Cours M1 - 2012
description
Transcript of Cours M1 - 2012
Cours M1 - 2012
Introduction aux techniques de biologie
moléculaire
ADN
ARNmProtéine
Expression des gènes
Analyse des ARNm
Analyse des protéines
ADN
ARNmProtéine
Expression des gènes
Analyse des ARNm
Analyse des protéines
Analyse des interactions protéines/protéines
Analyse des interactions protéines/ADN
Expression des protéines
Western-blot
Immunoprécipitation
Immunocytochimie
ELISA
Western-blot
Principe:
Séparation des protéines selon leur poids moléculaire
Immunodétection de la protéine d’intérêt
Étapes:
Extraction et préparation des protéines des échantillons
biologiques (dosage de protéine)
Migration et transfert sur membrane
Immunodétection
Expression des protéines
Dosage des protéines: pourquoi ?
- Échantillons différents: foie, cœur, poumon, rein, etc…
- Conditions différentes: - témoin,
- traitement inducteur ou inhibiteur
Expression différente de la protéine d’intérêt
Uniformisation des échantillons
Même quantité de protéines analysée quelque soit l’origine de
l’échantillon ou le traitement reçu
Dosage des protéines
Préparation des échantillonsProtéines: grande hétérogénéité de poids, charges et formes
Contrecarrer ces effets Différenciation sur 1 seul paramètre
Glycérol augmente densité échantillon
-
H2N COOH
+
+
+
+
-
- Ebullition dénaturation
H2N COOH-
--
+
++
Détergent anionique lipophile (SDS) charges négatives solvatation
+ empêche précipitation
Solution tampon (Laemmli)
Composant sulfhydryl (β-mercaptoéthanol, DTT) empêche
régénération des ponts disulfures
H2N COOH-
--+
++- -
--
- --- -- -
H2N COOH- ----- -
Protéines dépliées et uniformément chargées (Fct masse) Migration en fonction du poids moléculaire (+ petite, + vite)
Western-blot
Immunodétection
Blocage des sites aspécifiques
Incubation avec Anticorps primaires
Incubation avec Anticorps secondaires
Révélation
Western-blot
Blocage de la membrane
Blocage des sites aspécifiques:
- Protéines de lait (solution de lait à 5% dans tampon TBS-Tween)
- BSA (Bovine Serum Albumin – 3-5% dans tampon TBS-Tween)
MembraneX X X X
Blocage avec des protéines inertes
Membrane
Western-blot
Incubation avec Anticorps primaires
Anticorps primaires = dirigé contre un épitope de la protéine X
Dilués dans la solution de blocage (lait ou BSA)
X X X X
MembraneX X X X
Lavage = supprime l’excès d’Ac 1aires
Western-blot
Incubation avec Anticorps secondaires Anticorps secondaire = dirigé contre l’espèce à laquelle
appartient l’anticorps primaire (ex: souris, chèvre, lapin)
Couplés à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline)
MembraneX X X X
Perox Perox Perox Perox
Pero
xPerox
Perox
X X X X
Perox Perox Perox Perox
Pero
x
PeroxPerox
Lavage = supprime l’excès d’Ac 2aires
Western-blot
Révélation par chemiluminescence Ajout du substrat de l’enzyme
Clivage avec relargage d’un produit émettant de la lumière
Impression d’un film photographique
Révélation photo
X X X X
Perox Perox Perox Perox
Ex: Stabilisation du facteur de
transcription HIF-1α par l’hypoxie
Normoxie
Hypoxie
Western-blot
Western-blot: Résumé
Extraction et préparation des échantillons- Protection vis-à-vis des protéases- Dosage- Dénaturation
Electrophorèse- Dépôt et migration des échantillons sur gel (selon leur poids moléculaire)- Transfert sur membrane
Immunodétection- Blocage des sites aspécifiques- Incubations avec Ac 1aire puis 2aire- Révélation
Immunoprécipitation Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à
des anticorps (ex: Protein G) Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée
Interactions protéines-protéines, protéine-médicament Concentration d’une protéines présente en faible quantité
Western-blot
Western-blot
Méthode d’analyse des cellules in situ par une technique
d’immunofluorescence Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des
anticorps spécifiques Utilisation d’un fluorochrome couplé à:
- anticorps primaire = immunofluorecence directe
- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte
Ex: Mise en évidence du cytosquelette Anticorps 1aire anti-tubuline Anticorps 2aire couplé à la fluorescéine
Immunocytochimie
