Cours 5 - Les milieux de culture - étudiant

2011-10-05

1

Cours 5: Les milieux de culture

GCH-2100 – Éléments de Bioprocédés, 05 octobre 2011

Bruno Gaillet

Plan du cours Introduction

Les milieux de culture employés principalement lors des analyses microbiologiques

Les milieux de culture employés en microbiologie industrielle

Les milieux pour la culture de cellules animales

Formulation d’un milieu de culture microbienne

2011-10-05

2

Introduction Pour les analyses microbiologiques

En microbiologie industrielle (alimentaire, pharmaceutique)

Les milieux de culture doivent satisfaire à toutes les exigences citées

Analyses microbiologiques Les besoins nutritifs courants

Environ 97% du poids sec d’un organisme vivant est composé de quelques éléments majeurs:

Carbone

Hydrogène

Oxygène

Azote

Souffre

Phosphore

Potassium

Calcium

Magnésium

Fer

Ces éléments sont nécessaires aux MO en quantités importantes = macro-éléments.

Élément Homme Alfalfa Bactérie

Carbone 19.37% 11.34% 12.14%

Hydrogène 9.31 8.72 9.94

Azote 5.14 0.83 3.04

Oxygène 62.81 77.9 73.68

Phosphore 0.63 0.71 0.6

Souffre 0.64 0.1 0.32

Total 97.9 99.6 99.72

2011-10-05

3

Analyses microbiologiques Les besoins nutritifs courants: les macroéléments

Les 6 premiers éléments (C, O, H, N, S et P) sont des constituants des glucides, des lipides, des protéines et des acides nucléiques.

Les 4 autres existent dans la cellule à l’état de cations et jouent plusieurs rôles:

K+ est nécessaire à l’activité de plusieurs enzymes y compris celles qui interviennent dans la synthèse protéique

Ca2+ a de nombreuses fonctions dont l’une est de contribuer à la thermorésistance des endospores bactériennes

Mg2+ est un cofacteur de nombreuses enzymes, il forme un complexe avec l’ATP, stabilise les ribosomes et les membranes cellulaires

Analyses microbiologiques Les besoins nutritifs courants: les oligoéléments et l’eau

Les oligoéléments – manganèse, zinc, cobalt, molybdate, nickel et cuivre – sont indispensables à la plupart des cellules en quantité tellement faible que les impuretés de l’eau, la verrerie et les composants habituels des milieux de culture sont généralement suffisantes (en laboratoire).

Les oligoéléments font souvent partie des enzymes et des cofacteurs, ils aident à la catalyse des réactions et au maintien de la structure des protéines.

Par exemple:

Le zinc se trouve dans le site actif de quelques enzymes

Le manganèse peut aider beaucoup d’enzymes qui catalysent le transfert de groupes P

Le molybdène est requis pour la fixation de l’N

Le cobalt est un composant de la vitamine B12

L'eau joue un rôle fondamental en solubilisant les nutriments, en assurant leur transport et en assurant les réactions d'hydrolyse.

2011-10-05

4

Analyses microbiologiques Les milieux de culture

Leur composition doit permettre la croissance des MO et doit donc tenir compte de leurs besoins nutritifs.

La composition de base de ces milieux comprend:

Analyses microbiologiques Les différents types de milieux de culture

On distingue plusieurs types de milieux de culture selon leur composition:

2011-10-05

5

AM - Les milieux définis Certains germes tels que les cyanobactéries et les algues se multiplient sur des milieux

assez simples contenant

du CO2 comme source de carbone = bicarbonate de soude

du nitrate ou de l’ammonium comme source d’azote

du sulfate

du phosphate

une série de minéraux

Milieu dans lequel tous les composants sont connus =

Ces milieux sont beaucoup utilisés en recherche afin de déterminer ce que le microorganisme est capable de métaboliser

AM - Les milieux complexes Les milieux qui contiennent des ingrédients de composition chimique indéterminée sont

appelés milieux complexes

Ces milieux sont très utiles, car un seul milieu complexe peut être suffisamment riche et complet pour satisfaire les besoins nutritifs de nombreux MO différents.

Ces milieux sont indispensables lorsque les besoins nutritifs d’un MO sont inconnus

Ces milieux contiennent des composés indéfinis: Peptones: hydrolysats de protéines préparés

par digestion protéolytique partielle de viande, caséine, soja, etc = source de carbone, d’énergie et d’azote

Extraits de viande: extraits de viande bovine maigre = source AA, peptides, nucléotides, acides organiques, vitamines, minéraux

Extraits de levure de bière: source de vitamines B, composés azotés et carbonés

2011-10-05

6

AM – Classification des milieux

On distingue également les milieux de culture selon leur fonction:

les milieux d’isolement permettant la croissance de plusieurs espèces bactériennes,

les milieux d’enrichissement permettant de favoriser la croissance d’une espèce en faible quantité dans un échantillon,

les milieux enrichis permettant la croissance des bactéries exigeantes,

AM – Classification des milieux Les milieux comme le bouillon au soja et la gélose au soja sont aussi appelés milieux de

culture à utilisation générale car ils permettent la croissance de la plupart des MO.

