CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre...
-
Upload
doriane-claudel -
Category
Documents
-
view
104 -
download
0
Transcript of CONTAMINANTS ALIMENTAIRES ET CIBLES CELLULAIRES Exemple des pesticides Laurence Gamet-Payrastre...
CONTAMINANTS ALIMENTAIRES
ET CIBLES CELLULAIRES
Exemple des pesticides
Laurence Gamet-PayrastreLaurence Gamet-Payrastre [email protected]@toulouse.inra.fr
• Des facteurs de risque pour la santé Des facteurs de risque pour la santé chez l’hommechez l’homme
• Mécanisme d’action de la toxicité des Mécanisme d’action de la toxicité des pesticides :Les cibles cellulairespesticides :Les cibles cellulaires
• Les approches en toxicologie cellulaire Les approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités● Définition
toute substance naturelle ou de synthèse capable de contrôler, repousser ou détruire des organismes vivants ou de s’opposer à leur développement. Produits phytosanitaires destinés à un usage agricole ou non agricole
● Classification selon leur activité biologique- les insecticides- les fongicides -les herbicides- les divers (nématicides, rodenticides, taupicides, etc…)
● Classification par famille chimique:
- Composés organiques chlorés (DDT, Lindane, Aldrine, Dieldrine, etc.)
- Composés organiques phosphorés (Parathion, Fenthion)
- Composés organométalliques (Dérivés de l’urée, carbamates, etc.)
- pyréthrinoides de synthèse, triazine etc…. "
• Usage agricole (90%)
- 3 ième consommateur mondial de pesticides - 4 ième utilisateur européen (par hectare de surface cultivée ) • Usage non agricole (10%)
- traitement des parasites dans la maison- traitement des bois et textiles- soins des animaux- traitement des plantes d’intérieurs, jardins, espaces verts
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
Exposition professionnelle Exposition professionnelle • Population définie
1.3 millions de personnes professionnellement
exposées en France (X2 avec les retraités)
• Molécules définies• Temps d’exposition défini
Exposition non professionnelleExposition non professionnelle 80% via l’alimentation
Les pesticides : généralitésLes pesticides : généralités
Exposition alimentaire -Mélange de résidus-long terme-Faibles doses
L’exposition professionnelle aux pesticides, et en particulier chez les agriculteurs, est souvent corrélée à un risque accru de troubles de la santé
- Certains cancers (hématopoïétique, cerveau, prostate) - Certaines maladies neuro-dégénératives comme la maladie de Parkinson - Certaines déficiences au niveau du développement cérébral - Des troubles de l’immunité- Des troubles de la reproduction- Des perturbations endocriniennes
Études épidémiologiques dans les populations professionnellement exposées
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
• Les cancers hématopoïétiques tumeurs du cerveau,
• des troubles au niveau du système nerveux central (développement cérébral, neuro-comportement) ou de l’immunité
Exposition professionnelle des parents pendant la période prénatale
associées à diverses pathologies chez les enfants
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
Certains pesticides, sont capables d’induire in vitro dans des cellules
humaines des perturbations du fonctionnement cellulaire
Les pesticides : des facteurs de risquesLes pesticides : des facteurs de risques
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesElimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la prolifération de la survie
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
pesticides
la génotoxicité
REPARATION ADN
Ralentissement du cycle cellulaire
Système d’excision et réparation des dommages
Système enzymatique de réparations des cassures
•Les différents dommages à l’ADN sont: les bases oxydées (8oxodG),• les coupures simples et doubles brins,• les adduits à l’ADN
• Dans les lymphocytes d’agriculteurs on observe une augmentation des cassures simples et doubles brins de l’ADN (MN) (Tope A. et al, 2006)
• Augmentation des adduits à l’ADN dans le sang périphériques des agriculteurs (J. Le Goff, ,2005)
• Dans les cellules RTG2, l’alachlore induit des cassures d’ADN (Parra JM, 2010)
30 000 lésions spontanées / jour/ cellule
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotiques
mutation
RNA, Protéines
Cellule transformée Stimulation de la prolifération
de la cellule transformée
Promotion
tumeur
Accumulation d’anomalies génétiques
définitives dans des gènes contrôlant la survie
et la prolifération
Initiation
Conséquence de la génotoxicité des pesticides ?
Réparation de l ’ADN
Ils peuvent affecter la structure du DNA et donc la transcription de gènes importants
ils peuvent conduire à des mutations qui affecteront la survie ou la capacité de prolifération des cellules.
