Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.
description
Transcript of Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.
![Page 1: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/1.jpg)
Ćwiczenie 4
Przygotowanie wektora do klonowania.
Hydroliza plazmidu pUC19 enzymami HindIII oraz EcoRI.
Oczyszczanie DNA wektora po reakcjach enzymatycznych.
![Page 2: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/2.jpg)
Protokół 4
Hydroliza DNA wektora enzymami restrykcyjnymi HindIII oraz EcoRI
Mieszanina reakcyjna (30μl)
1. wektor pUC19 5 µl
2. woda dejonizowana 20,5 µl
3. bufor R+ 3 µl
4. HindIII 1 µl
5. EcoRI 0,5 µl
Mieszaninę zwirować (3000obr/min); inkubować 1 godzinę w temp. 37˚C
![Page 3: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/3.jpg)
Protokół 4a
Oczyszczanie DNA wektora plazmidowego po trawieniu enzymami - DNA Clean-Up
1. Do probówki zawierającej DNA dodać 150 µl roztworu G i wymieszać przez
odwracanie probówki lub worteksowanie.
2. Całość nanieść na minikolumnę do oczyszczania DNA i wirować przy 6000 RPM
przez 30s
3. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do
probówki; dodać do kolumny 600 µl roztworu płuczącego A1 i wirować j.w.
4. Wyciągnąć kolumnę z probówki, wylać przesącz i ponownie włożyć kolumnę do
probówki; dodać do kolumny 300 µl roztworu A1 i wirować przy 12000 RPM przez
30s.
5. Osuszoną kolumnę umieścić w nowej probówce 1,5 ml i do złoża znajdującego się
na dnie kolumny dodać 30 µl buforu TE (lub jałowej wody destylowanej );
6. Inkubować próbkę 3 min w temperaturze pokojowej, a następnie wirować przy 12000
RPM przez 30s.
![Page 4: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/4.jpg)
Wektory i metody wprowadzania wektorów do komórek biorców
• klonowany DNA (np. genomowy) musi być na początku procedury klonowania
strawiony enzymami restrykcyjnymi.
• Następnie mieszany jest in vitro z wektorami przeciętymi odpowiednim enzymem, a
następnie (po defosforylacji) łączony jest z DNA wektora (ligowany) przy udziale
ligazy.
• W kolejnym etapie musi nastąpić selekcja klonów rekombinowanych.
• Do tego celu niezbędne jest wstawienie do wektorów tzw. markerów selekcyjnych
(genów warunkujących wystąpienie cechy fenotypowej np. gen oporności na
tetracyklinę).
![Page 5: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/5.jpg)
Wektory powinny ponadto:
• zawierać geny, tzw. markery selekcyjne, nadające komórkom gospodarza łatwy do
testowania fenotyp, np. oporność na antybiotyk, zdolność do rozkładania barwnego
substratu zawartego z podłoża itp.
• być niezdolnym do przeżycia poza komórką gospodarza, namnażać się w niewielu
szczepach, to znaczy mieć tzw. mały zakres gospodarza.
Rozróżniamy wektory:
• autonomiczne – replikują one niezależnie (autonomicznie) w komórkach biorcy
• integracyjne – włączają się (integrują) do DNA gospodarza.
W komórkach prokariotycznych używamy najczęściej 3 rodzajów wektorów:
• Plazmidów, kosmidów, wektorów fagowych
Co to jest wektor?
Wektorem służącym do klonowania DNA może być taki element genetyczny, który ma
zdolność do namnażania się po wprowadzeniu do komórki biorcy.
![Page 6: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/6.jpg)
WEKTORY PLAZMIDOWE
• Wektory plazmidowe skonstruowane są z fragmentów naturalnie występujących
plazmidów, a ostatnio coraz częściej także z odcinków DNA chromosomowego,
fagowego lub syntetycznych oligonukleotydów
• Klasycznym przykładem wektora plazmidowego jest pBR322, replikujący się w
liczbie 15-20 kopii w komórkach bakterii gramujemnych.