Le sang et d’autres aliments spéciaux peuvent être ajoutés aux milieu de base pour favoriser le développement d’hétérotrophes capricieux

Ces milieux spéciaux sont appelés

Les milieux sélectifs : ils favorisent la croissance de MO particuliers. Exemples:

Les sels biliaires ou les colorants comme la fuchsine basique favorisent la croissance des bactéries Gram négatives. Ils inhibent la croissance des Gram+

Les géloses Endo, éosine-bleu de méthylène et Mac Conkey sont utilisées pour détecter E.coli. Elles contiennent des colorants qui empêchent la croissance des Gram-

2011-10-05

7


Les milieux sélectifs : ils favorisent la croissance de MO particuliers.

Exemple des milieux sélectifs pour les bactéries à Gram positif contenant des antibiotiques inhibiteurs des bactéries à Gram négatif).

Les bactéries peuvent aussi être sélectionnées en culture avec des éléments nutritifs qu’elles utilisent spécifiquement

Exemple: un milieu ne contenant que de la cellulose comme sources de carbone et d’énergie, est très efficace dans l’isolement de bactéries digérant la cellulose.

Les possibilités de sélection sont sans fin et il existe des dizaines de milieux sélectifs spéciaux


Les milieux différentiels : ils permettent de distinguer différents groupes de bactéries et même d’identifier des MO sur la base de leurs caractéristiques biologiques.

La gélose au sang est un milieu différentiel et enrichi

La gélose au sang est un milieu différentiel et enrichi. Il permet de distinguer les bactéries hémolytiques des bactéries non hémolytiques

Les bactéries hémolytiques (streptocoques, staphylocoques) produisent des zones claires autour de leurs colonies, résultant de la destruction des globules rouges

2011-10-05

8


Les milieux différentiels : ils permettent de distinguer différents groupes de bactéries et même d’identifier des MO sur la base de leurs caractéristiques biologiques.

La gélose Mac Conkey est à la fois différentielle et sélective

Cette gélose est utilisée pour tester la capacité des bactéries Gram – à fermenter certains sucres ou sources de carbone

Ce milieu contient des sels biliaires et du violet de gentiane qui permettent d'éliminer les bactéries à Gram+.

Il contient de plus un indicateur de pH (rouge neutre) et le sucre dont on veut tester la fermentation (ex lactose).

AM - Les milieux solides

Les milieux solides ou semi-solides, à base d'agar (gélose), sont utilisés pour l'isolement et l’identification de microorganismes. Dans ces milieux, ont été ajoutés des nutriments favorisants la croissance des microorganismes étudiés.

Le gel d’agar conserve sa fermeté même lorsque soumis à des températures frôlant 85°C, à la différence des gels à base de gélatine, qui fondent à 37°C.

Ce large écart entre la température à laquelle un gel se forme et la température à laquelle il fond est unique.

2011-10-05

9

AM - Isolement de cultures pures

Isolement sur boîte par étalement en surface

L’agar est au préalable stérilisé et rendu fluide par chauffage; y sont incorporés des nutriments nécessaires à la croissance bactérienne. Refroidi à une température inférieure à 40°C, l’agar se prend en un gel solide.

Une goutte d’une suspension bactérienne très diluée déposée sur ce gel est étalée de façon uniforme à l’aide d’une fine baguette de verre recourbée, servant en quelque sorte de râteau.

La boite recouverte de son couvercle est portée à l’étuve à 30°C ou 37°C. Après 24h, on découvre la formation de colonies à la surface du gel

D’après : Prescott, Harley, Microbiologie


Isolement sur boîte par la technique des stries

Le mélange microbien est transféré au bord d’une boîte gélosé à l’aide d’une boucle d’inoculation ou d’un écouvillon et étalé sur la surface de la boîte en suivant un motif défini

À certains moments, des cellules isolées se détachent de la boucle en mouvement et se développent en colonies séparées.


2011-10-05

10


Isolement sur boîte par étalement en profondeur

L’échantillon de départ est dilué plusieurs fois pour réduire la population microbienne et obtenir la croissance de colonies séparées.

De petits volumes de chacun des échantillons dilués sont alors mélangés à de la gélose liquide refroidie à 45°C.

Les mélanges sont immédiatement versés dans des boîtes de culture stériles. La plupart des bactéries et des champignons ne sont pas tués par ce bref contact avec la gélose chaude.


