clase 2 BIO040 2014-20
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Preparación de muestras, extracción y análisis de ácidos nucleicos.
Comportamiento de las moléculas en el agua
Moléculas hidrofóbicas• Moléculas en las que predominan los enlaces no polares, generalmente son insolubles en agua. Las moléculas de agua no son atraídas por estas moléculas y tienden a aislarlas. • Los hidrocarburos que contienen muchos enlaces C-H, son especialmente hidrófobos
Comportamiento de las moléculas en el agua
Moléculas Hidrofílicas
Las moléculas que poseen carga – o + (iones) se disuelven con facilidad en el agua (azucares, DNA, RNA y proteínas). Las sustancias polares se disuelven porque sus moléculas forma enlaces de hidrógeno con las moléculas de agua que la rodean
Fuentes de ADN
Purificación DNA Genómico
Bacterias
Cells. Mamíferos
Cells. Vegetales
Hongos Virus
Etapas:!1. -Rompimiento Celular!2. -Eliminación de Contaminantes!3. -Concentración
Extracción de DNA Genómico
Células Eucariotas Células Procariotas
1.- Rompimiento Celular: (Tris-HCl pH 8.0, EDTA 1mM, Sacarosa o Glucosa)
Incubación con Detergente (SDS)
Congelamiento en N2 Líquido (-196° C)
Mecánico Uso de Enzimas (Vegetales, Hongos, Bacterias)
2.- Eliminación de Contaminantes:
Proteínas (proteinasa K + SDS)
Fenol Saturado pH 8.0 ó neutro
Centrifugación
Fenol:Cloroformo
RNA (Ribonucleasa A)
Fenol
2.- Concentración:
Etanol Absoluto
Gel Electroforesis
3.-
Etapas:!1. -Rompimiento Celular!2. -Eliminación de Contaminantes!3. -Concentración
Extracción de DNA Plasmidial
PLASMIDIOS:
Método Lisis Alcalina (mini-prep)
Sol. 1 Glucosa / Tris HCl pH 8.0 / Glucosa
Sol. 2 NaOH / SDS
Sol. 3 Acetato de Potasio
Precipitación: Isopropanol
o
Extracción de DNA Plasmidial
RNA: - Principal problema es la degradación
- DEPC (Diethylepyrocarbonate)
- Buffers sin Alcali
- Cuidado con RNAsa !!!
Precipitación:
- Etanol 95% O.N.
- Fenol/cloroformo
- Trizol
- Aislamiento mRNA
RNA: - Principal problema es la degradación
- DEPC (Diethylepyrocarbonate)
- Buffers sin Alcali
- Cuidado con RNAsa !!!
Precipitación:
- Etanol 95% O.N.
- Fenol/cloroformo
- Trizol
- Aislamiento mRNA
RNA: - Principal problema es la degradación
- DEPC (Diethylepyrocarbonate)
- Buffers sin Alcali
- Cuidado con RNAsa !!!
Precipitación:
- Etanol 95% O.N.
- Fenol/cloroformo
- Trizol
- Aislamiento mRNA
RNA: - Principal problema es la degradación
- DEPC (Diethylepyrocarbonate)
- Buffers sin Alcali
- Cuidado con RNAsa !!!
Precipitación:
- Etanol 95% O.N.
- Fenol/cloroformo
- Trizol
- Aislamiento mRNA
Métodos de extracción:
-Isopropanol
Extracción de RNA
Trizol:
- Solución monofásica del fenol e isotiocianato de guanidina.
- Mantiene integridad de RNA mientras rompe a las células
- Disuelve otros componentes celulares
- RNA permanece en fase acuosa despues de agregar Cloroformo
- Precipitar con Isopropanol
Extracción de RNA utilizando Trizol
- Cuantificación:
-Absorbancia 260nm 40 x O.D.260 = [ ] RNA µg/mL
50 x O.D.260 = [ ] DNA mg/mL
Relación de pureza:
260/280 RNA 1.8 ± 0.15
DNA 2.0 ± 0.15
-Geles
Una vez extraídos los ácidos nucleicos es necesario cuantificarlos
Cuantificación de ácidos nucleicos por espectofotometría
Secuenciación del DNA
Enzimas de restricciónNucleasas de restricción: cortan los enlaces fosfodiester de los ácidos nucleicos
(EXONUCLEASAS O ENDONUCLEASAS)
1. Tipo I y Tipo III: a. Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan). b. Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la
secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo. Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o después de la secuencia que reconocen.
c. Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.
2. Tipo II:
a. Sólo tienen actividad de restricción. b. Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen. c. Sólo requieren Mg++ como cofactor. d. No necesitan ATP.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN * Se aislaron de bacterias (donde su función es destruir DNA no propio).
* Reconocen secuencias PALINDRÓMICAS específicas de DNA (de 4, 6 u 8 pb) y cortan en lugares concretos.
Romos Cohesivos
* Generan extremos ROMOS o COHESIVOS.
Aplicaciones de las enzimas de restricción: !
1. Hacer mapa de restricción de un fragmento DNA. 2. Fragmentar DNA genómico para separación de
electroforesis y “Southern Blot”. 3. Generación de fragmentos para ser usados como sondas
marcadas en “Southern”y “Northern” blotting. 4. Generación de fragmentos para ser subclonados en los
vectores apropiados, creación de DNA recombinante.
Mapa de restricción
B15 8
AA1 5.5 1.5
A
105
Electroforesis
Sondas
Una sonda es un objeto de manipulación remota cuya misión es llegar a un objetivo prefijado y realizar algún tipo de acción o mandar información.
¿Qué es una sonda en biología molecular? Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reportera, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucléico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. ! Existen tres Dpos de sonda de ácidos nucleicos: !-‐ Fragmentos de DNA -‐ Fragmentos de RNA -‐ OligonucleóDdos sintéDcos u oligosondas.
Sondas de Acidos Nucleicos!
El uso de las sondas se basa en el descubrimiento (década del 60)!!!
es posible hibridar ácidos nucleicos en función de la complementariedad de sus secuencias de nucleótidos !
La doble cadena del ADN ha sido abierta
(desnaturalizada)
la sonda se va uniendo por reconocimiento de las bases complementarias.
Sondas “Calientes”
* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta: tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125
Autorradiografía
ADN
Isotopo radioactivo
Sondas “Frías”
Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas,
1) enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabo una reacción detectable )
2) marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra molécula)
3) moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes (que producen luz y puede excitar una película fotográfica).
Tipos de Hibridación
Hibridación en Fase Líquida
EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)
Si hay más sitios de unión...
Especificidad de la interacción
Competidor
Supershift
Hibridación en Soporte Sólido
DNA arrays: es una superficie sólida a la cual se unen una serie de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN son muy variables y pueden ser vidrio, plástico e incluso chips de silicio. Los arreglos de ADN son utilizadas para averiguar la expresión de genes, monitorizandose los niveles de miles de ellos de forma simultanea.
Microarreglos
!!
Esta modalidad permite localizar en forma muy precisa, a nivel de la célula o de sus componentes, las secuencias específicas complementarias
de la sonda empleada
Hibridación in situ
Las sondas son puestas directamente en contacto con preparados citológicos o histológicos
Virus Papiloma Humano Tipo II
In Situ Hibridization
In Situ Hibridization in zebrafish
FISH (Fluorescent in situ hybridizaDon )Es una técnica citogenéDca que puede ser uDlizada para detectar y localizar la presencia o ausencia de una secuencia específica de DNA en un cromosoma. Se uDliza sondas fluorescentes que se unen sólo a aquellas partes del cromosoma con el que muestran un alto grado de similitud de secuencia. La microscopía de fluorescencia se puede uDlizar para averiguar donde la sonda fluorescente se ha unido al cromosoma. FISH se uDliza a menudo para encontrar caracterísDcas específicas en el ADN. Estas caracterísDcas se pueden usar en el asesoramiento genéDco, la medicina y la idenDficación de especies.
Southerns y Northerns: Técnicas de Búsqueda Molecular.
1)DNA-‐DNA. Un ADN sonda de DNA de cadena sencilla (ssDNA) puede formar un híbrido de cadena doble al aparearse con un DNA objeDvo de cadena simple, esto ocurre si la secuencia de la sonda es el complementaria y de orientación inversa a la secuencia diana.
! 2) DNA-‐RNA. Una sonda de DNA de cadena sencilla (ssDNA) puede formar un
híbrido de cadena doble al aparearse con un RNA objeDvo de cadena simple (el RNA usualmente es de cadena simple), esto ocurre si la secuencia de la sonda es el complementaria y de orientación inversa a la secuencia diana.
!•-‐ Electroforesis en gel •-‐ Transferencia a un soporte sólido •-‐ Bloqueo •-‐ Preparar la sonda •-‐ Hibridación •-‐ Lavados •-‐ Detección del híbrido de sonda-objetivo
Etapas de un Southern y Northern
Southern Blot DNA se corta con enzimas de restricción-‐ sonda con DNA marcado
Northern Blot (RNA)
!!Northern Blot RNA-‐ sonda con DNA o RNA marcado
RNA Sonda