII reinforces that this genotype deserves more investigations in
other parts of the Brazilian Amazonia and other South American countries.
This study indicates that C. neoformans molecular type VNI and C. gattii
molecular type VGII, both presenting as mating type α, are present in the urban
environment of the city of Belém, Amazon region, adding new genotype and serotype
information about the molecular types in the north of Brazil.
154
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank to Antonio Sérgio Lima (MPEG) for in the identification of botanic specimen
and to Roseane Norat for her technical assistance.
REFERENCES
Chaturvedi S, Rodeghier B, Fan J, McClelland C M, Wickes B L, Chaturvedi V 2000.
Direct PCR of Cryptococcus neoformans MAT alfa and MATa Pheromones to
Determine Mating Type, Ploidy, and Variety: a Tool for Epidemiological and
Molecular Pathogenesis Studies. J Clin Microbiol 38: 2007 - 2009.
Corrêa MPSC, Oliveira EC, Duarte RRBS, Pardal PPO, Oliveira FM, Severo LC.
1999. Criptococose em crianças no estado do Pará, Brasil. Rev Soc Bras Med Trop
32: 505-508.
Ellis DH, Pfeiffer TJ 1990. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. gattii. J
Clin Microbiol 28: 1642-1644.
Ferrer C, Colom F, Frase S, Mulet E, Abad JL, Alio, JL 2001. Detection and
Identification of Fungal Pathogens by PCR and by ITS2 and 5.8S Ribosomal DNA
Typing in Ocular Infections. JCM 39: 2873–2879
Fortes ST, Lazéra MS, Nishikawa MM, Macedo RCL, Wanke B 2001. First isolation
of Cryptococcus neoformans var. gattii from a native jungle tree in the Brazilian
Amazon rainforest. Mycoses 44: 137-140.
Kidd, SE, Hagen F, Tscharke RL, Huynh M, Barlett KH, Fyfe M, McDougall L,
Boekhout T, Kwon-Chung KJ, Meyer W 2004. A rare genotype of Cryptococcus gattii
caused the cryptococcosis outbreak on Vancouver Island (British Columbia,
Canada). PNAS 101: 17258-17263.
Kwon-Chung KJ, Bennett JE 1992. Cryptococcosis. In: KJ Kwon-Chung, JE Bennett
Med Mycol Lea & Febiger, Philadelphia, p. 397-446.
Kwon-Chung KJ, Varma SA 2006. Do major species concepts support one, two or
more species within Cryptococcus neoformans? FEMS Yeast Res 6:574-587.
155
Lazéra MS, Wanke B, Nishikawa MM 1993. Isolation of both varieties of
Cryptococcus neoformans from saprophytic sources in the city of Rio de Janeiro,
Brazil. J Med Vet Mycol 31: 449-454.
Lazéra MS, Pires FDA, Camillo-Coura L, Nishikawa MM, Bezera CCF, Trilles L,
Wanke B 1996. Natural habitat of Cryptococcus neoformans var. neoformans in
decaying wood forming hollows in living trees. J Med Vet Mycol 34: 127-131.
Lazéra MS, Cavalcanti MAS, Londero AT, Trilles L, Nishikawa MM, Wanke B 2000.
Possible primary ecological niche of Cryptococcus neoformans. Med Mycol 38: 379-
383.
Lazéra MS, Gutierrez-Galhardo MC, Cavalcanti MAS, Wanke B 2005. Criptococose.
In: JR Coura, Dinâmica das Doenças Infecciosas e Parasitárias, V. II, Guanabara
Koogan SA, Rio de Janeiro, p. 1223-1235.
Licea BA, Garza DG, Zúñiga MT 1996. Aislamento de Cryptococcus neoformans var.
gattii de Eucalyptus tereticornis. Rev Iberoam Micol 13: 27-28.
Meyer W, Castañeda A, Jackson S, Huynh M, Castañeda E, 2003. Molecular typing
of IberoAmerican Cryptococcus neoformans isolates. Emerg Infect Dis 9:189-195.
Prefeitura Municipal de Belém 2006. Indicadores da Cidade de Belém. SEGEP.