AM - Clonage et milieu sélectif

2011-10-05

11

Microbiologie industrielle

Pourquoi formuler le milieu de culture ?

Pour fournir une quantité juste de chacun des ingrédients pour la production industrielle

Éviter la perte sur le coût d’achat des ingrédients pour la production industrielle

Éviter le coût de disposition des ingrédients résiduels dans l’effluent industriel

La « quantité juste » de nutriments est essentielle pour éviter:


Pourquoi formuler le milieu de culture ?

Appliquer selon la valeur marchande du produit

Appliquer selon l’échelle de l’utilisation

Utiliser dans les laboratoires de recherche: ingrédients grade analytique

Utiliser pour la production industrielle:

Ingrédients grade technique ou industriel

Produits naturels

Résidus

2011-10-05

12


Des matières brutes peu coûteuses servent de source de carbone, d’azote de phosphore et de facteurs de croissance

Hydrolysats végétaux bruts

Les sous produits de brasserie

Les mélasses

Le petit-lait obtenu lors de la fabrication du fromage

Etc.


Les sources de carbone

Les carbohydrates sont d’excellentes sources de carbone, d’oxygène, d’hydrogène et d’énergie.

Ils sont fréquemment présent dans le milieu de culture à des concentrations plus hautes que celles des autres nutriments.

La disponibilité des carbohydrates pour le microorganisme dépend de la complexité de la molécule

Hexose > disaccharides > pentoses > polysaccharides

Les sucres simples sont disponibles en poudre et sous forme liquide à différents degrés de pureté

2011-10-05

13



Le glucose utilisé lors de fermentation industrielle provient:

De l’hydrolyse de la fécule de mais

Du sucrose de la canne et de la betterave à sucre

Le sucrose est le plus souvent acheté sous forme de mélasses


Les sources de carbone: Procédé de fabrication du sucre de table

2011-10-05

14


Les sources de carbone: les mélasses

La composition des 2 types de mélasses varie beaucoup

(A). Moyenne de 2 échantillons de «sugar beetmolasse» (1 français + 1 hollandais) provenant de la campagne de 1990

(B). Moyenne de 5 échantillons de «sugar beetmolasse» (US) provenant de 5 usines (campagne de 1991)

«Blackstrap molasse» (1975-1983)

La composition des mélasses varie chaque année dépendamment:

Du type de betterave ou de canne à sucre cultivée

Du type de sol

Des conditions climatiques, etc.


Les sources de carbone: les mélasses

2011-10-05

15



Les 2 types de mélasses contiennent des oligoéléments, des vitamines et des facteurs de croissance

Les «beet molasse» ont une odeur désagréable et un pH = 8

Les «blackstrap molasse» ont une odeur fruité, pH = 7

Les alcools (glycérol) peuvent être utilisés comme source de carbone dans les bioconversions. Aussi le méthane, méthanol et les n-alcanes.

Les acides gras peuvent être convertis par les champignons après hydrolyse (lipase).

Les acides organiques carbonés (acides oléique, linolénique, linoleique) peuvent être utilisés comme agents anti-mousse

Le CO2 est aussi une source de carbone mais il n’est pas utilisé en raison des faibles taux de croissance obtenus à partir de ce substrat


Les sources d’azote et de soufre

La source d’azote est, après la source de carbone, la substance la plus importante en quantité dans le milieu de culture

Quelques organismes peuvent utiliser la source d’azote comme source d’énergie

L’azote et le soufre sont présents et incorporés sous la forme de composés organique, principalement dans les acides aminés et les groupements thiol.

Plusieurs fermentations commerciales utilisent des sources de composés organiques complexes qui sont des sous-produits de l’industrie alimentaire et de l’agriculture:

«Corn steep liquor, protein peptones, hydrolysates and digests from casein, yeast, cotton seed, milk protein», etc.

2011-10-05

16

Microbiologie industrielle Les sources d’azote et de soufre


Les sources d’azote et de soufre

Les fermentations industrielles sont en général plus rapide et efficace lorsque ces hydrolysats sont employés puisqu’ils réduisent le nombre de composés que la cellule devrait synthétiser «de novo».

La disponibilité en azote ainsi que sa concentration dans le milieu est du cas par cas:

Les protéines peuvent être assimilées seulement par les MO qui sécrètent des protéases → hydrolyse des protéines en aa.

Pour les autres → apport d’hydrolysats

2011-10-05

17


Autres éléments essentiels

Le phosphore est présent principalement dans les sucres à l’origine des nucléotides.

Le phosphore est assimilé sous sa forme inorganique.

