DANIELY XAVIER SOARES PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO...

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DANIELY XAVIER SOARES

PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS: TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO

CAMPINAS 2014

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

DANIELY XAVIER SOARES

PLANEJAMENTO E OTIMIZAÇÃO DE PROCESSOS MULTIRESPOSTAS:TRATAMENTO QUIMIOMÉTRICO

ORIENTADOR: PROF. DR. ROY EDWARD BRUNS CO-ORIENTADOR: PROFA. DRA. IEDA SPACINO SCARMINIO

TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO

INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTORA EM CIÊNCIAS.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR DANIELY XAVIER SOARES, E ORIENTADA PELO PROF.DR. ROY EDWARD BRUNS.

______________________ Assinatura do Orientador

CAMPINAS 2014

vii

“Que coleção de cicatrizes você tem? Nunca se

esqueça de quem lhe deu as melhores. E seja

grato. Nossas cicatrizes têm o poder de nos

fazer lembrar que o passado foi real.”

Hannibal Lecter

http://pensador.uol.com.br/autor/hannibal_lecter/

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AGRADECIMENTOS

Embora uma tese seja, pela sua finalidade acadêmica, um trabalho

individual, há contribuições de natureza diversa que não podem e nem devem

deixar de ser realçados. Por essa razão, desejo expressar os meus sinceros

agradecimentos:

Aos meus pais por tudo apoio e por me permitirem escolher.

Ao meu irmão pela amizade e por ser minha fonte de inspiração.

Ao Professor Dr. Roy Edward Bruns, meu orientador, pela competência

científica, correções e sugestões relevantes feitas durante a orientação.

Pela paciência e atenção.

À Professora Dra. Ieda Spacino Scarminio, minha co-orientadora, pela

competência científica e orientação, bem como pela disponibilidade.

À Professora Dra. Isabel Jardim, por toda ajuda e contribuição para o

resultado final desta tese, pela atenção e disponibilidade.

Aos Professores Dr. Ronei Poppi e Dr. Fábio Gozzo, por sempre

estarem dispostos a tirar dúvidas e pela atenção.

Ao Dr. Alexandre Ferreira Gomes: namorado, amigo e companheiro

que sempre me estimula a crescer científica e pessoalmente. Pelas

inúmeras conversas sobre assuntos diversos, pelas correções e

x

comentários na tese. Acima de tudo, pelo inestimável apoio, pela

paciência e compreensão.

Aos amigos de todas as horas: Hector Koolen, Dr. Clécio Klitzke e

Adriana Godoy.

Aos amigos que conquistei no Instituto de Química: Giovana, Aline,

Carla, Ana Carolina, Bruna Campos, Eduardo, Arnaldo, Bruna Zucoloto,

Nicolas, João, Dr. Maurício (Cabuloso), Maurício (Xanxeré), Dr. Marcelo

(P2), Luana, Jandyson, Lívia, Wagner e Klécia e aos muitos outros que

também estão em meu coração.

A Dra. Márcia Breitkreitz, IAPAR e Arnaldo pela contribuição com os

conjuntos de dados.

A todo Instituto de Química, professores, técnicos e funcionários.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pelo apoio no desenvolvimento do trabalho.

Mais uma vez, a todos os meus sinceros agradecimentos.

xi

SÚMULA CURRICULAR (2010-2014)

Daniely Xavier Soares

Data de nascimento: 24/06/1985 Endereço eletrônico: [email protected]

Formação Acadêmica

2010 – 2014 Doutorado em Ciências (Química Analítica) Título: “Planejamento e otimização de processos

multirespostas: tratamento quimiométrico”

Instituto de Química – Universidade Estadual de

Campinas (UNICAMP), Campinas, SP

Orientador: Prof. Dr. Roy Edward Bruns

Agência Financiadora: Capes

2008 – 2010 Mestrado em Química Título: “Comparação de procedimentos de extração

de material vegetal para otimizar o rendimento de

metabólitos secundários”

Departamento de Química – Universidade Estadual

de Londrina (UEL)

Orientador: Profa. Dra. Roy Edward Bruns

Agência Financiadora: Capes

2004 – 2007 Licenciada em Química

Universidade Estadual de Goiás (UEG)

2006 – 2007 Iniciação Científica em Química Analítica Título: “Avaliação das características físico-química

do leite ultrapasteurizado (UHT)”

Orientador: Profa. Ms. Tatiana de Oliveira Zuppa

Universidade Estadual de Goiás (UEG)

1. Produção Científica

mailto:[email protected]

xii

SOARES, D. X.; Scarminio, I. S.; Bruns, R. E. Mixture designs for

exploring class diversity and metabolite fingerprinting: An efficient column

chromatographic strategy. Analytica Chimica Acta, 2011.

Silva, A. F.; Soares, D. X.; Faria, S. H. D. M.; Bruns, R. E. . Basis set

selection for the calculation of the IR fundamental intensities for 1,1-

C2H2F2 and F2CO. Journal of Molecular Structure, 2011.

2. Experiência Didática

2014 - CH5 serviços em análise instrumental: Ministrou o curso de

planejamento de experimentos.

2013 - Participação no Programa de Estágio Docente (PED) do Instituto de

Química da UNICAMP, nível C, por um semestres, na disciplina QG108

(Química Geral Teórica).

2013 - Universidade Federal de Santa Maria: Ministrou o curso de

planejamento de experimentos.

2012 – Faculdade Oswaldo Cruz: Professora de quimiometria do curso de pós-

graduação em analise instrumental.

3. Apresentação de trabalhos em eventos

2014 - 37° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química. Trabalho:

Identificação dos isômeros eritrartina e 11-metoxi-erisodina através dos

espectros UV-VIS e cálculos teóricos

2013 - V Congresso da BrMass. Trabalho: Simplex centroid design

optimization for the extraction of the alkaloids in erisotrina of flowers

Erythrina speciosa Andrews.

2012 - XIII Chemometrics in Analytical Chemestry Conference.

Trabalho: Multiple criteria decision making for chromatographic and

electrophoretic separations.

2011 - 16° Encontro Nacional de Química Analítica.

Trabalhos: a) Análise multi-way dos dados CLAE-DAD da fração básica de

Erythrina speciosa Andrews. b) Análise quimiométrica e planejamento

experimental para avaliação dos espectros UV-Visível de extratos de plantas

medicinais.

2010 - 33º reunião Anual da Sociedade Brasileira de química. Trabalhos:

(a) Comparação de dois procedimentos cromatográficos de coluna aberta pata

análise de extratos das folhas de Erythrina speciosa Andrews. (b)

Planejamento estatístico de misturas em cromatografia liquida para a busca da

impressão digital de extrato de Erythrina speciosa Andrews.

xiii

RESUMO “Planejamento e otimização de processos multirespostas: tratamento

quimiométrico”

Foram estudados três parâmetros cromatográficos: tempo de retenção,

resolução e largura dos picos, em cromatogramas obtidos para uma mistura de

onze agrotóxicos. Ajustes de modelos de regressão foram construídos e

validados por ANOVA. Devido a sua simplicidade, os resultados obtidos para

tempo de retenção foram usados em um programa interativo para estudar as

separações como função de todo domínio experimental do planejamento

simplex centróide. Um planejamento de misturas envolvendo três solventes

(etanol, diclorometano e hexano) foi usado para avaliar a extração de

alcalóides em Erythrina speciosa. Resultados diferentes foram observados

para os extratos da flor, caule e folha, evidenciando que perfis de alcalóides

distintos podem ser obtidos a partir de diferentes partes da planta. Modelos de

regressão foram construídos e validados por ANOVA para dois alcalóides

(tentativamente identificados por espectrometria de massas como eritrartina e

11-metoxi-erisodina, isóbaros em m/z 330, e erisotrina em m/z 314, com base

em literatura prévia). A análise das componentes principais foi aplicada ao um

conjunto de dados de absorbância de folhas de quatro cultivares de café (IPR-

59, CAT, 027 e 083) obtidos entre 350-1100 nm por um espectroradiômetro

portátil LI_COR 1800. Esta análise somente conseguiu discriminar espectros

obtidos na face adaxial e abaxial das folhas. Como estes dados seguem um

planejamento fatorial para quatro fatores (irrigação, estratos extremos, pontos

cardeais e face) valores de efeitos foram determinados para absorbância em

três comprimentos de onda estratégicos, 520, 554 e 650 nm, que são

importantes para a quantificação de conteúdos de clorofilas e antocianinas.

xv

ABSTRACT “Design and multiresponse optimization of processes: chemometric

treatments”

Three chromatographic separation criteria were evaluated: retention time,

resolution and peak width, in chromatograms obtained from a mixture of

eleven pesticides. Regression models were constructed and validated by

ANOVA. The use of the interactive program proved to be a valuable tool for

studying peak separation behavior for the entire experimental domain of the

simplex centroid design. Three solvents (ethanol, dichloromethane and

hexane) and their binary and ternary mixtures were evaluated as extraction

media for alkaloids in Erythrina speciosa. Different results were obtained

between extracts of flowers, stems and leaves, showing that distinct alkaloid

profiles can be obtained from different sources within the plant. Regression

models were constructed and validated by ANOVA for two alkaloids

(tentatively identified by MS as erytrartine and 11-methoxy-erisodine, isobaric

ions of m/z 330, and erysothrine of m/z 314, based on previous literature).

Principal component analysis was applied to data sets of absorbance values for

leaves of four coffee cultivars (IPR-59, CAT, 027 and 083) obtained between

350 – 1100 nm by a LI_COR 1800 portable radioespectrometer. This analysis

was only able to discriminate between spectra of the abaxial and adaxial faces

of the leaves. Since the spectral data were consistent with a factorial design for

four factors (irrigated/field water, superior/inferior strata, cardinal points and

face) effect values for absorbance were calculated at four strategic

wavelengths, 520, 554 and 650 nm that are important for quantifying

chlorophyll and anthocyanin contents of coffee.

xvii

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS.............................................................................................XIX

LISTA DE FIGURAS...........................................................................................XXIII

LISTA DE ABREVIATURAS..............................................................................XXVII

INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................. 1

CAPITULO 1 - OTIMIZAÇÃO CROMATOGRÁFICA POR MÉTODO

COMPUTACIONAL INTERATIVO ............................................................. 13

1.1. Introdução..............................................................................................13

1.1. Parte experimental .................................................................................19

1.2. Tratamento multivariado ...................................................................... 21

1.3.1.Tempo de retenção .................................................................................21

1.3.2. Resolução.............................................................................................. 23

1.3.3. Larguras da base ...................................................................................27

1.4. Programa Computacional ......................................................................29

1.5. Conclusões 1..........................................................................................32

CAPITULO 2 – OTIMIZAÇÃO DO SOLVENTE EXTRATOR DE

ALCALÓIDES NAS FLORES, CAULE E FOLHAS DE ERYTHRINA

SPECIOSA ANDREWS .................................................................................35

2.1. Introdução .............................................................................................35

2.2. Experimental .........................................................................................41

2.2.1. Material botânico..................................................................................42

2.2.2. Preparação das amostras e extratos.......................................................43

2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS..............................................................44

xviii

2.3. Resultados e Discussão..........................................................................44

2.3.1. Analise dos extratos das flores ..............................................................46

2.3.2. Analise dos extratos do caule ................................................................61

2.3.3. Analise dos extratos das folhas .............................................................71

2.4. Identificações das estruturas de alcalóides erytrinicos por cálculos

teóricos...................................................................................................85

2.5. Conclusões 2 .........................................................................................87

CAPITULO 3 - OTIMIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES PARA ABSORÇÃO

NAS FOLHAS DE CULTIVARES DE CAFÉ ..............................................91

3.1. Introdução ...............................................................................................91

3.2. Dados .......................................................................................................94

3.3. Tratamento multivariado .........................................................................96

3.4. Conclusões 3 ..........................................................................................108

xix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1. Tempos de retenção para os agrotóxicos analisados em cada ponto

do planejamento experimental e sua replica em minutos.................................21

Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média

quadrática dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e

media quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção....22

Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos com base no

cromatograma obtido no ponto central............................................................25

Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média


média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução................26

Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada

agrotóxico estudado ........................................................................................28

Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média


média quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da bas.........29

Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para

cada mistura.....................................................................................................45

Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina

speciosa em cada uma das misturas de acordo com o planejamento simplex

centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de

m/z foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos

com tempos de retenção distintos....................................................................49

Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos

com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o número de

picos com m/z par para cada cromatograma....................................................50

xx

Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático as

intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex

centróide...........................................................................................................52



centróide...........................................................................................................55

Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina


centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de



Tabela 2.7. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides obtidos

com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o numero de

picos com massa par para cada cromatograma ...............................................63


com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos

axiais e o número de picos com massa par para cada

cromatograma.................................................................................................. 64

Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina


centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de



Tabela 2.10. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides

obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide e o

número de picos com m/z par para cada cromatograma .................................73

Tabela 2.11. Intensidades totais dos espectros de massas dos alcalóides

obtidos com a extração baseada num planejamento simplex centróide com

xxi

pontos axiais e o número de picos com m/z par para cada

cromatograma...................................................................................................75

Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as


centróide...........................................................................................................75

Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas

diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um

pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma

m/z....................................................................................................................82

Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-

pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente ..............................................87

Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para analise das folhas dos cultivares

com a latitude variando nos pontos cardeais .................................................100

Tabela 3.2. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão

para cada efeito .............................................................................................101


650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão

para cada efeito .............................................................................................102

Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520nm, 554nm e

650nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para

cada efeito .....................................................................................................103



cada efeito .....................................................................................................104

Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares

com a longitude variando nos pontos cardeais ..............................................105

Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520nm, 554nm, e

650 nm para os quatro cultivares estudados...................................................106

xxiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas

matrizes............................................................................................................. 7

Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores ...13

Figura 1.2. Esquema de otimização multi resposta para fase móvel em

cromatografia...................................................................................................17

Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das

composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH

= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v) ...............................20

Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos

empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),

volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O

45:55 (v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de

ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em

210 nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,

3=imazaquim, 4 = ametrina, 5 = cianazina, 6 = tiofanato, 7 = metsulfuron, 8 =

bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................24

Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos

cromatográficos de cada agrotóxico estudado.................................................27

Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma

simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental;

(c)cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin ....................................30

Figura 2.1. Componentes basicos de um espectrometro de massas................39

Figura 2.2. Procedimentos experimental empregado na analise da planta

Erythrina speciosa..........................................................................................42

Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol

(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica

das misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das

misturas do planejamento simplex centróide...................................................43

Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com

a mistura (etanol:diclorometano:hexano (0.33;0.33;0.33(v/v)) ......................47

xxiv

Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas

do planejamento simplex centróide ............................................................50

Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,

observados por ESI (+)-MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,

previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e

(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina

lysistemon26......................................................................................................51

Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada as intensidades referentes a m/z

330 de acordo com o planejamento simplex

centróide...........................................................................................................53

Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina

speciosa como erisotrina2.................................................................................54

Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas

do planejamento simplex centróide ...........................................................54

Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os

picos.................................................................................................................57

Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons

no tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento

simplex centróide das flores de Erythrina speciosa .......................................59

Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas

diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex

centróide...........................................................................................................60

Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2 obtidos

com as flores da Erythrina speciosa ...............................................................61

Figura 2.14. Valores de intensidades para m/z 314 de acordo com o

planejamento simplex centróide ...............................................................63

Figura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de

intensidades para m/z 314 em suas respectivas misturas ................................65

Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons

para o caule de acordo com a planejamento simplex centróide ......................66

Figura 2.17. Gráfico dos loadings das componentes principais 1 e 2 para os

dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................68

Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e

caule de acordo com o planejamento simplex centróide .................................69

xxv

Figura 2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do

planejamento simplex centróide para o caule da planta e o cromatograma total

de íons em hexano puro para as flores em negrito ..........................................70


planejamento simplex centróide para as flores com o cromatograma em obtido

em hexano puro em negrito .............................................................................71


planejamento simplex centróide ...............................................................74

Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com

m/z 314 ............................................................................................................76

Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas

totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa ....................................78


dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa ..........................................79

Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na

projeção CP1xCP2xCP3 .................................................................................80


dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa .....................................81

Figura 2.27. Estrutura clássica de alcalóides eritrinicos ...........................85

Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides

eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z

330..................................................................................................................86

Figura 3.1. Curva de rflectância de folhas verde e saudável típica.................93

Figura 3.2. Esquema de analises para cada cultivar com as combinações

possíveis dos fatores estudadas ..................................................................95

Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com

todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos separam as

amostras irrigadas das amostras não irrigados .........................................97

Figura 3.4. Gráfico dos escores para o conjunto de dados irrigado e não

irrigado nos quatro cultivares analisados ........................................................98

Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares

de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na

face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos

de onda de 350 até 1100nm............................................................................107

xxvii

LISTA DE ABREVIATURAS

ANOVA Análise de variância

ACN Acetonitrila

Am Ametrina

At Atrazina

Be Bentazona

Ca Carbaril

CAT Catuaí IAC 99

Ci Cianazina

Cx Carboxim

Dm Diclorometano

Et Etanol

FM Fase móvel

Hx Hexano

IAPAR Instituto Agronômico do Paraná

IPR-59 IAPAR 59

Im Imazetapir

In Intensidade

Iz Imazaquim

Me Metsulfuron

MeOH Metanol

MQep Media quadrática do erro puro

MQfaj Média quadrática da falta de ajuste

MQR Média quadrática da regressão

m/z Razão massa/carga

PCA Analise de Componentes Principais

Rs Resolução

Si Simazina

THF Tetrahidrofurano

TIC Cromatograma totais de íons

UPLC Cromatografia liquida de ultra eficiência

v/v Volume/volume

α Acidicidade

β Basicidade

π Dipolaridade

027 Etiópia IAPAR 027

083 Etiópia IAPAR 083

xxviii

1

1. Introdução geral

O uso de computadores para analisar dados químicos cresceu

drasticamente nos últimos vinte anos, em parte devido aos recentes avanços em

hardware e software1. Cada vez mais fica evidente nos diversos segmentos da

química o crescimento científico e também tecnológico devido ao uso de

recursos computacionais, a química analítica não foge a esta regra. Na área de

química analítica, a aquisição de dados atingiu um ponto bastante sofisticado

com interface de instrumentos aos computadores produzindo uma enorme

quantidade de informação, muitas vezes complexa e variada. Uma das

características mais interessantes dos modernos instrumentos é o número das

variáveis que podem ser medidas em uma única amostra. Diante desse cenário,

os químicos analíticos se deparam com conjuntos de dados que podem oferecer

diversos tipos de informações, sendo importante ter como alternativas algumas

ferramentas matemáticas e estatísticas que possam extrair um maior número de

informações do conjunto de dados de forma criteriosa e científica2,3,4. Tais

ferramentas matemáticas e estatísticas também podem diminuir drasticamente o

tempo necessário para extrair informações relevantes com confiabilidade a

partir de grandes conjuntos de dados.