Figure 4.17. pBR322. The map shows
the positions of the ampicillin-
resistance gene (amp R ), the
tetracycline-resistance gene (tet R ),
the origin of replication (ori) and the
recognition sequences for seven
restriction endonucleases (Genomes)
![Page 7: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/7.jpg)
Konstrukcja nowych wektorów poszła w kierunku:
• zmniejszania wielkości wektora (2-10 kb) – małe wymiary plazmidu zwiększają jego
pojemność (można klonować wówczas większe fragmenty DNA) oraz wpływają ponadto
na zwiększenie częstości transformacji komórek biorcy. Niewielkie plazmidy występują w
większej liczbie kopii (nawet 500-700/komórkę)
• włączenia w miejsce klonowania DNA syntetycznego oligonukleotydu, tzw. „polilinkera”,
z sekwencjami rozpoznawanymi przez wiele enzymów restrykcyjnych (ang. multiple
cloning sites); umożliwia to bezpośrednie wstawienie fragmentów klonowanego DNA,
które powstały przez trawienie jednym z wielu lub też dwoma różnymi enzymami.
Wycinając następnie tak klonowany DNA innymi ER powodujemy modyfikację jego
końców tj. dodanie syntetycznych sekwencji
• włączenia miejsca klonowania w obrębie genu selekcyjnego, w celu łatwiejszego
rozróżnienia komórki z wektorem zrekombinowanym i niezrekombinowanym. Plazmid
powinien zawierać wówczas przynajmniej dwa różne markery (geny) selekcyjne. Insercja
(wstawienie) obcych sekwencji do jednego z nich inaktywuje go. Brak ekspresji genu
selekcyjnego w komórkach transformowanych wektorem, w odpowiednich warunkach
selekcyjnych, wskazuje na występowanie w nich wektora zrekombinowanego.
• dołączenia do wektorów sekwencji ułatwiających selekcję i zwiększających możliwości
analizy klonowanych fragmentów
![Page 8: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/9.jpg)
![Page 10: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/10.jpg)
Figure 4.18. Recombinant selection with pBR322. See text for details. The inset shows how replica plating is performed.
![Page 11: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/11.jpg)
• wizualna identyfikacja klonów zrekombinowanych możliwa jest po włączeniu do
wektora genu kodującego enzym, który rozkłada barwny substrat. Miejsce klonowania
obcego DNA znajduje się w obrębie tego genu – przykład pUC19, zawierający sekwencje
regulatorowe i N – końcowy fragment genu ß-galaktozydazy (lacZ).
• Wektory takie wprowadzane są do komórek zawierających zmutowany gen lacZ z delecją
w początkowych sekwencjach, które zdolne są do syntezy jedynie C-końcowego
fragmentu ß-galoktyzydazy. Obydwa powstałe peptydy mogą asocjować tworząc
enzymatycznie aktywne białko (λ-komplementacja).
• Insercja klonowanego odcinka w obrębie genu lacZ przerywa jego ciągłość i uniemożliwia
syntezę peptydu zdolnego do tworzenia aktywnej cząsteczki ß-galaktozydazy. Komórki
produkujące aktywny enzym hydrolizują substrat zawarty w podłożu, nadając barwę
koloniom na agarze. Zrekombinowane komórki nie posiadają takiej zdolności (kolonie są
białe).
• selekcja zrekombinowanych klonów może zachodzić bezpośrednio poprzez
zahamowanie namnażania się komórek posiadających niezrekombinowany plazmid. Do
tak działających wektorów włączony jest gen letalny dla komórki gospodarza. Insercja
klonowanego DNA w obrębie tego genu inaktywuje ekspresję, umożliwiając namnażanie
się rekombinantów
IDENTYFIKACJA KLONÓW ZREKOMBINOWANYCH
![Page 12: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/12.jpg)
• otrzymanie dużych ilości mRNA syntetyzowanego na matrycy klonowanego DNA
możliwe jest, gdy wektor zaopatrzony jest w silny promotor rozpoznawany przez
polimerazę RNA gospodarza (wektory ekspresyjne).
• zawierają one także często sekwencje regulujące transkrypcję. Klonowanie genów
eukariotycznych w komórkach prokariotycznych wymaga wprowadzenia genów
eukariotycznych pod kontrolę prokariotycznych sekwencji regulujących – operatora i
promotora.
• do konstrukcji wektorów ekspresyjnych stosuje się m.in. promotory: pL faga lambda,
lac E.coli, trp E.coli i bla (promotor genu ß-laktamazy).
