Curs d’Especialista Universitari en...
Transcript of Curs d’Especialista Universitari en...
-
Mòdul 8.1. Seqüenciació de proteïnes.Mètodes de determinació de l’estructura primària de proteïnes.
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica
Febrer 2007
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 2
¿Qué información queremos saber de las proteínas?
Función
Regulación de la función
Estructura
Niveles estructurales
Secuencia
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 3
http://www.rcsb.org
http://www.rcsb.org/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 4
http://www.rcsb.org/pdb/
http://www.rcsb.org/pdb/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 5
http://www.rcsb.org/pdb/
http://www.rcsb.org/pdb/http://www.rcsb.org/pdb/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 6
http://www.rcsb.org/pdb/statistics/holdings.do
http://www.rcsb.org/pdb/statistics/holdings.do
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 7
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 8
NCBI Entrez Nucleotide
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 9
Métodos de secuenciación de proteínasMÉTODOS TRADICIONALES: propiedades
químicas de las proteínas
MÉTODOS ACTUALES: conocimientos del flujo de información
biológica, aplicación de nuevas técnicas de determinación químicas, …)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 10
Seqüenciació i microseqüenciació de proteïnes
1. Introducció.1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de
proteïnes.1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.3. Passes prèvies a la seqüenciació.
3.1. Determinació del nombre de subunitats.3.2. Ruptura i determinació del nombre de enllaços disulfur.3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.
4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.
5. Etapes finals a la seqüenciació de proteïnes.5.1. Determinació de la posició dels enllaços disulfur.5.2. Determinació de la seqüència completa.
6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 11
1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.
1953 El grup de Frederick Sanger va determinar la seqüència de la Insulina Bovina.
– Insulina Bovina: proteïna polipeptídica de 51 aa, amb dues cadenes de 21 aa i 30 aa, amb 3 ponts disulfur (2 intercatenarisi 1 intracatenari).
– Important no només per la seqüenciació de la insulina sinótambé per la demostració de l'existència d'una seqüència única per a cada proteïna.
‘Seqüenciades’ més de 3.000.000 de proteïnes diferents.
Llocs de Internet: National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)Brookhaven Protein Data Bank (http://www.rscb.org)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/http://www.rscb.org/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 12
1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.
Es requereix per conèixer els mecanismes moleculars d'acció i pels estudis de difracció de raigs X alhora de determinar l'estructura.
Per comparar seqüències de proteïnes anàlogues del mateix individu, entre membres d'una mateixa espècie i entre espècies diferents.
Aplicacions clíniques en el cas de les malalties d'origen hereditari on es donen mutacions que produeixen canvis en la seqüència d'aminoàcids.
Més de 100 g de la proteïna purificada, deu anys per aconseguir la seqüència completa.
Ara fan falta només uns micrograms de proteïna purificada i la seqüenciació es pot realitzar amb unes setmanes.
Fita important 1978 seqüenciació de la β-galactosidasa proteïna de 1021 aa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 13
1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.
α
α
α
α
+
Glicina (Gly, G)
NC
C
O
O
H
H
H
H H
+-
+
Alanina (Ala, A)
NC
C
O
O
H
H
H
C H
H
H
H
+-
NC
H
NC
C
OH
H
H
H H
C
O
O
H
H
H
H
-
GlicilalaninaEnllaç peptídic
+ HO H
Aigüa
Primària: seqüència d’aminoàcids i ponts disulfur
Secundaria: disposició espacial de la cadena lateral dels aminoàcids
Terciària: estructura tridimensional de tota la cadena de aminoàcids
Quaternària: agrupacions de polipéptids o subunitats per a formar una proteïna
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 14
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
Purificació de la proteïna
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
3) Organització de l’estructura completa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 15
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
Purificació de la proteïna
Obtenció de la mostra (si pot esser enriquida amb la proteïna)
Precipitació amb sals (NH4)2SO4
Dessalat
Cromatografia líquida: intercanvi iònic, hidrofòbic, cribatge molecular, afinitat, etc.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 16
Cromatografia de cribatge molecular
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 17
Cromatografia de intercanvi iònic
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 18
FPLC™Amersham
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 19
FPLC™Amersham
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 20
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüenciació.
