Cultivo de Linfocitos

7/21/2019 Cultivo de Linfocitos

http://slidepdf.com/reader/full/cultivo-de-linfocitos 1/29

Laboratorio de Genética Clíni

Cultiv

o de linfocitos yobservación de cariotipohumano

Semestre 2016-1.Grupo 1802. !uipo "#

• $ac%as &lvera $isael 'mir• (uechol )am%re* Gerardo• +orres ,imne* )amón

'sesor# )a!uel )etana/alde



&betivos

Que el alumno desarrolle experimentala metodología que se requiere para reun cultivo de linfocitos de sangre perifé

Que el alumno realice y observepreparaciones semipermanentes de cécultivo de linfocitos para analizar lascaracterísticas de los cromosomas hum



Cito/entica

Parte de la genética queestudia los cromosomas ylas enfermedadesrelacionadas causadas por

un número o unaestructura anormales delos mismos.



Cultivo celular

Se entiende por cultivocelular al conunto detécnicas que permiten elmantenimiento decélulas! in vitro!

preservando al m"ximosus propiedades#siol$gicas! bioquímicasy genéticas.



Cultivo celular

Se realiza en medios arti#cialespreparados mediante la mezclade componentes puri#cados ode soluciones org"nicascompleas! en el interior de

instrumentos que mantienenlas condiciones físico%químicasadecuadas y sobre soportes orecipientes que los contienen yaíslan del medio exterior.



+3'3 3 &S C+4&SC')S

Permiten un control preciso y #no del

medio ambiente. &as células en cultivo de una línea

celular son homogéneas! conmorfología y composici$n uniformes

Se pueden obtener con facilidad unnúmero elevado de réplicas idénticas.

Suponen una economía en el uso dereactivos o drogas a estudiar pues alrealizarse en volúmenes reducidos

's una alternativa viable para el ensayo(in vivo) en muchas situaciones.



Cultivo celularprimario

*islados directamentede teidos demamíferos.

Su crecimiento in vitroes limitado.

+ay inhibici$n porcontacto,topoinhibici$n-.

Cultivo celularsecundario

uando uno o vtipos de células dcultivo primario s

siembran ,sub%culel cultivo obteni

denomina csecund



Cultivo celular secundario



%nea Celular

ultivo celular que tiene alta

capacidad de multiplicarse invitro! establecido a partir delprimer subcultivo de uncultivo primario y que tienelas mismas característicasque el teido de origen.

&ínea celular cocelular que ha posibilidades subcultivada in menos 01 vsubcultivos- inde

&ínea celular

celular que tienelimitado de subcultivos ,alre

4na de las primeras líneas celulares humanas! obtenida de +enrietta&ac5s! quien falleci$ de c"ncer de útero a partir del cual se obtuvieron

estas células



l sustrato de cultivo.

Según si la línea celular precise o nounirse al sustrato para proliferar se

dice que es dependiente ,adhesi$n-o independiente ,suspensi$n- deanclae.

&os tipos de sustrato m"s empleadosen la actualidad son los siguientes/

6idrio

Pl"stico desechable/ el m"sempleado es el poliestireno! 7trospl"sticos que se emplean sonpolivinil%cloruro! policarbonato ,P6-!politetra8uoretileno ,te8$n! P9:'-!thermanox ,9P;-.

<icrosoportes ,=microcarriers=-. Setrata de soportes pl"sticos,poliestireno-! de sephadex opoliacrilamida

Placas de Petri <ultiplac

:rascos de >oux >oller bott



a formación de una l%nea celupartir de un cultivo primario im!ue#

*umenta el número de células obtenidas. *caban predominando uno o dos tipos cel

que tienen mayor tasa de crecimiento

&a poblaci$n celular se hace uniforme y homo

? Sus características se conservan durante las

generaciones y! si se conservan en nitr$geno forma inde#nida.



Cultivo de clulas san/u%ne

Para prop$sitos de diagn$stico! los

cromosomas son usualmente analizados enmetafases preparadas de cultivo delinfocitos.

9ambién se utiliza cultivos de #broblastos dela piel! amni$citos del liquido amni$tico océlulas de medula $sea.

&os linfocitos de sangre periférica crecen enun cultivo en suspensi$n luego de serestimulados con #tohemaglutina.



Cultivo de clulas san/u%ne

Su periodo de vida es limitado a solo unascuantas divisiones.

>equiere de alrededor de 0@ horas a A0 B parados divisiones celulares.

Se adiciona la sangre directa o se aíslan de ella alos linfocitos 9.

