DANIELY XAVIER SOARES PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE...
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DANIELY XAVIER SOARES
PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS: TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA
DANIELY XAVIER SOARES
PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS:TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO
ORIENTADOR: PROF. DR. ROY EDWARD BRUNS CO-ORIENTADOR: PROFA. DRA. IEDA SPACINO SCARMINIO
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO
INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR DANIELY XAVIER SOARES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. ROY EDWARD BRUNS.
______________________ Assinatura do Orientador
CAMPINAS 2014
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“Que coleção de cicatrizes você tem? Nunca se esqueça de quem lhe deu as melhores. E seja
grato. Nossas cicatrizes têm o poder de nos
fazer lembrar que o passado foi real.”
Hannibal Lecter
http://pensador.uol.com.br/autor/hannibal_lecter/
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AGRADECIMENTOS
Embora uma tese seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho
individual, há contribuições de natureza diversa que não podem e nem devem
deixar de ser realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros
agradecimentos:
Aos meus pais por tudo apoio e por me permitirem escolher.
Ao meu irmão pela amizade e por ser minha fonte de inspiração.
Ao Professor Dr. Roy Edward Bruns, meu orientador, pela competência
científica, correções e sugestões relevantes feitas durante a orientação.
Pela paciência e atenção.
À Professora Dra. Ieda Spacino Scarminio, minha co-orientadora, pela
competência científica e orientação, bem como pela disponibilidade.
À Professora Dra. Isabel Jardim, por toda ajuda e contribuição para o
resultado final desta tese, pela atenção e disponibilidade.
Aos Professores Dr. Ronei Poppi e Dr. Fábio Gozzo, por sempre
estarem dispostos a tirar dúvidas e pela atenção.
Ao Dr. Alexandre Ferreira Gomes: namorado, amigo e companheiro
que sempre me estimula a crescer científica e pessoalmente. Pelas
inúmeras conversas sobre assuntos diversos, pelas correções e
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comentários na tese. Acima de tudo, pelo inestimável apoio, pela
paciência e compreensão.
Aos amigos de todas as horas: Hector Koolen, Dr. Clécio Klitzke e
Adriana Godoy.
Aos amigos que conquistei no Instituto de Química: Giovana, Aline,
Carla, Ana Carolina, Bruna Campos, Eduardo, Arnaldo, Bruna Zucoloto,
Nicolas, João, Dr. Maurício (Cabuloso), Maurício (Xanxeré), Dr. Marcelo
(P2), Luana, Jandyson, Lívia, Wagner e Klécia e aos muitos outros que
também estão em meu coração.
A Dra. Márcia Breitkreitz, IAPAR e Arnaldo pela contribuição com os
conjuntos de dados.
A todo Instituto de Química, professores, técnicos e funcionários.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pelo apoio no desenvolvimento do trabalho.
Mais uma vez, a todos os meus sinceros agradecimentos.
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SÚMULA CURRICULAR (2010-2014)
Daniely Xavier Soares
Data de nascimento: 24/06/1985 Endereço eletrônico: [email protected]
Formação Acadêmica
2010 – 2014 Doutorado em Ciências (Química Analítica) Título: “Planejamento e otimização de processos
multirespostas: tratamento quimiométrico”
Instituto de Química – Universidade Estadual de
Campinas (UNICAMP), Campinas, SP
Orientador: Prof. Dr. Roy Edward Bruns
Agência Financiadora: Capes
2008 – 2010 Mestrado em Química Título: “Comparação de procedimentos de extração
de material vegetal para otimizar o rendimento de
metabólitos secundários”
Departamento de Química – Universidade Estadual
de Londrina (UEL)
Orientador: Profa. Dra. Roy Edward Bruns
Agência Financiadora: Capes
2004 – 2007 Licenciada em Química Universidade Estadual de Goiás (UEG)
2006 – 2007 Iniciação Científica em Química Analítica Título: “Avaliação das características físico-química
do leite ultrapasteurizado (UHT)”
Orientador: Profa. Ms. Tatiana de Oliveira Zuppa
Universidade Estadual de Goiás (UEG)
1. Produção Científica
mailto:[email protected]
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SOARES, D. X.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E. Mixture designs for
exploring class diversity and metabolite fingerprinting: An efficient column
chromatographic strategy. Analytica Chimica Acta, 2011.
Silva, A. F.; Soares, D. X.; Faria, S. H. D. M.; Bruns, R. E. . Basis set
selection for the calculation of the IR fundamental intensities for 1,1-
C2H2F2 and F2CO. Journal of Molecular Structure, 2011.
2. Experiência Didática
2014 - CH5 serviços em análise instrumental: Ministrou o curso de
planejamento de experimentos.
2013 - Participação no Programa de Estágio Docente (PED) do Instituto de
Química da UNICAMP, nível C, por um semestres, na disciplina QG108
(Química Geral Teórica).
2013 - Universidade Federal de Santa Maria: Ministrou o curso de
planejamento de experimentos.
2012 – Faculdade Oswaldo Cruz: Professora de quimiometria do curso de pós-
graduação em analise instrumental.
3. Apresentação de trabalhos em eventos
2014 - 37° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Trabalho:
Identificação dos isômeros eritrartina e 11-metoxi-erisodina através dos
espectros UV-VIS e cálculos teóricos
2013 - V Congresso da BrMass. Trabalho: Simplex centroid design
optimization for the extraction of the alkaloids in erisotrina of flowers
Erythrina speciosa Andrews.
2012 - XIII Chemometrics in Analytical Chemestry Conference.
Trabalho: Multiple criteria decision making for chromatographic and
electrophoretic separations.
2011 - 16° Encontro Nacional de Química Analítica.
Trabalhos: a) Análise multi-way dos dados CLAE-DAD da fração básica de
Erythrina speciosa Andrews. b) Análise quimiométrica e planejamento
experimental para avaliação dos espectros UV-Visível de extratos de plantas
medicinais.
2010 - 33º reunião Anual da Sociedade Brasileira de química. Trabalhos:
(a) Comparação de dois procedimentos cromatográficos de coluna aberta pata
análise de extratos das folhas de Erythrina speciosa Andrews. (b)
Planejamento estatístico de misturas em cromatografia liquida para a busca da
impressão digital de extrato de Erythrina speciosa Andrews.
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RESUMO “Planejamento e otimização de processos multirespostas: tratamento
quimiométrico”
Foram estudados três parâmetros cromatográficos: tempo de retenção,
resolução e largura dos picos, em cromatogramas obtidos para uma mistura de
onze agrotóxicos. Ajustes de modelos de regressão foram construídos e
validados por ANOVA. Devido a sua simplicidade, os resultados obtidos para
tempo de retenção foram usados em um programa interativo para estudar as
separações como função de todo domínio experimental do planejamento
simplex centróide. Um planejamento de misturas envolvendo três solventes
(etanol, diclorometano e hexano) foi usado para avaliar a extração de
alcalóides em Erythrina speciosa. Resultados diferentes foram observados
para os extratos da flor, caule e folha, evidenciando que perfis de alcalóides
distintos podem ser obtidos a partir de diferentes partes da planta. Modelos de
regressão foram construídos e validados por ANOVA para dois alcalóides
(tentativamente identificados por espectrometria de massas como eritrartina e
11-metoxi-erisodina, isóbaros em m/z 330, e erisotrina em m/z 314, com base
em literatura prévia). A análise das componentes principais foi aplicada ao um
conjunto de dados de absorbância de folhas de quatro cultivares de café (IPR-
59, CAT, 027 e 083) obtidos entre 350-1100 nm por um espectroradiômetro
portátil LI_COR 1800. Esta análise somente conseguiu discriminar espectros
obtidos na face adaxial e abaxial das folhas. Como estes dados seguem um
planejamento fatorial para quatro fatores (irrigação, estratos extremos, pontos
cardeais e face) valores de efeitos foram determinados para absorbância em
três comprimentos de onda estratégicos, 520, 554 e 650 nm, que são
importantes para a quantificação de conteúdos de clorofilas e antocianinas.