a)Determinació del nombre de cadenes polipeptídiquesdiferents (subunitats) existents a la proteïna,
b)Ruptura dels enllaços disulfur si n’hi ha.
c) Separació i purificació de les subunitats,
d)Determinació de la composició aminoacídica de les subunitats.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
3) Organització de l’estructura completa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 21
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
a)Fragmentació de les subunitats individuals en punts específics.
b)Separació i purificació dels fragments.
c) Determinació de la seqüència aminoacídica de cada un dels fragments peptídics.
d)Repetició de l’etapa 2(a) amb un procés de fragmentació d’especificitat diferent.
3) Organització de l’estructura completa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 22
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
3) Organització de l’estructura completa.
a)Solucionar el trencaclosques
b)Si n’hi ha esbrinament de les posicions dels enllaços disulfur.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 23
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.
a)Determinació del nombre de cadenes polipeptídiquesdiferents (subunitats) existents a la proteïna,
b)Ruptura dels enllaços disulfur si n’hi ha.
c) Separació i purificació de les subunitats,
d)Determinació de la composició aminoacídica de les subunitats.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
3) Organització de l’estructura completa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 24
3. Passes prèvies a la seqüenciació3.1. Determinació del nombre de subunitats
• Determinació del residu N-terminal d’una proteïna i del número de cadenes peptídiques– Dansil Clorur– Reacció de Sanger (Dinitrofluorobenzè, DNF)
• Determinació del residu C-terminal d’una proteïna.– Hidrazinòlisis (Hidrazina)– Exopeptidases
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 25
Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Dansil Clorur
N
SCl
OO
(CH3)2
+ NH2 CH C NH CH CR1 O R2 O
NH ...
Dansil Clorur
Polipèptid
OH-HCl
N
S OO
(CH3)2
NH CH
C NH
CH
C
R1 O R2 O
NH ...Polipèptid dansilat
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 26
Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Dansil Clorur
N
S OO
(CH3)2
NH CH
C NH
CH
C
R1 O R2 O
NH ...Polipèptid dansilat
H+
N
S OO
(CH3)2
NH CH
C OH
R1 O
Aminoàcid dansilat
CH
C
R2 O
OHNH3 ...+ + + CH CR3 O
OHNH3+ +
Aminoàcids lliures
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 27
CromatografCromatografííaa
Acetato n-butiloMetanolÁcido acético (75:25:2)
Ácido fórmico 2%
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 28
Cis Cys Tau
AspGlu
Ser
Gln Asn
ArgHys
Thr
HypGly
AlaProValNvaLeu+Ile
Lys Phe Met
OrnTrp
Tyr
1
2
VisualizaciVisualizacióón y n y contajecontaje
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 29
Determinació del residu N-terminal d’una proteïna.Reacció de Sanger
2,4-dinitrofluorobenzè (DNF)
F
NO2
O2N + CH CR O
NH2OH-
CH
C
R O
NH
NO2
O2N + H+
F+
DNF Aminoàcid DNF-aminoàcido
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 30
Determinació del residu C-terminal d’una proteïna.Hidrazinòlisis
ExopeptidasesExopeptidases
...Polipèptid
HN CH
C NH
CH
C
R O Rn O
O-
NH2 NH2 H++
Hidrazina
+...
