CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATÓGENOS VIABLES
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TEMA 10
CULTIVO Y AISLAMIENTO DE PATÓGENOS VIABLES
ÍNDICE DE CONTENIDOS
IntroducciónPreparación de medios artificiales
Condiciones para el aislamiento de patógenos
Microorganismos y oxígeno
Incubación en condiciones anaerobias
Incubación de microorganismos capnófilos
Temperatura de incubación, pH, humedad
Medios artificiales. Ejemplos.
Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento)
Medios de enriquecimiento
Medios selectivos
Medios diferenciales
Medios cromogénicos
Cultivo de patógenos intracelulares obligados
Introducción
� Regla de oro de la microbiología
Muestra
Cultivo y aislamiento de microorganismos
Cultivo puro
identificación
Realización pruebas susceptibilidad
Etapa limitante en la rapidez del diagnóstico microbiológico
Medios de cultivo
� Qué es un medio de cultivo
�Medios deshidratados
�Cientos de formulaciones
�Empresas del sector farmacéutico �Empresas del sector farmacéutico dedicadas a la producción y control de calidad de los medios
�Placas de petri y tubos con todos los medios necesarios
EXISTEN CIENTOS DE FORMULACIONES DISPONILES EN EL
MERCADOMERCADO
Preparación de medios de cultivo artificiales
� Preparación� Esterilización
� Autoclave� Tindalización� FiltraciónLuz UV� Luz UV
� Estufas a 180 ºC� Óxido de etileno
� Adición de sustancias termolábiles� Vertido en placas de petri (medios sólidos) o tubos (medios líquidos o medios sólidos)
Condiciones para el desarrollo de patógenos
� Medio de cultivo � No exigentes (nutrientes (C, N, S, P) sales, tampón)� Exigentes (ídem. + sustancias complejas (sangre, suero, huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas)
� Condiciones ambientales adecuadasAtmósfera adecuada� Atmósfera adecuada
� Temperatura adecuada� Humedad� Tiempo de incubación� pH� Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento
Relaciones de los microorganimos con el oxígeno
� Aerobios � Anaerobios facultativos
� Anaerobios� Estufas para anaerobios� Bolsas para anaerobios (generan H2 y CO2) (Gas-Pak)
Microaerófilos� Microaerófilos� Frascos con vela� Agar semisólido
� Capnófilos� Atmósfera de CO2
� Sistemas Gas Pak, Bio Bag (bicarbonato y ácidos)
� Utilización de estufas de CO2
Sistemas para anaerobiosis
Sistemas para incubación de microorganismos capnófilos
Jarra con vela
Estufas CO2
Sistemas Biobag, Gas Pak (bicarbonato y ácidos)
� Temperatura de incubación� 35-37 ºC� 30 ºC
� Otras temperaturas� Elevadas (42 ºC)Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío
CONDICIONES DE INCUBACIÓN
� Bajas (4ºC) enriquecimiento en frío� Intermedias (22 ºC)
� Tiempo de incubación
� pH
Clasificación de los medios de cultivo
� Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento y medios enriquecidos)
� Medios de enriquecimiento
� Medios diferenciales
� Medios selectivos
� Medios cromogénicos
Ejemplos de medios de aislamiento primario o medios de crecimiento y medios enriquecidos
� Agar nutritivo � Agar infusión de cerebro y corazón (BHIA)� Agar triptona soja (TSA)� Agar sangreAgar chocolate� Agar chocolate
� Agar CLED (urocultivo)� Agar de Múeller-Hinton� Caldo de carne picada� Caldo tioglicolato
Agar BHIA (Infusión de cerebro y corazón )
Componentes
Extracto de cerebro
Extracto de corazón
Peptona
Dextrosa
Cantidad
7,8 g/l
9,7 g/l
10 g/l
2 g/l
Propiedad
Fuente de nutrientes
Fuente de nutrientes
Fuente de proteínas
Hidrato de carbono
Tampón fosfato
NaCl
Agar
2,5 g/l
5 g/l
15 g/l
Regulación pH
Sales
Agente solidificante
Objetivo
Medio rico, no selectivo, permite crecimiento de la mayoría de microorganismos no exigentes
Ausencia de agentes inhibidores
CLED (cistina-lactosa-deficiente en electrolitos
Componentes Cantidad
Digerido pancreático de gelatina 4 g/L
Digerido pancreático de caseína 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/LL-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar 15 g/L
Medio rico y selectivo
Específico para urocultivo
Deficiencia de electrolitos inhibe la movilidad de Proteus
Agar sangre� Triptona� Hidratos de carbono� NaCl� Tampón
Características y usos de algunos medios más frecuentemente utilizados
� Agar� 5% sangre desfibrinada
Medio enriquecido y selectivoMedio enriquecido y selectivo
Permite ver distintos tipos de hemolisis, es diferencial
Recuento de patógenos mediante la técnica de estría en placa
También se utiliza para cuantificación de resultados:
Estimación del número de microorganismos en la muestra microorganismos en la muestra original en función del crecimiento:
Crecimiento escaso
Crecimiento moderado
Crecimiento abundante
Recuento de patógenos mediante el uso del asa calibrada (u.f.c.)