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotiques
mutation
Réparation de l ’ADN
Cellules transformées
initiation
promotion
tumeur
ARNProtéines
Mort cellulaire programmée
Ex Methoxychlor induit une atrophie du thymus via l’induction de l’apoptose dans les thymocytes.Fukuyama T, 2010, 2010
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
mort cellulaire programmée apoptose
Processus physiologique de régulation du nombre de cellules
■ Au cours du développement embryonnaire,
■ Dans la défense immunitaire
■ Pour le renouvellement des cellules du tractus digestif
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
Le phénomène d'apoptose « mort cellulaire programmée »
modifications structurales• Plusieurs étapes en cascade,
dont les effets sont visualisables dans les cellules : – flip-flop de la
phosphatidyl-sérine du feuillet cytosolique au feuillet extracellulaire de la membrane plasmique
– Boursouflure membranaire
– fragmentation de l'ADN nucléaire
– fragmentation du cytoplasme , formation des corps apoptotiques
Apoptose Modifications biochimiques
P53 Independent pathways
Ca++
Modification de la répartition des phospholipides membranaires
Hydrolase Cytosolique inactives
Hydrolase Cytosolique actives
P53 Dependent pathways
Lésions irréversibles des protéines cytosoliques
• Le paraoxon modifie le potentiel mitochondrial transmembranaire des cellules leucémiques EL4 T, induit la libération du cytochrome c dans le cytosol et l’activation conséquentes des caspases (Saleh AM et al, 2003).
• le paraquat dichloride, un herbicide,induit l’apoptose via l’induction de P53 (Takeyama N, et al, 2004)
• Le diazinon active l’apoptose via l’activation des caspases dans les cellules de teratocarcinome humain (Aluigi MG, 2010)
Hydrolyze des enzymesde réparation de l'ADN (PARP)Et des enzymes de structure :
gelsoline lamineFragmentation de l'ADN
Cascade d'activation d'enzymes
APAF-1 : apoptosis protease activating factor-1 ; CAD : caspase-activated internucleosomal DNAse ; IAP : inhibitors of apoptosis proteases ; PARP : poly(ADP-ribose) polymerase ; pro-CASP-9 : précurseur inactif de la caspase initiatrice CASP-9.
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticidesconséquence de la génotoxicité : apoptoseconséquence de la génotoxicité : apoptose
la toxicité d’un xénobiotique peut être due à une variation du statut
oxydo-réducteur de la cellule
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Statut oxydo-réducteur : définition
ROS espèces oxygénées réactives
Echec régulationstatut redox
Stress oxydant
Attaque lipide, DNA, protéines
O2
Chaine
mitochondriale
InflammationDéfenses
cellulaires
PROTECTION
Initiation
Promotion: expansion clonaleCroissance et Instabilité génétique
tumeur
Dégâts cellulairesMutation DNA
apoptose
RéparationDNA
Systèmes enzymatiques (SOD, catalase, glutathion peroxydase)glutathionAnti-oxydants vit E, C
cytoP450
Facteurs environnementauxRadiation, ozone, hyperoxie, xénobiotiques
Radicaux primaires dérivent de l’oxygène (OH., O2., NO.)jouent un rôle cellulaire dans : défense, cycle cellulaire, différenciation, mort cellulaire, transduction des signaux
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Exemple d’effet pro-oxydant des pesticides
• Dans les follicules ovariens isolés, le methoxychlore entraine une diminution des activités enzymatiques régulant le statut oxydo-réducteur (SOD, catalase, super-oxyde dismutase) et modifie l’activité respiratoire des mitochondries. Gupta
RK et al, 2006
• Le malathion (OP) inhibe l’activité des enzymes de régulation du stress oxydant , diminue la production d’ATP et altère la matrice mitochondriale. Delgado EHB et al, 2006.
• Le traitement des rats avec du chlorpyrifos (insecticide, OP) conduit à une diminution des activité des enzymes du type SOD, catalase, à une déplétion en glutathion intracellulaire dans le foie , le rein et le cerveau des animaux traités avec 100mg/kg; (forte dose). Verma RS et al, 2007.
• Enantioselective cytotoxicity of isocarbophos is mediated by oxidative stress-induced JNK activation in human hepatocytes. Liu H, Liu J, Xu L, Zhou S, Li L, Liu W. Toxicology. 2010 .
• Hydrogen peroxide induced by the fungicide prothioconazole triggers deoxynivalenol (DON) production by Fusarium graminearum. Audenaert K, Callewaert E, Höfte M, De Saeger S, Haesaert G. BMC Microbiol. 2010
• Pentachlorophenol and its derivatives induce oxidative damage and morphological changes in human lymphocytes (in vitro). Michałowicz J.Arch Toxicol. 2010
• Oxidative stress induced by loss of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1) or superoxide-generating herbicides causes axonal degeneration in mouse DRG cultures.Fischer LR, Glass JD. Acta Neuropathol. 2010
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la survie de la prolifération
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
La transduction du signal
La transduction du signalTout processus qui convertit un type de signal ou un stimulus vers une réponse cellulaire• via une succession d’évènements biochimiques (de phosphorylation et de déphosphorylation) • dans lesquels interviennent de nombreuses enzymes (kinase/phosphatase) i.e. les intermédiaires de la signalisation
Cascade de phosphorylationdéphosphorylation
La transduction du signal peut se faire soit via- La liaison de molécules sur des récepteurs membranaires ou intracellulaires
- Un stimulus « physique » (lumière/cellules de la rétine)
- L ’interaction directe d’une molécule (xénobiotiques) avec les intermédiaires de la signalisation
Réponse cellulaire, survie, prolifération, mort cellulaire, différenciation
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
Les intermédiaires
• Les pesticides organochlorés (endosulfan, lindane) active la voie des MAP kinases (raf MEK et ERK) ainsi que la transcription de c-Jun. Ledirac N et al, 2005.