Um novo termo foi introduzido na química e denominado quimiometria,

que é uma área especificamente destinada à análise de dados químicos de

natureza multivariada. A quimiometria pode ser definida com um ramo da

química que se utiliza da matemática e da estatística de forma a obter resultados

mais satisfatórios possíveis e fornecer conhecimentos sobre os sistemas

químicos5. Esse termo surgiu pela primeira vez em 1971, quando o Professor

Svante Wold (Umea University, Suécia) criou a palavra Kemometri das

2

combinações suecas Kemo e metri. Neste mesmo ano, sugeriu a palavra

equivalente do inglês chemometrics. Em 1972 Svante Wold criou o primeiro

grupo de quimiometria. Em 1973, o primeiro artigo com o termo chemometrics

foi publicado. Em 10 de junho de 1974 a Sociedade Internacional de

Quimiometria, do inglês International Chemometrics Society foi fundada por

Svante Wold (Umea University) e Bruce R. Kowalski (University of

Washington). Em 1975 os dois primeiros artigos contendo o termo

chemometrics em seus títulos foram publicados pelo Grupo de Pesquisa em

Quimiometria do Professor Bruce R. Kowalski, sendo que estes artigos

definiram a quimiometria como uma nova disciplina da Química. Em 1976

aconteceu o primeiro Simpósio de Quimiometria6, 7.

O avanço da quimiometria veio no século 21 pelo fato de várias empresas

de desenvolvimento de software terem promovido métodos de construção de

equipamentos hifenados e mais avançados, abrindo muitas opções para

melhoria de dados analíticos. Assim, a quimiometria passou a ter um papel

importante na química analítica. Diversas contribuições da quimiometria no

tratamento de dados analíticos estão presentes na literatura, seja em dados

espectroscópicos, cromatográficos, eletroforéticos, entre outros8.

A análise multivariada envolve a análise de dados que consiste em

númerosas variáveis medidas a partir de um número de amostras. O objetivo da

análise multivariada de dados é determinar todas as variações na matriz de

dados de estudo. Assim, ferramentas quimiométricas tentam encontrar as

relações entre as amostras e as variáveis em um determinado conjunto de

dados9.

Em sistemas multivariados, a conversão da resposta instrumental no dado

químico de interesse requer a utilização de técnicas de estatística multivariada,

álgebra matricial e análise numérica. Essas técnicas são apontadas, atualmente,

3

como a melhor alternativa para a interpretação de dados e para a aquisição do

máximo de informação sobre o sistema10.

Encontrar as melhores condições para uma dada medida requer

procedimentos de otimização e encontrar as melhores respostas pode ser um

trabalho difícil já que diversas respostas simultâneas podem ser geradas em um

grande conjunto de dados. Pode-se definir otimização como sendo um processo

baseado em instruções que permitam obter o melhor resultado de uma dada

situação. Cientificamente, estas instruções são frequentemente expressas

através de métodos matemáticos que procuram maximizar ou minimizar alguma

propriedade, e obtenção das condições de controle otimizadas11, 12.

Dentre as atividades habituais em química analítica que envolvem

otimização estão13:

a) O desenvolvimento de novos métodos de análise e o melhoramento ou

adaptação de métodos já estabelecidos, estudando-se as variáveis que exibem

efeitos significativos na resposta e que podem ser ajustadas para melhorar a

eficiência do método.

b) O melhoramento do desempenho de instrumentos analíticos

complexos, por acerto simultâneo dos vários parâmetros instrumentais até que a

resposta ótima seja obtida.

c) O ajuste do modelo matemático para os dados experimentais, de tal

modo que a equação teórica represente verdadeiramente os valores

experimentais.

Os procedimentos tradicionais de otimização consistem em estudar cada

fator separadamente. Esse tipo de otimização conduz a um grande número de

experimentos que têm que ser executados, tornando-se um processo demorado e

caro. Em tais casos, uma abordagem multivariada ao problema pode ser

utilizada. Ela baseia-se na utilização de um conjunto mínimo de experimentos

4

que permite a variação e avaliação simultânea de todos os fatores estudados. Há

vários planejamentos de experimentos que se aplicam à otimização, reduzindo o

número de experimentos e fornecendo informações que conduzem à

otimização, entre eles estão: fatorial completo e fracionado, Plackett-Burman,

composto central, Box-Behnken e o simplex centróide14,15.

Por poderem ser usados em diferentes tipos de análises, os planejamentos

mais usuais são os planejamentos fatoriais e o planejamento de misturas tipo

simplex centróide. Com o planejamento fatorial é possível o estudo simultâneo

dos efeitos que vários fatores podem ter sobre a otimização de um processo.

Sua aplicação determina quais fatores tem importância sobre a resposta e como

o efeito de um fator varia de acordo com o nível dos outros fatores16. Os efeitos

são as quantidades diferenciais expressas com uma mudança de resposta

quando o nível de um ou mais fatores são alterados. As interações são a força

motriz em muitos processos de otimização de forma que, sem o uso do

planejamento fatorial, algumas interações importantes podem permanecer

escondidas, e a otimização global não pode ser alcançada. Um dos mais simples

tipos de planejamentos fatoriais utilizados no trabalho experimental é aquele

que tem dois níveis (2k). Num planejamento fatorial 2k, a cada fator podem ser

atribuídos dois níveis: baixo (-1) e alto (+1). Se k fatores são considerados,

então um minímo de 2k medições são realizadas numa análise fatorial17.

Nos planejamentos com misturas, muito aplicados nesta tese, as

propriedades estudadas dependem da proporção dos componentes da mistura e

não da quantidade de cada componente da mistura18. Nesse caso, as variáveis

não são independentes, ou seja, se o nível de uma variável muda significa que o

nível de alguma outra variável também irá mudar, já que a proporção ente elas é

a característica de interesse e o total da mistura corresponde a 100%k. Assim

temos a seguinte restrição19:

5

(1)

de forma que Xi é a proporção dos componentes na mistura e q é o número de

componentes da mistura. Com três componentes (q=3) o espaço da mistura é

um triângulo, chamado simplex, onde os vértices correspondem à composição

dos componentes puros, ou seja, 100% de um componente simples. Nas arestas

estão as misturas binárias em mesma proporção e o centro do triângulo

corresponde à mistura na mesma proporção dos três componentes da mistura. A

mesma ideia pode ser aplicada para q=4, onde a figura geométrica seria um

tetraedro. Maiores números de componentes da mistura levam a figuras mais

difíceis de serem visualizadas, dificultando o processo de otimização já que o

planejamento de misturas explora todo o espaço da figura geométrica20.

Na etapa de avaliação dos resultados dos experimentos, técnicas como a

análise de variância (ANOVA) e a utilização de equações de regressão

encontram larga aplicação. Para estudar o efeito da composição da mistura na

variável resposta de um ensaio, podem-se utilizar modelos matemáticos, que

fazem uso da resolução de equações pelo método dos mínimos quadrados para

encontrar soluções que expressem o comportamento de uma variável

dependente em função da proporção de cada fator estudado. Em geral, utilizam-

se modelos lineares, quadráticos ou cúbicos que usam o mesmo número de

ensaios que o número de coeficientes que se quer estimar21, 22.

Em geral, os modelos usados em planejamentos de mistura são o

quadrático e o cúbico especial. O polinômio cúbico especial é uma forma

reduzida do polinômio de terceiro grau que contém informações sobre as

misturas de todos os componentes. Com q=3 componentes, por exemplo, os

modelos quadráticos e cúbicos especiais, respectivamente são23:

6

= β1X1 + β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + (2)

= β1X1+ β2X2 + β3X3 + β12X1X2 + β13X1X3 + β23X2X3 + β123X1X2X3 + (3)

Onde y representa a função resposta dos dados experimentais; X1, X2 e

X3 são variáveis de mistura que correspondem às proporções dos componentes

estudados, e β representa os parâmetros estimados. A partir das respostas

experimentais e dada a forma do modelo estima-se o vetor dos parâmetros β, de

forma que o modelo se ajuste adequadamente aos dados. O vetor β é o resultado

da operação matricial apresentada na equação 4:

(4)

O teste mais geral de ajuste do modelo aos dados é o teste F de análise de

variância, que verifica a significância do modelo como um todo. Através do

modelo ajustado, pode-se realizar a otimização da variável de resposta de

interesse, isto é, obter a combinação de variáveis de controle que propiciará a

melhor resposta do sistema com o qual se está trabalhando com o menor custo.

Para extrair o máximo de informações dos resultados de um experimento

químico, um grande número de variáveis está envolvida24. Muitas vezes, apenas

parte dessas variáveis contém informações relevantes e a maioria das variáveis

adiciona pouco ou quase nada à interpretação dos resultados em termos

químicos. A redução de variáveis através de critérios objetivos, que permita

dizer quais são as variáveis de interesse contendo maior informação, pode ser

alcançada através da Análise de Componentes Principais (PCA), que permite

explorar os resultados obtidos por meio de análises químicas com intuito de

verificar a existência de similaridade entre as amostras.

7

A PCA é um método que tem por finalidade básica a redução de dados a

partir de combinações lineares das variáveis originais. Na PCA, a

decomposição é calculada através da diagonalização da matriz XtX ou XXt. A

matriz X (n x p), formada por n objetos e p variáveis é decomposta no produto

de duas matrizes menores, equação 5:

X = T x P’ + (5)

no qual T é a matriz dos scores das componentes principais, P é a matriz

loadings (pesos) das componentes principais, e é a matriz dos resíduos. O

sobrescrito t indica a transposta da matriz e q é um escalar que indica o número

de componentes principais que descreve a maior parte da variância dos dados.

Este procedimento está representado esquematicamente na Figura 125.

Figura 1. Esquema da decomposição da matriz X no produto de duas matrizes.

Após os cálculos, os resultados são utilizados para interpretar a

distribuição das amostras num gráfico bidimensional das componentes

principais e posteriormente identificar e julgar a importância das variáveis

originais escolhidas, pois as variáveis originais com maiores valores de

loadings na combinação linear das componentes principais são as mais

importantes do ponto de vista estatístico26.

q

.

p p

n

X

n

q

T

P t

n

p

= +

8

Os chamados dados brutos, ou seja, dados obtidos diretamente de uma

análise podem apresentar diversas fontes de variação. Isso causa irregularidades

sistemáticas na linha de base, ruídos instrumentais ou unidades e magnitudes.

Antes da realização do tratamento multivariado pode ser necessário um pré-

processamento para remover fontes indesejáveis de variações que podem afetar

as variáveis do conjunto de dados como um todo.

Essa etapa é muito importante para os resultados obtidos no tratamento

multivariado. Os principais pré-processamentos são o centrado na média, que

subtrai de cada elemento da linha a média de sua respectiva coluna; o

escalonamento, onde cada elemento fica na mesma escala fazendo com que

cada variável fique com o mesmo peso; auto-escalonamento, que centraliza os

dados na média e faz o escalonamento, deixando as variáveis com média zero e

desvio-padrão igual a um. Outros pré-processamentos vem sendo utilizados

como, por exemplo, a derivação. Essa etapa deve ser avaliada com cuidado e a

decisão de qual pré-processamento deve ser coerente com a natureza dos dados.

Para isso é muito importante ter conhecimento aprofundado sobre o sistema em

estudo27.

Tendo em vista a complexidade dos dados analíticos e a importância de

condições que levem a melhores resultados, com extração do maior número de

informações possível, ferramentas quimiométricas foram aplicadas a dados

multirespostas para estudar e otimizar os fatores que levam as melhores

respostas. Foram utilizados planejamentos fatoriais e de misturas com o

objetivo de eliminar fatores que não afetam os resultados e chegar a condições

que levem ao máximo em cada conjunto de dados.

No capítulo 1 o objetivo geral foi utilizar planejamento de misturas para

otimizar separações cromatográficas. Modelos de regressão foram construídos e

9

usados num programa computacional interativo para investigar a separação

cromatográfica em todo domínio experimental.

No capítulo 2 o objetivo geral foi a aplicação de planejamento de

misturas para otimizar o solvente extrator na planta medicinal Erythrina

speciosa e avaliar a influência de misturas de solventes na extração de

alcalóides, principais constituintes da planta, e identificar similaridades nas

extrações por PCA.

No capítulo 3 o objetivo geral foi utilizar planejamentos fatoriais para

avaliar a influência dos fatores na absorção de clorofila e antocianinas em

cultivares do café para otimizar as melhores condições de absorção. Um estudo

exploratório dos dados experimentais foi feito por PCA.

_____________________________________________________________

1 CORREIRA, P. R. M.; FERREIRA, M. M. C. Reconhecimento de padrões por métodos

não supervisionados: explorando procedimentos quimiométricos para tratamento de dados

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combustion data: Data pre-processing and manifold sensitivity. Combustion and Flame. 160,

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13

Capitulo 1 - Otimização cromatográfica por método

computacional interativo

1.1. Introdução

Um dos problemas mais comuns para o experimentalista é determinar a

influência de vários fatores ou variáveis sobre as respostas ou propriedades de

um sistema. A Figura 1.1 descreve um sistema de natureza desconhecido com j

respostas ou propriedades que serão otimizadas manipulando os níveis de k

fatores ou condições experimentais.

Figura 1.1. Sistema de natureza desconhecida com j respostas e k fatores.

O grande desafio na otimização de sistemas químicos é simultaneamente

tratar muitas respostas. As condições experimentais que melhoram algumas

respostas muitas vezes resultam em piora nos valores de outras respostas.

Existem dois métodos sendo usados em química para otimizar sistemas

14

multirespostas. Ambos são baseados em modelos empíricos obtidos dos

resultados de um planejamento experimental1. Um dos métodos consiste na

sobreposição das curvas de níveis de superfícies para cada resposta investigada.

O pesquisador visualmente tenta achar regiões dentro do domínio experimental

para as quais todas as respostas têm valores aceitáveis. O segundo utiliza a

função de desejabilidade de Derringer e Suich. Esta função consiste de um

produto das desejabilidades individuais de cada resposta. Utilizando os modelos

empíricos que estão armazenados no computador, um algoritmo computacional

faz uma busca para as condições experimentais que maximiza a desejabilidade

global. Além de ser de uso difícil para o experimentalista e de exigir a escolha

dos valores de vários parâmetros abstratos, sua aplicação requer a especificação

de um alvo que nem sempre é fácil de definir 1.

A otimização em cromatografia é um grande passo para funcionamento

ótimo da técnica, porém é complicado achar uma condição cromatográfica que

atinja todos objetivos da análise. Um fator complicado é que os objetivos da

otimização cromatográfica podem variar consideravelmente de um caso para

outro. Por exemplo, pode ser necessária a separação de todos ou apenas de

alguns picos relevantes em um cromatograma complexo.

Um problema de interesse contínuo em cromatografia líquida é o

desenvolvimento de procedimentos práticos para otimizar processos de

separação2. Neste caso, a composição e valor de pH da fase móvel são de suma

importância bem como outros fatores, como tipo de coluna e química da fase

estacionária, temperatura, etc. Métodos multivariados de otimização baseados

em conceitos estatísticos tem bastante sucesso na otimização do sistema

extrator, bem como da fase móvel em cromatografia líquida de alta eficiência2,3.

Primeiro, porque as interações entre os fatores somente podem ser descobertas

usando-se estratégias multivariadas. Segundo, os parâmetros calculados para

15

modelos multivariados são mais precisos do que as medidas individuais usadas

para determinar o modelo. Terceiro, planejamentos multivariados economizam

experimentos. As otimizações são alcançadas usando menor tempo, menos

materiais e de uma maneira bem mais segura. O pesquisador pode sistematizar

seu trabalho usando métodos multivariados de forma bem mais objetiva do que

usando métodos convencionais de otimização 4,5.

O estado da arte em separações de picos em cromatografia líquida inclui

a utilização de modelos estatísticos obtidos de resultados de planejamentos de

experimentos para descrever como os sinais analíticos se comportam como

função das condições cromatográficas como composição da fase móvel, tipo e

temperatura da coluna, fluxo da fase móvel entre outras. As primeiras tentativas

nesse sentido envolveram o uso de funções objetivas que combinam

informações de vários pares de picos e tentam descrever a separação global de

um cromatograma. Mais de que uma dúzia de funções objetivas foram

propostas e revisadas na literatura na tentativa de otimizar as separações

cromatográficas6,7.

Diferentes critérios têm sido sugeridos na literatura para avaliar a

qualidade das separações cromatográficas. Os critérios de otimização que

descrevem adequadamente a qualidade da separação estão entre os fatores

essenciais que determinam a aplicabilidade dos procedimentos. A resolução é

critério o mais clássico de otimização8.

A resolução entre dois picos consecutivos é frequentemente escolhida

como um critério elementar na construção de funções de resposta. A resolução

de dois picos adjacentes é habitualmente definida como uma função da largura

de cada pico na base (ou a metade da altura) e a diferença nas distâncias de

retenção para os picos de interesse. Embora esta descrição possa ser aplicada, a

mesma não é usual quando há sobreposição e assimetria de picos, que

16

constituem perfis bastante comuns no caso da separação de misturas

complexas9.

A resolução pode ser calculada a partir da distância que separa os pontos

máximos dos picos (dR) e da média das larguras de suas respectivas bases (wb):

(1.1)

Quando a resolução é 1, os dois picos são razoavelmente separados. Um

valor de resolução de 1,25 é suficiente para fins quantitativos e acima de 1,5

têm-se separação completa10. Quando se pretende otimizar a resolução de

apenas dois picos, a expressão para a resolução entre os dois picos é bastante

simples. O problema se torna mais difícil quando se tenta descrever a resolução

global de um cromatograma de componentes múltiplos11.

A desvantagem no uso do critério resolução em sistemas cromatográficos

é que existem várias resoluções de pares de picos que precisam ser otimizadas

simultaneamente. Mais do que isto várias mudanças de ordem de eluição são

observadas complicando o processo de otimização das separações de misturas.

Idealmente seria mais conveniente utilizar tempos de retenção como critério

cromatográfico para otimização. Além de simplificar a modelagem para

amostras que apresentam inversão de picos, no caso dos tempos de retenção os

modelos estatísticos devem ser mais precisos do que aqueles para resoluções,

porque o tempo de retenção depende do comportamento de um pico só ao invés

de um par de picos. Mas para a otimização com metodologia conhecida, no

caso, para a função de desejabilidade é necessário um valor alvo para cálculo da

função, que não pode ser expresso em termos de tempos de retenção12.

17

A resolução também apresenta limitações. Trata-se de um critério não

normalizado, que restringe as possibilidades de combinações de valores

elementares e torna a interpretação mais difícil. Refere-se a par de picos, em

vez de picos individuais, o que implica em restrição quando o objetivo não é

separação de todos os componentes, mas a resolução de alguns compostos

particulares. A atribuição de valores é problemática quando a ordem de eluição

é alterada, por exemplo, com a mudança da composição da fase móvel13. A

Figura 1.2 descreve um planejamento tipo simplex centróide para a composição

da fase móvel, onde os valores das resoluções são representados por superfícies

de respostas que, quando sobrepostas, podem alcançar uma única região

otimizada, desde que os máximos individuais estejam nas mesmas regiões de

cada figura. Porém, em dados cromatográficos, isso se torna complicado, pois

nem sempre a região otimizada individualmente será a mesma para todos os

compostos analisados.

Figura 1.2. Esquema de otimização multiresposta para fase móvel em

cromatografia líquida.

