Evaluación de contaminantes en sedimento con tres

especies acuáticas mediante ensayo cometa

Arias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; ScArias, M.; Brancolini, F.; Marrochi, N.; Ruiz de Arcaute, C.; Scalise, A.M.alise, A.M.alise, A.M.alise, A.M.

SEDIMENTOS ���� reservorio y fuente de nutrientes, plaguicidas ,

metales, bifenilos policlorados (PCBs), e hidrocarburos policiclicos

aromaticos (PAH), etc.

Fuentes de contaminación de sistemas acuáticos :

•descargas industriales

•desechos domésticos

•prácticas agrícolas

•derrames de petróleo

Introducción

Introducción Argentina 30 millones de ha sembradas � 77% con transgénicos

3,5 millones de tn Fertilizantes36 millones kg Plaguicidas

Paquete tecnológico:•siembra directa•soja transgénica•glifosato•aplicación intensiva de agroquímicos

�una fracción de los agroquímicos es transportada por las lluvias a los cuerpos de aguas superficiales � riesgo para la biota.

CASAFE (2012), SAGPyA (2007), MAGyP (2013)

Hipótesis

Los distintos usos del suelo producen diferentes grados de impacto sobre los

cuerpos de agua adyacentes

Objetivos

• Evaluar la tolerancia a contaminantes de sitios con diferentes usos del suelo para distintas poblaciones de Simocephalus

vetulus, Hyalella curvispina y Cnesterodon decemmaculatus

mediante Ensayo Cometa (EC).

• Comparar la respuesta de individuos provenientes de cada sitio con individuos criados en laboratorio.

• Establecer el efecto genotóxico (EC) a corto y a largo plazo producido por sedimentos provenientes de los distintos sitios sobre una población de laboratorio de cada una de las especies mencionadas, en condiciones controladas.

Metodología• Área de estudio: 3 arroyos entre La Plata y Magdalena, prov.

Buenos Aires, con distinto uso del suelo en sus cuencas.

• Fecha de Muestreo: durante el período de crecimiento de soja

• Especies:

Simocephalus vetulus (cladócero)

Hyalella curvispina (anfípodo)

Cnesterodon decemmaculatus (pez)

• Muestras de sedimentos de fondo por triplicado: determinación de contaminantes.

• Muestras de Agua por triplicado para la determinación de nutrientes: Nitrato, Amonio, PRS, Clorofila y Solidos Suspendidos.

• Realización de bioensayos con sedimento, agudos y crónicos, con cada especie, renovando el medio.

Área de Estudio

Arroyo El Destino (SR)

Ubicado en el Parque Costero Sur (Partido de Magdalena), declarado Reserva de Biosfera por la UNESCO.

Arroyo Sin Nombre (S1)

Ubicado en el Partido de Magdalena, sobre la intersección de la Ruta Provincial nº 54 y caminos rurales

Arroyo El Sauce (S2)

Ubicado sobre la Ruta Provincial nº36,en el Partido de La Plata.

Simocephalus vetulus

• Cladóceros: Organismos Modelos para

Bioensayos de Toxicidad

• Fam. Daphnidae.

• Ampliamente distribuido en la zona de estudio

• De gran tamaño: adultos = 2,8mm

• Fácilidad de cría en bioterios

• Tolentantes a la manipulación

• Reproducción partenogenética

• Ciclo de vida corto (30-60d)

• Nivel trófico intermedio

• Sensibilidad a diversos contaminantes

(USEPA, 2002)

Hyalella curvispina

• Crustacea – Orden: Amphipoda

• Agua dulce.

• Amplia distribución en Sudamérica

• Asociados a sustratos duros, macrófitas y

algas

• Fácil de criar en laboratorio

• Muy sensibles a la contaminación por

plaguicidas .

Cnesterodon decemmaculatus• Orden: Cyprinodontiformes• Fam: Poecílidae

• bentopelágico de agua dulce a salobre.

• Se encuentra en Argentina, Chile y Uruguay, en climas subtropicales.

• Pequeño, ovovivíparo, con marcada diferenciación sexual.

• Tolerante a variaciones de salinidad y temperatura.

• Fácil de criar en laboratorio y resistente a la manipulación.

Parámetros físicos y químicos

• Temperatura

• Oxígeno disuelto

• Conductividad

• pH

• Turbidez

• Profundidad

• Ancho

Parámetros físicos y químicos

• NH4+

• NO3-

• PRS

• Clorofila

• Sólidos

suspendidos

Espectrofotómetro

Peso seco

Análisis de Sedimento

Método Compuesto

Cromatografía Gaseosa - ECD Plaguicidas Organoclorados, Piretroides

Cromatografía Gaseosa - MSD Plaguicidas Organofosforados, Hidrocarburos

HPLC Herbicidas (glifosato, 2-4D), Fármacos, Carbamatos, Triazinas, Fenoles

Espectometría de Absorción Atómica

Metales Pesados

Esquema de los Sitios y usos del suelo

SR S1 S2

Captura de organismos

Se realizará el Ensayo Cometa sobre:

– S. vetulus, H. curvispina y C. decemmaculatus

provenientes de cada sitio.

– Animales de laboratorio de las mismas especies, expuestos a sedimento proveniente de cada sitio por 96h, y a 7, 14 y 21 días.

