Começando a decifrar... O fenômeno de restrição-modificação Infecções com bacteriófagos em...
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Começando a decifrar...
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O fenômeno de restrição-modificação
K B
Cepa K OK
Cepa B OK
Infecções com bacteriófagos em diferentes cepas bacterianas produziam o fenômeno de restrição-modificação.
Arber, 1962Nathans & Smith, 1962
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Enzimas de restrição
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Clivagem de restrição
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Sítio de Restrição
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Nomenclatura das enzimas de restrição
EcoRI Escherichia coliBamHI Bacillus amyloliquefaciens RHBglII Bacillus globigiiPvuII Proteus vulgarisHindIII Haemophilus influenzae RdHinfI Haemophilus influenzae RfSau3A Staphylococcus aureusAluI Arthrobacter luteusTaqI Thermus aquaticusHaeIII Haemophilus aegyptiusNotI Nocardia otitidis-caviarum
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Fracionamento de DNA
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Mapa de Restrição
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Utilização do Mapa
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Detectar mutações
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Comparação de Mapas
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Fracionamento de DNA
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Como reconhecer o fragmento de interesse?
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Complementariedade
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Hibridação
Calor ou pH = desnaturação
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Reassociação
Temperatura e força iônica
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Sonda
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Marcação da sonda
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Estringência
Reação de Hibridação e Lavagem:• especificidade da sonda• tamanho da sonda• temperatura (T’m)• força iônica
Especificidade : identidade de seqüência
Tamanho: fragmento/ oligonucleotídeo
Temperatura: T’m - 25oC
Força iônica: NaCl
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Southern blot
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Resultado
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Hibridação in situ
Localização de mRNA de ciclina (uma proteína que incita a célula a se dividir) = azul escuro
Em azul claro os núcleos corados com DAPI
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Southern blot
Animação
Southern.exe
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O que fazer com o fragmento?
Clonagem de DNA
A clonagem permite a eternizar o fragmento
Um pedaço de DNA de um eucarioto poderia ser
produzido por um procarioto.
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Vetores de clonagem
1. Replicação autônoma2. Marcas de seleção3. Sítio para clonagem
O que deve ter uma molécula para ser um veículo de clonagem?
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Sítio de clonagem
O sítio de restrição deve estar nas duas moléculas a serem ligadas.Após a clivagem, as extremidades são recombinadas e a enzima LIGASE refaz a ligação fosfodiester.
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Plasmídio recombinante
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Transformação
Hospedeiro: E.coli fenótipo e genótipo seleção, contenção,multiplicação
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Hospedeira transformada
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Clonagem molecular
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Outro vetor?
Bacteriófagos e, mais recentemente, cosmídios são utilizados como vetores de clonagem, principalmente quando se deseja inserir um fragmento de DNA com tamanho de ~40 kb.YACs - fragmentos maiores ainda.
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Biblioteca Genômica
Genoteca
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Varredura de biblioteca
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Seqüenciamento de DNA
Princípios
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Reação em cadeia de polimerização
1. Replicação
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PCR
2. Amplificação
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PCR - ANIMAÇÃO
Pcr.exe
Um momento, por favor, estou carregando o programa.