Le soufre est présent dans les acides aminés cystéine et méthionine. Il est apporté sous forme:

d’H2SO4 pour ajuster le pH

Sulfate d’ammonium

Bisulfate de potassium



Le fer (Fe2+, Fe3+), le zinc (Zn2+), le manganèse (Mn2+), le molybdène (Mo2+), le cobalt (Co2+), le cuivre (Cu2+) et le Calcium (Ca2+) sont également requis:

Fonctions de coenzymes, synthèse de vitamines, transport de molécules

Les besoins sont tellement faibles que ces composés peuvent être apportés en quantité suffisante par l’eau ou l’équipement

2011-10-05

18



Les oligoéléments peuvent contribuer de façon importante à la production de métabolites primaires et secondaires:

Bacillus licheniformis produit le métabolite secondaire, la bacitracine. [Mn2+] = 0,07 x 10-5 M est requise. Pour [Mn2+] = 4,0 x 10-5 M, Mn devient un inhibiteur



Les éléments métalliques peuvent être apportés comme nutriments sous la forme de cations de sels inorganiques.

La combinaison des différents minéraux régule également les propriétés osmotiques à l’intérieur de la cellule.

Dans la plupart des cas, les sources complexes de carbone et/ou d’azote apportent suffisamment de minéraux pour une fermentation adéquate

2011-10-05

19


Les sources de vitamines et les autres facteurs de croissance

Les vitamines sont des composés organiques agissant comme des co-enzymesou des parties de co-enzymes.

Une faible quantité de ces composés est requise.

En fermentation industrielle, la balance correcte en vitamines est obtenue en mélangeant adéquatement des milieux complexes et, si nécessaire, en ajoutant des vitamines pures. Exemples:

Production de la levure de boulanger: «blackstrap molasse» (riche en biotine) + «beet molasse» (riche en vitamines du groupe B)

La production d’acide glutamique par Corynebacterium glutamicum est fonction de la concentration en biotine dans le milieu. Elle doit être maintenue entre 2 -5 ug/L.


2011-10-05

20


Contrôle du pH

Un milieu peut être adapté pour initier la croissance du MO → changement au cours de la fermentation en raison du métabolisme cellulaire !!

Dans le cas d’un milieu contenant du glucose, des acides organiques peuvent être produits → la fermentation peut inhiber la croissance

La décomposition cellulaire tend à rendre le milieu plus alcalin

La décomposition des aa et des protéines → production d’ammonium → milieu plus alcalin


Contrôle du pH

Pour prévenir des changements excessifs dans la concentration en ions H+, du tampon phosphate ou du carbonate insoluble est ajouté au milieu

Tampon phosphate: mélange équimolaire de K2HPO4 et de KH2PO4 → pH = 6,8

Si une quantité limitée d’acide fort est ajoutée dans le milieu, le sel basique est converti en l’acide:

K2HPO4 + HCL → KH2PO4 + KCl

Si une base est ajoutée, la réaction opposée s’effectue

KH2PO4 + KOH → K2HPO4 + H2O

2011-10-05

21


Contrôle du pH

Conséquence: la solution joue le rôle de tampon en s’opposant au changement de concentration en ions H+ lorsque des composés acides ou basiques sont libérés dans le milieu.

Les bactéries et les fungi peuvent tolérer jusqu’à 5 g/L de potassium phosphate → cela est insuffisant pour maintenir un pH proche de 7 lorsque qu’une quantité importante d’acide est produite dans le milieu de culture

Du carbonate en poudre peut être ajouté dans le milieu pour neutraliser les acides formés.

CaCO3 + 2 H+ → H2CO3 + Ca2+ → → CO2 + H2O

Contrôle du pH lors de la fermentation au moyen d’une sonde et d’un réservoir d’acide ou de base


Contrôle du pH – Milieux synthétiques

Des précipités se forment parfois suivant la stérilisation du milieu en raison de la concentration élevée en phosphate.

Ce précipité résulte de la formation de complexes insolubles entre les phosphates et les cations fer et calcium

En stérilisant le calcium et les ions fer séparément et en les associant lorsque le milieu est refroidi le problème peut être résolu

De l’EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) peut être ajouté dans le milieu pour former un complexe avec ces métaux

2011-10-05

22


Culture mixte et mise à l’échelle

Lorsque 2 ou plusieurs MO sont placés dans un milieu, leurs activités métaboliques combinées peut différer à la fois qualitativement et quantitativement de la somme des activités métaboliques des membres cultivés de façon séparée dans le même milieu =

MO 1 MO 2

Métabolisme 1 Métabolisme 2

MO 1MO 2

≠ Métabolisme 1 + 2

Un fermenteur de laboratoire ou un flacon agité stérilisé dans un autoclave aura une concentration plus élevée en nutriments en raison de l’évaporation

Cette différence peut certainement altérer le rendement de la fermentation

Culture de cellules animales

Introduction

La culture de cellules animales s’effectuait initialement dans des milieux «naturels».