Em otimização multiresposta, Figura 1.2, as variáveis são avaliadas

simultaneamente em relação a mais de uma resposta. Isso implica na

determinação do ponto na superfície de resposta onde em relação aos critérios

estabelecidos as respostas apresentem melhor desempenho ao mesmo tempo.

18

Os poucos métodos disponíveis para otimizar várias respostas

cromatográficas simultaneamente como sobreposição de superfícies de

respostas e o método de desejabilidade de Derringer e Suich que são úteis em

termos de resolução entre pares de picos e retenções relativas. Infelizmente isto

não é possível usando tempos de retenção porque as propriedades a serem

otimizadas dependem das localizações de mais do que um pico.

Devido à importância dos critérios de separação cromatográfica, foram

comparados três parâmetros: tempo de retenção, resolução e largura na base dos

picos com o objetivo de comparar as precisões de modelos obtidos de

planejamentos de experimentos. Isso permitirá avaliar a viabilidade do uso de

modelos de tempo de retenção juntamente com a computação gráfica na

otimização multiresposta de sistemas cromatográficos. Tendo em vista as

vantagens em fazer modelagem estatística usando tempos de retenção, que trata

picos individuais, o desenvolvimento de um método de otimização por

simulação dos comportamentos de picos cromatográficos com mudanças nas

condições cromatográficas foi utilizado.

A simulação foi feita com base em um programa de computação gráfica

desenvolvido na Universidade Estadual de Londrina pelo Professor Doutor

Carlos Alberto Paulinetti da Camara. Através do ponteiro do mouse escolhe-se

um conjunto de condições dentro do domínio experimental já investigado por

planejamento de experimentos. Os valores das condições cromatográficas serão

substituídos nos modelos estatísticos onde o tempo de retenção de todos os

picos cromatográficos de interesse é calculado. Esses tempos são então exibidos

graficamente na tela de computador. O usuário manipula o mouse dentro do

domínio experimental até conseguir obter um cromatograma simulado que

satisfaça os objetivos previamente definidos, como a maximização das

resoluções de todos os picos.

19

1.2. Parte experimental

O conjunto de dados cromatográficos utilizado foi obtido em

experimentos realizados no laboratório da Professora Doutora Isabel Cristina

Sales Fontes Jardim, no Instituto de Química da Universidade Estadual de

Campinas.

Uma mistura complexa envolvendo onze agrotóxicos foi analisada por

cromatografia liquida de alta eficiência com detector do tipo arranjo de diodos.

A mistura de agrotóxicos foi composta de imazetapir (Im), imazaquim (Iz),

ametrina (Am), cianazina (Ci), simazina (Si), atrazina (At), bentazona (Be),

carbaril (Ca), carboxim (Cx), tiofanato metílico (Tm) e metsulfuron (Me). Essa

mistura de agrotóxicos apresentou problemas de sobreposição de picos em

trabalhos anteriores14.

Um planejamento simplex centróide foi empregado para a fase móvel. Os

três modificadores orgânicos mais usados em cromatografia líquida em fase

reversa são acetonitrila, metanol e tetrahidrofurano, que correspondem

respectivamente aos pontos 1, 2 e 3 do planejamento, Figura 1.3. A água foi

usada para ajustar as misturas de forma que os três solventes apresentassem

mesma força cromatográfica.

As condições cromatográficas foram: temperatura ambiente, eluição

isocrática (acidificada a pH 3 com ácido fosfórico) de 1 mL/min. Foram

utilizadas duas colunas recheadas com as seguintes fases estacionárias: SGE

C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm) e Thermo Hypersil ODS

C18 (4,6 x 150 mm, partículas de 5 µm). As corridas foram realizadas

empregando-se um cromatógrafo a líquido marca Shimadzu, constituído de

auto injetor com amostragem programada de 10 µL, modelo SIL-10AF;

bombas de alta pressão, tipo recíproca, pistão duplo, modelo LC-10AT;

https://www.google.com.br/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&cad=rja&uact=8&ved=0CBwQFjAA&url=http%3A%2F%2Fdgp.cnpq.br%2Fbuscaoperacional%2Fdetalhepesq.jsp%3Fpesq%3D7627341680778347&ei=FJLWU8-sE-HO8AGmsIGgAQ&usg=AFQjCNHkxPETUqEkx4h1c4hgtjIAxz0StQ&bvm=bv.71778758,d.b2U

20

detector espectrofotométrico de arranjo por diodos, cela do injetor de 8 µL de

volume, 10 mm de caminho óptico, modelo SPD-M10AVP; sistema de

aquisição de dados: microcomputador, com software de aquisição de dados

cromatográficos Class VP; forno para coluna, modelo CTO-10AS; controlador

de sistema SCL-10 A.

Figura 1.3. Planejamento simplex centróide utilizado para determinação das

composições de FM a serem utilizadas. ACN = ACN:H2O 30:70 (v/v); MeOH

= MeOH:H2O 45:55 (v/v); THF = THF:H2O 30:70 (v/v).

Para cada coluna foram gerados dois conjuntos de dados, nos quais a

composições (v/v) de fase móvel dos vértices do planejamento simplex

centróide foram:

1) ACN:H2O (30:70); MeOH:H2O (45:55); THF:H2O (30:70).

2) ACN:H2O (55:45); MeOH:H2O (70:30); THF:H2O (50:50).

Foram gerados dois conjuntos de dados, utilizando as mesmas condições

cromatográficas com exceção da coluna, que foi variada entre a coluna SGE e

a coluna Thermo descritas acima. Porém, os experimentais não foram uteis

para fins de previsão, pois apresentaram falta de ajuste para praticamente todos

21

os agrotóxicos. Como alternativa, o conjunto de dados apresentados nos

cálculos foi gerado por Marcia Breitkreitz14 com uma coluna SGE (idêntica à

descrita acima) nas condições de fase móvel 1 demonstrada acima.

1.3. Tratamento multivariado

1.3.1. Tempo de retenção

Os tempos de retenção para cada agrotóxico analisado, em todas as

misturas do planejamento e suas réplicas, são apresentados da Tabela 1.1:

Tabela 1.1. Tempos de retenção, em minutos, para os agrotóxicos analisados

em cada mistura do planejamento experimental e sua réplica em minutos. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx

1 0 0 9,75 10,41 11,30 11,30 13,86 14,82 17,70 18,43 20,00 6,41 22,15

0 1 0 11,97 13,60 19,60 9,53 11,97 13,60 22,28 22,25 15,73 9,46 15,17

0 0 1 9,25 9,91 13,93 10,50 18,78 7,68 15,46 15,50 9,60 5,01 12,20

0,5 0,5 0 12,20 15,45 17,81 12,20 16,20 18,35 22,76 22,75 20,20 10,07 20,20

0,5 0 0,5 8,45 7,28 10,80 9,15 14,87 8,45 15,27 14,40 11,85 5,37 13,27

0 0,5 0,5 8,94 6,89 12,89 8,94 17,37 8,34 15,83 15,13 11,21 4,97 12,48

0,33 0,33 0,33 5,74 9,17 8,10 12,60 9,17 16,02 9,67 16,04 16,02 13,27 14,02

1 0 0 9,26 9,73 10,65 10,65 12,85 13,56 18,47 17,15 18,40 6,08 20,45

0 1 0 12,20 13,25 10,03 9,95 12,72 14,02 22,20 22,16 15,92 9,51 15,40

0 0 1 9,35 6,87 14,76 10,67 19,54 7,64 15,98 15,96 9,73 4,90 12,44

0,5 0,5 0 12,45 16,10 18,69 12,45 16,79 19,22 23,66 23,68 21,08 9,84 21,08

0,5 0 0,5 8,83 7,57 11,71 9,62 15,92 9,15 14,38 15,25 12,54 5,52 14,04

0 0,5 0,5 9,22 7,06 13,89 9,22 18,26 8,60 15,13 15,79 11,67 5,03 12,97

0,33 0,33 0,33 5,63 9,26 8,09 13,01 9,26 16,51 9,75 16,53 16,51 13,59 14,42

22

Com as respostas de tempo de retenção para cada um dos agrotóxicos

foram construídos modelos de regressão para obter uma relação que nos

permitisse prever estes valores de tempo de retenção como função dos valores

de proporções dos solventes. Primeiramente foi aplicado o modelo linear,

porém a análise de variância utilizada para testar o ajuste do modelo no nível de

95% de confiança apresentou equação inadequada para representar

precisamente os dados.

O modelo quadrático foi avaliado quanto ao ajuste dos dados no nível de

95% de confiança e os resultados da ANOVA para esse teste estão apresentados

na Tabela 1.2, assim como o teste para significância da regressão.

Tabela 1.2. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e media

quadrática do erro puro (MQep) dos modelos de tempo de retenção. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

Imazetapir 10,55 1,46 1,44 0,02 7,20 72,00

Simazina 5,40 0,65 0,61 0,04 8,24 14,36

Imazaquim 26,06 4,60 3,86 0,74 5,67 5,21

Ametrina 13,87 10,80 3,98 6,82 1,28 0,58

Cianazina 3,10 1,28 1,21 0,07 2,43 16,94

Tiofanato 13,47 1,20 0,87 0,33 11,22 2,62

Metsulfuron 38,62 7,01 6,79 0,22 5,51 30,80

Atrazina 0,40 7,90 1,21 6,69 0,05 0,18

Bentazona 27,40 2,44 2,14 0,29 11,25 7,28

Carbaril 39,85 2,32 2,02 0,30 17,20 6,76

Carboxin 32,65 2,24 1,90 0,34 14,58 5,58

*Valor de F para significância dos resultados dado por MQR/MQr e para

falta de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de

95% de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

A razão MQfaj/MQep é usada para avaliar se o modelo está ou não bem

ajustado as observações. Valores altos dessa razão significam maior falta de

23

ajuste. O valor dessa razão é comparado com o valor de F tabelado com os

graus de liberdade correspondentes, que nesse caso é 1 e 7.

O valor de F 1,7 é 5,59 e com base na Tabela 1.2, o imazetapir, a simazina,

a cianazina e metsulfuron apresentaram falta de ajuste no nível de 95% de

confiança. A bentazona e o carbaril estão bem próximos do valor tabelado, já o

imazaquim, ametrina, tiofanato, atrazina e o carboxin apresentaram valores

menores ao valor de Ftab para o modelo quadrático.

No nível de 95% de confiança F5,8 é 3,69. Nesse caso a regressão é

estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base na Tabela 1.2,

apenas a ametrina, cianazina e a atrazina não apresentam significância

estatística da regressão, porém nenhuma razão tem valor altamente

significativo.

Os dados foram testados em relação ao ajuste com o modelo linear,

porém ocorreu falta de ajuste para todos os agrotóxicos. O modelo cúbico

especial também foi testado, mas não apresentou resultados mais satisfatórios

do que o modelo quadrático.

Para testar modelos mais superiores é necessário um número bem maior

de experimentos e as funções assim obtidas teriam comportamentos complexos

e dificilmente seriam representadas por polinômios de baixa ordem. Como

resultado os modelos estatísticos determinados para tempos de retenção não

representaram precisamente os resultados experimentais.

1.3.2. Resolução

Muitos problemas que assolam tradicionais funções cromatográficas de

resposta ou de critérios de separação podem ser atribuídos às sobreposições de

picos, situação em que dificilmente se obtém informações suficientes quanto ao

24

número de componentes, grau de pureza e de sobreposição de pico a partir de

uma única resposta no cromatograma16.

No caso da mistura de agrotóxicos o uso da resolução tornou-se

complicado devido à enorme inversão de picos de um ponto do planejamento

simplex centróide em relação aos outros. A ordem de eluição obtida no

cromatograma do ponto central foi tomada como base para os possíveis pares

de picos e esta ordem pode ser vista na Figura 1.4.

5 10 15 20 25

40

60

80

100

120

140

160

180

2001/3ACN:1/3MeOH:1/3THF

6+8+9

11

10

4

7

2+5

31

Inte

nsid

ade d

e a

bsorb

ância

Tempo / min

Figura 1.4. Cromatograma obtido na separação de onze agrotóxicos

empregando coluna SGE C18 (4,6 x 150 mm, partículas Wakosil II de 5 µm),

volume de injeção 10 μL, FM 1/3 ACN:H2O 30:70 (v/v), 1/3 MeOH:H2O 45:55

(v/v), 1/3 THF:H2O 30:70 (v/v), totalizando uma mistura final de

ACN:MeOH:THF:H2O 10:15:10:65 (v/v), vazão 1,0 mL/min, detecção em 210

nm e temperatura ambiente. Agrotóxicos: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.

25

A Tabela 1.3 agrupa os valores de resolução para cada par de picos,

calculados de acordo com a equação 1. Os pares de picos seguindo a ordem da

Figura 1.4 e seus valores de resolução estão na Tabela 1.3.

Tabela 1.3. Valores de resolução para os pares de picos usando como base a

ordem de eluição do cromatograma obtido no ponto central. ACN MeOH THF 1 e 3 3 e 2 2 e 5 5 e 7 7 e 4 4 e 10 10 e 11 11 e 6 6 e 8 8 e 9

0 1 0 9,30 -1,45 3,46 8,08 -8,08 20,08 4,96 -19,04 9,00 1,50

1 0 0 9,00 -2,54 -5,19 9,42 11,47 -7,15 -1,15 -6,23 1,38 21,46

0,5 0,5 0 4,38 5,54 2,77 -6,69 14,54 -9,92 6,00 15,23 -4,38 -3,23

0 0,5 0,5 13,15 -7,62 0 14,08 -1,15 5,54 0 -9,23 2,77 12,46

0 0 1 4,38 2,77 1,62 -1,62 5,31 2,54 3,23 3,69 2,08 -3,23

0,5 0 0,5 4,45 4,71 0 -1,25 10,39 -3,92 3,00 11,54 -2,31 -3,12

0,33 0,33 0,33 5,42 2,54 0 1,13 6,97 1,43 1,62 4,73 0 0

1 0 0 8,31 -0,92 3,00 6,92 -6,92 18,00 4,85 -17,77 8,31 1,62

0 1 0 9,46 -3,69 -5,77 9,46 13,85 -9,00 -1,15 -7,39 -2,31 21,46

0 0 1 4,62 5,77 2,77 -6,92 16,62 -11,77 6,23 16,62 -4,85 -3,46

0,5 0,5 0 13,85 -8,54 0 15,69 -1,15 5,31 0 -9,69 2,77 13,15

0,5 0 0,5 4,85 2,77 1,85 -0,92 5,77 2,08 3,23 4,38 2,08 -3,46

0 0,5 0,5 4,85 4,85 0 -1,38 12,23 -5,08 3,00 12,23 -2,54 -3,23

0,33 0,33 0,33 5,54 2,77 0 0,92 7,62 1,38 1,85 4,85 0 0

Os valores de resolução para todos os pontos do planejamento simplex

centróide foram submetidos a análise de variância ANOVA para testar o ajuste

do modelo quadrático aos dados. A Tabela 1.4 apresenta os valores para estimar

a significância da regressão e da falta de ajuste no nível de 95% de confiança.

Para testar a falta de ajuste, o valor tabelado de F 1,7 foi 5,59. Com base

na Tabela 1.4, a maioria dos pares de picos apresentou falta de ajuste. Os pares

1-3, 3-2, 2-5, 5-7 apresentaram alto valor de MQfaj/MQep indicando que o

modelo quadrático não se ajusta aos dados. Os pares 4-10, 10-11, 11-6 e 6-8

não apresentaram falta de ajuste. E os pares 7-4 e 8-9 têm valores calculados

próximos do valor tabelado podendo ser ajustados ao modelo quadrático.

26

Tabela 1.4. Valores de média quadrática da regressão (MQR), média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média

quadrática do erro puro (MQep) para modelos de resolução. Pares de picos MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

1 -3 26,80 5,74 5,59 0,15 4,67 37,05

3 - 2 55,39 11,53 11,34 0,19 4,80 61,28

2 - 5 20,05 0,66 0,62 0,04 30,37 14,52

5 - 7 132,93 13,81 13,48 0,32 9,63 41,59

7 - 4 157,97 9,53 8,44 1,10 16,58 7,70

4 - 10 239,66 0,91 0,03 0,91 263,36 0,03

10 - 11 15,93 0,01 0,04 0,09 1592,55 0,48

11 - 6 363,07 1,39 0,96 0,43 261,20 2,22

6 - 8 43,54 1,59 0,57 1,03 27,38 0,55

8 - 9 225,23 0,49 0,46 0,04 459,66 10,40

*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta

de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%

de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

A regressão é estaticamente significativa se MQR/MQr > 3,69. Com base

na Tabela 1.4, todos os pares de picos apresentam significância estatística da

regressão.

As variáveis em questão, proporções de acetonitrila, metanol e

tretrahidrofurano, exercem influência sobre a resposta do cromatograma.

Mudando-se a composição da fase móvel, a separação da mistura analisada

também muda. As misturas binárias entre esses solventes também tem efeito

significativo diante da resposta cromatográfica. Um modelo mais complexo

poderia ser testado, visando melhorar a falta de ajuste e significância da

regressão, porém seria necessária uma grande quantidade de experimentos.

27

1.3.3. Largura da base

O tempo de retenção e a resolução são regularmente aplicados para

avaliar a qualidade do cromatograma obtido, já os valores referentes à largura da

base, ou seja, a distância entre as tangentes traçadas nas laterais do pico, não são

comumente usados, mas de qualquer maneira foram testados para avaliar a falta

de ajuste e a significância da regressão. Isso é importante porque além de simular

o tempo de retenção de cada pico no programa computacional também é

necessário prever a largura dos picos para se ter uma indicação da separação real

entre os picos.

A Tabela 1.5 contém os valores de largura da base dos picos

cromatográficos para cada agrotóxico presente na mistura estudada. Esses valores

foram obtidos pela subtração: X2 – X1, como representado na Figura 1.5:

Figura 1.5. Representação gráfica do cálculo da largura da base para os picos

cromatográficos de cada agrotóxico estudado.

28

Tabela 1.5. Valores de largura da base para os picos cromatográficos de cada

agrotóxico estudado. ACN MeOH THF Im Si Iz Am Ci Tm Me At Be Ca Cx

1 0 0 0,44 0,66 0,6 0,76 0,76 0,76 0,75 0,69 0,81 1,11 0,92

0 1 0 0,46 0,65 0,71 1,15 0,64 0,44 0,53 0,71 1,10 1,43 1,43

0 0 1 0,3 0,91 0,48 0,84 0,66 0,68 0,54 0,78 0,82 0,94 0,53

0,5 0,5 0 0,53 0,91 1,57 1,73 0,91 1,57 1,73 1,73 1,20 1,21 1,21

0,5 0 0,5 0,30 1,14 0,44 0,56 1,20 1,10 1,14 0,62 1,08 0,66 0,54

0 0,5 0,5 0,30 0,66 0,40 0,98 0,66 0,56 0,38 0,70 0,76 0,59 0,98

0,33 0,33 0,33 0,34 1,01 0,41 1,36 1,01 1,30 1,01 1,30 1,30 1,36 0,43

1 0 0 0,50 0,47 0,50 0,78 0,78 0,63 0,69 0,65 0,86 1,09 0,71

0 1 0 0,93 0,92 0,93 1,06 0,93 0,92 0,93 1,49 1,10 1,37 1,37

0 0 1 0,51 0,87 0,44 0,75 0,76 0,81 0,47 0,87 0,78 0,87 0,51

0,5 0,5 0 0,47 0,86 1,39 2,02 0,86 1,39 2,02 2,02 1,09 1,14 1,14

0,5 0 0,5 0,35 1,19 0,37 0,47 1,19 1,20 1,19 0,65 1,20 0,70 0,56

0 0,5 0,5 0,29 0,59 0,36 0,69 0,59 0,65 0,42 0,77 0,84 0,67 0,42

0,33 0,33 0,33 0,36 1,07 0,46 1,16 1,07 1,07 1,07 1,07 1,07 1,16 0,46

Com base na Tabela 1.6, podemos observar que os valores maiores que

MQR/MQr > 3,69 são poucos e que nenhuma das medidas de largura de base

apresentou um grande valor de significância estatística no nível de 95% para o

modelo quadrático, portanto não sendo muito úteis para fins de previsão.

O valor tabelado de F 1,7 é 5,59. Com base na Tabela 1.6, a falta de ajuste

foi alta apenas para os agrotóxicos imazaquim e carbaril. Os demais

agrotóxicos apresentaram valores de MQfaj/MQep baixos, indicando o bom

ajuste ao modelo quadrático.

29

Tabela 1.6. Valores de média quadrática da regressão (MQR) média quadrática

dos resíduos (MQr), média quadrática da falta de ajuste (MQfaj) e média

quadrática do erro puro (MQep) para modelos de largura da base. Agrotóxico MQR MQr MQfaj MQep MQR/MQr* MQfaj/MQep*

Imazetapir 0,05 0,02 0,00 0,02 2,25 0,04

Simazina 0,11 0,02 0,01 0,01 5,11 1,39

Imazaquim 0,34 0,17 0,17 0,01 1,98 22,99

Ametrina 0,48 0,04 0,02 0,02 13,59 1,12

Cianazina 0,09 0,02 0,01 0,01 5,45 1,30

Tiofanato 0,27 0,03 0,00 0,03 10,36 0,01

Metsulfuron 0,58 0,11 0,09 0,02 5,36 4,87

Atrazina 0,07 0,02 0,02 0,01 3,19 2,65

Bentazona 0,46 0,06 0,00 0,05 8,23 0,02

Carbaril 0,14 0,35 0,35 0,00 0,38 79,25

Carboxin 0,29 0,16 0,13 0,03 1,79 5,05

*Valor de F para significância dos dados dado por MQR/MQr e para falta

de ajuste MQfaj/MQep. Valores críticos de F correspondentes no nível de 95%

de confiança são com F 5,8 = 3,69 e F 1,7 = 5,59, respectivamente.

Portanto, independente dos critérios usados para modelos de regressão, o

sistema cromatográfico estudado mostrou-se complexo e de difícil separação.

Sendo o tempo de retenção o critério mais simples por tratar os picos de forma

individual, os resultados obtidos foram usados para simular a separação

cromatográfica no programa computacional.

1.4. Programa Computacional

A escolha e validação dos modelos que foram usados na simulação

usando o programa computacional foram definidos pelos resultados das

ANOVA das regressões para tempos de retenção. Para isso, foram utilizados os

tempos de retenção dos onze agrotóxicos analisados estatisticamente de acordo

com o planejamento simplex centróide. Após inserir os coeficientes dos

30

modelos da regressão no programa, com o ponteiro do mouse foi simulada a

separação dos 11 compostos e a separação simulada foi então comparada com

os cromatogramas reais obtidos em cromatografia liquida de alta eficiência em

fase reversa (Figura 1.6).

(a)

31

(b)

5 10 15 20 25

0

20

40

60

80

100

11

10

9

876

4+5

3

2

1

Inte

nsid

ade d

e a

bsorb

ância

Tempo / min

(c)

Figura 1.6. ACN:H2O 30:70 (v/v) do planejamento (a), cromatograma

simulado pelo programa computacional; (b) cromatograma experimental; (c)

cromatograma simulado. Ordem de eluição: 1 = imazetapir, 2 = simazina,


bentazona, 9= atrazina, 10 = carbaril e 11 = carboxin.

Para exemplificar, observamos à similaridade do comportamento

experimental com o obtido pelo programa computacional (Figura 1.5) em

32

relação à separação e ordem de eluição dos agrotóxicos analisados no ponto

indicado pela seta que corresponde a ACN: H2O. Essa similaridade nos

permitiu avaliar todo espaço do simplex e em cada ponto obter a separação

simulada. Assim, todas as combinações possíveis de misturas de fase móvel

podem ser avaliadas.

1.5. Conclusões 1

De acordo com o estudo realizado no capitulo 1 concluímos que:

1) A resolução e tempo de retenção mostraram a mesma dificuldade em

ajustar um modelo matemático aos dados experimentais. Ambos os

parâmetros cromatográficos apresentaram falta de ajuste para vários

agrotóxicos presente na mistura.

2) A maioria dos modelos para largura dos picos não mostraram falta de

ajuste significativa e também uma branda dependência em mudanças no

domínio experimental, ou seja, não apresentaram significância na

regressão. Isto significa que podemos ter menos preocupação com a

largura dos picos em tentativas de prever informações cromatográficas.

3) Mesmo utilizando um método cromatográfico isocrático de separação,

uma boa separação cromatográfica foi obtida com o planejamento de

misturas, pois os picos que não foram separados seriam facilmente

separados com espectrometria de massas.

_____________________________________________________________

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New York, John Wiley & Sons, 1979. 2 GARCIA, L. M. Z.; OLIVEITA, T. F.; SOARES, P. K.; BRUNS, R. E.; SCARMINIO, I.

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33

interactions for natural product extractions. Chemometrics and Intelligent Laboratory

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610, 1999. 8 DUARTE, R. M.B.O.; DUARTE, A. C. A new chromatographic response function for use

in size-exclusion chromatography optimization strategies: Application to complex organic

mixtures. Journal of Chromatography A. 1217, 7556–7563, 2010, 9 COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L.; BONATO, P.S. Fundamentos de

cromatografia. Campinas: UNICAMP, 2006. 10 DIVJAK, B.; MODER, M.; ZUPAN, J. Chemometrics approach to the optimization of ion

chromatographic analysis of transition metal cations for routine work. Analytica Chimica

Acta. 358, 305-315, 1998. 11 BOURGUIGNON, B.; MASSART, D. L. Simultaneous optimization of several

chromatographic performance goals using Derringer’s desirability functior. Journal of

Chromatography. 586, 11-20, 1991. 12 GARCIA, A. C. M. C.; TORRES, L. J. R.; BAEZA, B. J.J. Models and objective

functions for the optimization of selectivity in reversed-phase liquid chromatography.

Analytica Chimica Acta. 579, 125–145, 2006. 13 FOGLIATTO, Flávio Sanson. Otimização de experimentos com variáveis de resposta

descritas por perfis. 28, 577-595, 2008. 14 BREITKREITZ, M. C.; JARDIM, I. C. S. F.; BRUNS, R.E. Combined column–mobile

phase mixture statistical design optimization of high-performance liquid chromatographic

analysis of multicomponent systems. Journal of Chromatography A. 1216, 1439–1449,

2009. 15 BREITKREITZ, M.C. Otimização simultânea de variáveis de processo e mistura em

cromatografia líquida de alta eficiência. Dissertação de mestrado, Universidade Estadual de

Campinas, 2007.

http://journals.ohiolink.edu/ejc/search.cgi?q=authorExact:%22Berridge%2C%20J.%20C.%22

34

16 XU, L.; TANG,L.J.; CAI,C.B.; WU,H.L.; SHEN,G.L.; QIN YU, R.; JIANG, J.H.

Chemometric methods for evaluation of chromatographic separation quality from two-way

data—A review. Analytica Chimica Acta. 613, 121–134, 2008.

35

Capitulo 2 – Otimização do solvente extrator de alcalóides nas

flores, caule e folhas de Erythrina speciosa Andrews

2.1. Introdução

O gênero Erythrina compreende mais de 100 espécies de árvores,

arbustos e plantas rasteiras que estão distribuídas por todas as regiões tropicais

do mundo. No Brasil são encontradas cerca de 11 espécies deste gênero,

destacando-se Erythrina speciosa, que se encontra amplamante distribuída

pelas regiões sul e sudeste. Extratos de Erythrina são utilizados popularmente

no combate a desinterias, asma e infecções microbianas, além de possuírem

atividades ansiolíticas. Este gênero é conhecido pela produção de alcalóides de

esqueleto do tipo eritrínico, contendo um sistema do tipo espiro único, sendo

marcadores destas espécies. Também são encontrados em espécies de Erythrina

diversos outros metabólitos secundários tais como: flavonoides, isoflavonóides

e terpenóides1-4.

As atividades biológicas de Erythrina são atribuídas aos alcalóides

eritrinicos presentes como constituintes majoritários em todas as partes da

planta. O mais abundante destes alcalóides, denominado erisotrina, apresenta

elevada atividade ansiolítica, o que desperta interesse em seus análogos

estruturais tais como derivados mais hidroxilados e metoxilados5.

Os alcalóides são continuamente estudados devido às diferentes

atividades biológicas a eles atribuídas. São conhecidos por seu acentuado efeito

no sistema nervoso, sendo muitos deles utilizados como venenos ou

alucinógenos. O estudo de espécies de Erythrina foi estimulado após a

verificação, entre os anos de 1930 e 1940, que extratos de sementes de várias

36

espécies continham alcalóides com atividade fisiológica semelhante à ação do

curare. Desde então, são vários os exemplos de alcalóides isolados de diferentes

espécies do gênero. Os interesses medicinais pelos alcalóides são muitos,

podemos destacar o uso no tratamento da leishmaniose, doença endêmica que

causa problema em torno de 88 países em 4 continentes. Brasil, Bangladesh,

Índia, Peru, Iran, Arábia Saudita e alguns países da África são os mais

atingidos6.

Em trabalhos anteriores com algumas espécies de Erythrina, em geral

foram utilizados solventes puros para a extração destes alcalóides. Entretanto,

em certas extrações solventes puros não são os melhores extratores e nestes

casos torna-se necessário a utilização de misturas de solventes, que podem

variar de simples misturas binárias até misturas multicomponentes. O

planejamento estatístico de misturas fornece uma base para um estudo

sistemático de solventes sobre produtos naturais7. Estes experimentos são ideais

não apenas para comparar os efeitos de solventes puros, como também para

determinar efeitos sinérgicos e/ou antagonísticos de misturas de solventes.

Efeitos sinérgicos entre os componentes da mistura levam a um aumento na

quantidade dos compostos extraídos.

De acordo com a literatura, planejamentos de mistura vêm apresentando

ótimos resultados para otimização do solvente extrator em plantas medicinais8.

Uma mistura de igual proporção de água, metanol, acetona e etanol apresentou

melhores rendimentos para extratos de Trichilia catigua, comumente conhecida

como catuaba9. Misturas binárias entre vários solventes extratores também

apresentaram melhores rendimentos do que os solventes puros para extração em

Mikania laevigata Sch. Bip. conhecida como guaco10. O diclorometano, etanol

e hexano puros, assim como suas misturas, apresentaram as melhores respostas

37

em termos de rendimentos da extração através do planejamento de mistura para

Erythrina speciosa11.

Os métodos modernos de classificação de solventes são baseados no

sistema de classificação introduzido por Snyder, que classificou mais de oitenta

solventes em oito grupos de acordo com as suas propriedades. Embora a

produção da maioria dos fitoterápicos inclua procedimentos de extração, pouca

atenção tem sido dada à seleção de solventes adequados ou sistemas de

solventes para a extração sólido-liquido para o isolamento ou para fins de

produção. Este pode ser o motivo por trás do fato que as extrações sólido-

líquido são geralmente baseadas em tentativa e erro. Com base nessa

classificação dos solventes, um conjunto de três parâmetros foi criado para

descrever a acidicidade (α), que descreve a habilidade do solvente para formar

ligações de hidrogênio com o soluto; basicidade (β), que mede a tendência do

solvente em doar um par de elétrons (ou aceitar um próton) em ligações de

hidrogênio com o soluto; e dipolaridade (π) que é um termo que mede a

dipolaridade/polarizabilidade do solvente, ou seja, sua capacidade para

estabilizar uma carga ou um dipolo em virtude de seu efeito dielétrico12. Os

valores destes parâmetros para diferentes solventes foram derivados da

espectroscopia (daí o nome solvatocrômico) e de outras medidas, que foram

especificamente designadas para a medida de uma única interação. Os valores

dos parâmetros solvatocrômicos são as médias de resultados obtidos com vários

solutos investigados para cada parâmetro, em contraste com os parâmetros do

triângulo de seletividade de solvente, o qual se baseia na propriedade

termodinâmica de um único soluto13.

O solvatocromismo é produzido pela diferença na solvatação do estado

fundamental e do primeiro estado excitado da molécula que absorve a luz (ou o

seu cromóforo). A solvatação das moléculas do soluto pelas do solvente resulta

38

de forças físicas intermoleculares soluto-solvente, tais como: íon-dipolo,

dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido (forças de dispersão) e ligações de

hidrogênio. Essas interações soluto-solvente alteram a diferença de energia

entre os estados fundamental e excitado do soluto14,15.

A união entre a espectrometria de massas (MS) e a ideia de análise de

perfil químico forma um dos pilares da metabolômica, área que vem crescendo

de forma vertiginosa nos diversos campos da ciência e que tem como uma de

suas propostas o entendimento mais amplo de metabolismo de um organismo16-

19.

Na espectrometria de massas o analito neutro, em fase sólida, líquida ou

gasosa, deve ser convertido em íons na fase gasosa previamente à análise. Os

métodos de ionização empregados podem ser divididos em dois tipos: os que

requerem a amostra em fase gasosa e aqueles que provocam dessorção em

amostras sólidas ou líquidas. A vantagem do último é que pode ser aplicado

para amostras não voláteis e/ou termicamente instáveis. O princípio de

funcionamento de qualquer espectrômetro de massas baseia-se na detecção de

íons selecionados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z), sendo m a

massa em u (massa atômica unificada, chamada também de Dalton (Da)) e z a

carga formal. A sofisticação surge nos métodos que são usados para a geração

desses mesmos íons e no modo de analisá-los20.

Diversos tipos de espectrômetros de massas existem cada qual com suas

vantagens e limitações. Porém, todos apresentam os mesmos componentes

básicos: sistema de introdução de amostra, fonte de ionização, analisador de

massas e detector. A estrutura básica de um espectrômetro de massas é

apresentada na Figura 2.1. Na fonte de íons, os componentes neutros de uma

amostra são convertidos em íons positivos ou negativos e os mesmo são

imediatamente acelerados em direção ao analisador de massas. A função do

39

analisador de massas é separar tais íons de acordo com suas relações m/z e são

os tipos de analisadores que classificam as várias categorias dos espectrômetros

de massas. Por último, o detector recebe os íons que foram separados pelo

analisador, transformando a corrente de íons em sinais elétricos que são

processados, armazenados na memória de um computador e apresentados na

tela.

Figura 2.1. Componentes básicos de um espectrômetro de massas.

O surgimento da técnica de ionização denominada ionização por

eletrospray (ESI) após estudos de Yamashita e Fenn tornou a espectrometria de

massas uma das técnicas analíticas mais poderosas e amplamente utilizadas.

Dentre suas vantagens incluem a alta detectabilidade e seletividade, facilidade

do uso e pouco consumo de amostra21.

Nessa técnica, íons positivos e negativos são formados previamente em

solução mediante reações ácido-base. Em outras palavras, em solução os

analitos com caráter básico são geralmente protonados (H+) formando íons

positivos, ao passo que analitos com caráter ácido são desprotonados gerando

íons negativos. Então, a transferência dos íons de interesse para a fase gasosa

requer essencialmente dois passos: a dispersão do líquido em gotas altamente

40

carregadas à pressão atmosférica, seguida por condições que permitam a

evaporação da gota. Como resultado, são produzidos íons em fase gasosa por

um processo brando, sem fragmentação. A implementação de uma fonte de

ESI é bastante simples se comparada com outras fontes utilizadas em

espectrometria de massas. É necessária uma fonte de alta tensão que esteja em

contato com a solução contendo os analitos. Esta solução é transmitida através

do capilar, onde é aplicado um potencial positivo ou negativo forçando um

processo de oxi-redução e consequentemente a formação de algumas espécies

sem seus contra-íons. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará

enriquecida por íons positivos ou negativos dependendo do potencial aplicado.

Conforme a densidade de carga aumenta na gota presa à ponta do capilar, o

campo elétrico formado entre o capilar e o contra-eletrodo aumenta provocando

uma deformação na gota. A gota ganha forma de um cone, o qual é denominado

de cone de Taylor. Quando a densidade de carga supera a tensão superficial, a

gota se desprende do capilar subdividindo-se em uma névoa fina de gotículas.

A frequência deste último processo depende da magnitude do campo elétrico,

da tensão superficial do solvente e da condutividade da solução22,23.

Portanto, a espectrometria de massas com ionização por ESI (ESI-MS) é

uma técnica muito sensível para investigação de alcalóides por causa de sua boa

eficiência na formação de íons em fase gasosa, já que alcalóides sempre são

moléculas nitrogenadas com caráter básico e portanto fáceis de serem

protonadas, gerando íons abundantes. Durante a última década a técnica de ESI-

MS foi aplicada com êxito na análise e caracterização de alcalóides

diversos17,18,19. Além disso, a técnica de ESI-MS pode ser hifenada com

separação prévia por cromatografia líquida de alta eficiência, ampliando a

aplicabilidade da técnica.

41

Neste trabalho um planejamento simplex centróide envolvendo hexano,

diclorometano e etanol foi usado para avaliar a extração do material botânico de

Erythrina speciosa. Modelos de misturas foram usados para avaliar a

importância dos efeitos de cada solvente e suas misturas na eficiência de

extração de alcalóides de esqueleto eritrínico 11-metoxi-erisodina e erisotrina,

componentes majoritários da Erythrina speciosa. A otimização em processos de

extração é uma etapa fundamental para o estudo sobre a composição da planta.

Mais especificamente nesse caso, como se tratam de compostos químicos de

interesse para indústria farmacêutica, tornam-se de extrema importância estudos

de otimização em extrações. A análise das componentes principais foi aplicada

aos dados de cromatografia liquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria

de massas com ionização por electrospray para estudar a composição dos

alcalóides presentes nas flores, caule e folhas de Erythrina speciosa bem como

a melhor mistura para extraí-los.

2.2. Experimental

Os aspectos relacionados às análises da planta Erythrina speciosa serão

abordados nesse capitulo. Um resumo de procedimento experimental está

representado na Figura 2.2.

42

Figura 2.2. Procedimentos experimentais empregados na análise da planta

Erythrina speciosa.

Todos os solventes orgânicos utilizados foram de grau HPLC

(Mallinckrodt, Philipsburg, USA). A água pura utilizada para as separações

cromatográficas foi obtida de um sistema de purificação Milli-Q (Millipore,

Billerica, USA).

