Citometria de fluxo: Princípios e aplicações - CYTED - Univali · Componentes: Fotodetector,...
Transcript of Citometria de fluxo: Princípios e aplicações - CYTED - Univali · Componentes: Fotodetector,...
Aplicações da citometria
de fluxo na pesquisa
farmacológica de plantas
medicinais
Me. Ruberlei Godinho de Oliveira Doutorando em Biotecnologia – UFMT – Bionorte
Docente na Universidade de Cuiabá-MT
1
Cito metria de fluxo
Movimento Célula Medida
Utiliza dos princípios básicos da
fluorimetria.
É uma poderosa tecnologia, que possibilita a análise simultânea de
múltiplas características de uma
célula (análise multiparametrica).
Podem ser analisadas:
Qualquer partícula ou célula em
suspensão, com tamanho entre 0,2
a 50 µm.
Células de tecidos sólidos
precisam ser desagregadas e
colocadas em suspensão antes da análise.
2
O que o citômetro nos diz sobre as
células?
Tamanho relativo (SSC)
Granulosidade ou complexidade (FSC)
Intensidade de fluorescência (marcação)
3
Como funciona?
Combinação de 3 sistemas:
Sistema Fluido;
Sistema Óptico;
Sistema Eletrônico;
4
Sistema de Fluidos
Transporta as partículas em um fluxo de fluido
em direção ao feixe de laser para
interceptação;
Posiciona e alinha o fluxo da amostra no
centro do feixe de laser, permitindo que uma
única célula ou partícula passe pela luz do
laser em um dado momento;
Sistema pressurizado.
5
Laser
Fluxo
Sistema de Fluidos 6
Sistema Óptico
Excitação Emissão
Componentes de Excitação
(Lasers, prismas e lentes)
Componentes de Coleta (Lentes, espelhos, filtros e fotodetectores)
7
Sistema Óptico
• Componentes de Excitação
- Lasers e lentes
8
Sistema Óptico 9
Sistema Óptico
Componentes de Coleta
- Lentes coletoras: Captam a dispersão e a luz fluorescente emitida pelos fluoróforos que são excitadas pelo feixe de laser (Convergência do sinal, alinha em uma direção inicial).
- Espelhos e Filtros Ópticos: Direcionam a luz emitida, selecionando o comprimento de onda determinados
- Fotodetectores: Recebem a informação óptica que será digitalizada e armazenada em um computador
10
Sistema Óptico Filtros Ópticos – coletar sinais de luz
Espelhos LP (longpass) = todo comprimento de onda maior que seu
número é deixado passar e menor que seu número é refletido.
Espelhos SP (shortpass) = todo comprimento de onda abaixo de seu
número é deixado passar e acima de seu número é refletido.
Espelhos BP (bandpass) = deixa passar o comprimento de onda
compreendido em um intervalo especificado.
Detector – célula
fotoelétrica
SP 500 LP 500
Longpass Shortpass Bandpass
460 500 540 460 500 540 460 500 540
11
Sistema Óptico 12
Sistema Eletrônico Converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos proporcionais.
Componentes: Fotodetector, amplificador, processador e computador.