Extraits de tissus, d’embryons de poulet, fluide corporel, sérum, etc.

Avec le développement des lignées cellulaires, il a fallu développer de nouveaux milieux, chimiquement définis, dont la composition est basée sur l’analyse des fluides corporels et des besoins nutritionnels des cellules

«Eagle’s Basal Medium» (Eagle, 1955); «Eagle’s Minimal Essential Medium» (MEM) (Eagle, 1959)

+ suppléments: sérum humain, bovin, équin, hydrolysats, extraits d’embryons

2011-10-05

23


Introduction

L’isolement et la propagation des cellules issues d’une lignée spécifique peut nécessiter un milieu sélectif dépourvu de sérum Exemple: le milieu MCDB170 empêche la prolifération des

fibroblastes dans les cultures de cellules de peau.

Les cellules destinées 1) à la production de biomolécules, 2) à des études fonctionnelles non «cell-specific» se cultive dans Le MEM, Le DMEM: Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

(Dulbecco & Freeman, 1959), Le RPMI 1640 (Moore et al, 1967) + sérum

De plus en plus, dans le cadre de productions industrielles de biomolécules en culture de cellules animales, le milieu sans sérum est utilisé pour:


Propriétés physico-chimiques: le pH

La plupart des cellules se cultivent bien à pH = 7,4.

Le rouge de phénol est souvent utilisé comme indicateur:

Il est rouge à pH = 7,4, devient orange à 7,0; jaune à pH = 6,5, jaune citron à pH = 6,5, plus rose à pH = 7,6; violet à pH = 7,8

Attention : l’estimation de la couleur est subjective !!

Construction d’une série de solutions tampon

2011-10-05

24


Propriétés physico-chimiques: le pH

Le milieu régule la plage de pH de la culture et tamponne les cellules pour empêcher les modifications trop rapides de pH

Généralement, un tampon à base de (CO2 – bicarbonate) ou un tampon organique, comme l'HEPES, est utilisé pour aider à conserver le pH du milieu dans une plage comprise entre 7,0 et 7,4 suivant le type de cellules cultivées.


Propriétés physico-chimiques: Fonctionnement du système tampon (NaHCO3-

/CO2)

Le bicarbonate de sodium est en solution dans le milieu de culture

Il est en équilibre avec un pourcentage de 5 % en CO2 dans l'atmosphère ambiante de culture → nécessité d’avoir un incubateur à CO2

Le pKa de ce système tampon est de 6,3.

2011-10-05

25



/CO2)

À pH ̴ 7 pendant la culture, l’équilibre chimique entre les formes acide et basique du système tampon est:

CO2 + 2H2O ↔ H2CO3 + H2O ↔ HCO3- + H3O+

H2CO3 étant un produit très instable, on a donc: CO2 + 2H2O ↔ HCO3- + H3O+

La respiration cellulaire engendre du CO2→ entraîne une acidification du milieu

Si on ajoute dans le milieu du bicarbonate de sodium NaHCO3, on déplace l'équilibre et on limite l'acidification



/CO2)

À 37°C, HCO3- est volatil → sa désorption entraîne une basification du milieu

selon la même équation. Dans ce cas, le bicarbonate s’épuiserait dans le milieu, il faut donc le régénérer et c’est le rôle de l’apport du CO2

Selon la même équation chimique, le CO2 apporté peut être converti en HCO3-

L’enrichissement en CO2 à 5 % dans l’atmosphère de l’étuve permet donc de maintenir le tampon carbonate.

2011-10-05

26


Propriétés physico-chimiques: les systèmes tampons


Propriétés physico-chimiques: Osmolarité

L'osmolarité du milieu de culture est importante car elle aide à réguler le flux de substances qui entrent et sortent de la cellule.

Elle est contrôlée par l'addition ou la soustraction de sels dans le milieu de culture.

L'évaporation du milieu de culture dans les récipients de culture ouverts (boîtes, etc.) conduit rapidement à une augmentation de l'osmolarité, entraînant un stress, une dégradation ou la mort des cellules.

Pour les systèmes de culture ouverts (non scellés), les étuves à niveau d'humidité élevé sont essentielles pour réduire l'évaporation

Une osmolarité comprise entre 260 mOsm/kg et 320 mOsm/kg est acceptable pour la plupart des cellules

2011-10-05

27


Propriétés physico-chimiques: La température

Avec les vertébrés à sang froid, une plage de température de 18° à 25°C est parfaite ; la plupart des cellules de mammifère nécessitent 36° à 37°C.