2.2.1. Material botânico

As flores, caule e folhas da Erythrina speciosa foram coletadas na

Universidade Estadual de Campinas, seguindo os mesmos padrões: livres de

qualquer perfuração provocada por insetos ou queimaduras do sol. A coleta foi

no ano de 2012, sempre na parte da manhã para evitar qualquer oscilação de

componentes químicos que podem ocorrer nas plantas ao longo do dia. A

exsicata desta planta está depositada no herbário da Universidade Estadual de

Campinas, e foi classificada por N. D. Cruz, sob o número UEC060665.

Planta

Extrato

UHPLC-ESI-MS

Análise exploratória multivariada dos dados

43

2.2.2. Preparação das amostras e extratos

As três partes da planta foram cortadas em pedaços para facilitar a

secagem, que ocorreu em aproximadamente onze dias. Durante esse período as

flores, caule e folhas ficaram ao ar livre longe do calor e da umidade. Quando

secas, ou seja, com peso constante, foram trituradas em liquidificador, e o pó

resultante submetido a extração.

Pesaram-se 2 g de pó das folhas, flores ou caule de Erythrina speciosa

em um erlenmeyer para cada um dos extratos, acrescentaram-se 60 mL de

solvente nas proporções determinadas de acordo com o planejamento simplex

centróide da Figura 2.3. Depois o erlenmeyer foi levado ao banho ultrassom por

30 minutos. Em seguida filtrou-se com funil comum e algodão e reservou-se o

extrato filtrado. Esse processo foi repetido por três vezes, combinando-se os

filtrados. Os extratos combinados foram então filtrados em filtro Millipore

(0,22 µm) e analisados por UHPLC-ESI-MS.

(a) (b)

Figura 2.3. Planejamento simplex centróide, onde as proporções x1= etanol

(Et); x2= diclorometano (Dm); x3 = hexano (Hx). (a) Representação gráfica das

misturas do planejamento simplex centróide e (b) proporção numérica das

misturas do planejamento simplex centróide.

Misturas Planejamento

(Et, Dm, Hx)

Et 1:0:0

Dm 0:1:0

Hx 0:0:1

EtDm 0,5:0,5:0

DmHx 0:0,5:0,5

EtHx 0,5:0:0,5

EtDmHx 0,33:0,33:0,33

EtDmHx 0,33:0,33:0,33

44

2.2.3. Análises por UHPLC-ESI-MS

As separações cromatográficas foram realizadas em um cromatógrafo

Acquity UPLC (Waters®) equipado com um sistema de bombas binárias. As

análises foram realizadas utilizando-se uma coluna BEH Acquity UPLC (C18)

com dimensões 50 mm × 2,1 mm, 1,7 µm de partícula. Os solventes utilizados

como fases móveis foram H2O com 0,1% de ácido fórmico v/v (A) e ACN (B).

O método cromatográfico empregado consistiu de um gradiente crescente como

segue: 0-3,5 min, 40-65% de B; 3,5-6,5 min, 65-80% de B; 6,5-7,5 min, 80-

100% de B; 7,5-8,5 min, isocrático 100% de B; de 8,5 - 9 min de 100-40% de

B. O sistema de UPLC está acoplado a um espectrômetro de massas do tipo

triplo-quadrupolo modelo Quatro Micro API (Waters®). Foi utilizada uma

fonte de eletrospray (ESI) do tipo Z-spray. As análises de MS foram adquiridas

no modo positivo de polaridade devido à natureza básica dos compostos alvo.

Os dados foram obtidos no modo varredura (MS Scan) usando uma faixa de

m/z de 200 a 400. As condições de ionização da fonte foram: voltagem no

capilar 3 kV; temperatura da fonte 150 °C, vazão de gás no cone 80 L/h, vazão

de gás de dessolvatação 800 L/h, temperatura de dessolvatação 350 °C. Gás

nitrogênio (pureza >99%) foi utilizado como gás de nebulização. Os dados

obtidos foram processados no software MassLynx v4.1.

2.3. Resultados e Discussão

Para estudos de otimização de solventes extratores, espera-se que a

escolha dos solventes utilizados tenha valores de parâmetros solvatocrômicos

45

distintos para que se tenha maior seletividade. A Tabela 2. 1 apresenta os

valores de α, β, e π para as misturas do planejamento simplex centróide.

Tabela 2.1. Planejamento simplex centróide com os valores de α, β, e π para

cada mistura.

Mistura Planejamento

(Et, Dm, Hx)

α β π

Et 1:0:0 0,39 0,36 0,25

Dm 0:1:0 0,27 0,00 0,73

Hx 0:0:1 0,00 0,00 0,00

EtDm 0,5:0,5:0 0,33 0,18 0,49

DmHx 0:0,5:0,5 0,14 0,00 0,37

EtHx 0,5:0:0,5 0,20 0,18 0,13

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 0,20 0,11 0,30

Os valores desses parâmetros solvatocrômicos para cada solvente puro

são tabelados e para as misturas de solventes, foram calculados de acordo com

as equações 2.1, 2.2 e 2.3 abaixo.

(2.1)

(2.2)

(2.3)

Onde n é o número de solventes, αi, βi e πi, são os valores dos solventes puros e

i são as proporções das misturas.

46

Com base na Tabela 2.1 percebemos que os valores variam de mistura

para mistura e que as combinações binárias e a ternárias contribuem para

aumentos da seletividade em relação à acidicidade, basicidade e dipolaridade,

permitindo uma avaliação mais eficaz da influência do solvente no processo de

extração.

2.3.1. Análise dos extratos das flores

Primeiramente, os extratos das flores da Erythrina speciosa foram

submetidos a análises por UHPLC-ESI-MS. Parte dos dados obtidos geraram

cromatogramas totais de íons (TIC’s) com perfis semelhantes onde foram

identificados tentativamente alguns dos constituintes majoritários de esqueleto

eritrínico, tais como a erisotramidina (1), eritrartina (2), N-oxido-erisotrina (3),

erisotrina (4) e 11- metoxi-erisodina (5) (Figura 2. 4), com base em resultados

prévios descritos na literatura. Para a maioria das misturas analisadas foram

encontrados os principais constituintes com estruturas derivadas da erisotrina,

sendo a eritrartina (Rt 2,68) um dos principais alcalóides previamente

reportados nas análises de Erythrina speciosa 2.

47

Figura 2.4. Cromatograma total de íons das flores de Erythrina speciosa com a

mistura (etanol:diclorometano:hexano (0,33:0,33:0,33 (v/v/v))).

O conjunto de dados obtidos dos extratos das flores de Erythrina

speciosa foi analisado levando em conta apenas os picos correspondentes a íons

de moléculas protonadas com m/z par, uma vez que o interesse estava na busca

de alcalóides com esqueleto do tipo eritrínico. Como o esqueleto eritrínico

possui apenas um átomo de nitrogênio, a massa da molécula resultante será

sempre ímpar (considerando que os demais átomos são sempre C, H ou O) e

dessa forma, os íons monoprotonados ([M+H]+) dos alcalóides observados em

ESI(+)-MS possuirão m/z par. Picos referentes a íons de moléculas

monoprotonadas em m/z 288, 312, 314, 316, 328, 330, 342, 344 e 346 foram

encontrados nos extratos preparados nas diferentes proporções das misturas

indicadas no planejamento, Tabela 2.2. Todos esses íons foram encontrados em

48

pelo menos um dos extratos preparados de acordo com o planejamento, já os

íons referentes a m/z 330 e 314 são os únicos presentes em todos os extratos. Os

extratos das misturas onde foram encontrados valores de m/z 288, 316 e 330

mostram mais de um pico cromatográfico correspondente aos mesmos valores

de m/z, devido à existência de compostos isóbaros presentes na planta estudada.

Com base na Tabela 2.2, observamos que o solvente extrator exerce

grande influência no resultado. Por exemplo, etanol não é recomendado para

extração do alcalóide de m/z 288, em virtude da ausência desse íon no

cromatograma de UHPLC-MS obtido para esse solvente. Apesar de o hexano

puro ter os menores valores de intensidades totais ele é importante para

extração desses alcalóide e pode ser usado para futuros estudos de identificação

e isolamento do mesmo.

Apenas o extrato preparado em etanol puro mostrou a presença do

possível alcalóide em m/z 312. Para m/z 314 todas as misturas de solventes

foram eficazes para a extração. Para m/z 316 o etanol não é indicado já que não

extraiu esse alcalóide e para estudar os isóbaros desse metabólito o hexano puro

e misturas envolvendo o hexano são indicadas por conseguir extrair o alcalóide

de m/z 316. No caso do alcalóide de m/z 328 o hexano puro não foi eficiente,

mas as misturas de solventes envolvendo o hexano foram eficientes na

extração. O etanol extraiu dois compostos fornecendo picos com essa m/z. Para

m/z 330 todas as misturas de solventes foram eficientes para extração.

É possível observar que para alcalóides com m/z 342, m/z 344 e m/z 346 a

escolha do solvente é um passo importante para estudá-los, uma vez que

somente algumas misturas de solventes foram eficientes para extração destes

metabólitos. Nenhum solvente puro extraiu o alcalóide com m/z 342.

49

Tabela 2.2. Valores de m/z encontrados nos extratos das flores de Erythrina


centróide. Cada símbolo * representa o número de vezes que cada valor de m/z

foi encontrado nas diferentes misturas, na forma de picos cromatográficos com

tempos de retenção distintos.

Mistura m/z

288

m/z

312

m/z

314

m/z

316

m/z

328

m/z

330

m/z

342

m/z

344

m/z

346

Et

*

*

** ** * *

Dm **

*

**

* **

Hx ****

*

***

* *

EtDm **

*

*

* **

*

DmHx ***

*

***

* **

EtHx ***

*

***

*

**

* * *

EtDmHx ***

*

***

* **

* *

Foi feito um somatório das intensidades observadas nos espectros de

massas para cada pico com m/z par, gerando uma intensidade total de alcalóides

para cada mistura do planejamento. O alcalóide de m/z 330, de maior

intensidade, e m/z 314 ganharam destaque por serem os únicos a serem

encontrados em todas as misturas do planejamento e por já terem sido

reportados como possíveis marcadores da Erythrina speciosa, Tabela 2.3.

O menor valor de intensidade total de alcalóides identificado nas flores

foi com o extrato obtido em hexano puro, fato que pode ser atribuído à baixa

polaridade do hexano. Este solvente tem maior afinidade para extração de

compostos apolares presentes na planta tais como terpenóides e ácidos graxos24.

50

Tabela 2.3. Intensidades totais dos espectros de massas dos m/z pares obtidos


picos com m/z par para cada cromatograma.

Pontos Planejamento

(Et, Dm, Hx)*

Intensidade

total (In)

(x107)

Número

de

picos**

Intensidade

m/z 314 (x107)

Intensidade

m/z 330 (x107)

Et 1:0:0 21,69 8 2,57 4,39

Dm 0:1:0 26,48 8 4,26 9,20

Hx 0:0:1 7,70 10 2,58 0,38

EtDm 0,5:0,5:0 24,24 8 4,21 7,79

DmHx 0:0,5:0,5 13,51 13 1,96 2,47

EtHx 0,5:0:0,5 49,27 10 7,09 13,80

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 55,39 12 7,95 10,20

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 50,91 12 6,29 9,45

* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares

A Figura 2.5 apresenta as intensidades (In) dos espectros de massas para

o pico cromatográfico mais intenso (alcalóide de m/z 330) para cada mistura do

planejamento simplex centróide.

In

1;0;0

0;1;0

0;0;1

0.5;0.5;0

0;0.5;0.5

0.5;0;0.5

0.3;.0.3;0.3

0.3;.0.3;0.3

Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Figura 2.5. Valores de intensidade para m/z 330 de acordo com as misturas do


51

Os isóbaros com m/z 330 diferenciam-se durante seu processo de

biossíntese, onde são observados diferentes padrões de metilação para as

hidroxilas do anel eritrínico, Figura 2.6 25.

Figura 2.6. Alcalóides tentativamente identificados no gênero Erythrina,

observados por ESI (+) -MS como íons em m/z 330, sendo (a) eritrartina,

previamente reportada em Erithrina speciosa como composto majoritário2 e

(b)11-metoxi-erisodina, previamente identificado em Erythrina lysistemon26.

Os modelos de regressão foram construídos para se obter uma relação

que permitisse prever a resposta correspondente a qualquer valor de

composição de solventes. Aos dados da Tabela 2.3 para m/z 330 foi aplicado o

modelo linear e quadrático. O modelo linear aplicado às intensidades de m/z

330 apresentou falta de ajuste no nível de 95% de confiança. O modelo

quadrático foi testado e a equação para esse modelo é dada por:

In = (2.4)

(±0,58) (±0,58) (±0,58) (±2,61) (±2,61) (±2,61)

Neste modelo vemos que a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5(v/v))

apresenta coeficiente binário altamente significativo. Com esse modelo de

regressão todo o espaço do simplex, ou seja, todas as combinações possíveis

52

dos três solventes podem ser avaliadas para prever a melhor mistura para obter

maiores valores de intensidades contribuindo na obtenção das condições

otimizadas para extração.

A análise de variância (ANOVA), Tabela 2.4, foi utilizada para testar a

significância do modelo e validação do modelo quadrático apresentado.

Tabela 2.4. Análise de variância para o ajuste do modelo quadrático às

intensidades de m/z 330 para as misturas do planejamento simplex centróide.

Fonte de variação Soma quadrática Graus de liberdade Média quadrática

Modelo 138,06 5 27,61

Erro total 0,69 2 0,35

Falta de ajuste 0,41 1 0,41

Erro puro 0,28 1 0,28

Total ajustado 138,75 7 19,82

O valor de F para falta de ajuste do modelo, que é dado pela média

quadrática da falta de ajuste (MQfaj) dividida pela média quadrática do erro

puro (MQep), , é inferior ao valor tabelado de F1,1 (161,4)

no nível de 95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste

no modelo.

Para avaliar a significância da regressão usou-se o valor da média

quadrática da regressão (MQR) dividida pela média quadrática residual (MQr)

que foi obtida pela média ponderada da falta de ajuste e do erro puro:

. Comparando esse valor com o valor de F5,2 = 19,30 com

95% de confiança, a regressão é estatisticamente significativa já que o valor

calculado é maior que o tabelado.

Foi feita uma medida experimental com uma mistura ternária de

etanol:diclorometano:hexano (0,6:0,2:0,2 (v/v/v)). A intensidade de m/z 330

53

para essa mistura foi de 10,58 (107) que está bem próximo do valor previsto

pela equação validada do modelo quadrático que é de 10,44(107).

A superfície de resposta para o modelo quadrático aplicado à soma das

intensidades de m/z 330 pode ser vista na Figura 2.7. Nesta figura, observamos

que a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)) permite obter maior

intensidade de alcalóides referentes à m/z 330, além de confirmar que hexano

puro é a pior opção para estas extrações. Apesar desses solventes quando puros

não serem eficazes na extração, a mistura binária entre eles mostrou-se

satisfatória em relação às demais proporções utilizadas nos diferentes pontos do

planejamento na extração de alcalóides.

Figura 2.7. Superfície de resposta aplicada às intensidades referentes à m/z 330

de acordo com o planejamento simplex centróide.

O mesmo tratamento foi realizado para as intensidades dos picos

identificados em m/z 314. Este íon foi observado como apenas um pico em cada

cromatograma e, possivelmente, se trata da erisotrina (Figura 2.8), que pode ser

considerada um dos marcadores do gênero Erythrina.

54

Figura 2.8. Estrutura para m/z 314, tentativamente identificada em Erythrina

speciosa como erisotrina2.

Os menores valores de intensidades encontrados para m/z 314 (Figura

2.9) foram para os extratos preparados em etanol e hexano puros e na mistura

binária (diclorometano:hexano 0,5:0,5(v/v)), já a mistura binária (etanol:hexano

0,5:0,5(v/v)) apresentou alto valor de intensidade para a m/z referente a

erisotrina. A mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33

(v/v/v)) também apresentou alto valor de intensidade para m/z 314, sendo

assim, essas composições poderão ser recomendadas para a extração otimizada

deste metabólito em Erythrina speciosa.

In

1;0;0

0;1;0

0;0;1

0.5;0.5;0

0;0.5;0.5

0.5;0;0.5

0.3;.0.3;0.3

0.3;.0.3;0.3

Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

Figura 2.9. Valores de intensidade para m/z 314 de acordo com as misturas do


55

Para m/z 314 também foram construídos modelos de regressão para

obter uma relação que permitisse prever a resposta correspondente a qualquer

composição dos três solventes.

Aos dados da Tabela 2.3 para m/z 314, foi aplicado o modelo linear que

apresentou falta de ajuste no nível de 95% de confiança. O modelo quadrático

foi testado e a análise de variância (ANOVA), Tabela 2.5, foi utilizada para

testar a falta de ajuste na validação do modelo. Para obter uma equação com

ajuste dos dados, os efeitos de interação dos solventes não significativos foram

retirados dos cálculos e a equação simplificada para o modelo quadrático é dada

por:

In = (2.5)

(±1,71) (±1,71) (±1,71) (±7,63)

Nesse caso também foi obtido um modelo de regressão validado e que

representa de forma eficaz o conjunto de dados, possibilitando prever valores

de intensidades para as diferentes misturas de solventes possíveis de acordo

com o simplex centróide utilizado.




Modelo 26,67 3 8,89



Erro puro 1,41 1 1,41


56

O valor de F para falta de ajuste do modelo é dado por

que é inferior ao valor tabelado de F3,1 = (215,7) no nível

de 95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste no

modelo.

Para avaliar a significância da regressão, .

Comparando esse valor com o valor de F3,4= 6,59 com 95% de confiança, a

regressão não é estatisticamente significativa já que o valor calculado é menor

que o tabelado.

Avaliando os valores previstos pela equação em relação aos valores

experimentais é possível perceber a proximidade entre os resultados. Neste

caso, a extração usando a mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano

0,6:0,2:0,2 (v/v/v)) a equação para o modelo quadrático, equação 2.5, prevê um

valor de intensidade de 5,9 (107) que está próximo do valor de 6,25 (107) obtido

em um experimento confirmatório. No gráfico de superfície de resposta, Figura

2.10, a mistura binária entre etanol e hexano fica visualmente identificada como

região para melhor extração de alcalóides do tipo eritrínico.

57

Figura 2.10. Superfície de resposta aplicada às intensidades para os picos com

m/z 314.

O ponto central do planejamento simplex centróide,

(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33(v/v/v)) também pode ser indicado

com uma das melhores misturas para extração de alcalóides, pois altos valores

de intensidades foram obtidos nesse ponto. Os altos valores de intensidade no

ponto central podem indicar que um modelo superior descreveria de forma mais

significativa os resultados, porém seria necessário um número maior de

misturas no planejamento para que os graus de liberdade permitissem o teste

para falta de ajuste.

Os cromatogramas foram usados para originar uma matriz 894x7 que foi

submetida à análise das componentes principais. Essa matriz foi composta por

894 linhas referentes aos tempos de retenção até nove minutos e sete colunas

com os valores de intensidades provenientes das sete misturas do planejamento

simplex centróide. Os dados foram primeiramente pré-processados por

58

comprimento de vetor e área unitária. Com estes processamentos, não houve

diferença quanto ao resultado das componentes principais, provavelmente por

serem dados obtidos de uma técnica muito sensível, então foram usados os

dados originais dos cromatogramas totais de íons, sem nenhum pré-

processamento.