Immunocytochimie
Immunocytochimie: Méthode
Immunocytochimie
Cellules en culture
Fixation (PFA 4%) Lavages au PBS
Perméabilisation au Triton X-100 (0,05%)
Blocage des sites aspécifiques (BSA 3%)
Anticorps 1aire(une nuit – 4°C)
X X
X
Anticorps 2airecouplé au
fluorochrome
Lavages au PBS
Analyse au microscope
Anti-actine
Immunocytochimie: exemple
Immunocytochimie
Facteur de transcription HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor)
- Présence O2 cytoplasmique
- Absence O2 nucléaire transcription de gènes nécessaires à la survie
cellulaire
Fibroblastes de membrane synoviale humains
+ mimétique (CoCl2 150 µM) pendant 24 h
Témoin CoCl2
Les fluorochromesExemples
Immunocytochimie
DAPI- Excitation à 365 nm; émission à 420 nm- Contre-coloration de fond des noyaux - Fluorescence bleue
FITC: Isothiocyanate de Fluorescéine- Excitation à 490 nm ; émission à 520 nm- Fluorescence verte
TRITC: Tetra methyl Rhodamine Iso Thio Cyanate- Excitation à 541 nm ; émission à 572 nm- Fluorescence rouge
IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO
Méthode d’analyse des cellules in situ dans les tissu Révéler et cibler une molécule biologique à l’échelle cellulaire avec des
anticorps spécifiques
Utilisation un anti corps secondaire couplé à une enzyme (HRP ou ALP)Utilisation un anti corps secondaire couplé d’un fluorochrome
- anticorps primaire = immunofluorecence directe
- anticorps secondaire = immunofluorecence indirecte
IMMUNIHISTOCHIMIE ET IMMUNOHYSTOFLUO
Détection du collagène type deux Révéler par ALP coloration rouge
Détection du GFAPRévéler par fluorescence
Les differents type de microscopie
ELISA
.
ELISA
Expression des gènes
Étude de l’expression
Extraction des ARNs
Reverse Transcriptase
PCR semi quantitative et quantitative
Blocage de l’expression
siRNA
Extraction d’ARN
Extraction d’ARN
Cellules en culture - Enlever le milieu de culture- Ajouter le Trizol- Gratter avec une spatule- Récupérer dans un tube
Ajout Chloroforme
VortexIncubation sur glace
Protéines
Culot d’ARN
Resuspension dans l’eau UPLavage à l’Ethanol 70°C
Conservation à -80°CDosage à 260 nm
Centrifugation
Phénol + Chloroforme = Débris cellulaires
Phase aqueuse = ARN totauxAjout Isopropanol
= Précipitation ARN à -20°CCentrifugation
Transcription inverse (1)
Transcription inverse
ARN ADN complémentaire
Molécule moins fragile
Conservation à -20°C
Sélection des ARNm
Matrice pour la réaction d’amplification
Enzyme Transcriptase inverse isolée de rétrovirus à ARN
Transcription inverse (2)
Transcription inverse
Kits commerciaux avec:
- Enzyme + tampon d’activité
- dNTPs en quantité suffisante
- DTT élimination des structures 2aires des
ARNs
- Amorces polydT sélection des ARNm
AAAAA
10 min à 70°CDTT
AAAAAAAATTTTTTTTT
Amorce oligo dT1h – 37°C15 min – 70°C
ARNm
TTTTTTTTTADNc
Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR
Méthode d’amplification génique in vitro
Permet de copier en grand nombre (facteur de multiplication de l'ordre du
milliard), une séquence d'ADN ou d'ARN connue, à partir d'une faible quantité
(pg) d'acide nucléique
Utilisation d’amorces spécifiques constituées d'oligonucléotides de synthèse
(20 à 25 nucléotides) obtention d’un amplicon de taille connue
Basée sur:
L’utilisation d’enzymes ADN polymérase ADN dépendantes thermostables
Les propriétés d’hybridation et de déshybridation des brins complémentaires
d’ADN en fonction de la température
PCR: étapes d’un cycle
PCR
PCR: en pratique
PCR
Animation Flash
Au final, on obtient un très grand nombre de copies du
gène d’intérêt, visualisables sur gel
PCR: dépôt sur gel
PCR
Gel d’agarose = maillage
Plus solide et moins toxique que l’acrylamide
ADN chargé négativement, migre selon sa taille (ADN linéaire)
Plus % agarose est élevé, plus on sépare les petits fragments
Visualisation avec du Bromure d’Ethidium (agent intercalant)
- Ajouté lors de la préparation du gel
- En solution dans laquelle le gel est plongé après migration
M échantillons
PCR quantitative ou en temps réel
PCR
A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN total ou d’amplicon est
mesurée grâce à un marqueur fluorescent.