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ABSTRACT “Design and multiresponse optimization of processes: chemometric
treatments”
Three chromatographic separation criteria were evaluated: retention time,
resolution and peak width, in chromatograms obtained from a mixture of
eleven pesticides. Regression models were constructed and validated by
ANOVA. The use of the interactive program proved to be a valuable tool for
studying peak separation behavior for the entire experimental domain of the
simplex centroid design. Three solvents (ethanol, dichloromethane and
hexane) and their binary and ternary mixtures were evaluated as extraction
media for alkaloids in Erythrina speciosa. Different results were obtained
between extracts of flowers, stems and leaves, showing that distinct alkaloid
profiles can be obtained from different sources within the plant. Regression
models were constructed and validated by ANOVA for two alkaloids
(tentatively identified by MS as erytrartine and 11-methoxy-erisodine, isobaric
ions of m/z 330, and erysothrine of m/z 314, based on previous literature).
Principal component analysis was applied to data sets of absorbance values for
leaves of four coffee cultivars (IPR-59, CAT, 027 and 083) obtained between
350 – 1100 nm by a LI_COR 1800 portable radioespectrometer. This analysis
was only able to discriminate between spectra of the abaxial and adaxial faces
of the leaves. Since the spectral data were consistent with a factorial design for
four factors (irrigated/field water, superior/inferior strata, cardinal points and
face) effect values for absorbance were calculated at four strategic
wavelengths, 520, 554 and 650 nm that are important for quantifying
chlorophyll and anthocyanin contents of coffee.
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SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS.............................................................................................XIX
LISTA DE FIGURAS...........................................................................................XXIII
LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................XXVII
INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 1
CAPITULO 1 - OTIMIZAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR MÉTODO
COMPUTACIONAL INTERATIVO ............................................................. 13
1.1. Introdução..............................................................................................13
1.1. Parte experimental .................................................................................19
1.2. Tratamento multivariado ...................................................................... 21
1.3.1.Tempo de retenção .................................................................................21
1.3.2. Resolução.............................................................................................. 23
1.3.3. Larguras da base ...................................................................................27
1.4. Programa Computacional ......................................................................29
1.5. Conclusões 1..........................................................................................32
CAPITULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR DE
ALCALÓIDES NAS FLORES, CAULE E FOLHAS DE ERYTHRINA
SPECIOSA ANDREWS .................................................................................35
2.1. Introdução .............................................................................................35
2.2. Experimental .........................................................................................41
2.2.1. Material botânico..................................................................................42
2.2.2. Preparação das amostras e extratos.......................................................43
2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS..............................................................44
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2.3. Resultados e Discussão..........................................................................44
2.3.1. Analise dos extratos das flores ..............................................................46
2.3.2. Analise dos extratos do caule ................................................................61
2.3.3. Analise dos extratos das folhas .............................................................71
2.4. Identificações das estruturas de alcalóides erytrinicos por cálculos
teóricos...................................................................................................85
2.5. Conclusões 2 .........................................................................................87
CAPITULO 3 - OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES PARA ABSORÇÃO
NAS FOLHAS DE CULTIVARES DE CAFÉ ..............................................91
3.1. Introdução ...............................................................................................91
3.2. Dados .......................................................................................................94
3.3. Tratamento multivariado .........................................................................96
3.4. Conclusões 3 ..........................................................................................108
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1. Tempos de retenção para os agrotóxicos analisados em cada ponto
do planejamento experimental e sua replica em minutos.................................21
Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
media quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção....22
Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos com base no
cromatograma obtido no ponto central............................................................25
Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução................26
Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada
agrotóxico estudado ........................................................................................28
Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média
quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e
média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da bas.........29
Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para
cada mistura.....................................................................................................45
Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................49
Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de
picos com m/z par para cada cromatograma....................................................50
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Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as
intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................52
Tabela 2.5. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................55
Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................62
Tabela 2.7. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o numero de
picos com massa par para cada cromatograma ...............................................63
Tabela 2.8. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos
com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos
axiais e o número de picos com massa par para cada
cromatograma.................................................................................................. 64
Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina
speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex
centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de
m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos
com tempos de retenção distintos....................................................................72
Tabela 2.10. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides
obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o
número de picos com m/z par para cada cromatograma .................................73
Tabela 2.11. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides
obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide com
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pontos axiais e o número de picos com m/z par para cada
cromatograma...................................................................................................75
Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as
intensidades de m/z 314 para as misturas do planejamento simplex
centróide...........................................................................................................75
Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas
diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um
pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma
m/z....................................................................................................................82
Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-
pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente ..............................................87
Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para analise das folhas dos cultivares
com a latitude variando nos pontos cardeais .................................................100
Tabela 3.2. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão
para cada efeito .............................................................................................101
Tabela 3.3. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão
para cada efeito .............................................................................................102
Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito .....................................................................................................103
Tabela 3.5. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e
650nm para o cultivar 083, com os valores de significância e erro padrão para
cada efeito .....................................................................................................104
Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares
com a longitude variando nos pontos cardeais ..............................................105
Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm, e
650 nm para os quatro cultivares estudados...................................................106
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas
matrizes............................................................................................................. 7
Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores ...13
Figura 1.2. Esquema de otimização multi resposta para fase móvel em
cromatografia...................................................................................................17
Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das
composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH
= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v) ...............................20
Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos
empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),
volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O
45:55 (v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de
ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em
210 nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................24
Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos
cromatográficos de cada agrotóxico estudado.................................................27
Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma
simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental;
(c)cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................30
Figura 2.1. Componentes basicos de um espectrometro de massas................39
Figura 2.2. Procedimentos experimental empregado na analise da planta
Erythrina speciosa..........................................................................................42
Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol
(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica
das misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das
misturas do planejamento simplex centróide...................................................43
Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com
a mistura (etanol:diclorometano:hexano (0.33;0.33;0.33(v/v)) ......................47
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Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas
do planejamento simplex centróide ............................................................50
Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,
observados por ESI (+)-MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,
previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e
(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina
lysistemon26......................................................................................................51
Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada as intensidades referentes a m/z
330 de acordo com o planejamento simplex
centróide...........................................................................................................53
Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina
speciosa como erisotrina2.................................................................................54
Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas
do planejamento simplex centróide ...........................................................54
Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os
picos.................................................................................................................57
Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons
no tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento
simplex centróide das flores de Erythrina speciosa .......................................59
Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas
diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex
centróide...........................................................................................................60
Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2 obtidos
com as flores da Erythrina speciosa ...............................................................61
Figura 2.14. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide ...............................................................63
Figura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de
intensidades para m/z 314 em suas respectivas misturas ................................65
Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons
para o caule de acordo com a planejamento simplex centróide ......................66
Figura 2.17. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................68
Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e
caule de acordo com o planejamento simplex centróide .................................69
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Figura 2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do
planejamento simplex centróide para o caule da planta e o cromatograma total
de íons em hexano puro para as flores em negrito ..........................................70
Figura 2.20. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do
planejamento simplex centróide para as flores com o cromatograma em obtido
em hexano puro em negrito .............................................................................71
Figura 2.21. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o
planejamento simplex centróide ...............................................................74
Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com
m/z 314 ............................................................................................................76
Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas
totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa ....................................78
Figura 2.24. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................79
Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na
projeção CP1xCP2xCP3 .................................................................................80
Figura 2.26. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 3 para os
dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa .....................................81
Figura 2.27. Estrutura clássica de alcalóides eritrinicos ...........................85
Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides
eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z
330..................................................................................................................86
Figura 3.1. Curva de rflectância de folhas verde e saudável típica.................93
Figura 3.2. Esquema de analises para cada cultivar com as combinações
possíveis dos fatores estudadas ..................................................................95
Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com
todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos separam as
amostras irrigadas das amostras não irrigados .........................................97
Figura 3.4. Gráfico dos escores para o conjunto de dados irrigado e não
irrigado nos quatro cultivares analisados ........................................................98
Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares
de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na
face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos
de onda de 350 até 1100nm............................................................................107
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LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de variância
ACN Acetonitrila
Am Ametrina
At Atrazina
Be Bentazona
Ca Carbaril
CAT Catuaí IAC 99
Ci Cianazina
Cx Carboxim
Dm Diclorometano
Et Etanol
FM Fase móvel
Hx Hexano
IAPAR Instituto Agronômico do Paraná
IPR-59 IAPAR 59
Im Imazetapir
In Intensidade
Iz Imazaquim
Me Metsulfuron
MeOH Metanol
MQep Media quadrática do erro puro
MQfaj Média quadrática da falta de ajuste
MQR Média quadrática da regressão
m/z Razão massa/carga
PCA Analise de Componentes Principais
Rs Resolução
Si Simazina
THF Tetrahidrofurano
TIC Cromatograma totais de íons
UPLC Cromatografia liquida de ultra eficiência
v/v Volume/volume
α Acidicidade
β Basicidade
π Dipolaridade
027 Etiópia IAPAR 027
083 Etiópia IAPAR 083
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1. Introdução geral
O uso de computadores para analisar dados químicos cresceu
drasticamente nos últimos vinte anos, em parte devido aos recentes avanços em
hardware e software1. Cada vez mais fica evidente nos diversos segmentos da
química o crescimento científico e também tecnológico devido ao uso de
recursos computacionais, a química analítica não foge a esta regra. Na área de
química analítica, a aquisição de dados atingiu um ponto bastante sofisticado
com interface de instrumentos aos computadores produzindo uma enorme
quantidade de informação, muitas vezes complexa e variada. Uma das
características mais interessantes dos modernos instrumentos é o número das
variáveis que podem ser medidas em uma única amostra. Diante desse cenário,
os químicos analíticos se deparam com conjuntos de dados que podem oferecer
diversos tipos de informações, sendo importante ter como alternativas algumas
ferramentas matemáticas e estatísticas que possam extrair um maior número de
informações do conjunto de dados de forma criteriosa e científica2,3,4. Tais
ferramentas matemáticas e estatísticas também podem diminuir drasticamente o
tempo necessário para extrair informações relevantes com confiabilidade a
partir de grandes conjuntos de dados.
Um novo termo foi introduzido na química e denominado quimiometria,
que é uma área especificamente destinada à análise de dados químicos de
natureza multivariada. A quimiometria pode ser definida com um ramo da
química que se utiliza da matemática e da estatística de forma a obter resultados
mais satisfatórios possíveis e fornecer conhecimentos sobre os sistemas
químicos5. Esse termo surgiu pela primeira vez em 1971, quando o Professor
Svante Wold (Umea University, Suécia) criou a palavra Kemometri das
-
2
combinações suecas Kemo e metri. Neste mesmo ano, sugeriu a palavra
equivalente do inglês chemometrics. Em 1972 Svante Wold criou o primeiro
grupo de quimiometria. Em 1973, o primeiro artigo com o termo chemometrics
foi publicado. Em 10 de junho de 1974 a Sociedade Internacional de
Quimiometria, do inglês International Chemometrics Society foi fundada por
Svante Wold (Umea University) e Bruce R. Kowalski (University of
Washington). Em 1975 os dois primeiros artigos contendo o termo
chemometrics em seus títulos foram publicados pelo Grupo de Pesquisa em
Quimiometria do Professor Bruce R. Kowalski, sendo que estes artigos
definiram a quimiometria como uma nova disciplina da Química. Em 1976
aconteceu o primeiro Simpósio de Quimiometria6, 7.
O avanço da quimiometria veio no século 21 pelo fato de várias empresas
de desenvolvimento de software terem promovido métodos de construção de
equipamentos hifenados e mais avançados, abrindo muitas opções para
melhoria de dados analíticos. Assim, a quimiometria passou a ter um papel
importante na química analítica. Diversas contribuições da quimiometria no
tratamento de dados analíticos estão presentes na literatura, seja em dados
espectroscópicos, cromatográficos, eletroforéticos, entre outros8.
A análise multivariada envolve a análise de dados que consiste em
númerosas variáveis medidas a partir de um número de amostras. O objetivo da
análise multivariada de dados é determinar todas as variações na matriz de
dados de estudo. Assim, ferramentas quimiométricas tentam encontrar as
relações entre as amostras e as variáveis em um determinado conjunto de
dados9.
Em sistemas multivariados, a conversão da resposta instrumental no dado
químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada,
álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas são apontadas, atualmente,
-
3
como a melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do
máximo de informação sobre o sistema10.
Encontrar as melhores condições para uma dada medida requer
procedimentos de otimização e encontrar as melhores respostas pode ser um
trabalho difícil já que diversas respostas simultâneas podem ser geradas em um
grande conjunto de dados. Pode-se definir otimização como sendo um processo
baseado em instruções que permitam obter o melhor resultado de uma dada
situação. Cientificamente, estas instruções são frequentemente expressas
através de métodos matemáticos que procuram maximizar ou minimizar alguma
propriedade, e obtenção das condições de controle otimizadas11, 12.
Dentre as atividades habituais em química analítica que envolvem
otimização estão13:
a) O desenvolvimento de novos métodos de análise e o melhoramento ou
adaptação de métodos já estabelecidos, estudando-se as variáveis que exibem
efeitos significativos na resposta e que podem ser ajustadas para melhorar a
eficiência do método.
b) O melhoramento do desempenho de instrumentos analíticos
complexos, por acerto simultâneo dos vários parâmetros instrumentais até que a
resposta ótima seja obtida.
c) O ajuste do modelo matemático para os dados experimentais, de tal
modo que a equação teórica represente verdadeiramente os valores
experimentais.
Os procedimentos tradicionais de otimização consistem em estudar cada
fator separadamente. Esse tipo de otimização conduz a um grande número de
experimentos que têm que ser executados, tornando-se um processo demorado e
caro. Em tais casos, uma abordagem multivariada ao problema pode ser
utilizada. Ela baseia-se na utilização de um conjunto mínimo de experimentos
-
4
que permite a variação e avaliação simultânea de todos os fatores estudados. Há
vários planejamentos de experimentos que se aplicam à otimização, reduzindo o
número de experimentos e fornecendo informações que conduzem à
otimização, entre eles estão: fatorial completo e fracionado, Plackett-Burman,
composto central, Box-Behnken e o simplex centróide14,15.
Por poderem ser usados em diferentes tipos de análises, os planejamentos
mais usuais são os planejamentos fatoriais e o planejamento de misturas tipo
simplex centróide. Com o planejamento fatorial é possível o estudo simultâneo
dos efeitos que vários fatores podem ter sobre a otimização de um processo.