Juntos, os gráficos dos scores CP1 e CP2, Figura 2.11, explicam

aproximadamente 75% da variância total dos dados. Nessa projeção, o extrato

obtido em etanol puro (I) e mistura EtHx (II), ficaram separados na região

positiva da CP2. O etanol foi importante na extração dos alcalóides das flores,

já que apenas esse solvente extraiu o metabólito com m/z 312. Esse fato é

importante para isolar e identificar esse alcalóide, uma vez que não há relatos

na literatura sobre esse estudo. Já a mistura binária entre EtHx (II) apresentou

três picos cromatográficos, tanto para m/z 316 quanto para m/z 288. Esses

isóbaros aparecem três vezes juntos para essa mistura. A mistura binária DmHx

(IV) forneceu o extrato grande número de picos cromatográficos, ou seja, maior

variação de alcalóides encontrados.

59

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHx

EtDmHx

EtDmHx

-0,22 -0,20 -0,18 -0,16 -0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00

CP1(59,7%)

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

CP

2(1

4,7

%)

I

II

III

V

IV

Figura 2.11. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de íons no

tempo de retenção de nove minutos para as sete misturas do planejamento

simplex centróide das flores de Erythrina speciosa.

O grupo (V) contém o extrato preparado com as misturas Dm e EtDmHx,

nesse grupo os sinais com valores de m/z iguais possuem tempos de retenção

bem similares. Os oito picos obtidos com a mistura Dm são os mesmos obtidos

para EtDmHx, porém a mistura ternária apresentou doze picos cromatográficos,

mas os quatro picos que diferenciam essa mistura da Dm são de baixa

intensidade. Essas diferenças podem ser vistas na Figura 2.12.

60

Figura 2.12. Perfis cromatográficos para os extratos das flores obtidos nas

diferentes misturas de solventes com base no planejamento simplex centróide.

Os cromatogramas estão identificados de acordo com a separação obtida na

PCA.

Os loadings das componentes principais 1 e 2 podem ser visualizados na

Figura 2.13. O gráfico dos loadings analisados juntamente com o gráfico dos

scores mostra que o extrato obtido em etanol puro (I) e mistura binária

(etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)) (II), que ficaram separados na região positiva da

CP2, são caracterizados pelos valores de m/z encontrados nos tempos de

retenção 2,67; 3,49; 3,74; 4,04 min, que são m/z 328, m/z 330, m/z 346 e m/z

330 respectivamente. E que o tempo de retenção 7,22 min, que corresponde a

m/z 288, foi responsável pela separação do extrato obtido em hexano puro na

região negativa da CP2.

61

0 2 4 6 8 10

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

7,22

2,68

4,04

3,74

3,492,67

Loadin

gs

Tempo de retenção(min)

CP1

CP2

Figura 2.13. Gráfico dos loading das componentes principais 1 e 2

obtido com as flores da Erythrina speciosa.

Essa separação evidencia a importância do solvente na extração de

alcalóides, uma vez que o hexano apresentou baixos valores de intensidades,

não sendo recomendado para extração de alcalóides em flores de Erythrina

speciosa, porém quando o hexano está combinado com o etanol os valores de

intensidades já estão muito maiores como apresentados na Tabela 2. 3.

2.3.2. Análise dos extratos do caule

Nos extratos preparados com o caule foram encontrados alcalóides com

valores referentes a íons monoprotonados em m/z 288, 312, 314 e 316. A

Tabela 2.6 esclarece o fato que no caule da Erythrina a quantidade de

alcalóides encontrada é menor que nas flores. Os valores de diferentes m/z

presentes nas flores são mais que o dobro que os valores de m/z presentes no

62

caule e a presença de íons isóbaros com m/z 288 e m/z 316 destaca-se nessa

parte da planta.

Tabela 2.6. Valores de m/z encontrados nos extratos do caule de Erythrina


centróide. Cada símbolo # representa o número de vezes que cada valor de m/z



Mistura m/z

288

m/z

312

m/z

314

m/z

316

Et ### #

#

###

Dm ####

#

#

###

Hx ##

#

#

##

EtDm ###

#

#

###

DmHx ###

#

#

###

EtHx #

#

###

EtDmHx ###

#

#

###

Nesse caso, apenas o alcalóide com m/z 314 foi comparado com os

resultados anteriores, pois m/z 330 não foi observado no extrato do caule, e

também por m/z 314 já ter sido reportado como possível marcador da espécie.

Os valores de intensidade totais foram obtidos somando as intensidades dos

espectros de massas, da mesma forma como feito para os extratos de flores

(picos correspondentes a íons de moléculas monoprotonadas com m/z par)

Tabela 2.7.

Os menores valores de intensidades totais foram obtidos para os extratos

em diclorometano puro e a mistura binária (diclorometano:etanol 0,5:0,5(v/v)).

Para a melhor extração de alcalóides utilizando o caule da planta, a mistura

ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33 (v/v/v)) é recomendada,

uma vez que nessa mistura os maiores valores para intensidades totais e

63

também para intensidade do composto com m/z 314 foram obtidos, como

mostra a Figura 2.14.



picos com massa par para cada cromatograma.

Pontos Planejamento

(Et, Dm, Hx)*

Intensidade total

(x107)

Número de

picos**

Intensidade m/z

314 (x107)

Et 1:0:0 20,02 8 8,28

Dm 0:1:0 10,60 9 4,07

Hx 0:0:1 16,70 6 11,40

EtDm 0,5:0,5:0 13,20 8 5,23

DmHx 0:0,5:0,5 14,10 8 7,16

EtHx 0,5:0:0,5 23,90 5 11,40

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 36,00 8 15,60

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 34,90 8 15,70

* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares

In

1;0;0

0;1;0

0;0;1

0.5;0.5;0

0;0.5;0.5

0.5;0;0.5

0.3;.0.3;0.30.3;.0.3;0.3

Et Dm Hx EtDm EtHx DmHx EtDmHx EtDmHx0

2

4

6

8

10

12

14

16

18



64

Modelos de regressão foram construídos para obter uma relação que nos

permitisse prever a resposta correspondente aos valores de proporções dos

solventes. Aos dados da Tabela 2.7 para m/z 314 foi aplicado o modelo linear e

quadrático e a análise de variância (ANOVA) foi utilizada para testar a

significância do modelo e validação dos modelos ajustados. Os modelos linear

e quadrático aplicados às intensidades de m/z 314 apresentaram falta de ajuste

no nível de 95% de confiança.

Para testar um modelo superior foram acrescentados pontos axiais em

réplicas ao planejamento simplex centróide, Figura 2.15. Esses pontos

correspondem a misturas ternárias em diferentes proporções de etanol,

diclorometano e hexano que estão apresentados na Tabela 2.8.


com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos axiais

e o número de picos com massa par para cada cromatograma.


(Et, Dm, Hx)

Intensidade total

(In) (x107)

Número de

picos **

Intensidade m/z

314 (x107)

Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 15,50 4 12,00

Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 18,10 4 12,30

EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 24,40 7 13,00

EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 25,50 7 14,00

EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 22,10 7 12,30

EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 22,70 7 12,20

* Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) em maior

proporção ** Apenas m/z pares

O modelo cúbico especial também apresentou falta de ajuste, não sendo

possível validar um modelo matemático para descrever o conjunto de dados.

65

Para testar modelos superiores seria necessário um número bem maior de

experimentos, o que geraria equações matemáticas muito complexas.

Observando a figura geométrica que representa o planejamento simplex

centróide com os valores de intensidades para m/z 314, Figura 2.15, podemos

ter uma ideia da região que os melhores resultados de extração desses

alcalóides são obtidos.

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

11.40

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

8.28

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

4.075.23

7.1611.40

15.70

13.512.2

12.3

Et Dm

Hx

Fi

gura 2.15. Planejamento simplex centróide com valores médios de intensidades

para m/z 314 em suas respectivas misturas.

A região da mistura ternária (etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33

(v/v/v)) apresentou altos valores de intensidades para m/z 314 e provavelmente

com esta mistura é possível obter uma extração mais otimizada desse

metabólito, Figura 2.15. O hexano puro também apresenta alto valor de

66

intensidade, fato importante já que para as flores esse solvente apresentou

valores bem mais baixos de intensidades.

Os dados dos cromatogramas do caule foram submetidos à análise das

componentes principais. Essa matriz foi composta por 894 linhas referentes ao

tempo de retenção até nove minutos e dez colunas com os valores de

intensidades provenientes das sete misturas do planejamento simplex centróide

com os pontos axiais. Os dados foram primeiramente pré-processados por

comprimento de vetor e área unitária. O gráfico ficou visualmente com

resultados mais perceptíveis sem as réplicas, Figura 2.16.

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHxEtHx

EtDmHx

Et*DmHx

EtDm*HxEtDmHx*

-0,108 -0,107 -0,106 -0,105 -0,104 -0,103 -0,102 -0,101 -0,100 -0,099 -0,098

CP1(93%)

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

CP

2(4

%)

I

II

III

IV

VI

V

Figura 2.16. Gráfico dos scores CP1xCP2 dos cromatogramas totais de

íons para o caule de acordo com o planejamento simplex centróide.

A CP1xCP2 explica aproximadamente 97% da variância total dos dados.

Nessa separação, as misturas Dm (I) e EtDm (II) representam os menores

valores de intensidades totais do conjunto e foram separadas na região mais

positiva da CP2. O grupo III, com as misturas Et, DmHx e EtHx, representa os

67

valores intermediários de intensidades totais, que ficaram separados na região

mais próxima de zero da CP2 e o grupo IV, na região menos negativa da CP2,

com as misturas axiais EtDm*Hx, EtDmHx* e a mistura ternária

(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33(v/v/v)) apresentara os maiores

valores de intensidades totais. A mistura Hx (V) e a mistura axial Et*DmHx

(VI) apresentaram valores de intensidades totais muito próximas, como pode

ser observado na Tabela 2.7 e 2.8.

No caule, as intensidades dos picos cromatográficos influenciaram na

separação, pois os perfis observados nos cromatogramas são bem semelhantes.

Constatamos a influência do solvente na separação dos gráficos dos scores, e

nesse caso as misturas ternárias foram muito satisfatórias na extração de

alcalóides. As misturas ternárias são pouco utilizadas para esse tipo de

extração, sendo mais encontrados os solventes puros ou combinações binárias.

A Figura 2.17 apresenta o gráfico dos loadings da CP1 e CP2 que,

quando analisadas em conjunto com o gráfico dos scores, Figura 2.16 mostra

que os tempos de retenção responsáveis pela separação na região mais positiva

da CP2 são: 7,19; 7,45 e 8,38 min, que correspondem a m/z 288, m/z 288 e m/z

316 para o Dm (I) e EtDm (II). O tempo de retenção que influencia na

separação do Hx (V) e Et*DmHx (VI) foi 2,94 min, que corresponde a m/z 314

na região mais negativa da CP2.

68

0 2 4 6 8 10

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

8,387,45

7,19

2,94

Loadin

gs


CP1

CP2


dados obtidos com o caule da Erythrina speciosa.

Com o intuito de comparar os extratos das flores com o caule, os dados

dos cromatogramas totais de íons das flores e do caule foram agrupados em

uma única matriz e submetidos à análise das componentes principais. Essa

matriz foi composta pelo tempo de retenção até nove minutos, totalizando 894

linhas e os valores de intensidade para cada uma das misturas do planejamento

totalizando dezessete colunas: sete cromatogramas obtidos com o planejamento

simplex centróide para as flores e dez cromatogramas obtidos com o

planejamento simplex centróide com os pontos axiais para o caule. Quando

comparamos as flores e o caule da planta, Figura 2.18, observamos que existe

uma diferença entre as partes da planta analisada. O caule ficou separado na

região negativa de CP2, juntamente com extrato obtido em hexano puro das

flores.

69

Flores

Caule

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHx

EtDmHx

Et

Dm

Hx

EtDmDmHx

EtHxEtDmHx

Et*DmHx

EtDm*HxEtDmHx*

-0,09 -0,08 -0,07 -0,06 -0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01

CP1(66%)

-0,15

-0,10

-0,05

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

0,40

CP

2(1

3,8

%)

Figura 2.18. Gráfico dos scores para cromatogramas totais de íons das flores e

caule de acordo com o planejamento simplex centróide.

Observando os cromatogramas do extrato obtido em hexano puro para as

flores, que está em negrito na Figura 2.19 e os cromatogramas para o caule de

todas as dez misturas do planejamento simplex centróide, podemos notar que a

diferença está na intensidade dos picos. Todos os cromatogramas totais de íons

obtidos para o caule seguem o mesmo perfil, assim como o cromatograma total

de íons obtido com hexano puro nas flores. Os picos cromatográficos para o

caule apresentaram tempos de retenção bem similares, com mesmo valor de m/z

nos picos mais intensos. Apesar das flores e do caule terem apresentados

características diferentes, os extratos obtidos com solvente hexano puro não

mostraram-se diferentes entre as duas partes da planta.

70

2 4 6 8

0,00E+000

2,00E+007

4,00E+007

6,00E+007

8,00E+007

1,00E+008

1,20E+008

1,40E+008

1,60E+008

m/z 316

m/z 288

m/z 314

Inte

nsid

ade

Tempo de retenção

Figura

2.19. Cromatograma totais de íons para as sete misturas do planejamento

simplex centróide para o caule da planta. O cromatograma total de íons em

hexano puro para as flores em negrito.

Os cromatogramas totais de íons obtidos para as flores de acordo com o

planejamento simplex centróide não seguem o padrão do caule e apresentam

diferença tanto do perfil do cromatograma quanto no tempo de retenção e

valores de m/z. Nesse caso, observou-se que o cromatograma total de íons

obtido em hexano puro, que está em negrito, Figura 2.20, tem intensidade bem

mais baixa em todos os picos do cromatograma. Isso mostra que as duas partes

da planta se comportam de maneira diferente na obtenção de alcalóides e que a

influência do solvente na otimização da extração é um fator importante e que

interfere eficazmente no resultado.

71

2 4 6 8

0,00E+000

5,00E+007

1,00E+008

1,50E+008

Inte

nsid

ade

Tempo de rentenção


planejamento simplex centróide para as flores. O cromatograma obtido em

hexano puro está em negrito.

2.3.3. Análise dos extratos das folhas

Para os dados obtidos dos extratos das folhas de Erythrina speciosa

levando em conta apenas os picos correspondentes a íons de moléculas

protonadas pares, como descrito na parte experimental, foram encontrados os

valores referentes a íons de moléculas protonadas em m/z 288, 312, 314, 316,

330 e 332 para diferentes proporções de misturas indicada no planejamento,

Tabela 2. 9.

72

As misturas que mais extraíram alcalóides foram diclorometano puro, a

mistura binária (diclorometano:hexano 0,5:0,5(v/v)) e a mistura binária

(etanol:hexano 0,5:0,5(v/v)). O hexano foi importante para extração dos

isóbaros de m/z 288 e m/z 316.

Tabela 2.9. Valores de m/z encontrados nos extratos das folhas de Erythrina


centróide. Cada símbolo ▲ representa o número de vezes que cada valor de m/z



Mistura m/z

288

m/z

312

m/z

314

m/z

316

m/z

330

m/z

332

Et

▲

▲▲

▲

Dm

▲▲▲

▲

▲

▲▲

▲

▲

Hx

▲▲▲▲

▲

▲

▲▲▲▲

EtDm

▲▲

▲

▲

▲

DmHx

▲▲▲▲

▲

▲

▲▲▲

▲

▲

EtHx

▲▲

▲

▲

▲▲

▲

▲

EtDmHx

▲▲▲

▲

▲

▲▲▲

▲

O valor de m/z 330 não foi encontrado no extrato de etanol e hexano

puro, nas demais misturas m/z 330 foi encontrado em apenas um tempo de

retenção, não apresentando isóbaros. O m/z 314 foi encontrado em todas as

misturas e será usado para comparação com as flores e o caule da planta.

Os valores de intensidades totais foram obtidos somando as intensidades

dos espectros de massas dos íons de moléculas protonadas pares como para

73

flores e caules. Essa valores totais juntamente com os valores de intensidades

para m/z 314 estão apresentados na Tabela 2.10.



picos com m/z par para cada cromatograma.


(Et, Dm, Hx)*

Intensidade total

(x107)

Número de picos

**

Intensidade m/z

314 (x107)

Et 1:0:0 12,01 4 3,53

Dm 0:1:0 8,70 9 3,31

Hx 0:0:1 2,25 10 0,69

EtDm 0,5:0,5:0 5,99 6 3,96

DmHx 0:0,5:0,5 7,07 11 1,78

EtHx 0,5:0:0,5 6,56 8 3,57

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 12,13 9 4,69

EtDmHx 0,33:0,33:0,33 12,81 9 5,29 * Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) ** Apenas m/z pares

De acordo com a Figura 2.21, que representa graficamente os valores de

intensidades para m/z 314, observamos que o menor valor de intensidade foi

obtido para o extrato em hexano puro. A mistura ternária

(etanol:diclorometano:hexano 0,33:0,33:0,33 (v/v/v)) apresentou maiores

valores de intensidade, evidenciando a importância do uso de misturas de

solventes na obtenção de alcalóides da Erythrina speciosa.

74

In

1;0;00;1;0

0;0;1

0.5;0.5;0

0;0.5;0.5

0.5;0;0.5

0.3;.0.3;0.3

0.3;.0.3;0.3

Et Dm Hx EtDm DmHx EtHx EtDmHx EtDmHx0

1

2

3

4

5

6



A fim de prever a resposta correspondente aos valores das misturas do

solvente, modelos de regressão foram construídos. Aos dados da Tabela 2.10

para m/z 314 foi aplicado o modelo linear e quadrático e a análise de variância

(ANOVA) foi utilizada para testar a significância dos modelos e validação dos

modelos ajustados. Os modelos linear e quadrático apresentaram falta de ajuste

no nível de 95% de confiança.

Para testar o modelo cúbico especial foram adicionadas misturas axiais

em réplica ao planejamento inicial. A Tabela 2.11 apresenta os valores de

intensidades totais, números de picos e intensidade para m/z 314 encontrados

nas misturas adicionadas.

75


com a extração baseada num planejamento simplex centróide com pontos axiais

e o número de picos com m/z par para cada cromatograma.


(Et, Dm, Hx)

Intensidade total

(In) (x107)

Número de

picos **

Intensidade m/z

314 (x107)

Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 6,53 6 4,40

Et*DmHx 0,6:0,2:0,2 7,23 6 4,89

EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 7,90 8 3,41

EtDm*Hx 0,2:0,6:0,2 8,81 8 3,60

EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 7,66 9 3,52

EtDmHx* 0,2:0,2:0,6 8,90 9 4,37 * Solventes usados: Et (etanol), Dm (diclorometano), Hx (hexano) em maior

porcentagem ** Apenas m/z pares

O modelo cúbico especial no nível de 95% apresentou ajuste aos dados

de acordo com a Tabela 2.12 com os dados da ANOVA, e a equação que

descreve o modelo cúbico especial para esse conjunto de dados é dada pela

equação 2.6:

In=

(±0,53) (±0,53) (±0,53) (±2,71)

(±2,71) (±2,71) (±15,78) (2.6)

Tabela 2.12. Análise de variância para o ajuste do modelo cúbico especial as



Modelo 16,76 6 2,79



Erro puro 0,68 4 0,17


76

A equação mostra que as misturas ternárias, com coeficiente bem maior

que o das outras misturas, indicam extração otimizada.