Suivi de la cinétique complète = quantification absolue de la quantité initiale
d’ADN cible
2 techniques:
- agents se liant à l’ADN (ex: SYBR Green)
- sondes fluorescentes (ex: Taqman)
2 conditions:
- Fluorescence augmentée lorsque lié à l’ADN double brin
- Pas d’inhibition de la réaction de PCR
PCRq: SYBR Green
PCR
Étape de dénaturation: le colorant libre émet
peu de fluorescence
Étape de dénaturation: extinction de la
fluorescence
Mesure à la fin de l’étape d’élongation
Étape d’hybridation et d’élongation:
fluorescence associée à la quantité de colorant se
fixant à l’ADN double brin
Lorsque suivi en temps réel, l’augmentation du
signal de fluorescence est observée pendant l’étape
de polymérisation et l’émission fluorescente décroît
complètement lorsque l’ADN est dénaturé à l’étape
suivante
PCRq: SYBR Green
PCR
Avantages:
Utilisation simple
Pas de sonde
Nécessité d’amorces spécifiques
Pas affectée par la présence de mutations sur l’ADN cible
Inconvénient
Se fixe à n’importe quelle molécule d’ADN double brin
Visualisation des produits aspécifiques
PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde
PCR
Basée sur l’activité 5’-exonucléasique de la Taq polymérase pour hydrolyser
une sonde hybridée à sa séquence cible sur l’amplicon durant l’étape
d’hybridation/extension de la PCR.
Lorsque stimulé, le fluorochrome émetteur transfère son énergie au
fluorochrome suppresseur voisin par le principe FRET (fluorescence resonance
energy transfer) qui dissipe cette énergie sous forme de chaleur plutôt que
d’émettre de la fluorescence.
Un fluorochrome émetteur (reporter) (ex. FAM : 6-carboxyfluorocein) est fixé
à l’extrémité 5’ de la sonde d’hybridation et son émission est inhibée par un
second fluorochrome suppresseur (quencher) présent à l’extrémité 3’ (ex.
TAMRA : 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine).
PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde
PCR
Hybridation de la sonde
Fixation de l’amorce et
élongation
Hydrolyse de la sonde
Émission de fluorescence
L’émission de fluorescence augmente à chaque cycle proportionnellement au taux d’hydrolyse de la sonde
PCRq: Technologie TaqmanHydrolyse de sonde
PCR
Précautions:
Nécessité d’un A, un C ou un T à l’extrémité 5’ parce qu’un G supprime
la fluorescence de l’émetteur même après clivage
Tm de 5 à 10 °C plus élevé que les amorces afin de s’assurer qu’elles
s’hybrideront avant les amorces et qu’elles demeureront hybridées
pendant l’étape combinée d’hybridation et de polymérisation
Avantage:
Plus spécifique
Inconvénient:
Pas idéale pour la détection des mutations
PCRq: Cycle seuil (Ct)
PCR
Base de la quantification précise et reproductible de l’ADN par fluorescence
Valeurs de fluorescence enregistrées à chaque cycle représentent la quantité
d’amplicons produits à un instant précis
Plus il y a de matrices à amplifier au
départ de la réaction de PCR, moins élevé
sera le nombre de cycles requis pour
atteindre un point où le signal d’émission
de fluorescence sera statistiquement et
significativement plus élevé que le bruit de
fond)
Ce point est défini comme étant le cycle seuil (Ct) et apparaîtra toujours au cours de
la phase exponentielle d’amplification.
PCRq: Courbe de fusion« Melting curve »
PCR
Chaque produit d'ADN double brin synthétisé a une température de
fusion (Tm) spécifique, définie comme étant la température à partir de
laquelle 50% de l'ADN est sous forme double brin et 50% sous forme
simple brin.
Étape supplémentaire programmée en fin des cycles d’amplification
45°C à 75°C par palier de 0.1°C avec acquisition de la fluorescence en
continu
PCRq: Courbe de fusion« Melting curve »
PCR
Dérivée première de la fluorescence en fonction de la température
Vérification de la spécificité des sondes
PCRq vs PCR classique
PCR
Quelques ng d’ADN suffisent
Rapidité du run (~ 1 h vs 2h30)
Sensibilité
Quantification précise (si droite d’étalonnage avec une quantité connue)
Logiciels d’analyse = exportation des résultats et gain de temps
Autre aplication de la qpcr
Etude interaction proteine proteine
Co Immuno précipitation
Fretcolocalisation
Etude interaction proteine adn
gemsashipTrans activation
Régulation expérimental de l’expression des gène
TransfectionSi RNA
Les animaux transgenic Transgenique KoEt conditionelle
Conclusions Importance des outils de la biologie moléculaire
Etude de l’expression génique
- Transcriptionnel (ARNm)
- Traductionnel (Protéines)
Etudes de localisation
- Localisation fonctionnelle
- Physiologique vs pathologique
ne correspondent pas toujours
Limites: - Disposer d’un matériel en quantité suffisante
- Spécificité (anticorps, amorces, etc…)