Y también se utiliza para recuento de microorganismos mediante siembra con asa calibrada, recuento de unidades formadoras de colonias por mililito (u.f.c./mL)
Caldo con carne picada para cultivo de anaerobios
� Es un medio rico , pero es un caldo, un medio líquido
� Caldo con carne picada fuente de proteínas y nutrientes, potencial redox proteínas y nutrientes, potencial redox bajo (ambiente reductor)
� Añadido o no de glucosa
� Anaerobios (parafina líquida)
Ejemplos de caldos de enriquecimiento
Son medios líquidos que llevan una concentración baja de agentes inhibidores
Retrasan el crecimiento de los microorganismos comensales de la microbiota
Permiten enriquecer la muestra en un determinado patógeno que era menos abundante respecto al resto de la microbiota
� Caldo selenito Salmonella� Caldo tetrationato Salmonella y Shigella� Caldo Gram negativos Salmonella y Shigella
� Subcultivar en medios más selectivos al cabo de 6-8 horas
Caldo selenito
Componentes
Peptona
Lactosa
Selenito de sodio
Cantidad
5 g/l
4 g/l
4 g/l
Propiedad
Fuente de proteínas
Hidrato de carbono
Agente inhibidor de la mayoría de Enterobacterias, incluyendo muchas especies de Shigella
Fosfato de sodio 10 g/lTampón
Objetivo
Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio más selectivo (agar SS o agar sulfito de bismuto)
Medios selectivos
� Llevan una concentración alta de agentes inhibidores
� Permiten crecer a unos microorganismos pero inhiben el crecimiento de otros
� Los agentes inhibidores son sustancias de diferente naturaleza química
Agentes inhibidores: colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina), antibióticos, metales (Se, Bi), sales biliares, azida, alcoholes (alcohol feniletílico), cloruro sódico a alta concentración
Ejemplos de medios selectivos
� Moderadamente selectivos� MacConkey� EMB
� Altamente selectivos� Agar salino manitol Staphylococcus
� Medio SS Salmonella y Shigella� Medio SS Salmonella y Shigella� Agar Hektoen Salmonella y Shigella� Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella� Agar xylosa-lisina-dexosicolato Salmolella y Shigella
� Agar PEA Gram positivos
� Agar Columbia CNA Gram positivos
Agar MacConkey
Componentes
Peptona
Polipeptona
Lactosa
Sales biliares (conc. moderada)
Cantidad
17 g/l
3 g/l
10 g/l
1,5 g/l
Propiedad
Fuente de proteínas
Fuente de proteínas
Azúcar fermentable
Inhibidor de gram positivos
Cristal violeta
NaCl
Rojo neutro
Agar
0,001 g/l
5 g/l
13,5 g/l
Inhibidor de gram positivos
sales
Indicador de pH
Agente solidificante
Objetivo
Aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de la lactosa
Diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y no fermentadores de lactosa
Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa
Agar MacConkey
No patógenos (E. coli, Klebsiella, Citrobacter)
Colonias transparentes
No fermentan la lactosa
Patógenos (Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Yersinia,
Proteus)
Agar entérico Hektoen
Componentes
Peptona
Extracto de levadura
Sales biliares (alta conc.)
Lactosa
Sacarosa
Cantidad
12 g/l
3 g/l
9 g/l
12 g/l
12 g/l
Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N
Inhibidor de gram positivos
Azúcar fermentable
Azúcar fermentableSacarosa
NaCl
Tiosulfato de sodio
Citrato férrico amónico
Azul de timol
Agar
12 g/l
5 g/l
5 g/l
1,5 g/l
0,04 g/l
14 g/l
Azúcar fermentable
Sales
Fuente de azufre e inhibidor
Producción sulfuro Salmonella/ inhibidor
Indicador de pH
Agente solidificante
Objetivo: Aislamiento y diferenciación de especies de Salmonella y Shigella de otros bacilos entéricos gram negativos en muestras fecales
Propiedades diferenciales del medio Agar entérico Hektoen
Los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se ven amarillas. Los no fermentadores se ven incoloros. Salmonella tiene un punto negro central por la producción de sulfuro. La mayoría de las especies de Shigella no producen sulfuro.