Sua aplicação determina quais fatores tem importância sobre a resposta e como
o efeito de um fator varia de acordo com o nível dos outros fatores16. Os efeitos
são as quantidades diferenciais expressas com uma mudança de resposta
quando o nível de um ou mais fatores são alterados. As interações são a força
motriz em muitos processos de otimização de forma que, sem o uso do
planejamento fatorial, algumas interações importantes podem permanecer
escondidas, e a otimização global não pode ser alcançada. Um dos mais simples
tipos de planejamentos fatoriais utilizados no trabalho experimental é aquele
que tem dois níveis (2k). Num planejamento fatorial 2k, a cada fator podem ser
atribuídos dois níveis: baixo (-1) e alto (+1). Se k fatores são considerados,
então um minímo de 2k medições são realizadas numa análise fatorial17.
Nos planejamentos com misturas, muito aplicados nesta tese, as
propriedades estudadas dependem da proporção dos componentes da mistura e
não da quantidade de cada componente da mistura18. Nesse caso, as variáveis
não são independentes, ou seja, se o nível de uma variável muda significa que o
nível de alguma outra variável também irá mudar, já que a proporção ente elas é
a característica de interesse e o total da mistura corresponde a 100%k. Assim
temos a seguinte restrição19:
-
5
(1)
de forma que Xi é a proporção dos componentes na mistura e q é o número de
componentes da mistura. Com três componentes (q=3) o espaço da mistura é
um triângulo, chamado simplex, onde os vértices correspondem à composição
dos componentes puros, ou seja, 100% de um componente simples. Nas arestas
estão as misturas binárias em mesma proporção e o centro do triângulo
corresponde à mistura na mesma proporção dos três componentes da mistura. A
mesma ideia pode ser aplicada para q=4, onde a figura geométrica seria um
tetraedro. Maiores números de componentes da mistura levam a figuras mais
difíceis de serem visualizadas, dificultando o processo de otimização já que o
planejamento de misturas explora todo o espaço da figura geométrica20.
Na etapa de avaliação dos resultados dos experimentos, técnicas como a
análise de variância (ANOVA) e a utilização de equações de regressão
encontram larga aplicação. Para estudar o efeito da composição da mistura na
variável resposta de um ensaio, podem-se utilizar modelos matemáticos, que
fazem uso da resolução de equações pelo método dos mínimos quadrados para
encontrar soluções que expressem o comportamento de uma variável
dependente em função da proporção de cada fator estudado. Em geral, utilizam-
se modelos lineares, quadráticos ou cúbicos que usam o mesmo número de
ensaios que o número de coeficientes que se quer estimar21, 22.
Em geral, os modelos usados em planejamentos de mistura são o
quadrático e o cúbico especial. O polinômio cúbico especial é uma forma
reduzida do polinômio de terceiro grau que contém informações sobre as
misturas de todos os componentes. Com q=3 componentes, por exemplo, os
modelos quadráticos e cúbicos especiais, respectivamente são23:
-
6
= β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + (2)
= β1X1+ β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β123X1X2X3 + (3)
Onde y representa a função resposta dos dados experimentais; X1, X2 e
X3 são variáveis de mistura que correspondem às proporções dos componentes
estudados, e β representa os parâmetros estimados. A partir das respostas
experimentais e dada a forma do modelo estima-se o vetor dos parâmetros β, de
forma que o modelo se ajuste adequadamente aos dados. O vetor β é o resultado
da operação matricial apresentada na equação 4:
(4)
O teste mais geral de ajuste do modelo aos dados é o teste F de análise de
variância, que verifica a significância do modelo como um todo. Através do
modelo ajustado, pode-se realizar a otimização da variável de resposta de
interesse, isto é, obter a combinação de variáveis de controle que propiciará a
melhor resposta do sistema com o qual se está trabalhando com o menor custo.
Para extrair o máximo de informações dos resultados de um experimento
químico, um grande número de variáveis está envolvida24. Muitas vezes, apenas
parte dessas variáveis contém informações relevantes e a maioria das variáveis
adiciona pouco ou quase nada à interpretação dos resultados em termos
químicos. A redução de variáveis através de critérios objetivos, que permita
dizer quais são as variáveis de interesse contendo maior informação, pode ser
alcançada através da Análise de Componentes Principais (PCA), que permite
explorar os resultados obtidos por meio de análises químicas com intuito de
verificar a existência de similaridade entre as amostras.
-
7
A PCA é um método que tem por finalidade básica a redução de dados a
partir de combinações lineares das variáveis originais. Na PCA, a
decomposição é calculada através da diagonalização da matriz XtX ou XXt. A
matriz X (n x p), formada por n objetos e p variáveis é decomposta no produto
de duas matrizes menores, equação 5:
X = T x P’ + (5)
no qual T é a matriz dos scores das componentes principais, P é a matriz
loadings (pesos) das componentes principais, e é a matriz dos resíduos. O
sobrescrito t indica a transposta da matriz e q é um escalar que indica o número
de componentes principais que descreve a maior parte da variância dos dados.
Este procedimento está representado esquematicamente na Figura 125.
Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes.
Após os cálculos, os resultados são utilizados para interpretar a
distribuição das amostras num gráfico bidimensional das componentes
principais e posteriormente identificar e julgar a importância das variáveis
originais escolhidas, pois as variáveis originais com maiores valores de
loadings na combinação linear das componentes principais são as mais
importantes do ponto de vista estatístico26.
q
.
p p
n
X
n
q
T
P t
n
p
= +
-
8
Os chamados dados brutos, ou seja, dados obtidos diretamente de uma
análise podem apresentar diversas fontes de variação. Isso causa irregularidades
sistemáticas na linha de base, ruídos instrumentais ou unidades e magnitudes.
Antes da realização do tratamento multivariado pode ser necessário um pré-
processamento para remover fontes indesejáveis de variações que podem afetar
as variáveis do conjunto de dados como um todo.
Essa etapa é muito importante para os resultados obtidos no tratamento
multivariado. Os principais pré-processamentos são o centrado na média, que
subtrai de cada elemento da linha a média de sua respectiva coluna; o
escalonamento, onde cada elemento fica na mesma escala fazendo com que
cada variável fique com o mesmo peso; auto-escalonamento, que centraliza os
dados na média e faz o escalonamento, deixando as variáveis com média zero e
desvio-padrão igual a um. Outros pré-processamentos vem sendo utilizados
como, por exemplo, a derivação. Essa etapa deve ser avaliada com cuidado e a
decisão de qual pré-processamento deve ser coerente com a natureza dos dados.
Para isso é muito importante ter conhecimento aprofundado sobre o sistema em
estudo27.
Tendo em vista a complexidade dos dados analíticos e a importância de
condições que levem a melhores resultados, com extração do maior número de
informações possível, ferramentas quimiométricas foram aplicadas a dados
multirespostas para estudar e otimizar os fatores que levam as melhores
respostas. Foram utilizados planejamentos fatoriais e de misturas com o
objetivo de eliminar fatores que não afetam os resultados e chegar a condições
que levem ao máximo em cada conjunto de dados.
No capítulo 1 o objetivo geral foi utilizar planejamento de misturas para
otimizar separações cromatográficas. Modelos de regressão foram construídos e
-
9
usados num programa computacional interativo para investigar a separação
cromatográfica em todo domínio experimental.
No capítulo 2 o objetivo geral foi a aplicação de planejamento de
misturas para otimizar o solvente extrator na planta medicinal Erythrina
speciosa e avaliar a influência de misturas de solventes na extração de
alcalóides, principais constituintes da planta, e identificar similaridades nas
extrações por PCA.
