Implicaiile bacteriofagilor n utilizarea culturilor starter

Bacteriofagii (fagii) sunt virusuri patogene pentru bacterii. Genomul lor poate fi constituit din ADN sau ARN. Exist 6 tipuri morfologice de bacteriofagi:bacteriofagi cu coad lung contractil;bacteriofagi cu coad lung necontractil;bacteriofagi cu coad scurt;bacteriofagi fr coad cu capsomere mari la coluri;bacteriofagi fr coad cu capsomere mici la coluri;bacteriofagi fr cap.

Genomul fagic ADNss/ ds sau ARNss /ARNds

Electronomicrografia a Lactobacillus casei Siphovirus A2 i Lactobacillus plantarum Myovirus LP65 (www.thebacteriophages.org )

Tipul morfologic de bacteriofag cu coad lung contractil prezint cea mai complex structur i este alctuit din urmtoarele elemente constitutive: capul la care capsida este de tip icozaedral i adpostete genomul reprezentat de o molecul de ADN dublucatenar; coada bacteriofagului este alctuit din teaca cozii care are structur identic cu o capsid de tip helicoidal i smburele cozii sau cilindrul axial. Teaca cozii n stare necontractat are o lungime de circa 800, iar n urma contraciei prin alunecarea spirelor componente ale capsidei helicoidale, lungimea tecii se reduce la jumtae. ntre cap i coad exist un guler cu form de disc hexagonal, iar coada se termin cu aparatul de fixare. Aparatul de fixare este alctuit dintr-o plac terminal (un disc hexagonal similar gulerului) care prezint 6 croete dispuse la coluri i fibrele cozii de natur proteic. Aparatul de fixare conine lizine fagice (enzime capabile s permeabilizeze peretele celulei bacteriene).

Morfotipuri de fagi activi fata de LAB

Fagul cu coad lung contractilCap (Guler ntre cap i coad)CoadaAparatul de fixare-Placa terminal -disc hexagonal-Croete (6)-Fibrele cozii (6)

Obtinerea de culturi starter rezistente la fagi Fixarea fagilor pe Lactococcus

Sensibilitatea la ac. fagilorFixarea bacteriofagului se realizeaz numai pe anumite bacterii sensibile. Sensibilitatea unei bacterii pentru un anumit tip de bacteriofag este condiionat de prezena pe suprafaa nveliului bacterian a unor receptori specifici. Bacteriofagul se fixeaz pe celula bacterian prin intermediul aparatului de fixare, dup care elibereaz lizinele care perforeaz peretele bacterian i apoi prin contracia cozii injecteaz n citoplasma bacterian genomul fagic, prin canalul central al cozii.

Cicluri de replicare

Exist 2 cicluri de replicare ntlnite la bacteriofagi:ciclul litic sau productiv- cnd genomul fagic substituie genomul bacterian, sub form de virus vegetativ, care dirijeaz activitatea celular n sensul producerii de noi virioni.;ciclul lizogenizant sau reductiv-integrarea genomului fagic n genomul bacterian. Acest fenomen poart denumirea de lizogenie, iar populaia bacterian la care s-a produs acest fenomen se numete lizogen (determin liz ntr-o populaie bacterian sensibil, cu care vine n contact). Capacitatea populaiilor lizogene de a induce liz ntr-o populaie sensibil este datorat faptului c ntr-o populaie lizogen, genomul fagic nu se integreaz n 100% din celulele bacteriene, ci ntr-un mic numr de bacterii fagul se multuiplic i virionii progeni sunt eliberai prin liz celular.

Conversia fagicaTulpinile bacteriene lizogene sunt imune la infecia cu acelai bacteriofag. Populaiile bacteriene care au integrat genomul capt proprieti noi. Acest fenomen este cunoscut sub denumirea de conversie fagic sau lizogen. Caracterele induse prin conversie fagic pot fi: toxinogeneza (ex. Corynebacterium diphteriae), schimbarea structurii antigenice (Salmonella typhi), amplificarea ratei de sporogenez (Bacillus anthracis) etc.

n cadrul ciclului lizogenizant, la un moment dat, datorit aciunii unor factori stresani :-temperatur, -modificarea concentraiei anumitor ioni n mediu- calciu), -echilibrul bacteriofag-bacterie se rupe, genomul fagic se desprinde din cromozomul bacterian i se declaneaz ciclul litic, cu replicarea bacteriofagilor, eliberarea acestora prin liz celular i infectarea altor celule bacteriene. n momentul desprinderii genomului fagic, pot fi preluate anumite gene din cromozom, care vor fi transferate unor noi celule bacteriene. Fenomenul este cunoscut sub denumirea de transducie, iar fagii sunt numii fagi transductani. Transducia poate fi:Transducia generalizat- situaie cnd orice gen poate fi transferat i Transducia specializat- atunci cnd sunt transferate numai gene situate n vecintatea locusului de integrare a genomului fagic n cromozomul bacterian.