Departamento de Pesquisa e Informação, Belém, p. 1-60.
Perfect JR, Casadevall A 2002 . Cryptococcosis. Infect Dis Clin N Am 16:837-874.
Pfeiffer TJ, Ellis DH 1991. Environmental isolation of Cryptococcus neoformans var.
gattii from California. J Infect Dis 163: 929-930.
156
ANEXOS
157
ANEXO 1
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE MICOLOGIA
TERMO DE CONSENTIMENTO
Projeto de pesquisa: FONTES AMBIENTAIS DE Cryptococcus neoformans NA
REGIÃO METROPOLITANA DE BELÉM-PARÁ
Eu,......................................................................................................................
com ........... anos de idade fui procurado(a) pela Profª. Solange do Perpétuo Socorro
Evangelista Costa (CRBM Nº 232), biomédica, professora e pesquisadora do
Laboratório de Micologia da Universidade Federal do Pará, oportunidade em que fui
informado sobre os objetivos da pesquisa, dentro do projeto acima citado, sob sua
coordenação. Compreendi que o objetivo principal desta pesquisa é investigar a
presença do fungo Cryptococcus neoformans, causador de micose denominada
criptococose, no ambiente domiciliar.
A Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro de
sua equipe justificou o objetivo da pesquisa porque deseja saber se paciente com
criptococose esteve exposto ao fungo causador da micose em ambiente domiciliar
e/ou áreas vizinhas. Ela explicou a mim e a meus familiares, que este estudo irá
contribuir para a entender se a presença deste fungo nos domicílios e/ou áreas
vizinhas está relacionada aos casos de criptococose ocorridos em Belém.
Também me esclareceram que, serei informado sobre o resultado da
pesquisa efetuada em minha residência. Segundo as informações prestadas, a
pesquisa consta de levantamento de dados pessoais, relacionados ao hábito do
paciente, bem como de informações acerca do domicílio e área vizinha, que serão
anotados em uma ficha própria.
Está claro que eu posso não querer participar desta pesquisa, e isso não
causará mal, nem a mim nem a minha família. Mas também foi dito e repetido que
não receberei nenhum pagamento por participar. Compreendido tudo isso, eu
autorizo que minha residência seja visitada e estudada, através da coleta de
materiais no interior e área externa de meu domicílio, inclusive permito fotografar
locais da residência, relacionados à pesquisa.
158
Foi garantido também que as informações dadas ao projeto são
secretas, e que a ninguém será informado sobre meu nome, ou de meus familiares,
como participantes da pesquisa.
Também fiquei ciente que caso tenha alguma reclamação a fazer deverei
procurar a Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa ou outro membro
de sua equipe (telefones: (091) 211-1549, e fax (091) 221-1602 ou a direção do
Centro de Ciências Biológicas da UFPA, cito a Rua Augusto Corrêa, 01, Bairro do
Guamá em Belém.
Por fim declaro que além de ler esse documento, recebi as explicações que
desejei da equipe do projeto, e por não ter mais dúvidas, concordo em participar
como voluntário do projeto e estudo agora proposto, o que fica confirmado pela
minha assinatura abaixo. Como Tenho Dificuldade (SIM � NÃO �), de entender o
escrito acima, atesto também que a profª Solange Do Perpétuo Socorro E. Costa (ou
um membro da sua equipe) leu pausadamente este documento e esclareceu as
minhas dúvidas, e como tem a minha concordância para participar do estudo,
coloquei abaixo a minha assinatura (ou impressão digital).