Se utiliza heparina para evitar la coagulaci$n yque esta inter#era con la proliferaci$n! heparina%sangre C/@1.

Se detiene la mitosis en metafase con colcemida,derivado de la colchicina- @h antes de extraerlas.



aboratorio y e!uipos paracultivos de clulas

abinas de 8uo laminar

Dncubadoras

<icroscopios

ongeladores y

refrigeradores



$itó/enos

Sustancia que induce laproliferaci$n linfocitaria enforma no especí#ca.

&as glicoproteínas!

#tohemaglutinina ,P+*- yconcanavalina * ,on%*-!estimulan a los linfocitos 9.



5itohema/lutinina 7'9

's retirada de una variedad del Phascolus vulgaris.'sa variedad fue seleccionada! entre las muchasexistentes! buscando obtener actividad mitogénicasuperior! sin preocuparse con la aglutinaci$n de loseritrocitos provocada por las #tohemaglutininas yaexistentes.

'cción/ posee excelente grado de actividadmitogénica! siendo su#ciente 1!C % 1!@ ml paraestimular la diferenciaci$n b"sica y la consecuentemitosis de los linfocitos 9 presentes en C ml desangre



$edio de cultivo

onsideraremos que el mediode cultivo estar" formado porcuatro elementos/ la naturalezadel sustrato o fase en quecrecen las células! lascondiciones físico%químicas y

#siol$gicas del medio! lanaturaleza y composici$n de lafase gaseosa y las condicionesde incubaci$n! especialmente lahumedad y la temperatura.



os principales medios empley sus aplicaciones son#

$edio :asal de a/le:$9. <edio elemental cons$lo los amino"cidosesenciales. Se necesitasiempre la suplementaci$ncon suero bovino fetal al C1E. recimiento de#broblastos de rat$n ycélulas +e&a.

$edio $%nimo a/le $$9.

's el medio decorriente! contamino"cidos y

concentraci$n queusa para cada casicultivos y requiere suero ,C1E-.



)7$ 16;0.

<edio diseGado para elcrecimiento de linfoblastos ylíneas celulares leucémicas en

suspensi$n. 9iene un ampliorango de aplicaciones consuplementos adecuados.

$edio $$ modi<3ulbeco 3$$9.

ontiene cuatro vconcentraci$n de aminvitaminas que el F<'para la selecci$n de h

suplementado con +*9



+odo medio de cultivo est= fopor los si/uientes elementos Soluciones salinas equilibradas ,FSS-/ mez

de sales inorg"nicas! suplementada glucosa.

*mino"cidos.

6itaminas.

Hlucosa.

7tros suplementos org"nicos de bao pmolecular. nucle$sidos! piruvato! lípidos.

+ormonas y factores de crecimiento ,suesuero de ternera! suero bovino fetal! suero

caballo y suero humano.



Condiciones para un cultivo de lin



Contaminación

4so de campana laminar

*ntibi$ticos vs estreptococosesta#lococos y enterobacterias

• 0@ h/ Penicilina ,C11 4Im&- y 'streptomicina ,C11JgIm&-

• K 0@ h/ Lanamicina ,C11 JgIm&- y Hentamicina,31 JgIm&-

• Polimixina F ,C11 4Im&- vs Pseudomonas sp.

*ntifúngicos vs Candida sp y Aspergillus

sp

• Mistatina ,31 JgIm&- y *nfotericina ,@.3 JgIm&-



Colchicina

&a colchicina es un f"rmaque detiene o inhibe la dmetafase o en anafase. 'que evita la distribuci$n crom"tidas de un cromosmitosis! ya que aunque nseparaci$n! sí hubo duplimaterial genético

Col



$ecanismos de acción

*ctúa sobre las prcitoesqueléticas ddenominadas tubu

*l desorganizarsecinetocoros de lastienen donde unircual ocasiona que

no se distribuyan durante la divisi$n

N *ctualmente se est" uanticancerigeno! inhibiemultiplicaci$n de las cé



Sincroni*ación 'n un cultivo celular se

de la mitosis

Se adiciona metotrexat

temprano del ciclo celuan"logo del "cido f$licoa#nidad por la dihidrofoparticipa en la síntesis d

'l acido folínico se requde timina y por lo tanto

&as células se bloqueantiempo su#ciente para células.

Se retira el bloqueo vía nucle$sido de timidina

Si b d i f it



Siembra de infocitos

Cosecha de linfocitos



Cosecha de linfocitos

&:S)4'C>?



&:S)4'C>?

Cultivo de Linfocitos

Documents

Transcript of Cultivo de Linfocitos