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5 OBTENCIÓN DE PATRONES O PLANTAS COMPLETAS POR MEDIO DE CULTIVO DE TEJIDOS “in vitro”.

5.1 Definición.

La técnica de cultivo de vegetales “in vitro” consiste, muy esquemáticamente, en el cultivo dirigido de porciones de tejido ( células aisladas u otras estructuras, tales como granos de polen, embriones, meristemos, etc. ) en condiciones asépticas y en ambientales controladas. Esto significa que hay que proporcionar al explanto ( estructura o porción del vegetal que se introduce en los recipientes de cultivo ) objeto del cultivo una serie de condiciones que aseguren el éxito de la operación, entre las que cabe destacar:

Un medio de cultivo adecuado, que proporcione a dicho explanto los nutrientes y metabolitos que la planta madre le suministraría.

Unas condiciones de asépsia adecuadas, que aseguren la no contaminación del medio de cultivo durante el cultivo.

Unas condiciones ambientales ( temperatura, iluminación y fotoperiodo ) que promuevan el desarrollo de los explantos.

Unas buenas condiciones para la aclimatación de las plantas obtenidas para su posterior crianza en condiciones más o menos “normales “.

De todas las fases del cultivo, la menos espectacular pero la más importante es la última, ya que significa el paso de condiciones más que óptimas a otras más “duras”.

5.2 Instalaciones necesarias.Un vivero ( o parte de un vivero ) que se dedique a la obtención de plantas “in vitro” suele constar

de las siguientes instalaciones: Oficinas, para el control administrativo. Almacén de utensilios y materias primas. Cocina, donde se preparan los medios de cultivo. Sala de siembra. Sala de cultivo. Invernaderos, para la aclimatación de las plantas.Vamos a describir estas instalaciones y los detalles correspondientes.

5.2.1 Medios de cultivo:Los medios de cultivo se componen de: Sales minerales; macro y microelementos, dosificados en diferentes proporciones, pero siempre

asegurando su correcta disolución y asimilabilidad. Hidratos de Carbono, como fuente de energía, fácilmente asimilable. Se suele usar Sacarosa

y/o Glucosa. Vitaminas hidrosolubles, tales como Ácido Ascórbico, Ácido Nicotínico, etc. Y otras, como el

Sorbitol, de efectos antioxidantes. Hormonas de los grupos Auxína, Giberelinas y Citoquininas. Esta se dosifican en diferentes

equilibrios, según la dirección que queramos en que se desarrolle el cultivo. Concretamente: La Auxina promueve la formación de callos. Las Giberelinas favorecen el alargamiento de brotes. Las Citoquininas diferencian nuevos brotes.

El medio de cultivo se gelifica usando, normalmente, Agar.Estos medios de cultivo se preparan en la “cocina”, lugar del laboratorio dotada de los

elementos necesarios. La preparación de los medios se hace según una “receta”: Dilución de la sales minerales, a partir de soluciones madre previamente preparadas y

conservadas en cámaras frigoríficas, con agua bidestilada. Adición, en frío, de: Hidratos de Carbono, Vitaminas y Hormonas, por este orden. Comprobación y ajuste, en su caso, del pH del medio, con Ácido Clorhídrico o Hidróxido

Potásico ( 1 N ) hasta alcanzar valores de 5,0-5,5. Calentamiento de las soluciones hasta 45-50 ºC y adición del Agar, hasta que desaparece la

turbidez.Una vez preparadas, y todavía en caliente, se reparte en los recipientes de cultivo, que

pueden ser de vidrio o de plástico termoestable. En viveros comerciales se emplean francos de

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vidrio de los usados por la industria conservera mientras que en laboratorios de investigación es frecuente el uso de tubos de ensayo de vidrio especial.

5.2.2 Condiciones de asépsia:Los medios de cultivo son, además de idóneos para el desarrollo de los explantos, óptimos para el

desarrollo de patógenos ( Bacterias y Hongos ), por lo que hay que asegurar su ausencia en el interior de los frascos, en el propio explanto, así como en los utensilios que se emplean en la manipulación de los mismos.

Para resolver este problema se recurre a las siguientes soluciones: Esterilización, en autoclave, de los medios de cultivo, una vez entubados. Se suelen utilizar

temperaturas de 120-121 ºC, durante 10-15 minutos. Este calentamiento degrada las vitaminas y hormonas. Cuando es imprescindible el uso de sustancias muy termolábiles, como el AIA, se añaden a los medios de cultivo cuando están a punto de gelificarse mediante microfiltros microbianos.