Medio agar salino manitol (agar de Chapman)
� Agente inhibidor
� NaCl al 7,5% sólo crecen Staphylococcus y Microccocus
� Incluye manitol y rojo fenol como � Incluye manitol y rojo fenol como indicador (medio diferencial)
� Los microorganismos que fermentan el manitol se observan como colonias amarillas
� Los que no fermentan el manitol se observan blancos o del color del medio
Componentes
Extracto de carne
Triptosa
Feniletanol
Cloruro de sodio
Cantidad
3 g/L
10 g/L
2,5 g/L
5 g/L
Propiedad
Fuente de C y N
Fuente de N
Inhibidor de Gram negativos
Estabilizador osmótico
Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
Cloruro de sodio
Agar
5 g/L
15 g/L
Estabilizador osmótico
Agente solidificante
Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente
estafilococos y estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota
mixta. La adición de alcohol fenil etílico inhibe o reduce drásticamente el
crecimiento de bacterias Gram negativas porque inhibe la síntesis de ADN.
Además, previene la proliferación de colonias invasivas tipo “swarming”.
El alcohol fenil etílico es un antimicrobiano, antiséptico y desinfectante que
también se utiliza como esencia aromática y preservativo en farmacia y
perfumería. Las placas de este medio recién preparadas huelen a rosas.
Agar Alcohol Feniletílico (PEA)
Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se
convierte en un excelente medio para el aislamiento de bacterias
anaerobias presentes en muestras clínicas donde hay una
microbiota abundante y heterogénea que contiene bacterias Gram
negativas de crecimiento rápido tal como Proteus.
Medios diferenciales
Permiten distinguir entre bacterias diferentes en base a un comportamiento bioquímico (p.e., fermentación o no de la lactosa, fermentación del manitol, producción o no de sulfuro, distintos tipos de hemolisis, etc.).
Pueden ser, a su vez, ricos, enriquecidos o selectivos
Ejemplos de medios diferenciales
� MacConkey (moderadamente selectivo y diferencial)� EMB (moderadamente selectivo y diferencial)� Agar CLED (no selectivo, medio rico y diferencial)� Agar sangre (no selectivo, medio enriquecido y diferencial)� SM, SS, HE, XLD (altamente selectivos y diferenciales)
� Agar sangre, CLED
� Agar XLD,EMB, MacConkey;SS; HE; ADC
� Agar SM
Medios cromogénicos
Medios diferenciales
Incorporan sustancias cromogénicas
Detección de actividades enzimáticas características
de determinados géneros o especies de bacterias
β- galactosidasa
β- glucosidasa
β- glucuronidasa
Producción de un color característico identificación
ONPG ONP + galactosa
Incoloro amarillo
β- galactosidasa
Ejemplos de medios cromogénicos
� CPS ID3� Chromogenic UTI (infecciones tracto urinario)� ChromAgar Orientation� UriSelect 4 (urocultivos)
� Identificación bacterias en infecciones urinarias� Tres tipos de enzimas� Se puede añadir triptófano (prueba del indol o TDA) se incrementa el número de microorganismos que se pueden identificar
Medios diferenciales cromogénicos para la identificación de bacterias en muestras de orina
E. coli Klebsiella pneumoniaeE. coli
Enterococcus faecalis
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Un ejemplo de medio cromogénico
ChromAgar Candida
Permite diferenciar e
MEDIOS CROMOGÉNICOS PARA LEVADURAS
Permite diferenciar e identificar tres especies de este género (colonias verdes, azules y transparentes)
Medios específicos
BCYE (agar tamponado con carbón
y extracto de levadura) Legionella
Bordet-Gengou Bordetella pertussis
Regan-Lowe Bordetella pertussis
Thayer-Martin Neisseria meningitidis y N. gonorrhoeae
New York City Neisseria gonorrhoeae y micoplasmas
genitales
Lowestein-Jensen Mycobacterium tuberculosis
CIN (cefsulodina-irgasán-novobiocina) Yersinia
TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) Vibrio cholerae
Pico de flauta de Loeffler Corynebacterium difteriae
Diamond Trichomonas vaginalis
Sabouraud Hongos
CCF, CCYE Clostridium difficile
Patógenos intracelulares obligados
� Crecen sólo dentro de las células� No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo� Treponema pallidum
Mycobacterium leprae
No se pueden cultivar en medios artificiales� Mycobacterium leprae
� (Legionella pneumophila BCYE)
� Cultivos de tejidos en el laboratorio
en medios artificiales
Cultivos celulares
� Cultivos primarios nº Cromosomas=2n� Células de riñón� Fibroblastos
� Líneas celulares continuas aberraciones en el nº de cromosomas aneuploidíael nº de cromosomas aneuploidía
� Hep-2, HeLa, Vero efecto citopático de latoxina de Clostridiumdifficile
� McCoy Clamidias� A-549, RD, MDCK Virus