Ensayo agudo a 96 hs

Ensayo crónico a 21 díasPara cada especie:

• Biomarcador sensible.

• Detecta daño a bajas concentraciones.

• Permite la detección de microlesiones inducidas en el

ADN. (rupturas de simple o doble cadena) luego de la

exposición a un agente genotóxico.

• Versátil: en cualquier célula eucariota, in vivo, in vitro o

ex vivo.

• Rápido, simple y de bajo costo.

Ensayo Cometa (EC)

Metodología de EC

Las células son embebidas en agarosa y colocadas en un portaobjetos

Lisis 1h: Triton X, DMSO, NaCl

Incubación en solución alcalina: EDTA, NaOH

Electroforesis

Neutralización

Coloración y observación en microscopio de fluorescencia

En el microscopio se cuentan 100 células por preparado y se contabilizan según 5 categorías:

IDG: I (I) + II (II)+ III (III)+ IV (IV)

N (I-IV)

Se analiza estadísticamente mediante ANOVA y Test a posteriori (Dunnet).

Resultado

s

Resultados esperados EC individuos

del campo

Resultados esperados EC con sedimentos

en laboratorio

S1

Índice de daño genético (IDG) calculado para ambos ensayos:

Resultados en Agua obtenidos

Sitio Ancho Prof. pH Cond OD Turbidez T°°°° Nitrato Amonio PRS Sol. Susp. Clorof.

mts cm uS mg/L NTU ºC ug/L ug/L ug/L mg / L ug/L

Destino (SR)

11,7 31 7.4 590 5,59 14.7 20.5 125 26 8 47,2 15,7

Sin Nombre (S1)

13,8 86 7.14 83 7,25 8.6 19.7 509 522 436 20,4 8,8

El Sauce (S2)

15 50 7.31 110 7,15 10.5 18.1 402 285 576 32 5,1

Análisis de SedimentoContaminantes

Concentración en ppb

SR S1 S2

Organoclorados ND 0,5 - 10 > 50

Organofosforados ND 0,5 – 10 > 100

Piretroides ND < 100 > 100

Glifosato ND 0,5 - 10 > 150

Hidrocarburos ND ND ND

Metales Pesados ND ND ND

Conclusiones• Se observaron diferencias entre las poblaciones de los diferentes

sitios de muestreo para cada especie.

• Estas diferencias también se vieron reflejadas en los ensayos de laboratorio tanto agudo como crónico.

• La utilización del Ensayo Cometa demostró ser un biomarcador sensible a la contaminación.

• Seria conveniente complementar con otros ensayos de genotoxicidad para validar estos resultados.

• Además utilizar sedimento estéril agregando una concentración conocida de un toxico determinado.

Gracias!!!

Bibliografía

• Cavaş T, Könen S. Detection of cytogenetic and DNA damage in peripheral erythrocytes of goldfish (Carassius auratus) exposed to a

glyphosate formulation using the micronucleus test and the comet assay. Mutagenesis. 2007 Jul;22(4):263-8.

• CASAFE (Cámara Argentina de Sanidad Agropecuaria y Fertilizantes). Disponible en: http://casafe.org.ar/estad/Mercado2010.htm.

• Dekker T., G.D. Greve , T.L. Ter Laak , M.E. Boivin, B. Veuger , G. Gortzak, S. Dumfries, S.M.G. Lücker, M.H.S. Kraak , W. Admiraal, H.G.

van der Geest. 2006. Development and application of a sediment toxicity test using the benthic cladoceran Chydorus sphaericus.

Environmental Pollution 140:231-238

• Frenzilli G.; M. Nigro, B.P. Lyons. 2009. The Comet assay for the evaluation of genotoxic impact in aquatic environments. Mutation

Research 681:80–92

• Marino D., Ronco A. Cypermethrin and Chlorpyrifos Concentration Levels in Surface Water Bodies of the Pampa Ondulada, Argentina. Bull.

Environ. Contam. Toxicol. 2005. 75: 820-826.

• MAGyP (Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca de la Nación); SIIA sistema integrado de información agropecuaria. Disponible en:

http://old.siia.gov.ar/index.php/series-por-tema/agricultura.

• Singh N.P. Microgel Electrophoresis of DNA from Individual Cells.Technologies for Detection of DNA Damage and Mutations. 1996, pp 3-

24.

• SAGPyA. 2007. Secretaria de Agricultura, Ganaderia, Pesca y Alimentación, Argentina. Disponible en:

http://www.sagpya.mecon.gov.ar/new/00/nuevositio/agricultura/insumos_maquinarias/fertilizantes/panorama.pdf.

• Somma A., Mastrángelo M. y Ferrari L. 2011. Manual de producción de Cnesterodon desemmaculatus en laboratorio. Ed. Utopia

• U. S. Environmental Protection Agency (USEPA). 2000. Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation of Sediment-associated

Contaminants with Freshwater Invertebrates, second ed. EPA 600/R-99/064, March.

• U. S. Environmental Protection Agency (USEPA). 2002. Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to

Freshwater and Marine Organisms, fifth ed. EPA-821-R-02-012 U.S. Environmental Protection Agency Office of Water, Washington, DC.