COME GENERARE UNA PIANTA TRANSGENICA … · dimensioni molto grandi come il plasmide Ti ... sistema...
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COME GENERARE UNA PIANTA TRANSGENICAUTILIZZANDO AGROBACTERIUM TUMEFACIENS
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Agrobacterium è in grado di trasferire nel genoma vegetale qualsiasi sequenza si trovi delimitata dai righte left borders
gene di interesse
gene di interesse
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Il gene di interesse è in genere mantenuto in vettori di clonaggio in E. coli
mcsmulti cloning site
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Il gene deve quindi essere trasferito nel plasmide Ti di Agrobacterium tumefaciens
Limitazioni per l’uso di plasmidi Ti naturali
- la sovrapproduzione di auxina e citochinina(fenotipo tumorale) non permette la rigenerazione della pianta
- i geni per la biosintesi delle opine non sono necessari
- difficoltà nel manipolare plasmidi di dimensioni molto grandi come il plasmide Ti (200 kbp)
- non hanno un’origine di replicazione per E. coli
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Come si risolve il problema?
sistema vettore binario
sistema vettore cointegrativo
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sistema vettore binario
Principio di base: DNA da trasferire e geni vir possono trovarsi su plasmidi differenti
DUE PLASMIDI- vettore binario
contiene E. coli e A. tumefaciens ori
marker di selezione batterico
marker di selezione vegetale
right/left borders del T-DNA
gene di interesse
non contiene i geni vir
- plasmide Ti “disarmato”
non contiene il T-DNA
contiene i geni vir
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sistema vettore binarioVETTORE BINARIO
gene target
vettore binario∼ 13 kbp
marker selezione vegetale
right borderleft border
E. coli ori marker selezione batterica
A. tumefaciens ori PIÙ VETTORE Ti DISARMATO
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sistema vettore binario
plasmide Ti “disarmato” vettore binario
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sistema vettore cointegrativo
Principio di base: due plasmidiricombinano per dar luogo al plasmide Ti
DUE PLASMIDI- vettore cointegrativo
contiene E. coli ori (non A. tumefaciens ori)
marker di selezione batterico
marker di selezione vegetale
right border del T-DNA
gene target
DNA omologo al plasmide Ti
- plasmide Ti “disarmato”
non contiene T-DNA
contiene i geni vir
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right bordermarker selezione vegetale
gene target
marker selezione batterico
E. coli ori
DNA omologo
left border
geni virA. tumefaciens
ori
VETTORE COINTEGRIVO
DNA omologo
PLASMIDE Ti RICOMBINANTE
gene target
marker selezione vegetale
right border
left border
A. tumefaciensori
E. coli ori
marker selezione batterico
ricombinazione
cointegrazione
geni virPLASMIDE Ti DISARMATO
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PLASMIDI Ti RICOMBINANTI
Sistema del vettore binario
- Due plasmidi• geni vir su uno
• T-DNA sull’altro
Sistema del vettore cointegrativo
- Inizialmente due plasmidi
- Ricombinazione per ottenere un unico plasmide
• geni vir e T-DNA sullo stesso plasmide
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Dal plasmide di clonaggio in E. coli si recupera il gene target (cDNA) mediante digestione con opportuni enzimi di restrizione e si inserisce nel vettore binario o nel vettore di cointegrazione
pUC18
EcoRI
BamHI
pBIN19
EcoRISmaIHindIIXhoIBamHI
LB
RB
BamHI
LB
RB
EcoRI
BamHI
LB
RB
vettore binario con il gene target
EcoRIligazione
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vettori binari
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Il vettore binario o il vettore cointegrato contenenti il gene target devono essere inseriti nel ceppo di Agrobacterium “disarmato”
ELETTROPORAZIONECONIUGAZIONE
TRIPARENTAL MATING
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CONIUGAZIONETRIPARENTAL MATING
si utilizza un plasmide helper capace di mobilizzare se stesso e altri plasmidi
pRK2013mob
E. coli con plasmide helper
E. coli con plasmide binario o cointegrato
pBIN19T-DNA
Ti
Agrobacterium
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Che cosa si utilizza per l’infezione con Agrobacterium?
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Per la trasformazione con Agrobacterium si utilizzano piccoli espianti di tessuti
foglie fusto radici gemme cotiledonida cui verrà rigenerata l’intera pianta
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Trasformazione mediatadall’Agrobacterium
• Vantaggi– Molto efficace– Espressione stabile– Basso numero di copie inserite (1÷5)
• Svantaggi– Un limitato numero di specie sono infettabili
(no leguminose e monocotiledoni)– Richiede colture cellulari per la rigenerazione
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Utilizzo di SUPERBINARY VECTOR e CEPPI IPERVIRULENTI
super binary vector: vettori binaricontenenti virC, virB, virG
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metodi di trasferimento del DNA
Trasferimento diretto del DNA
- sistema biolistico
- trasformazione protoplasti
- microiniezione
Agrobacteriumtumefaciens
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elettroporazione protoplasti
microiniezione(funziona bene negli animalipoco nelle piante)
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SISTEMA BIOLISTICO PARTICLE GUN
1987 Sanford e colleghi
particelle di oro o tungsteno ricoperte di DNA vengono accelerate e “sparate” sul tessuto penetrando rilasciano il DNA che viene integrato nel genoma vegetale
prima si usava polvere da sparo per l’accelerazioneoggi He
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Helios “gene gun”
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Anche per la trasformazione con il sistema biolistico si utilizzano espianti di tessuti
foglie fusto radici gemme cotiledonida cui verrà rigenerata l’intera pianta
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Trasformazione con metodo biolistico
• Vantaggi– Abbastanza efficiente– Utilizzabile con qualsiasi specie
(trasformazione governata da parametri fisici e non biologici)– Possibilità di inserire più geni
• Svantaggi– Integrazione del plasmide– Eventi di ricombinazione e riarrangiamenti del
DNA esogeno (copie multiple, concatenameri, frammentazioni del transgene)
– Richiede colture cellulari per la rigenerazione
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“Trasformazione pulita”
SCOPO: evitare che, utilizzando il sistema biolistico, oltre al gene di interesse, nel genoma vegetale, siintegrino anche sequenze di DNA non desiderate
DNA plasmidico cassetta
transgene
transgene
svantaggio: il DNA linearizzato sidegrada molto facilmente –bassissima resa
utilizzo della cassetta senza il plasmide
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“Trasformazione pulita”
Geni killer
gene killerconferisce fenotipo letale alle piante trasformate
transgene
sopravvivono solo le piante nellequali si è integrato
esclusivamente il transgene
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“Trasformazione pulita”
Tecnica della trasformazione “agrolistica”
Introduzione di tre plasmidi con metodo biolistico
LB RB
transgene VirD1 VirD2
VirD1 e VirD2 riconoscono le sequenze RB e LB ed excidono il transgene dal plasmide
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Spesso la limitazione maggiore alla trasformazione delle piante non è la metodica di trasferimento del DNA, quanto la rigenerazione della pianta