Desinfección del material vegetal: cuando se hacen cultivos sucesivos, procedentes de cultivos anteriores no es preciso desinfectarlos, pero cuando se inicia un cultivo, a partir de plantas cultivadas en condiciones normales ( aíre libre o invernadero ) es necesario desinfectar la superficie del material ( brotes, por ejemplo ), para lo cual se usa Hipoclorito Cálcico o Sódico o Cloruro de Mercurio ( solo para semillas ). Una vez mantenidos durante 15-20 minutos en soluciones de estos productos se lavan tres veces con agua bidestilada previamente esterilizada , para eliminar restos de los mismos.

Asépsia durante la manipulación: con las precauciones anteriormente descritas tendremos tanto en interior de los frascos de cultivo como el material suficientemente limpio. Pero como durante las operaciones de siembra, troceado, repicados, etc. pueden producirse contaminaciones ( procedentes del aíre, ropas, etc. ) dichas operaciones hay que realizarlas en unas salas especiales ( salas de siembra ) en las cuales: Se realizan desinfecciones periódicas con lejía en techos, paredes y suelos. Antes de comenzar el trabajo se desinfectan con tubos fluorescentes de rayos UVA

germicidas. El personal utiliza ropas y calzado esterilizado. La manipulación se realiza en mesas de cultivo de flujo laminar. Los utensilios ( pinzas, escalpelos, etc. ) se esterilizan y flamean antes de ponerse en

contacto con los explantos.

5.2.3 Condiciones ambientales:En las cámaras de cultivo, donde se introducen los frascos una vez “sembrados”, consisten en

habitaciones aisladas térmicamente, más o menos grandes, según la cantidad de material a cultivar, dotadas de los siguientes elementos:

Estanterías para la colocación de los frascos. Equipo de climatización, frío-calor, capaz de mantener durante todo el año temperaturas del

orden de 25 ºC. Baterías de iluminación, a base de tubos fluorescentes de luz blanca o del tipo Growth Lux,

dispuestos en cantidad, separación y altura suficientes para asegurar una iluminación homogénea de intensidades entre 2.000 y 4.000 luxes.

Programadores para efectuar un fotoperiodo intermitente; normalmente se utilizan ciclos de 16/8 horas de luz-oscuridad.

En estas condiciones, un ciclo de cultivo suele durar alrededor de 30 días, durante los cuales los explantos habrán evolucionado y están en condiciones de iniciar otro nuevo ciclo, debiendo ser repicados a un medio fresco o bien pueden conservarse durante semanas en frigorífico, si no interesa seguir en este momento con el cultivo.

5.2.4 Condiciones para la aclimatación:Si el paso de las condiciones de cultivo dentro de las cámaras a las de campo no son graduales para

que las nuevas plantas se vayan aclimatando poco a poco, las pérdidas son elevadísimas y ponen en peligro el éxito técnico y económico del vivero. Esta aclimatación supone:

Para evitar contaminaciones posteriores a las nuevas plantas se les eliminan los restos del medio de cultivo, lavándolas en agua corriente.

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Se dan tratamientos preventivos contra bacterias y hongos, sumergiéndolas plantas en soluciones fungicidas y/o con estreptomicina.

Se usan substratos esterilizados en autoclave o por medio de vapor de agua. Se utilizan recipientes nuevos que, en el caso de que sean bandejas multipot de plástico

termoformado, al haber sido fabricadas en caliente, suelen estar limpias. No obstante, se pueden lavar previamente con lejía.

El paso de las condiciones de iluminación en las cámaras de cultivo ( iluminaciones bastante bajas ) a las normales de los climas mediterráneos ( muy altas ) se hace utilizando mallas de sombreo de porcentajes altos ( 80-90 % de sombra ) que se van retirando gradualmente a medida que se avanzando el periodo de endurecimiento.

El paso de las condiciones térmicas iniciales a las del interior de un invernadero ( con saltos térmicos diarios importantes ) se consigue con el uso de calefacción, normalmente basal.

Por último, para pasar de las condiciones de humedad del interior de los frascos ( cercanas al 100% ) a las del aíre más o menos libre se utilizan túneles de plástico, el cual se va retirando poco a poco, para que las plantas se vayan acostumbrando.