• Promotor pL faga lambda jest zwykle przynajmniej kilkakrotnie bardziej efektywny
niż promotor lac. Kontrolowany jest on przez wrażliwy na wysoką temperaturę
represor CI.
• W podwyższonej temperaturze następuje inaktywacja represora, co powoduje wzrost
ekspresji genu. Geny z promotorem trp indukowane są analogiem tryptofanu. Ich
ekspresja może prowadzić do syntezy nawet 20% białka komórkowego;
EKSPRESJA
![Page 13: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/13.jpg)
• jednoniciowe kopie DNA plazmidu można otrzymać przez włączenie do wektora fragmentu ori, tj. początku replikacji pochodzącego z jednoniciowego bakteriofaga np. M13. Jednoniciowe matryce stosowane są do sekwencjonowania DNA. Przkład plazmidu – Bluescript M13 (2,96 kb).
• wektory umożliwiające transkrypcję klonowanego DNA in vitro zawierają promotory bakteriofagów, np. T3, T7 lub SP6, umieszczone przed miejscem wstawienia DNA.
• Po linearyzacji plazmidu inkubuje się go z odpowiednią dla danego promotora
polimerazą RNA zależną od DNA i rybonukleotydami. Tak otrzymane próbki można
następnie zastosować do translacji w systemie bezkomórkowym. Przykład – pGEM-3
(2867 bp).
![Page 14: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/14.jpg)
KOSMIDY
• Kosmidy są zmodyfikowanymi plazmidami, zawierającymi oprócz fragmentu ori,
genu selekcyjnego i miejsca do klonowania także sekwencje cos faga λ.
• W normalnym cyklu życiowym faga λ, DNA jest syntetyzowany w postaci długich
cząsteczek, konkatamerów, w których genom bakteriofaga jest powtórzony
wielokrotnie.
• Podczas pakowania do główek cząsteczki te są cięte w miejscach cos przy udziale
fagowego białka A, na odcinki DNA odpowiadające długości DNA bakteriofaga.
Ponieważ kosmidy mają około 5 kb, długość klonowanych w nich fragmentów DNA
musi wynosić około 35-45 kb.
• Cząsteczki kosmidów przecinane są ER i łączone z fragmentami obcego
(klonowanego) DNA. Powstałe długie odcinki DNA, w których klonowany DNA
przedzielony jest cząsteczką kosmidu, ulegają fragmentacji w miejscach cos i są
upakowywane w kapsydach.
• Po infekcji szczepu E.coli zrekombinowany, liniowy DNA wstrzykiwany jest do
komórek, gdzie podlega cyrkularyzacji, tj. łączą się jego lepkie końce cos. Koliste
cząsteczki kosmodu replikują się i nadają nowe cechy komórkom gospodarza
pozwalające na ich selekcję.
![Page 15: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/15.jpg)
• Kosmidy służą do klonowania stosunkowo długich cząsteczek DNA (33-47 kb),
zbyt dużych do przenoszenia w wektorach pochodnych faga λ lub wektorach
plazmidowych.
• Są one szczególnie przydatne do badania wielu genów eukariotycznych,
zawierających liczne, długie introny, oraz innych sekwencji genomowego DNA.
KOSMIDY
![Page 16: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/16.jpg)
WEKTORY FAGOWE
Dwa typy fagów E. Coli znalazły ogromne zastosowanie jako prokariotyczne wektory
do klonowania, są to:
1. fag λ
2. jednoniciowy fag M13
• Fag λ zawiera liniowy, 2-niciowy DNA o długości 48502 par zasad z jednoniciowymi
lepkimi końcami cos, długości 12 nukleotydów.
• Liczne genetyczne zmiany, wprowadzone w DNA faga w wielu laboratoriach,
doprowadziły do otrzymania znacznej liczby pochodnych faga λ (>100), używanych
jako wektory do klonowania.
• Fag λ typu dzikiego nie może być stosowany jako wektor. Jednym z powodów tego
jest brak unikalnych miejsc rozpoznawanych przez ER. Drugą niedogodnością
cząsteczki DNA faga λ typu dzikiego jako wektora jest bardzo ograniczona wielkość
fragmentu obcego DNA, który może być wklonowany (nie więcej niż 10% genomu
dzikiego λ).
• Koniecznym było zatem skonstruowanie fagów delecyjnych.
