Determinacin de Tiamina por mtodo Fluorometrico - HPLC1 FundamentoSe basa en la extraccin de al tiamina por un tratamiento enzimtico, hidrolisis acida, seguido de purificacin, oxidacin a tiocromo (compuesto fluorescente cuya fluorescencia es directamente proporcional a la concentracin de tiamina presente en la muestra) y posterior identificacin y cuantificacin por cromatografa liquida isocrtica en fase inversa con detector de fluorescencia, ajustada a una longitud de onda de excitacin de 365nm y emisin de 436nm.1Estructura qumica La estructura qumica de la tiamina o vitamina B1 consta de un ncleo pirimidinico y otro tiazolico, unidos por un puente metilenico.2

Tiamina

Pirofosfato de tiamina

1.1 Materiales Columna C18 o RP-18 (5um) 125x4mm Dispositivo de filtracin al vaco para membrana Millipore. Embudos Esptula Matraces Erlenmeyer de color mbar, boca ancha de 250 mL. Matraces Erlenmeyer de color mbar de 100 mL. Matraces aforados de color mbar de 1000 mL. Matraces aforados de color mbar de 100 mL. Matraces aforado de color mbar de 10 mL Membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm. Membranas Millipore de 0,22 micras de 47 mm. Papel filtro Whatman N2 Pre Columna C 18 o RP-18 (5um) 4-41.2 Equipos Balanza analtica Bao termorregulado con agitacin magntica y rangos de T de 40c a 50C Bao termorregulado entre 80C a 90C Cromatgrafo liquido de alta resolucin con detector de fluorescencia bomba cuaternaria o isocrtica, autosampler o inyector manual y software adecuado.1.3 Reactivos cido clorhdrico fumante 37% p.a cido clorhdrico 1 N. en un matraz aforado de 1000mL que contenga aproximadamente 500mL de agua destilada, aadir con cuidado 82mL de HCl al 37%, enrasar con agua destilada. Hidrogenofosfato de di-Potasio trihidratado p.a Solucin de Hidrogenofosfato de di-potasio, solucin 10 mM pH 7,2. En un vaso de 1000mL pesar exactamente 2,28 g de K2HPO4 3H2O y disolver en aproximadamente 800mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7,2 con HCl 1N. Trasvasar a un matraz aforado de 1000mL y enrasar con agua destilada. Desgasificar bajo presin reducida y filtrar a travs de Membranas Millipore 0,22 micras x 47nm. N,N-dimetilformamida p.a NaOH 15% Papana soluble p.a Sodio acetato trihidratado p.a Solucin acetato de sodio 2,5M Fase mvil: dimetilformamida, solucoon al 30% en hidrogenofofasto de di-potasio. Tiamina clorhidrato o mononitrato estndar, secado a 105 C y almacenado en desecador con deshidratante adecuado. Ferrocianuro de potasio 1% Solucin oxidante. Tomar 4mL de la solucin de ferrocianuro de potasio al 1% en un matraz de 100mL y enrasar con solucin de NaOH al 15%.

2. Mtodos 2.1 Mtodo fluorometrico-HPLCEl mtodo ms ampliamente utilizado para la determinacin de la vitamina B1, incluye una hidrlisis cida seguida por una defosforilacin enzimtica de los steres y la cuantificacin de la tiamina liberada. La medicin de la vitamina B\ en el extracto final se realiza mediante fiuorometra despus oxidar a tiocromo que es un compuesto fluorescente. Ms recientemente, se han publicado procedimientos por HPLC que se utilizan para cuantificar, el propio tiocromo o a travs de una derivatizacin postcolumnaLa muestra (hasta 25 g) es hidrolizada utilizando cido sulfrico 0,1 M durante 15 min a 121C. El pH de la mezcla enfriada se ajusta a 4,5 a travs de la adicin de buffer acetato. Se agregan 500 mg de Takadiastasa y la suspensin se incuba al menos por 20 minutos a 45C. Debe mencionarse que las condiciones de incubacin dependen del tipo de enzima y del lote utilizado, as como tambin del tipo de muestra y pueden variar considerablemente.El extracto puede ser purificado si es necesario a travs de una columna de intercambio inico, como Amberlite CG 50 (100-200 mesh). La tiamina es retenida en el intercambio inico y luego es eluda con cido clorhdrico 0,15 M. El eluido se ajusta a un volumen definido con cido clorhdrico (0,15 M). Alcuotas de esta solucin se mezclan con isobutanol, una solucin de hidrxido de sodio (50%), una solucin de hexa-cianoferrato de potasio (5%) y se agita vigorosamente durante 60 segundos. En una serie paralela con los mismos reactivos, se prepara un blanco bloqueando la reaccin a travs de la adicin de cloruro de benceno-sulfonilo. Se agrega cloruro de sodio despus de la oxidacin para optimizar la extraccin. Despus de la centrifugacin se toman 10 ml del extracto de isobutanol, se mezcla con 0,5 ml de etanol y se mide la fluorescencia en contra del blanco. Es importante seguir exactamente el protocolo para obtener resultados reproducibles. 32.2 Preparacin de la muestraLa vitamina B1 no es sensible a la luz; en cambio el tiocromo que es el producto de la oxidacin si es fotosensible, por lo cual se debe utilizar material mbar o color marrn durante la etapa de oxidacin.