La utilidad de las técnicas de cultivo “in vitro” es múltiple. Tan solo citaremos las que pueden resultar de interés práctico en viveros comerciales:

Producción rápida de grandes cantidades de plantas. Existe un parámetro importante, el índice de multiplicación, que expresa el número de explantos resultantes tras un ciclo de cultivo. Este índice varia bastante de unas especies y/o variedades a otras, pero en aquellas en que el material responde normalmente suele estar comprendido entre 5 y 15. Si tomamos el ejemplo de un índice de valor 10 y un periodo de cultivo de un mes, partiendo de un solo explanto ya establecido se obtendría, tras un año de cultivos, 1012 nuevas plantas, es decir, 1.000.000.000.000, de idéntico genotipo ( en principio ) y con igual grado de desarrollo. Si se comparan estas cifras con las correspondientes a cualquier sistema clásico de multiplicación ( con las cuales se precisarían decenas de años ), se comprenderá la ventaja que supone disponer de una técnica que permite, una vez comprobadas las características agronómicas de una nueva variedad o patrón, poder introducirla en el mercado en tan poco tiempo.

Eliminación de patógenos no curables: mediante el cultivo de meristemos ( a veces combinando la técnica con la de la termoterapia ) se pueden obtener ejemplares “limpios” a partir de plantas contaminadas, por ejemplo, con virus. Esto es posible porque, utilizando porciones muy pequeñas de tejidos del meristemo terminal, o alguno de los axilares, de la zona indiferenciada, donde todavía no se han formado nuevos vasos conductores, aunque el resto de la planta esté contaminada en dicha zona no pueden llegar los virus por falta de comunicación. Cuando se realizan cultivos con este fin, una vez obtenidas las nuevas plantas hay que comprobar dos puntos fundamentales: Que, efectivamente, se ha conseguido la eliminación del patógeno. Esto se comprueba

mediante test inmunológicos ( Test E.L.I.S.A. ). Que no se han producido mutaciones que alteren las características agronómicas de la

variedad ( más frecuentes en cultivo “in vitro “ que en otras técnicas de propagación vegetativa ). Para ello hay que comprobar dichas características antes de poner en el mercado los nuevos ejemplares. Si por suerte las características producidas por la mutación ( color de la flor, por ejemplo, en cultivos para flor cortada como el Clavel ) son de interés comercial podrán ser aprovechadas, y registradas como nuevas.

Como ejemplos prácticas de aplicaciones de esa técnica, vamos a detallar tres casos, en los cuales se utiliza la técnica “in vitro” de forma muy diferente:

5.2.5 Clavel:El método comercial de producción de esquejes de Clavel es el siguiente: Siembra “in vitro” de meristemos terminales, que contienen el cono vegetativo terminal del tallo

y dos axilares; tras un ciclo de cultivo se obtiene un esqueje, sin raíces. Este, denominado Esqueje Meristemo, se enraiza en cámaras de nebulización normales ( aunque protegidas, para evitar contaminaciones ).

Las plantas obtenidas tras el enraizamiento ( denominadas Plantas Meristemo ) se cultivan, durante una campaña en el interior de invernaderos de “cuarentena”, en contenedores

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individuales convenientemente separados para evitar posibles contagios por contacto. Todas las plantas son testadas para detectar la presencia de virus, concretamente el Mottle y el Ring Spot; las plantas que dan positivo son, inmediatamente, quemadas.

Al final de esta primera campaña se recolectan todos los esquejes producidos y se enraízan en nebulización, dando lugar a lo que se llaman Plantas de Reemplazo, que se cultivan en invernaderos similares a los anteriores, en bancadas elevadas, rellenas de un substrato artificial previamente desinfectado con vapor de agua. Estas plantas se someten a testajes por lotes de igual procedencia ( hijas de la misma Planta Meristemo ) para detectar la presencia de virus y en ellas se comprueba la ausencia de mutaciones ( simplemente dejando una planta del lote sin pinzar para que florezca, comprobando el tipo de flor )

Los esquejes recolectados de las plantas de reemplazo se enraízan y pasan a convertirse en Plantas Madre; estas se cultivan durante otra campaña y los esquejes producidos, tras su enraizamiento, son los Esquejes Comerciales. Para aprovechar al máximo las cámaras de nebulización, y las exigencias del mercado en cuanto a fecha de plantación, los esquejes se pueden conservar ( antes y después del enraizamiento ) en cámaras frigoríficas durante 3-4 meses. Las plantas madre son también testadas, admitiéndose cierta tolerancia, concretamente el 10 % de ensayos positivos para el Ring Spot.

5.2.6 Fresón:El sistema de producción de plantas de Fresón es muy parecida al descrito para el Clavel, con la diferencia de que en vez de enraizar los esquejes las plantas de las sucesivas generaciones ( que se denominan R-1, R-2, etc. ) se propagan por acodo de punta, espontáneo.

