ClaseBM hibridacion

8/14/2019 ClaseBM hibridacion

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Hibridacin de cidos nucleicos


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snaturalizacin y renaturalizacin del ADN por la temperaturasnaturalizacin y renaturalizacin del ADN por la temperatura

Agentes desnaturantes:

- Temperatura

- Molculas polares (con gruposamino y carbonilo que compitan por laformacin de puentes hidrgeno)

- Condiciones alcalinas


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Alteracin de las propiedades fsicas del ADN por desnaturalizacinAlteracin de las propiedades fsicas del ADN por desnaturalizacin


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Estructura de los cidos nucleicos y su absorcin pticaEstructura de los cidos nucleicos y su absorcin ptica


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Curvas de DesnaturacinCurvas de Desnaturacin

-Las curvas de desnaturacin son especficas para cada molcula de ADN y dependen de lacomposicin nucleotdica-La curva sigmoidal muestra que las interacciones que mantiene la doble hlice son cooperativas (laseparacin en un punto estimula la separacin consecutiva de otros puntos en la molcula)-De esta curva se obtiene la Tm (temperatura media de fusin)-La Tm muestra una correlacin lineal con el contenido de G+C


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Curvas de DesnaturacinCurvas de Desnaturacin


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- Slot blot y dot blot

Hibridacin en fase slida - Hibridacin Southern

- Hidridacin Northern

Ensayos de hidridacinEnsayos de hidridacin

Hidridacin en fase lquida

Hibridacin in situ


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Dot blot y Slot blot

Permite analizar cidos nucleicos sin purificar (x ej: provenientes de muestras

biolgicas: sangre, heces, esputo)


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Southern blot

La tcnica de Northern blot es idntica en procedimiento pero se utiliza para analizarmuestras de RNA (aplicado al estudio de la expresin de genes).


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Mtodos paralelos de anlisis molecularMtodos paralelos de anlisis molecular


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Marcaje de sondasMarcaje de sondas

1) Marcaje por sntesis con DNA polimerasa

Traslado de la mella: Nick translation


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2) Marcaje terminal

Marcaje con polinucletido quinasa

Marcaje de sondasMarcaje de sondas


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Tipos de marca:

1) Directa:

2) Indirecta:

Fluorocromo

Grupo indicador

Radiactiva (32P)


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2) Marca Indirecta:


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Resumen de marcadores y mtodos para su deteccin


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Micromatrices de ADN: DNA microarraysMicromatrices de ADN: DNA microarrays

Tcnica revolucionaria que permite monitorear la expresin de mltiplesgenes en forma simultnea

Permite estudiar los genes que estn activos en tejidos particulares


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POLIMORFISMOSPOLIMORFISMOS

Variaciones en la secuencia del genoma. Pueden ser producidas por:- Recombinacin no homloga (duplicacin de genes)

Ej: isoformas de la fosfatasa alcalina- Transposicin y retrotransposicin

Ej. Secuencias LINE y SINE, secuencias Alu.

Polimorfismo en regiones gnicas (gnico)- Polimorfismo del grupo sanguneo ABO

- Polimorfismo de la galactosemia- Polimorfismo del CFTR

Polimorfismo en regiones no gnicas (gentico)Utilizado para la identificacin de individuos (huella dactilar de ADN)

-DNA mini-satlite

Repeticiones de 10 a 65 pb, ricas en C+G agrupadas en tandem formando bloques grandes de cientos ymiles de repeticiones repartidos en todo el genomaEj: GGGCAGGANG (N=cualquier nucletido), secuencias de DNA minisatlite hipervariable de elevadopolimorfismo

-DNA microsatliteRepeticiones de unidades menores a 7 pb, agrupadas en tandem hasta 50 repeticiones

Ej: secuencias telomricas


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FRLPPolimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin

(restriction fragment length polymorphism)

Cada muestra genera diferentes fragmentos de longitud diferente en funcin de los sitios de restriccin presentes

Se utiliza una sonda que hibrida en una posicin cercana al sitio polimrfico y se analizan los resultados por Southern

Ejemplo: La secuencia de corte de la enzima de restriccin est ausente en un alelo


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FRLP en el diagnstico de la anemia falciforme

Anemia falciforme: enfermedad hereditaria por presencia de HbS, generando un deficiente transporte de O2La -globina situada en el cromosoma 11 presenta una mutacin de cambio de sentido.

La mutacin genera la ausencia del sitio de corte para la enzima de restriccin MstII


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FRLP en el diagnstico de la anemia falciforme


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Estas determinaciones

pueden ser aplicadascomo diagnstico

prenatal

Estas determinaciones

pueden ser aplicadascomo diagnstico

prenatal


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Obtencin de una huella

dactilar de ADN empleandouna sonda VNTR

El intrn 1 del gen de la mioglobinaposee 4 secuencias repetidas

formando un loci de VNTR (VNTR1)

El esquema muestra el resultado delSouthern blot al utilizar la sonda de33 pb descrita, para analizar a tresdiferentes individuos

Sonda


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El polimorfismo VNTR utilizado en criminalstica


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Aplicaciones de los polimorfismos: FRLP y VNTR

-Diagnstico de paternidad biolgica

-Seguimiento de rboles genealgicos

-Identificacin de sospechosos en procedimientos penales

-Identificacin post-mrtem de individuos (casos judiciales y catstrofes)

-Diagnstico de patologas hereditarias-Compatibilidad de transplantes

-Anlisis de la inestabilidad gentica de cierto tumores


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Hidridacin in situ

Tisular

Aplicada a cortes de tejidos o clulas intactasfijados con formalina e incluidos en parafina

La sondas utilizada tiene una marca radiactiva o

fluorescente (FISH) y son analizada por elexamen de una pelcula fotogrfica(autorradiografa) o en un microscopio defluorescencia respectivamente.

FISH: hibridacin in situfluorescente(fluorescent in situ hybriditation).

Permite estudiar cambios en la expresin gnicaanalizando el mRNA (por ej: durante eldesarrollo)

Es utilizada para detectar virus patgenos enclulas infectadas.

Es utilizada en investigacin para la deteccinde la expresin especfica de genes en algunaspatologas.

Deteccin del mRNA para el gen tailless en unembrin de Drosophila.


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Hidridacin in situ

FISH para la deteccin del gen de una protena muscular(Lichter el al., Science 247, 1990, 64).

Coloreado de cromosomas mediante FISH

El coloreado de cromosomas permite identificar lalocalizacin de secuencias especficas en cada uno delos cromosomas utilizando sondas especificas paracada uno de ellos marcadas con diferentesfluorocromos

Permite la deteccin de cromosomopatias aneuploidas

(monosomas, trisomas) o variaciones estructurales(deleciones, inversiones).

Permite observar cambios grandes de reorganizacincromosmica (por ej. en clulas cancerosas).

Cromosmica

Se realiza en cromosomas metafsicos fijados,tratados con proteasa y desnaturalizados porcalor y lcali.

La sonda utilizada generalmente est asociadaa una marca fluorescente (FISH) y analizada enun microscopio de fluorescencia.

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