Cultivo in VitroTema 5 Para Clase

8/2/2019 Cultivo in VitroTema 5 Para Clase

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Propagacin de plantas superiores__________ _______Tema 5. ..cultivo de tejidos in vitro..

5 OBTENCIN DE PATRONES O PLANTAS COMPLETAS POR MEDIO DE CULTIVO DETEJIDOS in vitro.

5.1 Definicin.

La tcnica de cultivo de vegetales in vitro consiste, muy esquemticamente, en el cultivo dirigidode porciones de tejido ( clulas aisladas u otras estructuras, tales como granos de polen, embriones,meristemos, etc. ) en condiciones aspticas y en ambientales controladas. Esto significa que hay que

proporcionar al explanto ( estructura o porcin del vegetal que se introduce en los recipientes de cultivo )objeto del cultivo una serie de condiciones que aseguren el xito de la operacin, entre las que cabe destacar:

Un medio de cultivo adecuado, que proporcione a dicho explanto los nutrientes ymetabolitos que la planta madre le suministrara. Unas condiciones de aspsia adecuadas, que aseguren la no contaminacin del medio decultivo durante el cultivo. Unas condiciones ambientales ( temperatura, iluminacin y fotoperiodo ) que promuevan eldesarrollo de los explantos. Unas buenas condiciones para la aclimatacin de las plantas obtenidas para su posteriorcrianza en condiciones ms o menos normales .

De todas las fases del cultivo, la menos espectacular pero la ms importante es la ltima, ya quesignifica el paso de condiciones ms que ptimas a otras ms duras.

5.2 Instalaciones necesarias.Un vivero ( o parte de un vivero ) que se dedique a la obtencin de plantas in vitro suele constar de

las siguientes instalaciones: Oficinas, para el control administrativo. Almacn de utensilios y materias primas. Cocina, donde se preparan los medios de cultivo. Sala de siembra. Sala de cultivo. Invernaderos, para la aclimatacin de las plantas.

Vamos a describir estas instalaciones y los detalles correspondientes.

5.2.1 Medios de cultivo:Los medios de cultivo se componen de:

Sales minerales; macro y microelementos, dosificados en diferentes proporciones, perosiempre asegurando su correcta disolucin y asimilabilidad. Hidratos de Carbono, como fuente de energa, fcilmente asimilable. Se suele usarSacarosa y/o Glucosa. Vitaminas hidrosolubles, tales como cido Ascrbico, cido Nicotnico, etc. Y otras, comoel Sorbitol, de efectos antioxidantes. Hormonas de los gruposAuxna, Giberelinas y Citoquininas. Esta se dosifican en diferentesequilibrios, segn la direccin que queramos en que se desarrolle el cultivo. Concretamente:

LaAuxina promueve la formacin de callos. Las Giberelinas favorecen el alargamiento de brotes. Las Citoquininas diferencian nuevos brotes.

El medio de cultivo se gelifica usando, normalmente, Agar.Estos medios de cultivo se preparan en la cocina, lugar del laboratorio dotada de los

elementos necesarios. La preparacin de los medios se hace segn una receta: Dilucin de la sales minerales, a partir de soluciones madre previamente preparadasy conservadas en cmaras frigorficas, con agua bidestilada. Adicin, en fro, de: Hidratos de Carbono, Vitaminas y Hormonas, por este orden. Comprobacin y ajuste, en su caso, del pH del medio, con cido Clorhdrico oHidrxido Potsico ( 1 N ) hasta alcanzar valores de 5,0-5,5. Calentamiento de las soluciones hasta 45-50 C y adicin del Agar, hasta quedesaparece la turbidez.Una vez preparadas, y todava en caliente, se reparte en los recipientes de cultivo, que

pueden ser de vidrio o de plstico termoestable. En viveros comerciales se emplean francos de

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vidrio de los usados por la industria conservera mientras que en laboratorios de investigacin esfrecuente el uso de tubos de ensayo de vidrio especial.