No capítulo 3 o objetivo geral foi utilizar planejamentos fatoriais para
avaliar a influência dos fatores na absorção de clorofila e antocianinas em
cultivares do café para otimizar as melhores condições de absorção. Um estudo
exploratório dos dados experimentais foi feito por PCA.
_____________________________________________________________
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-
12
-
13
Capitulo 1 - Otimização cromatográfica por método
computacional interativo
1.1. Introdução
Um dos problemas mais comuns para o experimentalista é determinar a
influência de vários fatores ou variáveis sobre as respostas ou propriedades de
um sistema. A Figura 1.1 descreve um sistema de natureza desconhecido com j
respostas ou propriedades que serão otimizadas manipulando os níveis de k
fatores ou condições experimentais.
Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores.
O grande desafio na otimização de sistemas químicos é simultaneamente
tratar muitas respostas. As condições experimentais que melhoram algumas
respostas muitas vezes resultam em piora nos valores de outras respostas.
Existem dois métodos sendo usados em química para otimizar sistemas
-
14
multirespostas. Ambos são baseados em modelos empíricos obtidos dos
resultados de um planejamento experimental1. Um dos métodos consiste na
sobreposição das curvas de níveis de superfícies para cada resposta investigada.
O pesquisador visualmente tenta achar regiões dentro do domínio experimental
para as quais todas as respostas têm valores aceitáveis. O segundo utiliza a
função de desejabilidade de Derringer e Suich. Esta função consiste de um
produto das desejabilidades individuais de cada resposta. Utilizando os modelos
empíricos que estão armazenados no computador, um algoritmo computacional
faz uma busca para as condições experimentais que maximiza a desejabilidade
global. Além de ser de uso difícil para o experimentalista e de exigir a escolha
dos valores de vários parâmetros abstratos, sua aplicação requer a especificação
de um alvo que nem sempre é fácil de definir 1.
A otimização em cromatografia é um grande passo para funcionamento
ótimo da técnica, porém é complicado achar uma condição cromatográfica que
atinja todos objetivos da análise. Um fator complicado é que os objetivos da
otimização cromatográfica podem variar consideravelmente de um caso para
outro. Por exemplo, pode ser necessária a separação de todos ou apenas de
alguns picos relevantes em um cromatograma complexo.
Um problema de interesse contínuo em cromatografia líquida é o
desenvolvimento de procedimentos práticos para otimizar processos de
separação2. Neste caso, a composição e valor de pH da fase móvel são de suma
importância bem como outros fatores, como tipo de coluna e química da fase
estacionária, temperatura, etc. Métodos multivariados de otimização baseados
em conceitos estatísticos tem bastante sucesso na otimização do sistema
extrator, bem como da fase móvel em cromatografia líquida de alta eficiência2,3.
Primeiro, porque as interações entre os fatores somente podem ser descobertas
usando-se estratégias multivariadas. Segundo, os parâmetros calculados para
-
15
modelos multivariados são mais precisos do que as medidas individuais usadas
para determinar o modelo. Terceiro, planejamentos multivariados economizam
experimentos. As otimizações são alcançadas usando menor tempo, menos
materiais e de uma maneira bem mais segura. O pesquisador pode sistematizar
seu trabalho usando métodos multivariados de forma bem mais objetiva do que
usando métodos convencionais de otimização 4,5.
O estado da arte em separações de picos em cromatografia líquida inclui
a utilização de modelos estatísticos obtidos de resultados de planejamentos de
experimentos para descrever como os sinais analíticos se comportam como
função das condições cromatográficas como composição da fase móvel, tipo e
temperatura da coluna, fluxo da fase móvel entre outras. As primeiras tentativas
nesse sentido envolveram o uso de funções objetivas que combinam
informações de vários pares de picos e tentam descrever a separação global de
um cromatograma. Mais de que uma dúzia de funções objetivas foram
propostas e revisadas na literatura na tentativa de otimizar as separações
cromatográficas6,7.
Diferentes critérios têm sido sugeridos na literatura para avaliar a
qualidade das separações cromatográficas. Os critérios de otimização que
descrevem adequadamente a qualidade da separação estão entre os fatores
essenciais que determinam a aplicabilidade dos procedimentos. A resolução é
critério o mais clássico de otimização8.
A resolução entre dois picos consecutivos é frequentemente escolhida
como um critério elementar na construção de funções de resposta. A resolução
de dois picos adjacentes é habitualmente definida como uma função da largura
de cada pico na base (ou a metade da altura) e a diferença nas distâncias de
retenção para os picos de interesse. Embora esta descrição possa ser aplicada, a
mesma não é usual quando há sobreposição e assimetria de picos, que
-
16
constituem perfis bastante comuns no caso da separação de misturas
complexas9.
A resolução pode ser calculada a partir da distância que separa os pontos
máximos dos picos (dR) e da média das larguras de suas respectivas bases (wb):
(1.1)
Quando a resolução é 1, os dois picos são razoavelmente separados. Um
valor de resolução de 1,25 é suficiente para fins quantitativos e acima de 1,5
têm-se separação completa10. Quando se pretende otimizar a resolução de
apenas dois picos, a expressão para a resolução entre os dois picos é bastante
simples. O problema se torna mais difícil quando se tenta descrever a resolução
global de um cromatograma de componentes múltiplos11.
A desvantagem no uso do critério resolução em sistemas cromatográficos
é que existem várias resoluções de pares de picos que precisam ser otimizadas
simultaneamente. Mais do que isto várias mudanças de ordem de eluição são
observadas complicando o processo de otimização das separações de misturas.
Idealmente seria mais conveniente utilizar tempos de retenção como critério
cromatográfico para otimização. Além de simplificar a modelagem para
amostras que apresentam inversão de picos, no caso dos tempos de retenção os
modelos estatísticos devem ser mais precisos do que aqueles para resoluções,
porque o tempo de retenção depende do comportamento de um pico só ao invés
de um par de picos. Mas para a otimização com metodologia conhecida, no
caso, para a função de desejabilidade é necessário um valor alvo para cálculo da
função, que não pode ser expresso em termos de tempos de retenção12.
-
17
A resolução também apresenta limitações. Trata-se de um critério não
normalizado, que restringe as possibilidades de combinações de valores
elementares e torna a interpretação mais difícil. Refere-se a par de picos, em
vez de picos individuais, o que implica em restrição quando o objetivo não é
separação de todos os componentes, mas a resolução de alguns compostos
particulares. A atribuição de valores é problemática quando a ordem de eluição
é alterada, por exemplo, com a mudança da composição da fase móvel13. A
Figura 1.2 descreve um planejamento tipo simplex centróide para a composição
da fase móvel, onde os valores das resoluções são representados por superfícies
de respostas que, quando sobrepostas, podem alcançar uma única região
otimizada, desde que os máximos individuais estejam nas mesmas regiões de
cada figura. Porém, em dados cromatográficos, isso se torna complicado, pois
nem sempre a região otimizada individualmente será a mesma para todos os
compostos analisados.
Figura 1.2. Esquema de otimização multiresposta para fase móvel em
cromatografia líquida.
Em otimização multiresposta, Figura 1.2, as variáveis são avaliadas
simultaneamente em relação a mais de uma resposta. Isso implica na
determinação do ponto na superfície de resposta onde em relação aos critérios
estabelecidos as respostas apresentem melhor desempenho ao mesmo tempo.