• L’isocarbophos, un organophosphoré, induit la production de ROS, l’activation de la voie dépendante de la JNK et l’apoptose dans les cellules HepG2. Liu H, 2010
Cibles cellulaires des pesticidesCibles cellulaires des pesticides
La phosphorylation et la déphosphorylation modulent l'activité de certains facteurs de transcription :
•en les activant directement (exemple : facteur AP-1)
•en modifiant leur localisation cellulaire (exemple : facteurs NFkB et NFAT)
Elimination du conjugué
les systèmes de détoxification
xénobiotique
s
Mort cellulaire programmée
Transduction du signalStatut oxydo-réducteur
la génotoxicité
La régulation de la prolifération de la survie
Toxicologie cellulaire et moléculaireLes approches
Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire
EstimationEstimation de la viabilitéde la viabilité
• MTT sels de tetrazolium converti par les deshydrogenases mitochondriales actives en formazan (absorbance 570nm)
• Comptage cellulaire comptage des cellules flottant dans le milieu de culture et comptage des cellules adhérentes
Approches en toxicologie cellulaire Approches en toxicologie cellulaire et moléculaireet moléculaire
GénotoxicitéGénotoxicité
Comet assay
mesure des cassures simples et doubles brins induites - directement par un agent génotoxique,- indirectement lors des processus enzymatiques de réparation des dommages - lors de processus secondaires de fragmentation de l’ADN tel que l’apoptose.
- Principe : électrophorèse en gel d’agarose de noyaux marqués avec un agent fluorescent.
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
les noyaux dont l’ADN a subi des cassures prennent une forme de comète et les noyaux dont l’ADN n’est pas endommagé restent ronds
Stress oxydantStress oxydant• Taux de ROS nombreuses sondes fluorescentes réactives avec les
radicaux libres
• Mesure de l’activité des enzymes régulant le stress oxydant- SuperOxyde Dismutase (SOD): 2 O2° + 2 H→2 H2O2 + O2- Catalase: 2H2O2→ 2 H2O + O2- Glutathion peroxydase: H2O2 + 2 GSH→ 2 H2O + GS-SG
• Dosage des taux de glutathion
• Dosage des marqueurs périphérique d’oxydation (8oxodg dans le plasma; détection des bases ou nucléotides modifiés par chromatographie liquide haute perf. (HPLC) + Spectrométrie de masse (MS)
• Mise en évidence marqueurs cellulaires de peroxidation lipidique (HNE (4-hydroxy -2-nonenal; MDA malonyldialdehyde) utilisation d’anticorps
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
Signalisation cellulaireSignalisation cellulaire• Western blot : migration de protéines dans un gel dénaturant en
fonction de leur poids moléculaires : identifier une protéine spécifique dans un extrait cellulaire
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculairemoléculaire
• Arrays (Protein) antibody-array : visualiser et quantifier l’expression de plusieurs protéines d’un même extrait cellulaire
Plateforme Biopuces
Génopôle Toulouse Midi Pyrénées
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : signalisation cellulairemoléculaire : signalisation cellulaire
Incorporation de iodure de propidium dans les noyaux et analyse de la quantité defluorescence qui est le reflet de la quantité d’ADN
Sub G0/G1Cellules apoptotiques
G1
G2/M
Cytométrie en flux
Double marquage iodure de propidium/ l’anexine-fluorescéine Dans les cellules apoptotiques les phosphatidyl serine membranaires sont à l’extérieur et peuvent fixer l’anexine. Les membranes ne sont pas perforées et l’iodure de propidium ne pénètre pas .
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
DNA Laddermigration de l’ADN sur gel
d’agarose. Il apparaitra sous forme de petit fragments (échelle) le long du
gel dans le cas de cellules apoptotiques
sinon on ne voit qu’une seule bande.
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
Mesure de l’activité des caspases effectrices (3)
Approches en toxicologie cellulaire et Approches en toxicologie cellulaire et moléculaire : apoptosemoléculaire : apoptose
conclusionconclusion
• Les pesticides affectent différentes cibles qui contrôlent la croissance et la survie des cellules humaines.
• Ces effets sont observés pour des molécules testées individuellement
• Qu’en est-il de l’effet des mélanges et des faibles doses