Cette plage de température est généralement maintenue à l'aide d'étuves soigneusement étalonnées et fréquemment contrôlées.

La température influence également le pH en raison d’une augmentation de la solubilité en CO2 à basse température


Propriétés physico-chimiques: La viscosité

La viscosité du milieu de culture est influencée principalement par le contenu du sérum.

La viscosité joue un rôle important lorsque les cellules sont cultivées en agitation et en suspension.

Les dommages cellulaires peuvent être réduits en augmentant la viscosité du milieu avec du carboxyméthylcellulose (CMC») ou du polyvinylpyrrolidone (PVP).

En absence de sérum, en bioréacteur, l’ajout de Pluronic F68 dans le milieu de culture joue un rôle protecteur

Lakhotia et al, 1991

2011-10-05

28


Propriétés physico-chimiques: Tension de surface et mousse

La mousse limite la diffusion des gaz.

La mousse apparait dans les cultures en suspension lorsque 5 % de CO2 dans l’air est bullé à travers un milieu contenant du sérum ou lorsque l’agitation est trop importante

L’addition de silicone anti-mousse (Dow chemical) ou de Pluronic F68 (Sigma) 0,01 % à 0,1 % empêche la formation de mousse en réduisant la tension de surface. Cet agent peut également protéger les cellules contre les forces de cisaillement exercées par les bulles de gaz (cf. Cours phénomène d’échange).


Les produits tampons

Le tampon phosphate salin (PBS, phosphate buffered saline) est une solution tampon.

Il s'agit d'un soluté physiologique contenant du chlorure de sodium, du phosphate disodique et monopotassique et un peu de chlorure de potassium.

Il est prévu pour un usage sur les cellules maintenues hors de l'incubateur à CO2 et n'est pas conçu pour des incubations à long terme.

2011-10-05

29


Les produits tampons


Les milieux complets: contient tous les éléments nécessaires à l’usage prévu

Il sont constitués:

Les milieux définis peuvent se classer selon leur complexité:

Du très simple: Eagle’s MEM

Au très complexes: M199 (Morgan et al, 1950), CMRL1066 (Parker et al, 1957), MB 752/1 (Waymouth, 1959), RPMI 1640 (Moore et al, 1967), F12 (Ham, 1965) →→ milieu sans sérum

2011-10-05

30


Les milieux complets: contient tous les éléments nécessaires à l’usage prévu

Les milieux complexes contiennent un grand nombre d’acides aminés différents, incluant des acides aminés non essentiels + vitamines + métabolites (nucléosides, acides tricarboxyliques, lipides) + minéraux

La concentration de nutriments est dans l’ensemble faible dans le milieu F12 (qui a été optimisé pour le clonage) et élevée dans le DMEM (optimisé pour la production de virus à haute densité cellulaire)


Les milieux définis

2011-10-05

31



2011-10-05

32


Les milieux définis: les acides aminés

Essentiels : 8 chez l’homme (lleu, Leu, Lys, Meth, Phé, Thréo, Trp, Val).

Autres acides aminés dont la capacité de synthèse a été perdue lors du passage in vitro : au moins cinq autres Gln,Tyr, Cys, Arg et His.



Les vitamines

Les besoins sont variables suivant les types cellulaires. Selon Eagle, 8 vitamines sont indispensables : choline, acide folique, thiamine, pyridoxal, riboflavine, acide nicotinique, inositol, acide panthoténique.

Le glucose

la substance énergétique fondamentale est généralement le glucose à la concentration de 1 g/L (5 mM), concentration semblable à celle du sérum humain)

2011-10-05

33



Rouge de phénol

Indicateur coloré dont la zone de virage est située aux pH de 7,2-7,6.

Système tampon. Deux alternatives:

Utilisation du couple (bicarbonate de sodium, dioxyde de carbone), NaHCO3

apporté dans le milieu et CO2 (à 5 %) dans l’atmosphère de l’étuve.

Utilisation d’une molécule organique tampon dans le milieu, l’HEPES.


Rôle des constituants des milieux définis

Sels minéraux

cofacteurs d’enzymes,

pression osmotique,

le potentiel de membrane,

les communications (second messager Ca2+),

les transports (co-transport Na+ par exemple),

la régulation du pH,

l’attachement des cellules (notamment le Ca2+),

constitution de certaines molécules (groupement prosthétique, phosphate ou autres), etc.

Acides aminés

Sous-unités constitutives des protéines,

Parfois source énergétique

2011-10-05

34


Les antibiotiques

Ils ont été introduits à l’origine dans les milieux de culture pour réduire la fréquence des contaminations.