-
18
Os poucos métodos disponíveis para otimizar várias respostas
cromatográficas simultaneamente como sobreposição de superfícies de
respostas e o método de desejabilidade de Derringer e Suich que são úteis em
termos de resolução entre pares de picos e retenções relativas. Infelizmente isto
não é possível usando tempos de retenção porque as propriedades a serem
otimizadas dependem das localizações de mais do que um pico.
Devido à importância dos critérios de separação cromatográfica, foram
comparados três parâmetros: tempo de retenção, resolução e largura na base dos
picos com o objetivo de comparar as precisões de modelos obtidos de
planejamentos de experimentos. Isso permitirá avaliar a viabilidade do uso de
modelos de tempo de retenção juntamente com a computação gráfica na
otimização multiresposta de sistemas cromatográficos. Tendo em vista as
vantagens em fazer modelagem estatística usando tempos de retenção, que trata
picos individuais, o desenvolvimento de um método de otimização por
simulação dos comportamentos de picos cromatográficos com mudanças nas
condições cromatográficas foi utilizado.
A simulação foi feita com base em um programa de computação gráfica
desenvolvido na Universidade Estadual de Londrina pelo Professor Doutor
Carlos Alberto Paulinetti da Camara. Através do ponteiro do mouse escolhe-se
um conjunto de condições dentro do domínio experimental já investigado por
planejamento de experimentos. Os valores das condições cromatográficas serão
substituídos nos modelos estatísticos onde o tempo de retenção de todos os
picos cromatográficos de interesse é calculado. Esses tempos são então exibidos
graficamente na tela de computador. O usuário manipula o mouse dentro do
domínio experimental até conseguir obter um cromatograma simulado que
satisfaça os objetivos previamente definidos, como a maximização das
resoluções de todos os picos.
-
19
1.2. Parte experimental
O conjunto de dados cromatográficos utilizado foi obtido em
experimentos realizados no laboratório da Professora Doutora Isabel Cristina
Sales Fontes Jardim, no Instituto de Química da Universidade Estadual de
Campinas.
Uma mistura complexa envolvendo onze agrotóxicos foi analisada por
cromatografia liquida de alta eficiência com detector do tipo arranjo de diodos.
A mistura de agrotóxicos foi composta de imazetapir (Im), imazaquim (Iz),
ametrina (Am), cianazina (Ci), simazina (Si), atrazina (At), bentazona (Be),
carbaril (Ca), carboxim (Cx), tiofanato metílico (Tm) e metsulfuron (Me). Essa
mistura de agrotóxicos apresentou problemas de sobreposição de picos em
trabalhos anteriores14.
Um planejamento simplex centróide foi empregado para a fase móvel. Os
três modificadores orgânicos mais usados em cromatografia líquida em fase
reversa são acetonitrila, metanol e tetrahidrofurano, que correspondem
respectivamente aos pontos 1, 2 e 3 do planejamento, Figura 1.3. A água foi
usada para ajustar as misturas de forma que os três solventes apresentassem
mesma força cromatográfica.
As condições cromatográficas foram: temperatura ambiente, eluição
isocrática (acidificada a pH 3 com ácido fosfórico) de 1 mL/min. Foram
utilizadas duas colunas recheadas com as seguintes fases estacionárias: SGE
C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm) e Thermo Hypersil ODS
C18 (4,6 x 150 mm, partículas de 5 µm). As corridas foram realizadas
empregando-se um cromatógrafo a líquido marca Shimadzu, constituído de
auto injetor com amostragem programada de 10 µL, modelo SIL-10AF;
bombas de alta pressão, tipo recíproca, pistão duplo, modelo LC-10AT;
https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2F%2Fdgp.cnpq.br%2Fbuscaoperacional%2Fdetalhepesq.jsp%3Fpesq%3D7627341680778347&ei=FJLWU8-sE-HO8AGmsIGgAQ&usg=AFQjCNHkxPETUqEkx4h1c4hgtjIAxz0StQ&bvm=bv.71778758,d.b2U
-
20
detector espectrofotométrico de arranjo por diodos, cela do injetor de 8 µL de
volume, 10 mm de caminho óptico, modelo SPD-M10AVP; sistema de
aquisição de dados: microcomputador, com software de aquisição de dados
cromatográficos Class VP; forno para coluna, modelo CTO-10AS; controlador
de sistema SCL-10 A.
Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das
composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH
= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v).
Para cada coluna foram gerados dois conjuntos de dados, nos quais a
composições (v/v) de fase móvel dos vértices do planejamento simplex
centróide foram:
1) ACN:H2O (30:70); MeOH:H2O (45:55); THF:H2O (30:70).
2) ACN:H2O (55:45); MeOH:H2O (70:30); THF:H2O (50:50).
Foram gerados dois conjuntos de dados, utilizando as mesmas condições
cromatográficas com exceção da coluna, que foi variada entre a coluna SGE e
a coluna Thermo descritas acima. Porém, os experimentais não foram uteis
para fins de previsão, pois apresentaram falta de ajuste para praticamente todos
-
21
os agrotóxicos. Como alternativa, o conjunto de dados apresentados nos
cálculos foi gerado por Marcia Breitkreitz14 com uma coluna SGE (idêntica à
descrita acima) nas condições de fase móvel 1 demonstrada acima.
1.3. Tratamento multivariado
1.3.1. Tempo de retenção
Os tempos de retenção para cada agrotóxico analisado, em todas as
misturas do planejamento e suas réplicas, são apresentados da Tabela 1.1:
Tabela 1.1. Tempos de retenção, em minutos, para os agrotóxicos analisados
em cada mistura do planejamento experimental e sua réplica em minutos. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx
1 0 0 9,75 10,41 11,30 11,30 13,86 14,82 17,70 18,43 20,00 6,41 22,15
0 1 0 11,97 13,60 19,60 9,53 11,97 13,60 22,28 22,25 15,73 9,46 15,17
0 0 1 9,25 9,91 13,93 10,50 18,78 7,68 15,46 15,50 9,60 5,01 12,20
0,5 0,5 0 12,20 15,45 17,81 12,20 16,20 18,35 22,76 22,75 20,20 10,07 20,20
0,5 0 0,5 8,45 7,28 10,80 9,15 14,87 8,45 15,27 14,40 11,85 5,37 13,27
0 0,5 0,5 8,94 6,89 12,89 8,94 17,37 8,34 15,83 15,13 11,21 4,97 12,48
0,33 0,33 0,33 5,74 9,17 8,10 12,60 9,17 16,02 9,67 16,04 16,02 13,27 14,02
1 0 0 9,26 9,73 10,65 10,65 12,85 13,56 18,47 17,15 18,40 6,08 20,45
0 1 0 12,20 13,25 10,03 9,95 12,72 14,02 22,20 22,16 15,92 9,51 15,40
0 0 1 9,35 6,87 14,76 10,67 19,54 7,64 15,98 15,96 9,73 4,90 12,44
0,5 0,5 0 12,45 16,10 18,69 12,45 16,79 19,22 23,66 23,68 21,08 9,84 21,08
0,5 0 0,5 8,83 7,57 11,71 9,62 15,92 9,15 14,38 15,25 12,54 5,52 14,04
0 0,5 0,5 9,22 7,06 13,89 9,22 18,26 8,60 15,13 15,79 11,67 5,03 12,97
0,33 0,33 0,33 5,63 9,26 8,09 13,01 9,26 16,51 9,75 16,53 16,51 13,59 14,42
-
22
Com as respostas de tempo de retenção para cada um dos agrotóxicos
foram construídos modelos de regressão para obter uma relação que nos
permitisse prever estes valores de tempo de retenção como função dos valores
de proporções dos solventes. Primeiramente foi aplicado o modelo linear,
porém a análise de variância utilizada para testar o ajuste do modelo no nível de
95% de confiança apresentou equação inadequada para representar
precisamente os dados.