CH
C
R O
NHNH2H3N+
+ H3N CH CRn O
O-
CH
C
R1 O
NHNH2H3N+
+
Derivats de Hidrazina
Residu C-terminal lliure
(Carboxipeptidasa A pancreàtica, Carboxipeptidasa Y de llevats)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 31
3. Passes prèvies a la seqüenciació3.2. Ruptura dels enllaços disulfur
H3N C COOCH2
H
SH
+ -
H3N C COOCH2
H
SH
+ -
CisteïnaCysC
Oxidació
Reducció
+ -
H3N C COOCH2
H
S
H3N C COOCH2
H
S
+ -
CistinaCis
Enllaçdisulfur + H
+2 + e-2
Àcid perfòrmicβ-mercaptoetanol
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 32
Oxidació amb Àcid perfòrmic
NH
CH
CCH2
S
NH
CH
CCH2S
O
O
H CO
OOHÀcid perfòrmic
Pont disulfur
NH
CH
CCH2SO3
O
NH
CH
CCH2
SO3O
-
-
Àcid cisteic
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 33
Oxidació amb β-mercaptoetanol
NH
CH
CCH2
S
NH
CH
CCH2S
O
O
Pont disulfur
+ SH CH2
CH2OH2( )
NH
CH
CCH2SH
O
NH
CH
CCH2
SHO
+ S CH2
CH2OHS C
H2CH2OH
NH
CH
CCH2SH
O +ICH2COO
Acetat de IodeCys
SCH2COO
NH
CH
CCH2O
+ H+ I+
Residu de δ-carboximetilcisteïna
Valoració amb acetat de Iode
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 34
3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.
Hidròlisis àcida: HCl 6 N, al buit, 10 i 100 h a 100-120ºC. Problemes amb aminoàcids alifàtics: Val, Leu i Ile, més temps
de reacció.Problemes en la cadena lateral: Ser, Thr i Tyr.Trp es destrueix quasi totalment.Gln i Asn. Glx (= Glu + Gln), Asx (= Asp + Asn) i NH4+ (= Gln
+ Asn).
Hidròlisis bàsica: NaOH 2-4 N, 100ºC durant 4-8 h.Descomponen Cys, Ser, Thr i Arg.S’utilitza per determinar el Trp.
Hidròlisis enzimàtica
Per simplificar es convenient separar y purificar les diferents cadenes polipeptídiques que constitueixen la proteïna.Hidròlisis dels enllaços peptídics
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 35
Mètode de la ninhidrina
C
CC
O
O
OH
OH+ NH2 CH
R
COOH
C
CC
O
O
H
OH+ NH3 CO2 R CHO+ +
1. Descarboxilació oxidativa dels aminoàcids i la producció de ninhidrina reduïda, amoníac y diòxido de carboni.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 36
Mètode de la ninhidrina
2. La ninhidrina reduïda reacciona amb més ninhidrina i amb elsaminoàcids alliberats.3. S’obté un complex de color blau (λmax = 570 nm).
C
CC
O
O
OH
OH+ N
H
H H C
CC
O
O
H
OH+
C
CC
O
O
C
CC
O
O
N
Aminoácido Color producido His Marrón Phe Marrón/gris Gly Azul Glu Azul brillante Lys Gris/azul Tyr Gris Pro Naranja Hyp Naranja Asp Naranja/amarillo
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 37
TLC (ninhidrina)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 38
Mètode del o-ftalaldèhid.
C
C
O
O
HH + NH2 CH
R
COOH + CH3CH2SH N CH
S CH2
CH3
COOH
R
o-Ftalaldèhid Aminoàcid -Mercaptoetanolβ
β-Mercaptoetanol: Reductor fort. pH: 9-11Producte fluorescent (excetació λ: 340 nm, emissió λ: 455 nm)Pro, Hyp tractament prèvi.Cys i Cis: oxidació a àcid cistèic.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 39
Analizador automAnalizador automáático de aminotico de aminoáácidoscidos
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 40
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüènciació.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
a)Fragmentació de les subunitats individuals en punts específics.
b)Separació i purificació dels fragments.
c) Determinació de la seqüència aminoacídica de cada un dels fragments peptídics.
d)Repetició (!!) de l’etapa 2(a) amb un procés de fragmentació d’especificitat diferent.
3) Organització de l’estructura completa.
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 41
4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.