O valor de F para falta de ajuste do modelo é dado por

que é inferior ao valor tabelado de F3,4 (6,59) no nível de

95% de confiança, indicando que não há evidência de falta de ajuste no modelo.

Avaliando o significado da regressão, e comparando

esse valor com o valor tabelado de F6,7 =3,87 com 95% de confiança, a

regressão é estatisticamente significativa já que o valor calculado é maior que o

tabelado.

No gráfico de superfície de resposta, Figura 2.22, fica evidente que o

ponto central do planejamento simplex centróide foi onde os melhores

resultados foram obtidos para a extração do alcalóide erisotrina nas folhas da

Erythrina speciosa e que o etanol também tem influência positiva na extração,

sendo assim eficaz.

5

4

3

2

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Hx

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

Et

0,00 0,25 0,50 0,75 1,00

Dm

Figura 2.22. Superfície de resposta aplicada as intensidades para os picos com

m/z 314.

77

Os cromatogramas totais de íons de todas as misturas do planejamento

original e pontos axiais foram agrupados em forma de matriz, originando uma

matriz 894x14, correspondente a 894 linhas vindas dos nove minutos de tempo

de retenção e dez colunas das misturas do planejamento original e pontos

axiais.

A CP1 e a CP3 juntas explicam aproximadamente 89% da variância total

dos dados. Com base no gráfico dos scores, Figura 2.23, observamos a

separação de quatro grupos. A CP1 não explica nada em relação à mistura Et

(I) que se encontra no zero dessa CP, e que ficou separada na região positiva da

CP3. Nessa mistura o menor número de picos cromatográficos foi encontrado e

esses picos têm valores altos de intensidades. Hx e DmHx (II), que ficaram

separadas dos demais grupos na região mais positiva da CP3, são as únicas

misturas que apresentaram quatro isóbaros de m/z 288 e possuem valores

baixos de intensidades totais de alcalóides. A mistura Et*DmHx (IV), separada

na região mais negativa da CP3, tem os menores valores de intensidades totais

de alcalóides e menor número de picos dentre as misturas axiais. O grupo III

agrupa as demais misturas do planejamento, que apresentam valores de tempo

de retenção bem similares para os valores de m/z iguais entre todas as misturas.

78

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHxEtDmHx

Et*DmHx

EtDm*Hx

EtDmHx*

-0,14 -0,12 -0,10 -0,08 -0,06 -0,04 -0,02 0,00 0,02

CP1(78,5%)

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

CP

3(1

0,4

%)

I

II

III

IV

Figura 2.23. Gráfico dos scores CP1xCP3 para os dados dos cromatogramas

totais de íons obtidos nas folhas da Erytrina speciosa.

O gráfico dos loadings, Figura 2.24, analisados juntamente com o

gráfico dos scores indica quais valores de m/z estão nos grupos formados no

gráfico dos scores de acordo com seu tempo de retenção. O tempo de retenção

2,96 min, observado na região negativa da CP3, corresponde a m/z 314 para a

mistura Et*DmHx (IV) e foi importante para a separação dessa mistura das

demais. Na região positiva da CP3, que separou as misturas Et (I), Hx e DmHx

(II), os metabólitos com tempos de retenção 7,23; 7,46 e 8,43 min foram

importantes para essa discriminação. Esses tempos de retenção correspondem

aos metabólitos com m/z 288, 288 e 316 respectivamente.

79

0 2 4 6 8 10

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

8,437,48

7,23

2,94

Loadin

gs

Tempo de retenção (min)

CP1

CP3



Os dados dos cromatogramas totais de íons para as flores, caule e folhas

foram agrupados em uma única matriz 894x27, sendo 894 linhas provenientes

do tempo de retenção de nove minutos e 27 colunas referentes às sete misturas

do planejamento simplex centróide para as três partes da planta analisadas e os

três pontos axiais para a extração no caule e nas folhas. Essa matriz foi

submetida à análise das componentes principais. A CP1 e CP2, Figura 2. 25,

juntas explicam em torno de 82% da variância total dos dados. Nessa separação

fica evidente a influência do solvente na extração dos alcalóides e também

como a planta se comporta de maneira diferente em cada uma de suas partes

analisadas. A discriminação dos extratos obtidos com o caule mostrou que

nessa parte da planta, a extração de alcalóides foi similar independente da

mistura de solventes que foi utilizada e que poucos valores de m/z foram

80

encontrados. O extrato obtido em hexano puro nas flores se distinguiu dos

demais extratos da mesma por apresentar menores valores de intensidade. O

extrato em etanol puro das folhas apresentou menor número de picos, porém

com altos valores de intensidades, comparado com os resultados obtidos nas

outras misturas de solventes para essa parte da planta.

flores

caule

folhas

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHx

EtDmHx

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHxEtDmHx

Et*DmHx

EtDm*HxEtDmHx*

Et

Dm

Hx

EtDm

DmHx

EtHx

EtDmHx

Et*DmHxEtDm*HxEtDmHx*

-0,05 -0,04 -0,03 -0,02 -0,01 0,00 0,01

CP1(75,7%)

-0,2

-0,1

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

CP

2 (

6,1

%)

Figura 2.25. Gráfico dos scores dados das flores, caule e folhas da planta na

projeção CP1xCP2xCP3.

O gráfico dos loadings, Figura 2.26, analisado em conjunto com o gráfico

dos scores, indica que o tempo de retenção responsável pela discriminação dos

extratos em EtHx nas flores e Et nas folhas na região positiva da CP2 é 2,27

mim. Nesse tempo de retenção encontra-se o metabólito com m/z 314. O extrato

obtido em etanol puro nas folhas foi o que apresentou menor número de picos

entre todas as misturas analisadas nas três partes da planta e ainda assim, por ter

81

a presença da m/z 314 foi discriminado das demais misturas, isso indica que

esse alcalóide é importante na planta.

0 2 4 6 8 10

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

2,27Loadin

gs


CP1

CP2



As três partes de planta apresentaram composições diferentes e para cada

mistura de solvente utilizada houve variação das m/z. A flor mostrou-se mais

eficaz para obtenção de diferentes tipos de alcalóides, já que nove diferentes

valores de m/z foram encontrados e enquanto para o caule foram encontrados

cinco e para as folhas seis valores de m/z.

Em cada coluna da Tabela 2.13 temos todos os valores de m/z

encontrados nas análises feitas. Em cada linha da Tabela 2.13 temos uma

mistura do planejamento simplex centróide. As partes da planta serão

apresentadas com os símbolos: “*” para as flores, “#” para o caule e “▲” para

as folhas. Cada repetição do símbolo representa os isóbaros encontrados para

82

cada valor de m/z, por exemplo, para o etanol puro o caule apresentou três

vezes o valor de m/z 288 nos extratos do caule.

Tabela 2.13. Valores de m/z encontrados em cada mistura de solvente nas

diferentes partes da planta analisadas. Múltiplos símbolos indicam mais de um

pico cromatográfico com tempos de retenção distintos para a mesma m/z.

Mistura m/z

288

m/z

312

m/z

314

m/z

316

m/z

328

m/z

330

m/z

332

m/z

342

m/z

344

m/z

346

Et

###

*

#

▲

*

#

▲▲

###

** **

▲

* *

Dm

**

####

▲▲▲

#

▲

*

#

▲

**

###

▲▲

*

**

▲

▲

Hx

****

##

▲▲▲▲

#

▲

*

#

▲

***

##

▲▲▲▲

* *

EtDm

**

###

▲▲

#

*

#

▲

*

###

▲

*

**

▲

*

DmHx

***

###

▲▲▲▲

#

▲

*

#

▲

***

###

▲▲▲

*

**

▲

▲

EtHx

***

#

▲▲

▲

*

#

▲

***

###

▲▲

*

**

▲

▲

* * *

EtDmHx

***

###

▲▲▲

#

▲

*

#

▲

***

###

▲▲▲

*

**

▲

* *

* m/z encontrados nas flores

# m/z encontrados no caule

▲ m/z encontrados nas folhas

83

Para m/z 288 observamos a presença de isóbaros para as flores, para o

caule e folhas. Para o extrato em etanol o caule apresentou três isóbaros

enquanto que as flores e folhas não contém esse alcalóide. Para as demais

misturas tanto as flores quanto caule e folhas apresentaram isóbaros para m/z

288.

Apenas um pico cromatográfico foi obtido com valor m/z 312 nas

diferentes partes da planta e o solvente etanol foi importante por ter sido o

único a extrair esse alcalóide nas flores. No m/z 314 não houve presença de

isóbaros nos extratos das flores e caule, mas o etanol extraiu um isóbaro nas

folhas desse alcalóide.

Vários isóbaros foram encontrados para m/z 316 para as três partes da

planta analisada, porém o etanol puro não extraiu esse alcalóide nas flores e

folhas. Nem todas as misturas de solventes extraíram o alcalóide com m/z 328 e

a mistura binária (etanol:hexano 0,5:0,5 (v/v)) foi importante na extração de

isóbaros de m/z 328 no caule, sendo que nas folhas não foi encontrado esse

alcalóide. Os extratos do caule não apresentaram alcalóides com m/z 330 e

apenas as folhas contém alcalóides com m/z 332. Os valores de m/z 342, 344 e

346 foram encontrados apenas nas flores.

Tendo em vista as diferenças apresentadas para as flores, caule e folhas e

também o efeito do solvente na extração de alcalóides na Erytrina speciosa,

fica evidente a importância da otimização no processo de extração e que com o

uso do planejamento de misturas podemos direcionar a extração para o

composto de interesse, o que nem sempre é possível com a utilização apenas de

solventes puros.

No que diz respeito a moléculas pequenas (massa < 1000 Da), a MS é de

grande valia em fornecer informações a respeito de fórmula molecular mediante

medidas de m/z. Somada a essa capacidade, a realização de experimentos de

84

espectro de íons fragmentos (MS/MS) por técnicas como dissociação induzida

por colisão (CID) permite ainda obter informações estruturais a respeito da

molécula em questão através do padrão de fragmentação observado. Entretanto,

a elucidação estrutural de uma molécula pequena não pode ser alcançada

apenas por experimentos de MS e MS/MS, uma vez que moléculas muito

similares, como isômeros posicionais, frequentemente apresentam espectros de

íons fragmentos (MS/MS) virtualmente idênticos, dificultando sua distinção 27.

A elucidação estrutural completa de uma molécula pequena, que compreende a

identificação e atribuição de conectividades entre átomos e estereoquímica, é

sempre realizada por meio de técnicas independentes como a espectroscopia de

ressonância magnética nuclear (NMR) mono- (1D) e bidimensional (2D) e a

difração de raios-X (XRD)28. Embora esforços tenham sido feitos no sentido de

se expandir as capacidades de elucidação estrutural baseada em MS com

abordagens alternativas 27 e ferramentas de predição de espectros 28, a

elucidação estrutural completa de compostos orgânicos desconhecidos, sem

nenhum conhecimento prévio a respeito da estrutura, ainda é parte do domínio

da espectroscopia de NMR.

Pelas razões explicadas acima, não há garantia que os vários íons

isóbaros observados ao longo das análises por UHPLC-ESI-MS poderiam ser

diferenciados por experimentos de espectros de íons fragmentos (MS/MS) pois,

em muitos casos, como o de isômeros posicionais que constituem o par

eritrartina e 11-metoxi-erisodina, os espectros de fragmentação obtidos

possivelmente seriam muito parecidos, inviabilizando a diferenciação.

85

2.4. Identificações das estruturas de alcalóides eritrínicos por

cálculos teóricos

Os principais alcalóides eritrínicos apresentam como esqueleto clássico a

estrutura apresentada na Figura 2.27. Esses alcalóides se diferenciam uns dos

outros pela presença e posição de substituintes ao longo da estrutura29.

Figura 2.27. Estrutura clássica do esqueleto de alcalóides eritrínicos.

Os extratos das flores de Erythrina, preparados em hexano, etanol e

diclorometano puros, de acordo com o descrito na parte experimental foram

analisados por espectroscopia de absorção molecular na região UV-Vis (Cary

50, Varian/Agilent). Os espectros foram analisados e identificados nos pontos

de absorção máxima.

Adicionalmente aos procedimentos experimentais, os espectros UV-Vis

de alguns compostos com estrutura eritrínica foram calculados. Primeiramente

a geometria de equilíbrio foi obtida através de otimizações no funcional B3LYP

e a função base 6-311+G(d,p). Neste nível os resultados podem ser obtidos

rapidamente em uma estação de trabalho AMD 64 através do GAUSSIAN03 30.

Uma vez que as extrações utilizaram solventes com diferentes

polaridades foi utilizado o modelo de PCM implementado no GAUSSIAN03.

86

Para a obtenção das energias verticais de excitação foi empregada a Teoria do

Funcional de Densidade Dependente do Tempo (TDDFT) no mesmo nível das

otimizações geométricas. O protocolo teórico aplicado nesta tese foi discutido

anteriormente em outro trabalho31 como um método de reprodução dos

espectros UV-Vis de diversos cromóforos com excelente acordo com os dados

experimentais. As geometrias de dois alcalóides, eritrartina e 11-metoxi-

erisodina, identificados tentativamente por ESI-MS como íons isóbaros de m/z

330, Figura 2.28, foram otimizadas através do funcional hibrido B3LYP com a

função de base 6-311+G(d,p) .

Figura 2.28. Estruturas da (A) eritrartina e (B) 11-metoxi-erisodina, alcalóides

eritrínicos identificados tentativamente por MS como íons de m/z 330.

A Tabela 2.14 mostra a comparação entre as frequências de absorção

experimentais e as obtidas teoricamente. Quando se avalia a Tabela 2.14,

observamos que apesar do fato da medida experimental ser feita na presença de

diversas substâncias, existe um acordo muito bom do pico de absorbância com

os valores calculados para a eritrartina e a 11-metoxi-erisodina. É possível notar

que os solventes afetam muito pouco a frequência de absorção de ambos os

compostos. Independentemente do solvente utilizado a frequência de absorção

não varia mais de 1 nm.

87

Tabela 2.14. Comparação entre as frequências de absorção das transições pi-

pi*, obtidas experimentalmente e teoricamente.

Solvente Teórico

Eritrartina

Teórico

11-metoxi-erisodina Experimental

Etanol 282,7 273,2 271

Clorofórmio 282,2 273,4 282

Hexano 281,5 272,6 270

As medidas teóricas foram capazes de representar os valores

experimentais muito bem. Pela comparação entre os espectros teóricos e

experimentais, é possível afirmar que apenas quando o clorofórmio é utilizado

como solvente a 11-metoxi-erisodina é extraída em maior quantidade.

2.5. Conclusão 2:


1) As misturas de solventes foram eficazes para extração da maior

quantidade de alcaloides considerados como marcadores da planta

Erythrina speciosa Andrews.

2) Apesar das folhas serem mais utilizadas popularmente como sendo a

mais rica em alcaloides, as flores apresentaram maior diversidade de

alcaloides encontrados.

3) Modelos matemáticos foram validados aos conjuntos de dados obtidos

para os extratos das flores e folhas, podendo ser previsto qualquer valor

de intensidade para os picos dos alcaloides estudados dentro do domínio

experimental do planejamento simplex centróide.

88

4) Cálculos usando a Teoria do Funcional de Densidade Dependente do

Tempo (TDDFT) com a funcional B3LYP e o conjunto de base 6-

311+G(d,p) forneceram informações uteis para fazer atribuições de

bandas no UV.

____________________________________________________________

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90

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http://pubs.acs.org/journal/jctcce

91

Capitulo 3 - Otimização das condições para absorção nas folhas

de cultivares de café

3.1. Introdução

O café é uma das bebidas mais consumidas no mundo. Umas das

variedades de café mais comercializadas é o café arábico por ter qualidade

superior devido as suas propriedades sensoriais2,3. Diversas propriedades são

atribuídas ao café e diversos estudos envolvem o mesmo4.

O Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), localizado na cidade de

Londrina, foi criado em 1974 e possui um banco de genes do café arábico. Essa

coleção de genes foi usada para melhoramento genético como, por exemplo, a

resistência a ferrugem5.

Atualmente, o sensoriamento remoto tem sido bastante utilizado para

estudos onde é necessário o monitoramento da planta em seu lugar de

crescimento. Os equipamentos para sensoriamento remoto podem ser definido

como aqueles que processam dados, com a finalidade de estudar o ambiente

terrestre por meio do registro das interações entre a radiação eletromagnética e

as diversas coberturas que compõem a superfície terrestre, estando, portanto

relacionados a medidas de radiação eletromagnética6.

A aquisição de dados de sensoriamento remoto envolve quatro partes

básicas: a fonte de energia eletromagnética, a atmosfera, o alvo e o sensor. Em

sensoriamento remoto, a principal fonte de energia eletromagnética é o Sol. A

energia eletromagnética, ao se propagar pela atmosfera, sofre modificações em

sua intensidade e em sua distribuição espectral. Ao atingir a superfície terrestre,

a energia interage com os objetos, podendo ser refletida, transmitida e/ou

92

absorvida7. A quantidade de energia refletida (R) por um objeto é função de três

fatores: a energia eletromagnética incidente (I), proveniente do sol ou uma

lâmpada, a quantidade de energia absorvida (A) e a quantidade de energia

transmitida (T). Podemos expressar essa relação como R = I – (T + A). A razão

entre a quantidade de energia refletida e a quantidade de energia irradiada sobre

os objetos na superfície terrestre fornece a medida de refletância captada por

sensores, denominados espectroradiômetros.

A espectroradiometria permite a eliminação do efeito da atmosfera na

coleta dos dados, pois a distância entre o sensor e o alvo é mínima e é possível

controlar o ângulo de iluminação, isso elimina as fontes de variação na

obtenção dos dados de sensoriamento remoto. As folhas são o órgão mais

importante das plantas para sensoriamento remoto, pois elas têm grande

importância na interação do fluxo radiante com a vegetação devido a sua

constituição com estruturas fotossintetizantes. As folhas são responsáveis pela

absorção de energia eletromagnética necessária para realização da fotossíntese.

A parte mais importante do ponto de vista fisiológico e bioquímico para a

produtividade da planta é a parte absorvida da radiação, mas devido à

capacidade de muitos sensores a reflectância tem sido muito usual na

literatura8. Os valores de reflectância e transmitância variam de forma muito

semelhante ao longo do espectro eletromagnético, mas a produção de biomassa

é altamente relacionada com a quantidade total de energia absorvida pelas

folhas. Como os valores de absorbância são praticamente inversos aos de

reflectância e considerando a capacidade de medir reflectância pelos sensores, é

viável estabelecer relações entre a reflectância e os parâmetros de biomassa. A

Figura 3.1 apresenta a curva de reflectância de folhas verdes e saudáveis com

variações dos comprimentos de onda:

93

Figura 3.1. Curva de reflectância de folha verde e saudável típica9.

Na região do visível a resposta obtida espectralmente da planta é

dominada pela ação de pigmentos como clorofila e antocianinas, sendo que as

concentrações desses pigmentos variam de forma intensa dependendo da

espécie7.