5.2.2 Condiciones de aspsia:Los medios de cultivo son, adems de idneos para el desarrollo de los explantos, ptimos para el

desarrollo de patgenos ( Bacterias y Hongos ), por lo que hay que asegurar su ausencia en el interior de losfrascos, en el propio explanto, as como en los utensilios que se emplean en la manipulacin de los mismos.

Para resolver este problema se recurre a las siguientes soluciones: Esterilizacin, en autoclave, de los medios de cultivo, una vez entubados. Se suelen utilizartemperaturas de 120-121 C, durante 10-15 minutos. Este calentamiento degrada las vitaminas yhormonas. Cuando es imprescindible el uso de sustancias muy termolbiles, como el AIA, seaaden a los medios de cultivo cuando estn a punto de gelificarse mediante microfiltrosmicrobianos. Desinfeccin del material vegetal: cuando se hacen cultivos sucesivos, procedentes decultivos anteriores no es preciso desinfectarlos, pero cuando se inicia un cultivo, a partir de

plantas cultivadas en condiciones normales ( are libre o invernadero ) es necesario desinfectar lasuperficie del material ( brotes, por ejemplo ), para lo cual se usa Hipoclorito Clcico o Sdico oCloruro de Mercurio ( solo para semillas ). Una vez mantenidos durante 15-20 minutos ensoluciones de estos productos se lavan tres veces con agua bidestilada previamente esterilizada ,

para eliminar restos de los mismos. Aspsia durante la manipulacin: con las precauciones anteriormente descritas tendremostanto en interior de los frascos de cultivo como el material suficientemente limpio. Pero comodurante las operaciones de siembra, troceado, repicados, etc. pueden producirse contaminaciones( procedentes del are, ropas, etc. ) dichas operaciones hay que realizarlas en unas salasespeciales ( salas de siembra ) en las cuales:

Se realizan desinfecciones peridicas con leja en techos, paredes y suelos. Antes de comenzar el trabajo se desinfectan con tubos fluorescentes de rayos UVAgermicidas. El personal utiliza ropas y calzado esterilizado. La manipulacin se realiza en mesas de cultivo deflujo laminar. Los utensilios ( pinzas, escalpelos, etc. ) se esterilizan y flamean antes de ponerseen contacto con los explantos.

5.2.3 Condiciones ambientales:En las cmaras de cultivo, donde se introducen los frascos una vez sembrados, consisten en

habitaciones aisladas trmicamente, ms o menos grandes, segn la cantidad de material a cultivar, dotadas delos siguientes elementos:

Estanteras para la colocacin de los frascos. Equipo de climatizacin, fro-calor, capaz de mantener durante todo el ao temperaturas delorden de 25 C. Bateras de iluminacin, a base de tubos fluorescentes de luz blanca o del tipo Growth Lux,dispuestos en cantidad, separacin y altura suficientes para asegurar una iluminacin homogneade intensidades entre 2.000 y 4.000 luxes. Programadores para efectuar un fotoperiodo intermitente; normalmente se utilizan ciclos de16/8 horas de luz-oscuridad.

En estas condiciones, un ciclo de cultivo suele durar alrededor de 30 das, durante los cuales los

explantos habrn evolucionado y estn en condiciones de iniciar otro nuevo ciclo, debiendo ser repicados a unmedio fresco o bien pueden conservarse durante semanas en frigorfico, si no interesa seguir en este momentocon el cultivo.

5.2.4 Condiciones para la aclimatacin:Si el paso de las condiciones de cultivo dentro de las cmaras a las de campo no son graduales para

que las nuevas plantas se vayan aclimatando poco a poco, las prdidas son elevadsimas y ponen en peligro elxito tcnico y econmico del vivero. Esta aclimatacin supone:

Para evitar contaminaciones posteriores a las nuevas plantas se les eliminan los restos delmedio de cultivo, lavndolas en agua corriente.