a) Homogeneizar la muestra mezclando o moliendo cuando se requiera, pesar 5g de muestra en un matraz erlenmeyer con tapa de 250mL.b) Adicionar 0,5 g de Taka-Diastasa 0,25 g de papana y 15mL de agua destilada a +45-50 C. Mzclese bien a fin de obtener una suspensin homognea.c) Tapar el matraz y colocarlo durante 30 min en un bao termorregulador a + 45-50C. d) Enseguida aadir 30 ml de agua destilada entre + 45-50 C.2.3 Hidrlisisa) Aadir 5mL de HCL 1 N al matraz anterior, mezclar bien. Calentar por 30 min a bao mara hirviente agitando ocasionalmente para evitar grumos.b) Enfriar y aadir 5 mL de acetato de sodio 2,5 M, mezclar bien y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml color mbar y enrazar con agua destilada.c) Filtrar a travs de papel filtro Whatman N 2 y membranas Millipore de 0,22 micras de 13 mm. La solucin est lista para la oxidacin.

2.4 Oxidacin a) En un matraz aforado de 10mL color mbar, adicionar una alcuota de 1 mL de filtrado anterior que contiene la tiamina.b) Aadir 3mL de solucin de ferrocianuro de potasio alcalino, agitar por 2 min en forma constante.c) Aadir 0,45mL de cido fosfrico concentrado, mezclar, enfriar y enrasar con agua destilada.d) La solucin est lista para Cromatografiar.2.5 Condiciones Cromatogrficas de Tiamina Columna : C18 o RP-18 (5um) 125 x 4,6mm y Pre Columna RP -18 (5 um) 4-4 Fase mvil : 6.3.7 Inyeccin : 20 uL Flujo o caudal: 0,8 mL / min. Detector : Espectrofluormetro, Excitacin: 365 nm y Emisin 436 nm2.6 Cuantificacin de tiamina en muestras Ingresar al HPLC en mtodo tiamina que contiene la curva de calibracin obtenida de concentracin (C) en ug/mL e interpolar la muestra para cuantificar el resultado del rea vs concentracin. Valor C (ug/mL) Inyectar el duplicado 20uL de la solucin eludida del extracto de la muestra. Tiempo de recorrido: 7 minutos.

2.7 Calculo e informe de resultados Mg/kg = CxV aDonde C = concentracin en ug/mL obtenidos por la interpolacin en la curva de calibracin de la muestraV= volumen de la muestra finala= masa de la muestra en gramos

Lmite de deteccin: 0,01 ug/mLLmite de cuantificacin: 0,02ug/mLInformar mg/kg de tiamina con un decimal.

Bibliografa

1. Gobierno de chile instituto de salud pblica, procedimiento para determina tiamina en alimentos mtodo-Fluorometrico-HPLC, Chile, 2008, 12. Velzquez, Farmacologa bsica y clnica, Espaa, Editorial Medica Panamericana, 2008 (18), 583. Maritza Coureaux, Desarrollo y validacin del mtodo para control de calidad de clorhidrato de tiamina en tabletas, Cuba, 2014.