Cromatografía
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CromatografíaTécnica bioquímica en la que sustancias mezcladas se separan en función de su carga, hidrofobicidad, tamaño o alguna otra propiedad, al repartirse entre una fase móvil y una fase estacionaria
Volumen de columna
Muestra aplicada
Matriz
Tapónporoso
Eluyente
Eluyente Proteínas separadas
Matriz de la columna: (Fase estacionaria o lecho de la columna). Matriz ó sustancia empaquetada en la columna que está empapada de solvente y que se.
Fase Móvil. Solución tamponada que pasa a través de la columna.
Longitud del dispositivo en el que se empaqueta la columna: Es importante en algunos tipos de cromatografía como la de filtración en gel y poco importante en otras como la cromatografía de afinidad.
Volumen de la columna. (Geométrico) Volumen total de la matriz ó gel que se empaqueta en una columna cromatográfica.
Volumen muerto de la columna. Cantidad de solvente que tiene que atravesar la columna para asegurar que se ha reemplazado completamente.
Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel
PRINCIPIO: Separación en función del tamaño
TIPOS DE MATRIZ: Perlas de polímeros entrecruzados con poros de un tamaño determinado
Dextranos entrecruzados Agarosa Poliacrilamida
APLICACIONES Desalado de proteínas Purificación de proteínas Determinación de la masa molecular de proteínas
Cromatografía de exclusión molecular ó filtración en gel
PRINCIPIO: Tamaño de partícula y masa
molecular. Mayor masa molecular eluye primero El gel retiene particuas de menor
masa molecular
En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento (daltons)
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
Desventajas: No se pueden obtener fracciones de
proteínas altamente purificadas si se parte de una mezcla compleja de proteínas
Detección de proteína
Fraccionar extractos proteicos
0.00.20.40.60.81.0
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0.00.20.40.60.81.0
0 25 50 75 100 125 150 175 200
0.00.20.40.60.81.0
Abso
rbanci
a a
280 n
m (norm
aliz
ado) Alb + 0 hrs
Alb + 12 hrs
Tiempo (minutos)
Alb + 24hrs
Cromatograma
0.00.20.40.60.81.0
0.00.20.40.60.81.0
0 10 20 30 40 50 60 70
0.00.20.40.60.81.0
Alb + 0 hrs
AB
SO
RB
AN
CIA
A 2
80 n
m (N
OR
MA
LIZ
AD
O)
Alb + 12 hrs
NUMERO DE FRACCION
Alb + 24 hrs
Perfil de elución de extractos proteicos de 0, 12 y 24 h de germinación de maíz
En esta práctica se utilizará el matriz-gel dextrano.
FASE ESTACIONARIA
Tipo Peso molecularLímite de
fraccionamiento (daltons)
Agua retenida(g/g gel sec)
Volumen de gel hidratado (ml/g
gel seco)
G10 Hasta 700 1.0 2
G15 Hasta 1500 1.5 3
G25 1000 - 5000 2.5 5
G50 1500 - 30 000 5.0 10
G75 3000-80 000 7.5 12-15
G100 4000 - 150000 10.0 15-20
G150 5000 – 400 000 15.0 20-30
G200 5000 – 800 000 20.0 30-40
-25 0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300 32522
23
24
25
26
27
28
29
TIEMPO (Time [min.]:)CO
ND
UC
TIV
IDA
D (
Conductivity [m
S/c
m]:)
-0.005
0.000
0.005
0.010
0.015
0.020
0.025
0.030
0.035
A 2
80 n
m (U
V [A
.U.]:)
Ejemplo: