Corso di Biologia Molecolare - Laurea Triennale MODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE 1)...
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Corso di Biologia Molecolare - Laurea
TriennaleMODULO DI REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE
1) Metodiche per lo studio dell’RNA (trascrizione in vitro, Northern blot, interazioni nnRNA-proteine)
2) Produzione delle estremità 3’ degli mRNA - La poliadenilazione e U7 snRNA
3) Lo splicing e i piccoli RNA nucleari (regolazione di splicing – L32)
4) RNA interference e miRNA
Materiale didattico:Materiale disponibile su: http://www.gbm.uniroma1.it/informazioni/elencoDocenti.php
Testi consigliati:Biologia Molecolare – R.F. Weaver – Mc Graw Hill -Biologia Molecolare della cellula –Lodish et al. Ed. ZanichelliIl Gene - B. Lewin, Ed. Zanichelli
Quale è la differenza tra l’RNA ed il DNA?
L’ RNA ha l’uracile al posto della timina
L’ RNA ha il ribosio al posto del desossiribosio
L’ RNA è a singola elica, rispetto alla doppia elica del DNA, ma può strutturarsi in conformazioni a doppia elica molto complesse
Differenze tra DNA e RNA
L’ RNA ha l’uracile al posto della timina
CH3 timina
Desossi-ribosio
DNA
RNA
O
OH OH
O5’ribosio
P
Base
azotata
P P
O
OH H
O5’ P
Base
azotata
P P
Queste differenze hanno delle implicazioni funzionali ed evolutive
Le prime molecole “viventi” dovevano essere in grado di replicare e svolgere funzioni
Agli inizi degli anni ‘80 furono scoperti RNA che erano in grado di ricopiare altre molecole di RNA e che svolgevano funzioni catalitiche simili a quelle svolte dagli enzimi proteici
• mRNA splicing e la traduzione sono ribo-enzimi
• l’RNA regola la stabilità di altre molecole di RNA
• parte del genoma deriva da elementi ad RNA
L’RNA è in grado di replicare se stesso
RNA RNA proteine
?
Mondo ad RNA
Solo i polimeri di RNA hanno
mostrato capacità replicativa.catalytic
(+) strandtemplate(–) strand
catalytic (+) strand copies unfolded template (–) strand
two catalytic (+) strandsand original template (–) strand
Se l’RNA può essere sia enzima che stampo, e l’RNA può replicare se stesso….ecco la prima molecola “vivente”!
Cech dimostrò che l’RNA poteva polimerizzare legamifosfodiesterici ricopiando un templato di RNA
Protogenomamolecole di RNA
autoreplicanti capaci di dirigere semplici reazioni
biochimiche
Verso un mondo a DNA
sintesi di deossiNTP da riboNTP -
sintetasi mutanti che incorporavano dNTP (retrotrascrittasi) - prime sintesi di DNA
vantaggi del DNA - desossiribonucleotidi più stabili perché manca l’OH in 2’ sullo zucchero
OH H OH OH
upstream elements
promoter elements
transcription START site
introns
exons
TRANSCRIPTIONCAPPING
SPLICINGPOLYADENYLATION
m7G
m7G AAAAAAAAAn
m7G AAAAAAAAAn
TRANSPORT
TRANSLATION
gene
pre-mRNA
polyadenylated pre-mRNA
mature mRNA
Espressione genica negli eucarioti
La regolazione post-trascrizionale
Per tanti anni lo studio della regolazione dell’espressione genica si è concentrato sul controllo trascrizionale.Il motivo risiede nel fatto che i primi geni isolati codificavano per prodotti espressi nel differenziamento terminale (prevalentemente sotto controllo trascrizionale - globine, immunoglobuline, ovalbumina)
Quando si sono isolati i geni housekeeping o quelli finemente modulati nel differenziamento cellulare ci si è accorti che molta parte della regolazione dell’espressione genica avveniva a livello post-trascrizionale
Perché studiare l’RNA?
splicing/processing sn-snoRNAs
poliadenilazione/formazione 3’ snRNAs
modificazioni (CH3,U) snoRNAs
trasporto
traduzione miRNAs
editing gRNAs
stabilità siRNAs
Regolazione post-trascrizionale
nu
cle
us
cyto
pla
sm
RNA non codificanti
large - rRNA 18+28S
Xist
small - 5S rRNA traduzione tRNA traduzione snRNAs splicing snoRNAs modificaz./process. rRNA
scRNAs controllo traduzionale gRNAs editing
piRNAs stabilità del genoma miRNAs controllo traduzionale
siRNAs stabilità dell’RNA rasiRNAs silenziamento trascriz. …?….
