Conteo en La Camara de Neubauer

5/9/2018 Conteo en La Camara de Neubauer - slidepdf.com

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ANEXO 1

Conteo en cámara de Neubauer.

Esta cámara se utiliza para conteo celular.

• Limpie la cámara y la laminilla de cuarzo suavemente con alcohol.

• Revise la laminilla de cuarzo que no debe estar desbordada o quebrada.

• Coloque la laminilla de cuarzo sobre la cámara en forma vertical, esta debe

quedar centrada.• Proceda a llenar la cámara. Este paso es muy importante y definitivo en la

distribución de las células. Es recomendable llenarla con micropipeta pequeña

o con una jeringa ya que la cámara se llena con una gota. El llenado debe ser

continuo en un solo intento.

• La cámara no puede quedar seca esto se detecta porque en las esquinas del

recuadro de llenado se ven porciones secas. Tampoco se debe inundar, la

apariencia en la cámara es de líquido abundante en las terminaciones del

recuadro.

Conteo: Lleve la cámara a el microscopio y enfoque el cuadro de conteo con el

ocular de 4X. Observará lo siguiente.



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• Si las células que va a contar son pequeñas como son las levaduras, bacterias,

etc., ubicarse en la cuadricula central y pasar al ocular de 10X. Se visualizará

de la siguiente manera:

• En esta cuadricula se visualizan 25 cuadros, de los cuales se cuentan las

células presentes en 5 campos, generalmente se cuentan los cuadros de las

esquinas y el central, lo que garantiza un conteo aleatorio.

Para realizar el conteo se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza cada uno

de los campos y con ayuda de el carro del microscopio se desplaza la



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cuadricula hasta contar en todos los cuadros. El conteo en estos campos de la

cámara de conoce como AP (alto poder). Con el lente de 40X cada cuadro se

ve de la siguiente manera:

• Las células se cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. Se recomienda

realizar el conteo siguiendo las flechas para evitar que se cuenten las células

dos veces o no que no se cuenten. Alrededor de cada cuadricula se observa

que hay tres líneas que delimitan el cuadro, que son fundamentales en el

momento del conteo ya que definen cuales células son contables o cuales

están fuera del campo de conteo. Las células que no tocan la segunda línea

son contables, si la tocan o están encima de ella no se incluyen. Gráficamente

se puede apreciar la forma correcta de conteo. Las células que tiene una X son

las que no se deben contar.



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• Después de contar las células se procede a calcular la el numero de células

por unidad de volumen. Para esto se utiliza el área de cada cuadro, el espacio

ocupado por el líquido en el que están las células que es el mismo espacio que

hay entre la cuadricula de la cámara y la laminilla de cuarzo.

• Se promedia el número de esporas de la cámara de arriba con la de abajo, se

multiplica por el factor de dilución y por un factor F igual a106 si se contó el

cuadro central o 104 si se contaron los cuadros de los extremos, obteniendo el

valor X.

Si 1ml del preinoculo ____________ X esporas

? ____________ Esporas a inocular (Ej.: 1*108 esporas)

Luego, este valor se multiplica por la cantidad de mililitros de medio en el que va a

desarrollarse el microorganismo, esta cantidad se aproxima y se expresa en ul.



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ANEXO 2

Método del Ácido Dinitrosalicílico (DNS)

Pasos para preparar DNS:

• Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.

• Adicionar 30 g de tartrato de Na y K

• Adicionar 1 g de DNS

• Aforar a 100 mL con H2O destilada• Almacenar en frascos ámbar a 4 ºC

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg / mL y almacenarlo a 4 ºC. A partir

de la solución de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrón

con la siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.

Procedimiento:

• Tomar 0.5 mL de cada dilución y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.

• Preparar una muestra blanco por dilución de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL

del reactivo de DNS.

• Agitar todas las muestras.

• Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos.

• Enfriar con hielo.

• Adicionar 5 mL de H2O destilada.

• Agitar y dejar en reposo 15 min.

• Leer a 540 nm.



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• Realizar la curva Absorbancia versus concentración. Debe tener un coeficiente

de correlación de 0.991 a 0.999.

Figura 14. Método de DNS

0.5ml muestraproblema + 0.5 ml DNS

Ebullición de muestra5min

Enfriar con hielo

Agitar y reposar 15min

Leer Absorbanciaλ= 540nm

0.5ml agua destilada



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ANEXO 3

Método de Lowry

Para obtener la curva estándar de Albúmina se preparan 5 soluciones patrones de

Albúmina en NaCl al 0.9% (P/V) de las siguientes concentraciones: 15.2, 80, 200,

300 y 400 µg/mL. Si la concentración de Proteína es menor de 500 µg/mL se lee

la absorbancia a 750 nm, si está entre 1000 y 2000 µg/mL se lee a 550 nm. Se

prepara un blanco que no lleva Albúmina y en su reemplazo se adicionan 0.5 mL

de solución salina (NaCl) al 0.9% (P/V). Se aplica el mismo procedimiento que alas demás muestras.

Procedimiento:

• Servir en tubos de ensayo 0.5 mL de las soluciones patrón de albúmina, las

muestras problema y NaCl al 0.9% como blanco. Deben estar marcados para

conservar el orden de concentraciones para la curva.

• Adicionar a cada tubo 0.5 mL de NaOH 2N y llevar al baño María precalentado

a 100°C por un tiempo de 10 minutos.