Integration by site-specific recombination, between the attP site of the phage and the attB site of the host. The two circular molecules form a cointegrate, with junction points attL (left prophage end) and attR (right prophage end). Integration is carried out by a phage-coded protein, integrase. In many phages (including ), the reverse reaction (excision) frequently requires a second phage-coded protein, excisonase. Host proteins contributing to the reaction are not shown.

Incidena fagilor n ind. lapteluin industria laptelui, incidena bacteriofagior n culturile lactice este influenat de anumii factori: prezena n mediul de cultur a ionilor de calciu (n lapte se adaug CaCl2 pentru favorizarea coagulrii laptelui), rezistena lor la pasteurizare (rezist la temperaturi de 70-75C, timp de 30 minute), pH (intervalul de pH la care pot aciona este cuprins ntre 4,5 i 8,0). n ceea ce privete termorezistena fagilor specifici lactococilor, se considera, c temperatura de 85C, timp de 15 minute, este eficient fa de aceti fagi. Totui, unii fagi au rezistat timp de 5 minute n zer (pH 6,0) sau 2 ore (n stare uscat) la 90-95C. Din acest motiv se recomand, pentru siguran un tratament termic la 95C, timp de 10 minute. Deoarece fagii n stare uscat sunt mai termorezisteni, se impune splarea corespunztoare a recipientelor utilizate pentru culturile starter, nainte de sterilizare.

Sursele de contaminare cu fagi sunt reprezentate de: aerul din spaiile de prelucrare, zerul care uneori, din neglijen se prelinge pe pardoseal, bidoane, instrumentarul utilizat la prelucrare. Uneori chiar culturile starter pot fi contaminate cu fagi, sub form de profagi (integrai n genomul bacterian).Masuri pentru prevenirea contaminrii culturilor sau laptelui cu bacteriofagi: curenia i dezinfecia spaiilor i utilajelor, utilizarea lmpilor bactericide cu UV pentru strelizarea spaiilor, ventilaia aerului, utilizarea mediilor speciale pentru culturi starter, folosirea de culturi starter mixte i nlocuirea la maxim 10 zile a culturilor starter reprezentate de o singur specie microbian, utilizarea de separatoare diferite pentru laptele crud i zer, evitarea prelingerii zerului pe pardoseli, folosirea de bidoane diferite pentru lapte i zer.

Enzime fagiceEnzimele fagice au fost desemnate cu diferite denumiri: lizozim fagic, endolizin, lizozim, lizin, lizin fagic, muralizin, muramidaz i virolizin. Unele denumiri sunt inspirate de substratul specific al acestor enzime.Toate lizinele fagice se caracterizeaz prin capacitatea de a hidroliza specific legturile de la nivelul peptidoglicanului din peretele celular bacterian. Aceste enzime pot fi: gluozaminidaze care hidrolizeaz legturile glucozidice dintre glucozaminele din structura peptidoglicanului, amidaze care cliveaz legturile dintre componenta glicanic i peptide sau endopeptidaze care hidrolizeaz legturile inerpeptidice.

Factorii care influeneaz activitatea lizinelor fagice

Efectul cationilor-Lizinele elaborate de fagii specifici pentru lactococi, ca i cele ale fagilor patogeni pentru alte bacterii lactice, sunt activate de cationii monovaleni ct i de cei bivaleni. Activitatea litic maxim s-a nregistrat la o concentraie de 0,1M a ionilor de sodiu sau potasiu. Concentraia sodiului sau potasiului peste 1M a redus activitatea i stoparea a activitii litice s-a observat la o concentraie de 3,5 i respectiv 8 mM a ionilor de Mn2+, Ca2+ i Co2+. Completa inhibare a activitii litice s-a constatat la o concentraie de 30mM Co2+ . Mg2+ a indus o activitate litic maxim la o concentraie de 5mM. Spre deosebire de cationi, anionii au o influen redus fa de activitatea litic.

Sensibilitatea fagilor i lizinelor la inactivarea termic-Lizinele fagice i n special cele ale fagilor specifici lactococilor, sunt mult mai sensibile la inactivarea termic, dect fagii. n cazul lizinei C2 (W), s-a constatat inactivarea rapid n tampon la 47C, pe cnd virusul a prezentat modificri reduse ale titrului la 60C.Condiii optime de temperatur i pH pentru activitatea litic-Lizinele specifice pentru lactococi manifest o activitate litic optim la pH ntre 6-7 si la 37C.Influena factorilor reductori-:izinele fagice necesit pentru activitatea lor litic gruparea sulfhidril (SH-).

Actiunea unor dezinfectante fata de fagii specifici lactococilor

Actiunea unor dezinfectante

Concluzii:

hipocloritul manifest o puternic aciune antiviral. n cazul formaldehidei sunt necesare doze ridicate, eficiena alcoolului este limitat. Totui, avnd n vedere efectul corosiv al hipocloritului se recomand utilizarea unor compui organici pe baza de clor acidul dicloroizocianuric care este la fel de eficient, ns mai puin corosiv dect hipocloritul). Compuii cuaternari de amoniu sunt mai puin eficieni, iar iodoforii care sunt mai activi, prezint dezavantajul c pteaz suprafeele.