O modelo quadrático foi avaliado quanto ao ajuste dos dados no nível de
95% de confiança e os resultados da ANOVA para esse teste estão apresentados
na Tabela 1.2, assim como o teste para significância da regressão.
Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e media
quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
Imazetapir 10,55 1,46 1,44 0,02 7,20 72,00
Simazina 5,40 0,65 0,61 0,04 8,24 14,36
Imazaquim 26,06 4,60 3,86 0,74 5,67 5,21
Ametrina 13,87 10,80 3,98 6,82 1,28 0,58
Cianazina 3,10 1,28 1,21 0,07 2,43 16,94
Tiofanato 13,47 1,20 0,87 0,33 11,22 2,62
Metsulfuron 38,62 7,01 6,79 0,22 5,51 30,80
Atrazina 0,40 7,90 1,21 6,69 0,05 0,18
Bentazona 27,40 2,44 2,14 0,29 11,25 7,28
Carbaril 39,85 2,32 2,02 0,30 17,20 6,76
Carboxin 32,65 2,24 1,90 0,34 14,58 5,58
*Valor de F para significância dos resultados dado por MQR/MQr e para
falta de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de
95% de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
A razão MQfaj/MQep é usada para avaliar se o modelo está ou não bem
ajustado as observações. Valores altos dessa razão significam maior falta de
-
23
ajuste. O valor dessa razão é comparado com o valor de F tabelado com os
graus de liberdade correspondentes, que nesse caso é 1 e 7.
O valor de F 1,7 é 5,59 e com base na Tabela 1.2, o imazetapir, a simazina,
a cianazina e metsulfuron apresentaram falta de ajuste no nível de 95% de
confiança. A bentazona e o carbaril estão bem próximos do valor tabelado, já o
imazaquim, ametrina, tiofanato, atrazina e o carboxin apresentaram valores
menores ao valor de Ftab para o modelo quadrático.
No nível de 95% de confiança F5,8 é 3,69. Nesse caso a regressão é
estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base na Tabela 1.2,
apenas a ametrina, cianazina e a atrazina não apresentam significância
estatística da regressão, porém nenhuma razão tem valor altamente
significativo.
Os dados foram testados em relação ao ajuste com o modelo linear,
porém ocorreu falta de ajuste para todos os agrotóxicos. O modelo cúbico
especial também foi testado, mas não apresentou resultados mais satisfatórios
do que o modelo quadrático.
Para testar modelos mais superiores é necessário um número bem maior
de experimentos e as funções assim obtidas teriam comportamentos complexos
e dificilmente seriam representadas por polinômios de baixa ordem. Como
resultado os modelos estatísticos determinados para tempos de retenção não
representaram precisamente os resultados experimentais.
1.3.2. Resolução
Muitos problemas que assolam tradicionais funções cromatográficas de
resposta ou de critérios de separação podem ser atribuídos às sobreposições de
picos, situação em que dificilmente se obtém informações suficientes quanto ao
-
24
número de componentes, grau de pureza e de sobreposição de pico a partir de
uma única resposta no cromatograma16.
No caso da mistura de agrotóxicos o uso da resolução tornou-se
complicado devido à enorme inversão de picos de um ponto do planejamento
simplex centróide em relação aos outros. A ordem de eluição obtida no
cromatograma do ponto central foi tomada como base para os possíveis pares
de picos e esta ordem pode ser vista na Figura 1.4.
5 10 15 20 25
40
60
80
100
120
140
160
180
2001/3ACN:1/3MeOH:1/3THF
6+8+9
11
10
4
7
2+5
31
Inte
nsid
ade d
e a
bsorb
ância
Tempo / min
Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos
empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),
volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O 45:55
(v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de
ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em 210
nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.
-
25
A Tabela 1.3 agrupa os valores de resolução para cada par de picos,
calculados de acordo com a equação 1. Os pares de picos seguindo a ordem da
Figura 1.4 e seus valores de resolução estão na Tabela 1.3.
Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos usando como base a
ordem de eluição do cromatograma obtido no ponto central. ACN MeOH THF 1 e 3 3 e 2 2 e 5 5 e 7 7 e 4 4 e 10 10 e 11 11 e 6 6 e 8 8 e 9
0 1 0 9,30 -1,45 3,46 8,08 -8,08 20,08 4,96 -19,04 9,00 1,50
1 0 0 9,00 -2,54 -5,19 9,42 11,47 -7,15 -1,15 -6,23 1,38 21,46
0,5 0,5 0 4,38 5,54 2,77 -6,69 14,54 -9,92 6,00 15,23 -4,38 -3,23
0 0,5 0,5 13,15 -7,62 0 14,08 -1,15 5,54 0 -9,23 2,77 12,46
0 0 1 4,38 2,77 1,62 -1,62 5,31 2,54 3,23 3,69 2,08 -3,23
0,5 0 0,5 4,45 4,71 0 -1,25 10,39 -3,92 3,00 11,54 -2,31 -3,12
0,33 0,33 0,33 5,42 2,54 0 1,13 6,97 1,43 1,62 4,73 0 0
1 0 0 8,31 -0,92 3,00 6,92 -6,92 18,00 4,85 -17,77 8,31 1,62
0 1 0 9,46 -3,69 -5,77 9,46 13,85 -9,00 -1,15 -7,39 -2,31 21,46
0 0 1 4,62 5,77 2,77 -6,92 16,62 -11,77 6,23 16,62 -4,85 -3,46
0,5 0,5 0 13,85 -8,54 0 15,69 -1,15 5,31 0 -9,69 2,77 13,15
0,5 0 0,5 4,85 2,77 1,85 -0,92 5,77 2,08 3,23 4,38 2,08 -3,46
0 0,5 0,5 4,85 4,85 0 -1,38 12,23 -5,08 3,00 12,23 -2,54 -3,23
0,33 0,33 0,33 5,54 2,77 0 0,92 7,62 1,38 1,85 4,85 0 0
Os valores de resolução para todos os pontos do planejamento simplex
centróide foram submetidos a análise de variância ANOVA para testar o ajuste
do modelo quadrático aos dados. A Tabela 1.4 apresenta os valores para estimar
a significância da regressão e da falta de ajuste no nível de 95% de confiança.
Para testar a falta de ajuste, o valor tabelado de F 1,7 foi 5,59. Com base
na Tabela 1.4, a maioria dos pares de picos apresentou falta de ajuste. Os pares
1-3, 3-2, 2-5, 5-7 apresentaram alto valor de MQfaj/MQep indicando que o
modelo quadrático não se ajusta aos dados. Os pares 4-10, 10-11, 11-6 e 6-8
não apresentaram falta de ajuste. E os pares 7-4 e 8-9 têm valores calculados
próximos do valor tabelado podendo ser ajustados ao modelo quadrático.
-
26
Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média
quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução. Pares de picos MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
1 -3 26,80 5,74 5,59 0,15 4,67 37,05
3 - 2 55,39 11,53 11,34 0,19 4,80 61,28
2 - 5 20,05 0,66 0,62 0,04 30,37 14,52
5 - 7 132,93 13,81 13,48 0,32 9,63 41,59
7 - 4 157,97 9,53 8,44 1,10 16,58 7,70
4 - 10 239,66 0,91 0,03 0,91 263,36 0,03
10 - 11 15,93 0,01 0,04 0,09 1592,55 0,48
11 - 6 363,07 1,39 0,96 0,43 261,20 2,22
6 - 8 43,54 1,59 0,57 1,03 27,38 0,55
8 - 9 225,23 0,49 0,46 0,04 459,66 10,40
*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta
de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%
de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
A regressão é estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base
na Tabela 1.4, todos os pares de picos apresentam significância estatística da
regressão.