L’utilisation de hottes à flux laminaire couplés à l’utilisation de techniques aseptiques ont rendu l’usage des ATB inutile

Leur usage doit être réservé aux cultures primaires ou les expériences très couteuses en temps et argent


Les antibiotiques

2011-10-05

35


Rôle des constituants des milieux définis

Vitamines

Cofacteurs d’enzymes ou précurseurs pour la synthèse de molécules.

Glucose

Source d’énergie et source de carbone.

Rouge de phénol

Permet de visualiser les variations du pH, adapté car zone de virage située à la valeur du pH à réguler.

Système tampon

Permet la régulation du pH : régulation obligatoire pour les cellules de mammifères notamment qui sont issues d’un organisme où règne l’homéostasie.


Le sérum

Le pourcentage de sérum additionné au milieu défini varie, selon le type cellulaire, de 2 à 20 %, le plus souvent de l’ordre de 5 à 10 %.

L'effet cyto-stimulant global du sérum est inversement proportionnel à l'âge du donneur.

Les plus fréquemment retrouvés sont : le sérum de veau, le sérum de veau nouveau-né, le sérum de veau fœtal (SVF).

Le sérum est un mélange de composition extrêmement complexe qui contient, un grand nombre de substances libérées par toutes sortes de types cellulaires de l'organisme donneur.

2011-10-05

36


Avantages du sérum

Apport de facteurs de croissance permettant la prolifération cellulaire

Apport d’hormones

Apport de facteurs d’attachement contribuant à la bonne adhérence indispensable à la division cellulaire

Rôle protecteur : augmente la viabilité cellulaire et la stabilité des produits cellulaires

Propriétés nutritives (nombreux métabolites, ions, oligoéléments et lipides en solution)

Pouvoir tampon

Apport de protéines de transport (transportent des substances de faible poids moléculaire, fer et acides gras par exemple)

Pouvoir détoxifiant: absorbe et neutralise les toxines


Inconvénients du sérum

2011-10-05

37


Composition partielle du sérum


Principales fonctions des constituants du sérum

Facteurs de croissance et hormones:

Facteurs de croissance: Peptides impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire (messagers chimiques). Ils ont un effet mitogène et permettent la prolifération cellulaire.

Hormones: Messager chimique véhiculé par le système circulatoire qui agit à distance de son site de production par fixation sur des récepteurs spécifiques

Facteurs d'attachement (fibronectine):

Glycoprotéines qui favorisent l'adhésion des cellules.

Propriété nutritive :

Glucose

Riche en nombreux oligoéléments.

2011-10-05

38


Principales fonctions des constituants du sérum

L’albumine

Elle remplit différentes fonctions dont celle d’être le transporteur de substances lipophiles (acides gras, éléments de trace, hormones et vitamines liposolubles), mais aussi de permettre la détoxification du milieu (transport de H2O2, fixation de toxines).

Le sérum présente l’avantage d'apporter des inhibiteurs de protéases, l‘α2-macroglobuline et l'α1-antitrypsine, qui inactivent la trypsine que l'on utilise en routine pour le repiquage des cultures.


2011-10-05

39


Réservation des lots de sérum

La variation des lots de sérum peut être due à:

Une différence dans les méthodes de préparation et de filtration du sérum

Une différence d’âge et de stockage des lots

Une différence entre les stocks d’animaux (matériel brut)

Etc.

Un lot de sérum se conserve de 6 mois à un an à -20°C.

Il est possible de demander aux fournisseurs de réserver un lot de sérum


Tests des lots de sérum

La qualité d’un sérum est garantie par le fournisseur mais ces contrôles sont généralement effectués à partir d’un petit nombre de lignées cellulaires

Vous devrez tester le sérum sur vos propres lignées !!

Il existe 4 principaux paramètres pour tester le sérum

Efficacité de clonage

Courbe de croissance

Préservation des caractéristiques cellulaires

Stérilité

2011-10-05

40


Tests des lots de sérum: efficacité de clonage

Durant le clonage, les cellules sont à très faible densité et sont très fragiles = meilleure condition pour tester le sérum.

Ensemencer les cellules à raison de 10 à 100 cellules/mL et regarder les colonies après 2 semaines de culture.

Marquer et compter les colonies et regarder les différences dans l’efficacité de clonage (survie) et la taille des colonies (prolifération).

Chaque sérum devrait être testé pour des valeurs comprises entre 2 et 20 %.

Cette méthode révèle si un sérum 1) est performant à faible concentration (= sauver de l’argent) et toxique à des fortes concentrations.


Tests des lots de sérum: Courbe de croissance

Une courbe de croissance cellulaire devrait être réalisé pour chaque lot de sérum.

Une longue phase de latence indique que la culture doit s’adapter au sérum

Un temps de doublement rapide est préférable si l’on souhaite obtenir rapidement un lot de cellules et une concentration cellulaire maximale

2011-10-05

41


Tests des lots de sérum: préservation des caractéristiques cellulaires

En gros, les cellules doivent faire ce qu’on leur demande dans le nouveau sérum

Produire un virus, une protéine recombinante, se différencier, etc.