“Pulso de voltagem”;
Laser
Laser
Laser
Tempo
Vo
lta
ge
m
Tempo
Vo
lta
ge
m
Tempo
Vo
lta
ge
m
13
Sistema Eletrônico
Área
Altura
Largura
Dos pulsos de voltagem pode-se medir:
Dispersão ou intensidade do foton capturado
Tempo de passagem da partícula no feixe de
laser
14
Width
Height
Sistema Eletrônico
Event 1
Event 2
Event 3
FSC SSC
60 120
160 65
650 160
400 800 1000 0 0 200 400 600 800
0
200
400
600
800
1000
PE
FIT
C
840
85
245 638 PE
FIT
C
0
200
400
600
800
1000
200 600
840
85
156
FITC
638
245
612
PE
1000
• Armazenamento e visualização dos dados
15
16
17
18
19
FSC x SSC
Detector de dispersão de luz em ângulo reto 15 a 150º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm
Detector de dispersão de luz frontal 0.5 a 5º
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
20
FSC (Forward Scatter): Tamanho
celular
21
Side Scater (SSC):Complexidade:
Reflexão a 90°
22
23
Fatores que influenciam a
dispersão de luz
• Forma
• Tamanho
• Presença de grânulos
• Complexidade interna dos diversos tipos
celulares
24
Visualização dos dados 25
26
Detecção de Fluorescência
Detectores de Fluorescência:
FL1 FL2 FL3
Fonte de Luz Incidente: Laser de Argônio a 488 nm
FSC
SSC
27
Compensação – overlap 28
FL
1-%
FL
2
29
FL
2-%
FL
1
SOBREPOSIÇÃO
Compensação – overlap
30
SUBCOMPENSADO SUPERCOMPENSADO OTIMIZADO
A Fluorescência é proporcional a
quantidade de anticorpo ligada a células
PE
PE
Intensidade de Fluorescência
Nú
mero
de E
ven
tos
PE
PE
PE
PE
PE
PE
PE
PE
31
Fluoróforos
Fluorescein (FITC) 512 green
Alexa 488 515 green
Phycoerythrin (PE) 565 yellow
Cyanine 3 (Cy3) 570 yellow
PE-Texas Red (ECD) 620 red
PE-Cy5 (PC5) 665 deep red
Peridin-chlorophyll (PerCP) 670 deep red
PE-Cy5.5 (PC5.5) 695 deep red
PE-Cy7 (PC7) 755 far red
488 nm excitation 633 nm
Allophycyanin APC 660
Cy5 670
APC – Cy7 770
405 nm
Alexa 405 440
Pacific Blue (PB) 440
Cascade Blue (CB) 440
Típicos fluorocromos
32
Aplicações Estruturais Funcionais
Intrínsecos
Morfologia da célula
Proteínas fluorescentes
Estado Redox
Proliferação celular
Ativação celular
Apoptose
Extrínsecos Conteúdo de DNA e RNA
Taxa de DNA
Estrutura cromatínica
Proteínas totais ou básicas
Grupos químicos
Antígenos
Açúcares de superfície
Estrutura citoesqueleto
Estudos da membrana celular
Atividade enzimática Endocitose
Síntese de DNA
Receptores
Potencial de membrana
pH, cálcio, carga de superfície
33
Anexina V/Iodeto de Propídeo
Determinação de apoptose
Anexina V
Membrana
Plasmática
Fosfatidilserina
PI
Núcleo
Anexina V
34
Determinação da ativação de caspases 35
Ensaios de proliferação celular
Ensaio de proliferação;
5-bromo-deoxyuridina incorporado durante síntese de DNA; Análogo da timina;
Detecção: métodos enzimáticos, anticorpos fluorescentes, imuno-histoquímica;
36
37 Ensaios de proliferação celular Ciclo celular
MAPK – Quinases ativadas por
mitogenos
38
Marcação Aquisição Analise
dos dados
• BD CBA Human Th1/Th2/Th17 Cytokine Kit
• Phosphorylated Human NF-κB p65 Peptide
Basal
CN
Estimulado
39
40 MAPK – Quinases ativadas por mitogenos
41
42
Detecção intracelular de
citocinas – Beads magnéticas
43
Vantagens
Analise simultaneamente múltiplas citocinas (≤30) requisitos de volume reduzido da amostra;
Requer menos diluições de amostras - relevância estatística alta;
300 Beads medidos por citocina Æequivalent de 300 poços de ELISA
Reduzido hands-on tempo com análise paralela de amostras - ampla faixa dinâmica (fluorescência);
44
Dosagem de citocinas
Brefeldina A
Não estimulada Brefeldina A, 100 ng/mL
1,5 horas Brefeldina A, 20 µg/mL
Dependendo da célula e o estímulo realizado a retenção de
citocinas nas células ocorre com picos de 4h (para TNF-γ),
8h (para INF- γ e IL2) e mais de 12h (para IL-12).
45
Dosagem de citocinas 46
0,01 µg/mL
LPS
1 ng/mL LPS
10 µg/mL BFA
47
48
49
50
Vantagens x Desvantagens
Vantagens:
Mede múltiplos parâmetros individuais;
Grande número de células analisadas com rapidez;
Avaliação da heterogeneidade de células;
Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;
Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
Desvantagens:
Custo do equipamento;
Mão de obra especializada;
51
52