A análise das folhas é o método mais eficiente para monitorar a

composição química dos cultivares de café. Por exemplo, a deficiência de

nitrogênio provoca folhas amareladas e velhas, sendo necessária análise

química para determinação de nitrogênio, que pode ser feita com base na

clorofila presente nas folhas para controlar sua qualidade nutricional7,10.

Além da clorofila, outro pigmento importante nos cultivares são as

antocianinas11, um corante natural que aumenta o valor estético do produto. Nas

folhas com clorofila e antocianinas, a refletância é baixa em toda a faixa do

visível em razão da absorção diferenciada desses dois pigmentos na região do

visível. Na região do infravermelho próximo, a reflectância aumenta em

94

consequência da mudança nas estruturas internas das folhas. Na região do

infravermelho médio ocorre forte absorção principalmente da água. Se a

quantidade de água no interior da planta diminui, a reflectância aumenta.

Tendo em vista a importância da espécie arábica na produção do café,

medidas espectroradiômetricas foram realizadas em quatro cultivares de café no

IAPAR, para otimizar as variáveis que influenciam na absorção das folhas dos

cultivares na faixa de 350-1100 nm e para os comprimentos de onda referentes

à clorofila e antocianinas.

3.2. Dados

As análises foram realizadas pelo CEPAGRI - Centro de Pesquisas

Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura da Universidade Estadual

de Campinas, por Gustavo Coral. As medições foram realizadas com um

espectroradiômetro portátil LI_COR 1800 equipado com um adaptador

hemisférico para esta finalidade. A esfera integradora usava luz unidirecional,

na precisão de 2 nm e faixa de 350-1000 nm. As mudas de dois cultivares de

café IAPAR 59 (IPR-59) e Catuaí IAC 99 (CAT) e dois acessos da coleção de

Etiópia IAPAR intituladas E083 e E027 foram plantadas em 2009, no campo

experimental do IAPAR, em Londrina (-23 ° 18 '37'' S, 51 ° 09 '46'' W, 585 m

de altitude), Brasil. As plantas foram cultivadas sob dois regimes de

abastecimento de água - condições de campo e de irrigação. Cada observação

foi realizada três vezes, em agosto de 2012.

As condições de análise estão representadas na Figura 3.2, totalizando 16

diferentes medidas para cada cultivar, todas as medidas realizadas em triplicata.

http://www.cpa.unicamp.br/index.html

http://www.cpa.unicamp.br/index.html

95

Figura 3.2. Esquema de análises para cada cultivar com as combinações

possíveis dos fatores estudadas.

96

Para as folhas de quatro cultivares diferentes: IPR-59, CAT, 083 e 027,

as variáveis foram: duas faces: abaxial e adaxial; dois estratos extremos de cada

cultivar: superior e inferior e quatro pontos cardeais: norte e sul (latitude) e

leste e oeste (longitude) para cultivar com sistema irrigado e não irrigado.

Para cada cultivar 96 espectros de absorbância foram obtidos devido às

triplicatas. Essas respostas foram dispostas em forma de uma matriz 96x376,

que corresponde a 96 linhas referentes aos 32 espectros de absorbância em

triplicata e 376 colunas correspondentes aos comprimentos de onda de 350 até

1100 nm.

Os dados foram pré-processados por comprimento de vetor, área unitária,

centrados na média e segunda derivada. Essa etapa de pré-processamento é a

transformação matemática dos dados antes da aplicação de tratamentos

multivariados que visa remover ou reduzir fontes de variação aleatória nos

dados, que pode estar ligada a variação do equipamento ou da própria amostra.

Porém os pré-processamentos não mudaram e nem contribuíram para melhor

visualização a discriminação dos grupos, portanto os resultados apresentados

são com os dados brutos.

3.3. Tratamento multivariado

As duas primeiras componentes principais para os quatro cultivares

estudados explicam em torno de 90% da variação total dos dados. Os diferentes

cultivares apresentaram discriminação nos gráficos dos scores muito similares,

como pode ser observado na Figura 3.3. O gráfico dos scores da CP1xCP2,

onde a legenda permite identificar as amostras irrigadas e não irrigadas, dois

grupos foram formados, que representam os espectros com face abaxial e

97

adaxial. O tipo de irrigação não foi importante para discriminação dos grupos

de acordo com a análise de componentes principais.

Figura 3.3. Gráfico dos scores da CP1xCP2 para os cultivares de café com

todos os espectros irrigados e não irrigados, onde os símbolos identificam as

amostras irrigadas e as amostras não irrigadas.

Os gráficos dos scores para o conjunto de dados irrigado e o gráfico dos

scores para o conjunto de dados não irrigado, Figura 3.4, para os quatro

cultivares analisados, também apresentou discriminação apenas em relação às

faces adaxial (AD) e abaxial (AB). De acordo com os símbolos usados para

cada fator estudado, fica visualmente notável à similaridade entre os espectros,

já que nenhum grupo foi discriminado em relação aos extremos inferior e

superior.

Adaxial

Abaxial

Adaxial Abaxial

Adaxial Abaxial

Abaxial

Adaxial

98

Figura 3.4. Gráfico dos scores para o conjunto de dados irrigado e não

irrigado nos quatro cultivares analisados.

99

Os pontos cardeais não foram discriminados pela análise de componentes

principais. Levando em conta os gráficos dos scores para todos os fatores

estudados, apenas a face abaxial e adaxial foi importante para discriminação

dos grupos. Esse fato já era esperado devido à incidência de radiação, de forma

geral, ser maior na face adaxial das folhas, e por isso as respostas podem ser

observadas como maior facilidade.

Para estudar a influência das variáveis na absorção das antocianinas com

comprimento de onda em 520 nm12, da clorofila com comprimento de onda 650

nm13 e no comprimento de onda de 554 nm, onde foi encontrada a menor

absorção nas folhas dos cultivares, foram realizados planejamentos fatoriais

completos 24.

Cada um dos efeitos calculados é uma combinação linear dos valores das

respostas (y) e foi determinado de acordo com a equação 3.1:

(+) - (-) (3.1)

onde (+) é a média de todas as respostas com fator k no nível mais alto e

(-) é a média de todas as respostas com fator k no nível mais baixo. As

respostas são as absorbâncias nos comprimentos de onda mencionados acima

que podem ser afetadas ou não por modificações provocadas dos fatores.

Para avaliar a significância estatística dos efeitos das variáveis nas

absorções em questão, foram construídos intervalos de confiança, usando a

distribuição t de student. O erro padrão foi estimado devido a triplicata dos

pontos do planejamento fatorial.

São estatisticamente significativos os efeitos cujas estimativas (obtidos

no experimento) forem superiores em valor absoluto ao produto do erro padrão

pelo ponto crítico da distribuição de t student, porque só assim o intervalo de

100

confiança não incluirá o valor zero. A Tabela 3.1 apresenta os fatores e os

níveis que esses fatores foram estudados nos diferentes cultivares.

Tabela 3.1. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares com

a latitude variando nos pontos cardeais. Variáveis Níveis

+1 -1

Irrigação Irrigado Não irrigado

Estratos extremos Superior Inferior

Latitude Norte Sul

Face Abaxial Adaxial

No total 48 experimentos foram realizados, com t para 32 graus de

liberdade devido a triplicata do planejamento 24 para cada um dos quatro

cultivares estudados.

Para o cálculo dos efeitos, foi necessário alinhar os espectros. A Tabela

3.2 apresenta os valores dos efeitos das variáveis calculados para o cultivar

IPR-59 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a

significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão.

Consideraremos estatisticamente significativos, com 95% de confiança,

efeitos cujo valor absoluto for superior a para 520 nm, para

554 nm e para 650 nm. Aplicando esse critério aos valores da Tabela

3.2, observamos que apenas a variável face foi significativa, ou seja, a face

abaxial e adaxial interfere na absorção dos comprimentos de onda estudados.

Os valores abaixo de 0,05 de significância indicam que os efeitos são

significativos no nível de 95% de confiança, evidenciando que apenas o fator

face é importante para absorção nos comprimentos de onda 520 nm, 554 nm e

650 nm.

101


650nm para o cultivar IPR-59, com os valores de significância e erro padrão

para cada efeito. Para 520 nm:

IPR-59 Significância Erro padrão

Irrigação -0,0071 0,299306 0,007

Estratos extremos 0,0011 0,862760 0,007

Latitude 0,0016 0,812112 0,007

Face -0,0415 0,000001 0,007

Para 554 nm:


Irrigação 0,0106 0,349978 0,011


Latitude 0,0034 0,763385 0,011

Face -0,0703 0,000000 0,011

Para 650 nm:


Irrigação -0,0043 0,613436 0,008


Latitude 0,0005 0,945139 0,008

Face -0,0370 0,000130 0,008

O fato do valor calculado do efeito da face ser negativo indica que as

absorbâncias na face adaxial foram maiores do que na face abaxial. Isso indica

que têm maiores abundâncias de clorofilas e antocianinas na face recebendo

diretamente iluminação solar.

A Tabela 3.3 apresenta os valores dos efeitos dos fatores calculados para

o cultivar CAT nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a

significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão.

Foi considerado estatisticamente significativo, com 95% de confiança,

um efeito cujo valor absoluto foi superior para 520nm, para

554nm e para 650nm. De acordo com os valores da Tabela 3.3,

observamos que a variável face e irrigação foram significativas em todos os

comprimentos de onda. Isso indica que a face abaxial e adaxial e que se o

102

cultivar foi irrigado ou não afetam a absorção nos comprimentos de onda

estudados. A latitude também foi significativa para a absorção em 520 e

554nm. Os valores de significância também mostrou a importância dessas

variáveis em 95% de confiança.


650nm para o cultivar CAT, com os valores de significância e erro padrão para

cada efeito. Para 520 nm:

CAT Significância Erro padrão

Irrigação -0,00929 0,021532 0,004


Latitude 0,0116 0,004912 0,004

Face -0,0504 0,000000 0,004

Para 554 nm:


Irrigação -0,0168 0,006451 0,006


Latitude 0,0169 0,006063 0,006

Face -0,0740 0,000000 0,006

Para 650 nm:


Irrigação -0,0029 0,013829 0,001

Estratos extremos -0,0002 0,841585 0,001

Latitude 0,0017 0,145008 0,001

Face -0,0170 0,000000 0,001

*A interação entre estratos extremos e latitude foi significativa para os três comprimentos de

onda e a interação irrigação e face foi significativa para 650nm.

Os valores dos efeitos para irrigação e para a face foram negativos,

portanto os níveis mais baixos desses fatores (não irrigado e adaxial) obtiveram

maiores valores de absorção indicando maiores abundâncias de antocianinas e

clorofilas nesse cultivar. Para o fator latitude o nível mais alto foi o responsável

pela menor absorção do conjunto de dados para o cultivar CAT.

103

A Tabela 3.4 apresenta os valores dos efeitos calculados para o cultivar

27 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a significância no

nível de 95% de confiança e o erro padrão.

Tabela 3.4. Tabela dos efeitos das variáveis na absorção em 520 nm, 554 nm e

650 nm para o cultivar 027, com os valores de significância e erro padrão para

cada efeito. Para 520 nm:

027 Significância Erro padrão

Irrigação 0,0135 0,001210 0,004


Latitude -0,0049 0,203182 0,004

Face -0,0518 0,000000 0,004

Para 554 nm:


Irrigação 0,0242 0,001366 0,007


Latitude -0,0193 0,008622 0,007

Face -0,0832 0,000000 0,007

Para 650 nm:


Irrigação 0,00568 0,041147 0,003


Latitude -0,0063 0,023831 0,003

Face -0,0249 0,000000 0,003

Consideramos significativos os efeitos com valores superiores

para 520 nm, para 554 nm e para 650 nm. Portanto,

observamos que os fatores face e irrigação foram significativos nos três

comprimentos de onda, o que indica que as variáveis face abaxial e adaxial, e se

o cultivar foi irrigado ou não, afetam a absorção nos comprimentos de onda

estudados. Diferentemente do resultado obtido para o cultivar CAT, o fator

irrigação foi positivo, evidenciando que as maiores absorções da clorofilas e

antocianinas são obtidas para plantas sujeitas a irrigação. O efeito de latitude,

ou seja, a folha no norte e no sul também foi significativa para a absorção em

104

554 e 650 nm. Isso pode indicar maiores abundâncias de clorofilas nas folhas

localizadas no sul da planta.

A Tabela 3.5 apresenta os valores dos efeitos das variáveis calculados

para o cultivar 83 nos comprimentos de onda de 520 nm, 554 nm e 650 nm, a

significância no nível de 95% de confiança e o erro padrão. São significativos

os efeitos com valor superior para 520 nm, para 554 nm e

para 650 nm. Portanto, os fatores face e irrigação são significativos

para os três comprimentos de onda estudados. Para o fator irrigação o nível

mais alto e para a face o nível mais baixo são as condições otimizadas para

maior absorbância de clorofilas e antocianinas. Esses resultados são similares

aos obtidos para o cultivar 027. Essa similaridade pode ser devido ao fato

desses cultivares serem dois acessos da coleção de Etiópia IAPAR.



cada efeito. Para 520nm:


Irrigação 0,023322 0,000167 0,005


Latitude 0,005619 0,312355 0,005

Face -0,038104 0,000000 0,005

Para 554 nm:


Irrigação 0,054669 0,000658 0,014


Latitude 0,007939 0,587431 0,014

Face -0,062177 0,000153 0,014

Para 650 nm:


Irrigação 0,0302 0,001664 0,008


Latitude 0,0045 0,609451 0,008

Face -0,0253 0,007084 0,008

105

Um segundo planejamento fatorial 24 foi realizado com outra variável

dos pontos cardeais, a longitude. A Tabela 3.6 apresenta as variáveis e os níveis

das variáveis para os quatro cultivares estudados.

Tabela 3.6. Planejamento fatorial 24 para análise das folhas dos cultivares com

a longitude variando nos pontos cardeais. Variáveis Níveis

+1 -1

Irrigação Irrigado Não irrigado

Estratos extremos Superior Inferior

Longitude Leste Oeste

Face Abaxial Adaxial

Os resultados obtidos para esse planejamento, com 95% de confiança

estão apresentados na Tabela 3.7. Com base nesta tabela evidenciamos que a

troca do fator latitude pelo fator longitude manteve a face como o fator

associado com as maiores variações de absorção de clorofilas e antocianinas

para todos os cultivares, porém existem diferenças para os outros fatores.

Alguns efeitos que são significativos no planejamento com longitude, não são

significativos no planejamento com latitude. Existem duas possíveis

explicações para este comportamento: efeitos de interação entre estes fatores

podem ser significativos resultando em efeitos significativos nos dois

planejamentos e o modelo obtido do planejamento fatorial é linear e não levam

em conta possíveis curvaturas no comportamento de absorbância como função

dos níveis dos fatores.

106

Tabela 3.7. Tabela dos efeitos dos fatores na absorção em 520 nm, 554 nm, e

650 nm para os quatro cultivares estudados. IPR-59 520 nm 554 nm 650 nm

Efeito Erro padrão Efeito Erro padrão Efeito Erro padrão

Irrigação -0,0150 0,0048 0,0106 0,0112 -0,0032 0,0028

Estratos

extremos 0,0178 0,0048 0,0059 0,0112 0,0076 0,0028

Longitude -0,0041 0,0048 0,0034 0,0112 -0,0022 0,0028

Face -0,0438 0,0048 -0,0703 0,0112 -0,0207 0,0028

CAT 520 nm 554 nm 650 nm

Irrigação -0,0030 0,0080 0,0020 0,0015 0,0004 0,0041

Estratos

extremos 0,0090 0,0080 -0,0004 0,0015 0,0105 0,0041

Longitude -0,0027 0,0080 0,0009 0,0015 -0,0030 0,0041

Face -0,0792 0,0080 -0,0173 0,0015 -0,0558 0,0041

027 520 nm 554 nm 650 nm

Irrigação 0,0004 0,0069 -0,0062 0,0105 -0,0026 0,0037

Estratos

extremos 0,0150 0,0069 0,0211 0,0105 0,0046 0,0037

Longitude 0,0031 0,0069 0,0108 0,0105 0,0030 0,0037

Face -0,0346 0,0069 -0,0532 0,0105 -0,0162 0,0037

083 520 nm 554 nm 650 nm

Irrigação 0,0177 0,0080 0,0356 0,0166 0,0272 0,0103

Estratos

extremos -0,0072 0,0080 -0,0078 0,0166 -0,0067 0,0103

Longitude -0,0035 0,0080 -0,0047 0,0166 -0,0114 0,0103

Face -0,0330 0,0080 -0,0543 0,0166 -0,0215 0,0103

Analisando os resultados obtidos, foi de grande importância à face

adaxial para estudar a absorção das folhas dos cultivares. Com base nesses

resultados, a absorção das clorofilas e das antocianinas na parte adaxial pode

ser usada para controle da saúde dos cultivares.

Na Figura 3.5 temos os 32 espectros para cada cultivar de café que está

dividido em dois conjuntos: 16 espectros de absorção para cultivares irrigados e

16 espectros de absorção para cultivares não irrigados.

107

Figura 3.5. Gráfico dos 32 espectros de absorbância para os quatro cultivares

de cafés irrigados e não irrigados. Em vermelho temos os espectros obtidos na

face abaxial e em preto os espectros obtidos na face adaxial nos comprimentos

de onda de 350 até 1100nm.

108

Como pode ser observado na Figura 3.2, cada conjunto apresenta os

espectros nos demais fatores estudados: irrigado com face, estratos extremos e

pontos cardeais e não irrigado com face, estratos extremos e pontos cardeais

nos comprimentos de onda de 350 até 1100 nm. Os perfis dos espectros

apresentam diferenças bem sutis quando observados a olho nu, porém os perfis

dos espectros obtidos com a face adaxial e abaxial ficam separados nos

conjuntos de dados dos quatro cultivares.

O uso do planejamento experimental foi de grande importância para

identificar fatores que afetam na absorção e que não foram discriminados pela

análise das componentes principais. A influência dos quatro fatores mostra a

importância da face nesse estudo, independente se os dados usados forem de

absorbância, transmitância ou reflectância. Estudos envolvendo planejamentos

de experimentos não são muito usuais para dados de sensoriamento remoto

agrícola, sendo a primeira vez que foi usado para cultivares de café. Vários

fatores são importantes como, por exemplo, localidade, idade das plantas, tipo

de solo e quantidade de chuva.

3.4. Conclusões 3


1) Planejamento fatorial conseguiu discriminar amostras com diferentes

níveis de irrigação, estratos extremos, pontos cardeais e face. A análise

de componentes principais somente discriminou amostras com faces

diferentes.

109

2) Planejamentos experimentais não são muito utilizados para esse tipo de

estudo, porém sua abordagem foi essencial para avaliar a influência dos

fatores nas absorção de compostos importantes para os cultivares de café.

3) Futuramente o uso de planejamentos de experimentos podem ser testados

com polinômios de ordem superior, inclusive superfícies de respostas,

para explorar mais o ambiente agrícola no geral, trazendo informações

importantes contribuindo para estudos mais avançados na agricultura.

_____________________________________________________________

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