Tests des lots de sérum: Stérilité

Principalement les mycoplasmes


Inactivation du sérum à la chaleur

Le sérum est inactivé à la chaleur en l’incubant 30 mn à 56°C, puis il est aliquoté et conservé à -20°C.

Le chauffage est utilisé pour inactiver le complément lors d’expériences d’immunologie

Par contre, pour certains types d’applications (production de virus, protéines recombinantes) cela ne sert pas à grand-chose

On le fait quand même «par tradition»

Il semblerait que ce chauffage diminue le nombre de mycoplasmes, mais ne les élimine pas.

2011-10-05

42


Autres suppléments

Hydrolysats: beaucoup de suppléments sont des dérivés de milieux utilisés en fermentation

Bactopeptone, tryptose, hydrolysate de lactalbumine

Digestion protéolytique de cœur de bœuf

La bactopeptone et la tryptose peuvent contenir des nucléosides, des acides gras, des carbohydrates = substituts au sérum

Il est possible de les stériliser par autoclave

Pham et al, 2005


Autres suppléments

Extrait d’embryons

Milieu conditionné: culture sur couche nourricière

Couche de fibroblastes irradiés (perte de la capacité à se diviser)

2011-10-05

43


Milieu entièrement défini (sans sérum)

Différents constituants définis sont additionnés à des concentrations définies à un milieu synthétique de base riche (type HAM F12 ou MCDB 104). L'addition de ces substances varie en fonction des exigences du type cellulaire cultivé.

Avantages:



Inconvénients:

Emploi pouvant nécessiter une adaptation des cellules

Emploi souvent limité quant aux types cellulaires et aux applications

Moins bonne viabilité cellulaire à densité élevée

Moins bonne protection des cellules et des produits

Pas nécessairement moins chers que les milieux supplémentés en sérum

2011-10-05

44


Quelques exemples de Milieux entièrement définis (sans sérum)


2011-10-05

45



2011-10-05

46




Les facteurs de croissance:

Leur action sur les cellules est déclenchée par la formation d'un complexe spécifique avec un récepteur. Il en résulte:

soit une augmentation de la taille de la cellule,

soit une augmentation de la population cellulaire,

soit une induction ou un blocage d'une étape de différenciation.

Les facteurs de croissance sont des polypeptides dont la majorité d'entre eux sont actuellement la technologie de l’ADN recombinant.

Un milieu sans sérum et contenant ces facteurs devient très onéreux. Un tel milieu n’est utilisable que pour la recherche, mais rarement pour la production.

2011-10-05

47


Les facteurs de croissance



2011-10-05

48





2011-10-05

49




Domaines d’utilisation des milieux de culture de cellules animales

Obtention de matériel biologique cellulaire pour des études en recherche fondamentale et préclinique

Production de métabolites divers

Hormones, interférons, interleukines, facteurs de croissance, anticorps monoclonaux, etc.

Culture de tissus ou d’organes

Études physiologiques (recherche fondamentale ou appliquée)

Chirurgie réparatrice (peau, muscle, foie, vaisseaux sanguins, etc.

Production de vecteurs viraux et de vaccins

2011-10-05

50

Construction et sélection de clones CHO recombinants

Mammalian cell biotechnology in protein production. Par Hansjörg Hauser, Roland Wagner


Mammalian cell biotechnology in protein production. Par Hansjörg Hauser, Roland Wagner

2011-10-05

51


Construction et sélection de clones CHO recombinants « Fluorescent labelling in semi-solid medium » method

Instead of picking and analyzing blindly hundreds of clones, cells are directly labelled with a fluorescent antibody against the secreted re-protein

More efficient than limiting dilution

Thousands of clones can be screened rapidly

Only positive clones are analyzed for re-protein production

Procedure overview:

Pool of stable transfectants is generated

Cells are plated at low density in semi-solid culture medium in the presence of fluorescent antibody against re-protein

Fluorescent colonies are scanned, quantified, selected and picked

Clones are amplified and analyzed in batch cultures

2011-10-05

52


Untreated

Flat bottom

No autofluorescence

with black wall to reduce extraneous light


Cell selector

Scanned,

Quantified,

Picked

Transfer into96 wellplates

2011-10-05

53


Caron et al, 2009

« Fluorescent labelling in semi-solid medium » method

Formulation d’un milieu de culture microbien

2011-10-05

54

Formulation d’un milieu de culture microbien

Cours 5 - Les milieux de culture - étudiant

Documents

Transcript of Cours 5 - Les milieux de culture - étudiant