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Se dan tratamientos preventivos contra bacterias y hongos, sumergindolas plantas ensoluciones fungicidas y/o con estreptomicina. Se usan substratos esterilizados en autoclave o por medio de vapor de agua. Se utilizan recipientes nuevos que, en el caso de que sean bandejas multipot de plsticotermoformado, al haber sido fabricadas en caliente, suelen estar limpias. No obstante, se puedenlavar previamente con leja. El paso de las condiciones de iluminacin en las cmaras de cultivo ( iluminaciones bastante

bajas ) a las normales de los climas mediterrneos ( muy altas ) se hace utilizando mallas desombreo de porcentajes altos ( 80-90 % de sombra ) que se van retirando gradualmente a medidaque se avanzando el periodo de endurecimiento. El paso de las condiciones trmicas iniciales a las del interior de un invernadero ( con saltostrmicos diarios importantes ) se consigue con el uso de calefaccin, normalmente basal. Por ltimo, para pasar de las condiciones de humedad del interior de los frascos ( cercanasal 100% ) a las del are ms o menos libre se utilizan tneles de plstico, el cual se va retirando

poco a poco, para que las plantas se vayan acostumbrando.

La utilidad de las tcnicas de cultivo in vitro es mltiple. Tan solo citaremos las que puedenresultar de inters prctico en viveros comerciales:

Produccin rpida de grandes cantidades de plantas. Existe un parmetro importante, elndice de multiplicacin, que expresa el nmero de explantos resultantes tras un ciclo de cultivo.

Este ndice varia bastante de unas especies y/o variedades a otras, pero en aquellas en que elmaterial responde normalmente suele estar comprendido entre 5 y 15. Si tomamos el ejemplo deun ndice de valor 10 y un periodo de cultivo de un mes, partiendo de un solo explanto yaestablecido se obtendra, tras un ao de cultivos, 1012nuevas plantas, es decir, 1.000.000.000.000,de idntico genotipo ( en principio ) y con igual grado de desarrollo. Si se comparan estas cifrascon las correspondientes a cualquier sistema clsico de multiplicacin ( con las cuales se

precisaran decenas de aos ), se comprender la ventaja que supone disponer de una tcnica quepermite, una vez comprobadas las caractersticas agronmicas de una nueva variedad o patrn,poder introducirla en el mercado en tan poco tiempo. Eliminacin de patgenos no curables: mediante el cultivo de meristemos ( a vecescombinando la tcnica con la de la termoterapia ) se pueden obtener ejemplares limpios a

partir de plantas contaminadas, por ejemplo, con virus. Esto es posible porque, utilizandoporciones muy pequeas de tejidos del meristemo terminal, o alguno de los axilares, de la zona

indiferenciada, donde todava no se han formado nuevos vasos conductores, aunque el resto dela planta est contaminada en dicha zona no pueden llegar los virus por falta de comunicacin.Cuando se realizan cultivos con este fin, una vez obtenidas las nuevas plantas hay quecomprobar dos puntos fundamentales:

Que, efectivamente, se ha conseguido la eliminacin del patgeno. Esto secomprueba mediante test inmunolgicos ( Test E.L.I.S.A. ). Que no se han producido mutaciones que alteren las caractersticas agronmicas dela variedad ( ms frecuentes en cultivo in vitro que en otras tcnicas de propagacinvegetativa ). Para ello hay que comprobar dichas caractersticas antes de poner en elmercado los nuevos ejemplares. Si por suerte las caractersticas producidas por la mutacin( color de la flor, por ejemplo, en cultivos para flor cortada como el Clavel) son de interscomercial podrn ser aprovechadas, y registradas como nuevas.

Como ejemplos prcticas de aplicaciones de esa tcnica, vamos a detallar tres casos, en los cuales se

utiliza la tcnica in vitro de forma muy diferente:

RESUMEN

Recordar que: Utilizando un medio de cultivo artificial, estril y en un ambiente controlado, se pueden cultivar

porciones de tejido vegetal y obtener nuevos ejemplares, en muy poco tiempo y en grandes cantidades. Es imprescindible utilizar el equilibrio hormonal adecuado. La fase de aclimatacin es la ms importante de todas.

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Esta tcnica tambin sirve para eliminar virus de plantas contaminadas. Cuando se trata de eliminar patgenos, hay que comprobar el xito de la operacin con los tests

correspondientes.

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