Com a màxim fragments de 60-70 aminoàcids
Mètodes químics.Bromur de cianogen (Met)
Mètodes enzimàtics (endopeptidases).Enzims del tracte intestinal, de bactèries
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 42
Enzims
Enzim Procedència Especificitat Observacions
Tripsina Pàncreas boví Rn-1 = restes carregats positivament: Arg, Lys Rn no pot ser Pro
Molt específic
Quimotripsina Pàncreas boví Rn-1 = restes hidrofòbics voluminosos: Phe, Trp, Tyr Rn no pot ser Pro
És més lent quan Rn-1 = Asn, His, Met, leu
Elastasa Pàncreas boví Rn-1 = restes neutres petits: Ala, Gly, Ser, Val Rn no pot ser Pro
Termolisina Bacillus thermoproteolyticus
Rn-1 = Ile, Met, Phe, Trp, Tyr, Val Rn no pot ser Pro
Estable tèrmicament Rn = Ala, Asp, His, Thr
Pepsina Mucosa gàstrica bovina
Rn-1 = Leu, Phe, Trp, Tyr Rn no pot ser Pro
Poc específic, pH òptim = 2
Endopeptidasa Staphylococcus aureus
Rn-1 = Glu
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 43
Tripsina
Lys
+NH3
CH2
NH
CH
CCH2CH2
O
CH2
NH
CH
CCH2CH2
O
CH2NHCNH
NH2+
Arg
Enllaç hidrolitzat per la Tripsina
Tractament de la Lys amb anhídrid citracònic
NHCHCH2CH2CH2CH2NH3C O
+ +C
CO
CH3O
O
Lys Anhídrid citracònic
NHCHCH2CH2CH2CH2NHC O
C
OOC CH3
O
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 44
4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.
• Mètode de Sanger (dinitrofluorobenzè DNF)• Mètode d’Edman (fenilisotiocianat PITC)• Seqüenciadors automàtics
Cicle de dues etapes bàsiques:1) Reacció del pèptid amb un reactiu determinat2) Hidròlisi suau per alliberar l’aminoàcid que ha reaccionat
-
Curs Especialista Universitari en Bioinformàtica
MMèètodetode de de SangerSanger ((dinitrofluorobenzdinitrofluorobenzèè DNF).DNF).
DNF-aminoàcido 1Identificar
CH
C
R2 O
NH2 CHC
R3 O
NH
Pèptid amb n-1 aa
CH
C
R1 O
NH2 CHC
R2 O
NH
CH
C
R3 O
NH
Pèptid amb n aa
DNF-aminoàcido 2Identificar
CH
C
R3 O
NH2
Pèptid amb n-2 aa
CH
C
R1 O
OHNH
NO2
O2N
F
NO2
O2N
DNF
CH
C
R2 O
OHNH
NO2
O2N
F
NO2
O2N
DNF
-
Curs Especialista Universitari en Bioinformàtica
MMèètodetode dd’’Edman (fenilisotiocianat PITC).Edman (fenilisotiocianat PITC).
CH
C
R2 O
NH2 CHC
R3 O
NH
Pèptid amb n-1 aa
N C S + CH CR1 O
NH2 CHC
R2 O
NH
CH
C
R3 O
NH
PolipèptidFenilisotiocianat
OH-
CH
C
R1 O
NH
CH
C
R2 O
NH
CH
C
R3 O
NH
N C
S
¨ ...
...
Polipèptid Feniltiocarbamilo (PTC)
¨
HF anhidro
...+N
CS
CCHOR1
NH
Derivat de tiazolinona
H+
NC
NCCH
OR1
SAminoàcid feniltiohidantoïna (PTH)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 45
Seqüenciadors automàticsVas giratori Fase sòlida (fase gasosa)
NH2
Aminopolistireno
O SiO
OCH2
CH2
CH2
NH2
Vidre de 3-amino-propil
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 46
Seqüenciadors automàtics
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 47
2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.
1) Preparació de les proteïnes per a la seqüenciació.
2) Seqüenciació de les cadenes polipeptídiques.