(Local) ..........................., ......... de ........................ de 2003
PESQUISADO NOME: ................................................................................................ Assinatura:___________________________________ IMPRESSÃO DATILOSCÓPICA (quando se aplicar)
TESTEMUNHAS: 1. NOME:.................................................................................................. Assinatura:________________________________________________ 2. NOME:.................................................................................................. Assinatura:________________________________________________
__________________________________ Profª. Solange do Perpétuo Socorro Evangelista Costa
(DOCUMENTO EM DUAS VIAS, uma para ser entregue ao pesquisado)
159
ANEXO 2
Fontes ambientais de Cryptococcus neoformans na Região metropolitana de Belém/PA
ESTUDO AMBIENTAL
ESTADO DO PARÁ Município de Nº: ____________
Data: _____/_____/_______
Nome do Paciente: _____________________________________________________________
Endereço: ____________________________________________________________________
Número de residentes_______________________
Posição do Paciente na Família: [ ] Pai [ ] Mãe [ ] Filho [ ] Outro
Número de Cômodos : ______ Especificar : ________________________________________
Paredes: [ ] Alvenaria [ ] Madeira [ ] Taipa [ ] Outro
Piso:[ ] Cerâmica [ ] Cimento [ ] Carpete [ ] Tábua [ ] Terra [ ] Outro
Cobertura: [ ] Laje [ ] Telha de barro [ ] Telha de amianto [ ] Palha [ ] Outro
Presença de forro: [ ] Sim [ ] Não
AMBIENTE DOMICILIAR Acúmulo de Poeira: [ ] Sim [ ] Não Data da última limpeza: ____/____/______ Ventilação: [ ] Boa [ ] Ruim Umidade: [ ] Sim [ ] Não Iluminação Natural: [ ] Boa [ ] Ruim Condições de Higiene: [ ] Boa [ ] Ruim
Outras informações relevantes : _______________________________________________________
Presença de árvores: [ ] Mangueira [ ] Cajueiro [ ] Fícus [ ] Cássia [ ] Oitii [ ] Tento [ ] Mulungú [ ] Outras _______________________
Presença de aves: [ ] Pombo [ ] Galinha [ ] Arara [ ] Periquito [ ] Outras _________
Presença de animais: [ ] Morcego [ ] Gato [ ] Cachorro [ ] Outros _____________
Presença de insetos: [ ] Cupim [ ] Formiga [ ] Barata [ ] Outros _____________
Presença de outros animais: _________________________________________________________
PERIDOMICÍLIO:___________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
Coleta de Material: [ ] Sim [ ] Não Número de amostras : _________________________
Descrição das amostras: _____________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
Investigador: __________________________________________
ESTUDO DE VARIEDADE [sim] [não] ESTUDO DE SOROTIPO [sim] [não] [ ] neoformans [ ] gattii [ A ] [ B ] [ C ] [ D ]
160
ANEXO 3. Documento de comprovação do Comitê de Ética e Pesquisa do HUJBB
161
ANEXO 4
Livros Grátis( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download: Baixar livros de AdministraçãoBaixar livros de AgronomiaBaixar livros de ArquiteturaBaixar livros de ArtesBaixar livros de AstronomiaBaixar livros de Biologia GeralBaixar livros de Ciência da ComputaçãoBaixar livros de Ciência da InformaçãoBaixar livros de Ciência PolíticaBaixar livros de Ciências da SaúdeBaixar livros de ComunicaçãoBaixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNEBaixar livros de Defesa civilBaixar livros de DireitoBaixar livros de Direitos humanosBaixar livros de EconomiaBaixar livros de Economia DomésticaBaixar livros de EducaçãoBaixar livros de Educação - TrânsitoBaixar livros de Educação FísicaBaixar livros de Engenharia AeroespacialBaixar livros de FarmáciaBaixar livros de FilosofiaBaixar livros de FísicaBaixar livros de GeociênciasBaixar livros de GeografiaBaixar livros de HistóriaBaixar livros de Línguas
Baixar livros de LiteraturaBaixar livros de Literatura de CordelBaixar livros de Literatura InfantilBaixar livros de MatemáticaBaixar livros de MedicinaBaixar livros de Medicina VeterináriaBaixar livros de Meio AmbienteBaixar livros de MeteorologiaBaixar Monografias e TCCBaixar livros MultidisciplinarBaixar livros de MúsicaBaixar livros de PsicologiaBaixar livros de QuímicaBaixar livros de Saúde ColetivaBaixar livros de Serviço SocialBaixar livros de SociologiaBaixar livros de TeologiaBaixar livros de TrabalhoBaixar livros de Turismo