5.2.7 Híbridos de Melocotonero x Almendro:La producción de plantas del híbrido GF 677 se hace hasta el final “in vitro”, a diferencia de los

anteriores en los cuales solamente se emplea la técnica al principio. El problema de este híbrido es que se propaga muy mal por estaquillado, de forma que de los que se trata es de abaratar el coste de las plantas. El método consta de cinco fases:

Implantación: partiendo de meristemos terminales se logra la formación de un nuevo brote. Es obligatorio comenzar cada campaña con esta fase.

Ahijamiento, de los brotes obtenidos en la fase anterior se obtiene un “manojo” de brotes cortos ( 1-1,5 cm. ).

Alargamiento de los brotes del manojo, hasta que alcanzan 8-10 cm. de longitud. Enraizamiento de los brotes, previamente individualizados. Aclimatación.

Las fases 2,3 y 4 se hacen con el mismo medio de cultivo, con la sola diferencia de las hormonas utilizadas. Concretamente se utilizan los siguientes productos y concentraciones:

Medio Producto ConcentraciónMg/l

AhijamientoANA 0,01

BAP 0,60

AG 0,10

AlargamientoANA 0,01

BAP 0,10

AG 0,50

EnraizamientoANA 0,10

BAP 0,00

AG 0,00

Vemos como, variando el equilibrio hormonal, los explantos varían su respuesta.

Ya hemos visto como no siempre se logra la eliminación de los virus en los cultivos de meristemos, por lo que se han desarrollado técnicas para el testaje de muestras de tejidos vegetales. Hoy día se usan

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casi exclusivamente los métodos de indexaje basados en reacciones inmunológicas. Concretamente son muy utilizados los métodos ELISA ( Enzime Linked Inmuno Sorbent Assay ) Sandwich que se procesa en las siguientes etapas: Sobre un soporte insoluble ( pocillo de una placa ELISA múltiple ) se fijan anticuerpos específicos

del patógeno ( antígeno ) a detectar. Esta placas se compran ya preparadas con el antígeno adherido al fondo de los pocillos ( Tapizado ).

Una vez en el laboratorio se lavan las placas con una solución tampón y se les añade la Muestra, convenientemente preparada y tamponada; las muestras suele ser una papilla a base de brotes tiernos, hojas, etc.. El patógeno que se investiga ( si está presente y activo en la muestra ) reacciona con los anticuerpos del tapizado y queda fijado al fondo de la placa. Para ello, se incuba en condiciones adecuadas de temperatura durante algún tiempo ( horas ) y, a continuación, se lavan con una solución tampón. En el caso de que en la muestra no esté presente el antígeno, tras el lavado solamente queda en el fondo del pocillo el tapizado original ( anticuerpos ).

A continuación se le añade el Conjugado ( anticuerpos “marcados” con una enzima ); estos nuevos anticuerpos reaccionan con los antígenos que han quedado en los pocillos correspondientes a muestras contaminadas y queda, también, fijada la enzima. Esto no ocurre en los pocillos correspondientes a muestras limpias, ya que el conjugado desaparece tras un lavado.

Por último, se añade un Substrato ( solución de una sustancia orgánica, incolora, que reacciona con la enzima, cambiando de color ) y, tras un corto periodo de incubación, se observan los pocillos; en los que aparece el color producido por la reacción de la enzima con el substrato corresponden a muestras procedentes de plantas contaminadas; en los que no hay cambio de color no se puede afirmar la ausencia del patógeno, que puede, entre otras cosas, estar inactivo en el momento de la recogida de las muestras en el campo. La observación visual se complementa con la lectura en un fotocolorímetro, en el cual se miden absorbáncias.

RESUMEN

Recordar que: Utilizando un medio de cultivo artificial, estéril y en un ambiente controlado, se pueden cultivar

porciones de tejido vegetal y obtener nuevos ejemplares, en muy poco tiempo y en grandes cantidades. Es imprescindible utilizar el equilibrio hormonal adecuado. La fase de aclimatación es la más importante de todas. Esta técnica también sirve para eliminar virus de plantas contaminadas. A nivel comercial se usa solo al principio ( Clavel o Fresón ) y hasta la obtención de plantas con raíces

( Híbridos de MelocotoneroxAlmendro ). Cuando se trata de eliminar patógenos, hay que comprobar el éxito de la operación con los tests

correspondientes.

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