![Page 17: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/17.jpg)
• Ponieważ część genomu faga λ jest nieistotna dla cyklu litycznego, skontruowano
takie mutanty delecyjne, które zwiększały możliwość sklonowania większych
fragmentów obcego DNA.
• Wśród nich były również takie, które posiadały bardzo rozległe delecje (nawet do
25% genomu faga). Taki DNA (delecyjny) nie może być pakowany do główek
fagowych, co staje się zaletą w procedurze klonowania, gdyż tylko DNA z
wklonowanym obcym DNA może się pakować (dobra selekcja fagów
zrekombinowanych).
• Około 60% genomu faga niezbędne jest do jego litycznego wzrostu. Zawiera ona
geny syntezy główki i ogonka faga oraz region replikacji, geny lityczne i
sekwencje cos. Środkowa część genomu faga , około 1/3 całości cząsteczki DNA
może być zastąpiona przez fragment obcego DNA (klonowanego) lub wstawione
geny selekcyjne. Zrekombinowane fagi mogą być selekcjonowane ma wiele
sposobów:
1. selekcja wg wielkości, metabolizm laktozy lub biotyny
2. morfologia łysinek fagowych, analiza restrykcyjna
![Page 18: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/18.jpg)
Rycina. LambdaGem-11 Genomic Cloning
![Page 19: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/19.jpg)
Fag M13
• zbudowany jest z jednoniciowego DNA (6407 nukleotydów), bardzo mały w stosunku do genomu faga λ, występuje w komórce w liczbie 200-300 kopii.
• Po wniknięciu DNA faga M13 do komórki E.coli dosyntetyzowana jest druga, komplementarna nić DNA, a następnie zachodzi replikacja formy dwuniciowej. W końcowej fazie infekcji powstają jednoniciowe cząsteczki, które łączą się z osłonkami białkowymi i wydostają z komórki nie powodując jej lizy.
• Osłonka faga M13 nie limituje wielkości upakowanych cząsteczek, jednak wstawki większe niż 1 kb wykazują niestabilność w tego typu cząsteczkach.
• Fag M13 ma 10 genów, z których żaden nie może zostać usunięty lub unieczynniony bez wpływu na żywotność faga. Po długich badaniach stwierdzono, że w jedno z 10 miejsc rozpoznawanych przez ER BsuI można wstawić fragment obcego DNA nie powodując zaburzenia funkcji życiowych. W miejsce to wstawiono fragment operonu laktozowego E.coli (miejsce dla ER EcoRI). W ten sposób skonstruowano szereg pochodnych faga M13, wykorzystywanych do klonowania – tzw. wektory M13mp.
• Wektory te posiadają promotor i N-końcowy fragment genu ß-galaktozydazy z E.coli, z wbudowanym polilinkerem (MCS). Umożliwia to bezpośrednią selekcję klonów zrekombinowanych.
• Wektory powstałe na bazie faga M13 umożliwiają bezpośrednie sekwencjonowanie nukleotydów klonowanego odcinka DNA.
![Page 20: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/20.jpg)
![Page 21: Ćwiczenie 4 Przygotowanie wektora do klonowania.](https://reader035.fdocument.pub/reader035/viewer/2022062518/568146bd550346895db3f369/html5/thumbnails/21.jpg)
WEKTORY WAHADŁOWE
• Wektory wahadłowe replikują się w różnych gatunkach mikroorganizmów prokariotycznych jak i eukariotycznych komórkach gospodarzy.
• Typowy wektor wahadłowy skonstruowany jest z części prokariotycznej i eukariotycznej.
Część prokariotyczna wektora zawiera:
1. sekwencję ori (start replikacji)
2. marker selekcyjny
Część eukariotyczna wektora zawiera:
1. sekwencję ori rozpoznawaną przez polimerazę DNA gospodarza eukariotycznego
2. marker selekcyjny
3. sekwencje umożliwiające ekspresję genu – promotor, „polilinker”, sekwencja intronowa, terminator.
• Najczęściej stosowanymi wektorami wahadłowymi są wektory drożdżowe. Większość z nich zawiera sekwencje pochodzące z plazmidów bakteryjnych (pBR 322 i jego pochodnych) oraz sekwencje drożdżowe.
• Wektory te mogą być użyte jako wahadłowe, tzn. zrekombinowany gen można za ich pośrednictwem wprowadzić zarówno do komórek E.coli jak i komórek drożdży