• Dejar enfriar hasta que alcance la temperatura ambiente.

• Agregar a cada tubo 5 mL de la solución complejante, mezclar y dejar reposar

por 10 minutos.

• Adicionar 0.5 mL del reactivo de Folin-Ciocalteu 1:1, vortexiar durante 20

segundos.

• Reposar en un cuarto oscuro durante 30 minutos.

Leer la absorbancia a 750 nm y con las soluciones patrón construir la gráfica

Absorbancia vs. Concentración de albúmina sérica de bovina (BSA); con esta se

puede determinar la concentración de las muestras problema interpolando el valor



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de absorbancia. La curva estándar debe tener un coeficiente de correlación (r) de

0.991 a 0.999.

Figura 15. Método de Lowry

0.5ml de solución

Preparar tubos 1, 2, 3, 4,5 y blanco

Adicionar

Mezclar yagitar

Reposar

10 min.

Mezclar en vórtex 20

Leer absorbancia

Graficar Absorbancia

Vs.

Calentar 100ºC 10min.

0.5ml de NaOH 2N

0.5ml de Reactivo

Enfriar aTem. Ambiente



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ANEXO 4

Tablas ANOVA

Este es el análisis estadístico de las tablas ANOVA para el crecimiento microbiano

de microorganismos, variando el pH de extracción del Higo y la concentración de

nutrientes.

Tabla 35. Análisis de varianza efecto de pH de extracción sobre el crecimiento de A. niger .

ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de lasvariaciones

Suma decuadrados

Grados delibertad

Promedio delos cuadrados F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 124,684607 3 41,56153572,06354694 0,122294492,86626545Dentro de losgrupos 725,069663 36 20,140824

Total 849,75427 39

Tabla 36. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato en el

crecimiento de A. niger .


Suma decuadrados

Grados delibertad



Entre grupos 1255,85077 3 418,61692412,9680654 3,344E-062,81646351Dentro de losgrupos 1420,34637 44 32,2805993

Total 2676,19714 47



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Tabla 37. Análisis de varianza de la incidencia del pH de extracción en elcomportamiento del Trichoderma harzianum

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de lasvariaciones Suma decuadrados Grados delibertad Promedio delos cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 108,935449 3 36,31181644,02126552 0,014467032,86626545Dentro de losgrupos 325,078109 36 9,02994747

Total 434,013558 39

Tabla 38. Análisis de varianza de la incidencia de la concentración en elcrecimiento del Trichoderma harzianum


Suma decuadrados

Grados delibertad



Entre grupos 971,163585 3 323,72119512,0302319 7,0164E-062,81646351Dentro de losgrupos 1183,99485 44 26,9089738

Total 2155,15843 47

Tabla 39. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimientode Saccharomyces cerevisiae.

ANÁLISIS DE VARIANZAOrigen de

lasvariaciones

Suma decuadrados

Grados delibertad



Entregrupos 0,40189872 3 0,13396624 0,22807371 0,87615582 2,90111757Dentro delos grupos 18,7962027 32 0,58738133

Total 19,1981014 35



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Tabla 40. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre elcrecimiento de Saccharomyces cerevisiae.


Origen de lasvariaciones Suma decuadrados Grados delibertad Promedio delos cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F

Entre grupos 0,89247125 3 0,29749042 0,99085408 0,40807414 2,86626545Dentro de losgrupos 10,8085088 36 0,30023635

Total 11,70098 39

Tabla 41. Análisis de varianza del efecto del pH de extracción sobre el crecimientode Rhodotorula.


Origen de lasvariaciones

Suma decuadrados

Grados delibertad




Total 12,9627706 35

Tabla 42. Análisis de varianza del efecto de la concentración de sustrato sobre elcrecimiento de Rhodotorula.


Suma decuadrados

Grados delibertad




Total 15,0682993 39



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ANEXO 5

Constante K con el programa Polymath

Se utilizó el programa Polymath para hallar los valores de las constantes de K

Aspergillus niger variación del pH de extracción

• Aspergillus niger a pH de extracción 2

BiomasapH2 = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/14.786)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 1.333



134



k = 2.3556933



k = 2.2194934



135

• Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (0.96*exp(k*tiempo))/(1-((0.96/13.574)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 1.1340424

Trichoderma harzianum variación del pH de extracción

• Trichoderma harzianum a pH de extracción 2


k = 2.1203965



136


BiomsapH7 = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/11.412)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 2.2273364



k = 2.6580878



137

• Trichoderma harzianum medio de Control

BiomasaControl = (1.002*exp(k*tiempo))/(1-((1.002/9.648)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 0.97329

A. Niger variación de la concentración de azúcares reductores

• Aspergillus niger a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.158)*(1-exp(k*tiempo))))

k = 0.9509181



138



k = 1.4580631



k = 1.4753353



139

• Aspergillus niger medio de Control

Biomasa Control = (2.428*exp(k*tiempo))/(1-((2.482/13.4)*(1-exp(k*tiempo))))k = 0.6402406

T. harzianum variación de la concentración de azúcares reductores

• Trichoderma harzianum a concentración de 30g/L

Biomasa [30gr/L] = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/12.396)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 0.8190618



140



k = 1.1414981



k = 0.6289445



141

• Trichoderma harzianum medio de Control

Biomsa Control = (3.21*exp(k*Tiempo))/(1-((3.21/10.634)*(1-exp(k*Tiempo))))

k = 0.4885395

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