As variáveis em questão, proporções de acetonitrila, metanol e
tretrahidrofurano, exercem influência sobre a resposta do cromatograma.
Mudando-se a composição da fase móvel, a separação da mistura analisada
também muda. As misturas binárias entre esses solventes também tem efeito
significativo diante da resposta cromatográfica. Um modelo mais complexo
poderia ser testado, visando melhorar a falta de ajuste e significância da
regressão, porém seria necessária uma grande quantidade de experimentos.
-
27
1.3.3. Largura da base
O tempo de retenção e a resolução são regularmente aplicados para
avaliar a qualidade do cromatograma obtido, já os valores referentes à largura da
base, ou seja, a distância entre as tangentes traçadas nas laterais do pico, não são
comumente usados, mas de qualquer maneira foram testados para avaliar a falta
de ajuste e a significância da regressão. Isso é importante porque além de simular
o tempo de retenção de cada pico no programa computacional também é
necessário prever a largura dos picos para se ter uma indicação da separação real
entre os picos.
A Tabela 1.5 contém os valores de largura da base dos picos
cromatográficos para cada agrotóxico presente na mistura estudada. Esses valores
foram obtidos pela subtração: X2 – X1, como representado na Figura 1.5:
Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos
cromatográficos de cada agrotóxico estudado.
-
28
Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada
agrotóxico estudado. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx
1 0 0 0,44 0,66 0,6 0,76 0,76 0,76 0,75 0,69 0,81 1,11 0,92
0 1 0 0,46 0,65 0,71 1,15 0,64 0,44 0,53 0,71 1,10 1,43 1,43
0 0 1 0,3 0,91 0,48 0,84 0,66 0,68 0,54 0,78 0,82 0,94 0,53
0,5 0,5 0 0,53 0,91 1,57 1,73 0,91 1,57 1,73 1,73 1,20 1,21 1,21
0,5 0 0,5 0,30 1,14 0,44 0,56 1,20 1,10 1,14 0,62 1,08 0,66 0,54
0 0,5 0,5 0,30 0,66 0,40 0,98 0,66 0,56 0,38 0,70 0,76 0,59 0,98
0,33 0,33 0,33 0,34 1,01 0,41 1,36 1,01 1,30 1,01 1,30 1,30 1,36 0,43
1 0 0 0,50 0,47 0,50 0,78 0,78 0,63 0,69 0,65 0,86 1,09 0,71
0 1 0 0,93 0,92 0,93 1,06 0,93 0,92 0,93 1,49 1,10 1,37 1,37
0 0 1 0,51 0,87 0,44 0,75 0,76 0,81 0,47 0,87 0,78 0,87 0,51
0,5 0,5 0 0,47 0,86 1,39 2,02 0,86 1,39 2,02 2,02 1,09 1,14 1,14
0,5 0 0,5 0,35 1,19 0,37 0,47 1,19 1,20 1,19 0,65 1,20 0,70 0,56
0 0,5 0,5 0,29 0,59 0,36 0,69 0,59 0,65 0,42 0,77 0,84 0,67 0,42
0,33 0,33 0,33 0,36 1,07 0,46 1,16 1,07 1,07 1,07 1,07 1,07 1,16 0,46
Com base na Tabela 1.6, podemos observar que os valores maiores que
MQR/MQr > 3,69 são poucos e que nenhuma das medidas de largura de base
apresentou um grande valor de significância estatística no nível de 95% para o
modelo quadrático, portanto não sendo muito úteis para fins de previsão.
O valor tabelado de F 1,7 é 5,59. Com base na Tabela 1.6, a falta de ajuste
foi alta apenas para os agrotóxicos imazaquim e carbaril. Os demais
agrotóxicos apresentaram valores de MQfaj/MQep baixos, indicando o bom
ajuste ao modelo quadrático.
-
29
Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média quadrática
dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média
quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da base. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*
Imazetapir 0,05 0,02 0,00 0,02 2,25 0,04
Simazina 0,11 0,02 0,01 0,01 5,11 1,39
Imazaquim 0,34 0,17 0,17 0,01 1,98 22,99
Ametrina 0,48 0,04 0,02 0,02 13,59 1,12
Cianazina 0,09 0,02 0,01 0,01 5,45 1,30
Tiofanato 0,27 0,03 0,00 0,03 10,36 0,01
Metsulfuron 0,58 0,11 0,09 0,02 5,36 4,87
Atrazina 0,07 0,02 0,02 0,01 3,19 2,65
Bentazona 0,46 0,06 0,00 0,05 8,23 0,02
Carbaril 0,14 0,35 0,35 0,00 0,38 79,25
Carboxin 0,29 0,16 0,13 0,03 1,79 5,05
*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta
de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%
de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.
Portanto, independente dos critérios usados para modelos de regressão, o
sistema cromatográfico estudado mostrou-se complexo e de difícil separação.
Sendo o tempo de retenção o critério mais simples por tratar os picos de forma
individual, os resultados obtidos foram usados para simular a separação
cromatográfica no programa computacional.
1.4. Programa Computacional
A escolha e validação dos modelos que foram usados na simulação
usando o programa computacional foram definidos pelos resultados das
ANOVA das regressões para tempos de retenção. Para isso, foram utilizados os
tempos de retenção dos onze agrotóxicos analisados estatisticamente de acordo
com o planejamento simplex centróide. Após inserir os coeficientes dos
-
30
modelos da regressão no programa, com o ponteiro do mouse foi simulada a
separação dos 11 compostos e a separação simulada foi então comparada com
os cromatogramas reais obtidos em cromatografia liquida de alta eficiência em
fase reversa (Figura 1.6).
(a)
-
31
(b)
5 10 15 20 25
0
20
40
60
80
100
11
10
9
876
4+5
3
2
1
Inte
nsid
ade d
e a
bsorb
ância
Tempo / min
(c)
Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental; (c)
cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,
3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =
bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.
Para exemplificar, observamos à similaridade do comportamento
experimental com o obtido pelo programa computacional (Figura 1.5) em
-
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relação à separação e ordem de eluição dos agrotóxicos analisados no ponto
indicado pela seta que corresponde a ACN: H2O. Essa similaridade nos
permitiu avaliar todo espaço do simplex e em cada ponto obter a separação
simulada. Assim, todas as combinações possíveis de misturas de fase móvel
podem ser avaliadas.
1.5. Conclusões 1
De acordo com o estudo realizado no capitulo 1 concluímos que:
1) A resolução e tempo de retenção mostraram a mesma dificuldade em
ajustar um modelo matemático aos dados experimentais. Ambos os
parâmetros cromatográficos apresentaram falta de ajuste para vários
agrotóxicos presente na mistura.
2) A maioria dos modelos para largura dos picos não mostraram falta de
ajuste significativa e também uma branda dependência em mudanças no
domínio experimental, ou seja, não apresentaram significância na
regressão. Isto significa que podemos ter menos preocupação com a
largura dos picos em tentativas de prever informações cromatográficas.
3) Mesmo utilizando um método cromatográfico isocrático de separação,
uma boa separação cromatográfica foi obtida com o planejamento de
misturas, pois os picos que não f