…?…
……
La maggior parte dei trascritti del genoma sono RNA non codificanti per proteine
……
……
Metodi di studio Metodi di studio dell’RNAdell’RNA
• Trascrizione in vitroTrascrizione in vitro• Northern blotNorthern blot• Preparazione di estratti cellulariPreparazione di estratti cellulari• Studio delle interazioni tra RNA e proteineStudio delle interazioni tra RNA e proteine
• Trascrizione in vitroTrascrizione in vitro• Northern blotNorthern blot• Preparazione di estratti cellulariPreparazione di estratti cellulari• Studio delle interazioni tra RNA e proteineStudio delle interazioni tra RNA e proteine
Trascrizione Trascrizione in vitro in vitro dell’RNAdell’RNA
• Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un
promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)
-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)
-Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasipolimerasi
-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C
-estrarre l’RNA-estrarre l’RNA
• Procedura Procedura -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un -Clonare il DNA stampo in un vettore contenente un
promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)promotore per le RNA polimerasi fagiche (T7 o SP6)
-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)-Linearizzare il DNA stampo con enzimi di restrizione (*)
-Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA -Incubare in provetta DNA, ribonucleotidi trifosfato e RNA polimerasipolimerasi
-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C-Lasciare procedere la reazione per 1-2h a 37°C
-estrarre l’RNA-estrarre l’RNA
T7 o SP6
promoter
Sito di restrizione per *
cDNA
+ RNA pol+ NTPs+ 32P-UTP
Trascrizione
RNA radioattivo
digestionelinearizzazione
1000V 22 mA
RNA RNA circolarecircolare
RNA e DNA sono RNA e DNA sono carichi negativamentecarichi negativamente
catodocatodo
--
anodoanodo
++
Analisi diAnalisi di RNA marcato su gel e RNA marcato su gel e autoradiografiaautoradiografia
• Procedura Procedura – Isolare l’RNAIsolare l’RNA – Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o
PAGE)PAGE)– Trasferire l’RNA su membrana (nylon)Trasferire l’RNA su membrana (nylon)– Ibridazione con una sonda marcataIbridazione con una sonda marcata
• Procedura Procedura – Isolare l’RNAIsolare l’RNA – Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o Elettroforesi dell’RNA su gel (agarosio o
PAGE)PAGE)– Trasferire l’RNA su membrana (nylon)Trasferire l’RNA su membrana (nylon)– Ibridazione con una sonda marcataIbridazione con una sonda marcata
Northern blotNorthern blot
Elettroblot Elettroblot (per gel di (per gel di poliacrilammide)poliacrilammide)
Buffer Buffer TB 0.5XTB 0.5X
blotting paperblotting paper
gegell
blotting paperblotting papergel gel (acrilammide)(acrilammide)
MembranaMembrana(nylon)(nylon)
blotting paperblotting paper
10V10V 80 mA80 mA
ONON
Membrana (nylon)Membrana (nylon)
Polo +Polo +Polo -Polo -
Controllo, mediante colorazione con bromuro Controllo, mediante colorazione con bromuro d’etidio, del trasferimento dell’RNAd’etidio, del trasferimento dell’RNA
Membrana
prima28S rRNA
18S rRNA
Gel
dopo
A B C D
Gel
Soluzionedi sviluppo
Soluzionedi fissaggio
Lastra
mRNA per la proteina X
A B C D
Lastra autoradiograficamessa a contatto con il filtro
Lastra sviluppata
1) Ibridazione della membrana con una soluzione 1) Ibridazione della membrana con una soluzione nnnncontenente una sonda (RNA o DNA a singolo contenente una sonda (RNA o DNA a singolo nnnnfilamento) marcata radioattivamentefilamento) marcata radioattivamente2) 2) Rivelazione dei segnali
Alcune Alcune applicazioni...applicazioni...
1.1.In quali tessuti è In quali tessuti è espresso il trascritto?espresso il trascritto?