3) Organització de l’estructura completa.
a)Solucionar el trencaclosques
b)Si n’hi ha esbrinament de les posicions dels enllaços disulfur
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 48
Oxidació amb β-mercaptoetanol
NH
CH
CCH2
S
NH
CH
CCH2S
O
O
Pont disulfur
+ SH CH2
CH2OH2( )
NH
CH
CCH2SH
O
NH
CH
CCH2
SHO
+ S CH2
CH2OHS C
H2CH2OH
NH
CH
CCH2SH
O +ICH2COO
Acetat de IodeCys
SCH2COO
NH
CH
CCH2O
+ H+ I+
Residu de δ-carboximetilcisteïna
Valoració amb acetat de Iode
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 49
Exemple: la Insulina (I)
Àc. perfòrmic
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 50
Exemple: la Insulina (II)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 51
Exemple: la Insulina (III)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 52
Exemple: la Insulina (IV)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 53
Métodos de secuenciación de proteínasMÉTODOS TRADICIONALES: propiedades
químicas de las proteínas
MÉTODOS ACTUALES: conocimientos del flujo de información
biológica, aplicación de nuevas técnicas de determinación químicas, …)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 54
6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.
Mètode tradicionalPurificació proteïna
Fragmentació
Seqüenciació proteïna
Seqüència proteïna
Mètode actualPurificació gen
Fragmentació
Seqüenciació ADN
Seqüència ADN
Seqüència proteïna
Codi genCodi genèètictic
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 55
6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.
Flux d’informació
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 56
6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies
Tècniques de l’ADN recombinant
Mètodes de seqüenciació molt laboriosos
Purificació de quantitats petites de proteïna (electroforèsis, HPLC).
Digestió dels fragments
Seqüenciació d’un dels pèptids purificats
Determinació de les possibles seqüències del corresponen ARNm
Amb sondes sintetitzades es “pesca” l’ARNm problema
Seqüenciació del ARNm
Deducció de la seqüència de la proteïna
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 57
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de purificación de los mRNA
(librerias de cDNA)
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 58
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos químicos
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 59
Métodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos automáticos
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 60
Nuevas estrategias de secuenciación de proteínasMétodos de caracterización de proteínas, la proteómica
• Electroforesis bidimensional (2D)– Comparación de geles: tratamiento de imágenes
• Determinación de la secuencia de peptidos por MS– MALDI-TOF– MALDI-MS-PMF
• Separación de proteínas por LC y determinación por MS O MS/MS
– LC/MS-ESI– nanoLC-ESI-MS/MS
http://www.proteome-factory.de/
http://uk.eurogentec.com
http://www.proteome-factory.de/http://uk.eurogentec.com/http://www.proteome-factory.de/http://uk.eurogentec.com/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 61
Electroforesis 2D
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 62
Electroforesis 2D
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 63
LC-MS-MS
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 64
Nuevas estrategias de la Biología Molecular:Genómica y Proteómica
• Genómica:– Todos los genes de un organismo
• Proteómica– Todas las proteínas expresadas por el genoma de
un organismo
– Genes expresados en un momento dado y unacélula determinada
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 65
‘In silico’Bases de datos de secuencias de ADN
Localización de genes
Secuencia de proteína
Codi genCodi genèètictic
Kazusa DNA Research Institute EXPASY
http://www.kazusa.or.jp/ja2003/english/index.htmlhttp://us.expasy.org/http://us.expasy.org/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 66
Investigaciones ‘in silico’
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 67
Tamaño del genoma y número de proteínas
Organismo Tamaño genoma (pb) Número de genes
M. genitalium 5,8 x 105 480
E. coli 4,2 x 106 4.300
S. cerevisiae 1,3 x 107 6.000
D. melanogaster 1,8 x 108 14.000
C. elegans 1,0 x 108 19.000
A. thaliana 1,0 x 108 25.000
H. sapiens 3,3 x 109 30.000-40.000
O. sativa 4,2 x 108 45.000
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 68
De secuencia de ácidos nucleicos a secuencia de genes: estimación a partir de Human Genome Project
• Por software (Genscan, Grail, etc.)
http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
http://genes.mit.edu/GENSCAN.html
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 69
De secuencia de ácidos nucleicos a secuencia de genes: estimación a partir de Human Genome Project
• Por software (Genscan, Grail, etc.)
• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)– 70.000 genes
http://www.sagenet.org/
http://www.sagenet.org/
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 70
De secuencia de ácidos nucleicos a secuencia de genes: estimación a partir de Human Genome Project
• Por software (Genscan, Grail, etc.)
• Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)– 70.000 genes
• Human Genome Sciences deducido de cDNA– 100.000 genes
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 71
De secuencia de secuencia de gen a secuencia de proteína:
Procesos que incrementan la variabilidad proteica, estructural y funcional:
Genoma x10 o x100 == Proteoma30.000-40.000 genes == 1.000.000 proteínas
• Promotores alternativos (10%)(neurexinas, c-myc, IGF II, etc.)
• Sitios de poliadenilación alternativos (33%, máx. X4)(calcitonina y CGRP)
• Ayuste alternativo (50%, normalmente x3, máx. x100 o x1000)
• Edición del mRNA (2%, difícil puede confundirse con SNP)– (COX II de tripanosoma cerca del 50% del mRNA no es genómico)
• Cambio de marco de traducción (Frameshifting)
• Modificaciones post-traduccionales
-
Curs d’Especialista Universitari en Bioinformàtica. Febrer 2007 72
Módulo 8.
Módulo 8.1. Secuenciación de proteínas
Módulo 8.2. Análisis de secuencias de proteínas
Módulo 8.3. Estructura tridimensional de proteínas y otrasmacromoléculas (Núria Centeno, IMIM)
Módulo 8.4. Visualización de estructuras de proteínas y macromoléculas (Isabel Lladó)
Módulo 8.5. Predicción de la estructura tridimensional de proteínas (Michael Tress, CNB)
Módulo 8.6. Interacciones moleculares y macromoleculares (Ferrà Sanz, IMIM)
Mòdul 8.1. Seqüenciació de proteïnes.�Mètodes de determinació de l’estructura primària de proteïnes. ¿Qué información queremos saber de las proteínas?Métodos de secuenciación de proteínasSeqüenciació i microseqüenciació de proteïnes1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.1.1. Generalitats i aproximació històrica a la seqüenciació de proteïnes.1.2. L’enllaç peptídic. Estructura primària de les proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.Cromatografia de cribatge molecularCromatografia de intercanvi iònic2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes3. Passes prèvies a la seqüenciació�3.1. Determinació del nombre de subunitatsDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Dansil ClorurDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Dansil ClorurDeterminació del residu N-terminal d’una proteïna.�Reacció de SangerDeterminació del residu C-terminal d’una proteïna.�Hidrazinòlisis3. Passes prèvies a la seqüenciació�3.2. Ruptura dels enllaços disulfur Oxidació amb Àcid perfòrmicOxidació amb b-mercaptoetanol3.3. Anàlisis de la composició en aminoàcids.Mètode de la ninhidrinaMètode de la ninhidrinaMètode del o-ftalaldèhid.2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.4. Mètodes de seqüenciació de pèptids.�4.1. Mètodes de fragmentació de proteïnes.EnzimsTripsina4.2. Mètodes de determinació de la seqüència de pèptids.Seqüenciadors automàticsSeqüenciadors automàtics2. Etapes de la seqüenciació de proteïnes.Oxidació amb b-mercaptoetanolExemple: la Insulina (I)Exemple: la Insulina (II)Exemple: la Insulina (III)Exemple: la Insulina (IV)Métodos de secuenciación de proteínas6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègies.6. Microseqüenciació de proteïnes. Noves estratègiesMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosMétodos de secuenciación de ácidos nucleicosNuevas estrategias de secuenciación de proteínasElectroforesis 2DElectroforesis 2DLC-MS-MSNuevas estrategias de la Biología Molecular:�Genómica y Proteómica‘In silico’Tamaño del genoma y número de proteínasMódulo 8.sec_prot2_print.pdfMètode de Sanger (dinitrofluorobenzè DNF).Mètode d’Edman (fenilisotiocianat PITC).