2. Come varia 2. Come varia l’espressione del l’espressione del trascritto?trascritto?
miR-124amiR-124a
miR-98miR-98
U2 snRNAU2 snRNAcontrollo di controllo di caricamentocaricamento
++stimolostimolo
0,00
20.000,00
40.000,00
60.000,00
80.000,00
100.000,00
120.000,00
miR-98 miR-124a
assenza di assenza di stimolostimolo
+ stimolo+ stimolo
Estratti cellulariEstratti cellulari
• ProceduraProcedura• Cellule sedimentate, incubate in tampone Cellule sedimentate, incubate in tampone
di lisi (contenente detergente non ionico)di lisi (contenente detergente non ionico)• Dopo agitazione, gli omogenati sono Dopo agitazione, gli omogenati sono
centrifugati: i supernatanti contengono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici.estratti citoplasmatici.
• I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nuclearigli estratti nucleari
• ProceduraProcedura• Cellule sedimentate, incubate in tampone Cellule sedimentate, incubate in tampone
di lisi (contenente detergente non ionico)di lisi (contenente detergente non ionico)• Dopo agitazione, gli omogenati sono Dopo agitazione, gli omogenati sono
centrifugati: i supernatanti contengono centrifugati: i supernatanti contengono estratti citoplasmatici.estratti citoplasmatici.
• I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati I sedimenti, contenenti i nuclei, sono lisati in un tampone di estrazione per ottenere in un tampone di estrazione per ottenere gli estratti nuclearigli estratti nucleari
Purificazione di Purificazione di proteineproteine
• ProceduraProcedura• Si fissa ad un supporto solido una Si fissa ad un supporto solido una
molecola esca che ha affinità per la molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo)anticorpo)
• Si fa scorrere lungo il supporto solido un Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga estratto cellulare in modo che avvenga l’interazione specifica con la molecola l’interazione specifica con la molecola esca immobilizzataesca immobilizzata
• Si recuperano le proteine trattenute con Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola escacon la molecola esca
• ProceduraProcedura• Si fissa ad un supporto solido una Si fissa ad un supporto solido una
molecola esca che ha affinità per la molecola esca che ha affinità per la proteina che vogliamo isolare (es. proteina che vogliamo isolare (es. anticorpo)anticorpo)
• Si fa scorrere lungo il supporto solido un Si fa scorrere lungo il supporto solido un estratto cellulare in modo che avvenga estratto cellulare in modo che avvenga l’interazione specifica con la molecola l’interazione specifica con la molecola esca immobilizzataesca immobilizzata
• Si recuperano le proteine trattenute con Si recuperano le proteine trattenute con una soluzione che ne destabilizza i legami una soluzione che ne destabilizza i legami con la molecola escacon la molecola esca
Cromatografia per affinità
SDS-PAGE
Colorazione con Blu di Coomassie
acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
• ProceduraProcedura• si effettua una trascrizione in vitro si effettua una trascrizione in vitro
dell’RNA di interesse.dell’RNA di interesse.• Si incuba il trascritto marcato con un Si incuba il trascritto marcato con un
estratto proteico contenente la proteina estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare l’RNA di interesse che si ipotizza legare l’RNA di interesse
• Il complesso RNA-proteina viene quindi Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non analizzato su gel di acrilammide non denaturantedenaturante
• ProceduraProcedura• si effettua una trascrizione in vitro si effettua una trascrizione in vitro
dell’RNA di interesse.dell’RNA di interesse.• Si incuba il trascritto marcato con un Si incuba il trascritto marcato con un
estratto proteico contenente la proteina estratto proteico contenente la proteina che si ipotizza legare l’RNA di interesse che si ipotizza legare l’RNA di interesse
• Il complesso RNA-proteina viene quindi Il complesso RNA-proteina viene quindi analizzato su gel di acrilammide non analizzato su gel di acrilammide non denaturantedenaturante
Analisi di Analisi di interazione RNA-interazione RNA-
proteineproteine
Analisi
interazioni
RNA-proteine:
band shift
RNA radioattivo
estratto proteico
legame specifico
RNA senza aggiunta di proteine
elettroforesiautoradiografia
complesso
RNA libero
incubazione
Saggio di band shift
RNA libero