Citometria Brian
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“La citometría de flujo es un método analítico que permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o partículas microscópicas en suspensión que producen una señal de forma individual al interferir con una fuente de luz”
CITOMETRIA DE FLUJO
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NIVELES DE ANALISISMOLECULAR(esferas fluorescentes)
SUBCELULAR CELULAR SUPRACELULAR
Proteínas extracelulares
Viriones individuales
Bacterias Hibridomas
Secuencias de ADN o ARN libres
Liposomas Hongos unicelulares
Fusiones celulares
Complejos inmunes circulantes
Cromosomas aislados
Células humanas y animales
Orgánulos aislados
Protoplastos vegetales
Núcleos aislados
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EXTRACELULARES
DE SUPERFICIE
CITOPLASMATICO
NUCLEARES
PARAMETROS DE ANALISIS
A NIVEL CELULAR
Ploidía de ADN Regulación del ciclo
celular Acción de hormonas
Metabolismo celular Transducción de señales Lesión celular
Caracterización población celular
Interacciones célula-célula Resistencia a fármacos
Activación celular Interacciones célula-célula Diferenciación celular
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¿COMO FUNCIONA EL CITOMETRO DE FLUJO?
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
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¿Qué es un fluorocromo?
488 nm
LuzIncidente
HO O
CO2H
Molécula de
Fluoresceína
530 nm
LuzFluorescente
Emitida
• El fluorocromo absorbe la luz del láser
• El fluorocromo emite un rayo luminoso dediferente longitud de onda
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PRINCIPALES FLUOROCROMOS UTILIZADOS EN CITOMETRÍA DE FLUJO
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DATOS OBTENIDOS
1. PARAMETROS ESTRUCTURALES• El tamaño relativo (Forward scatter-FSC)• La granularidad o complejidad citoplasmática. (Side scatter-SSC)
2. CD (antigenos de superficie): La intensidad de fluorescencia (Identidad)• Linaje• Recuento • Activación
4. ALTERACION EN EL INMUNOFENOTIPO• Inmunoproliferacion/inmunodeficiencia
5. ALTERACION EN EL GENOTIPO• Cambios en contenido DNA• Cambio en la expresion de genes
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PRESENTACION DE LOS DATOS
• Histograma
• Gráfico de Puntos (Dot Plot)
• Gráfico de Contorno (Countour Plot)
• Gráfico de Densidad (Density Plot)
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REGISTRO PRIMARIO
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
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IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
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Granulocitos
DetritosLinfocitos
Monocitos
DISPERCION NORMAL
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Countour Plot Density Plot
IMAGEN DE:Rodrigo Blanco Salado, Alfredo Corell
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APLICACIONES CLINICASINMUNOFENOTIPIFICACIONi
PLAQUETASi TRANSPLANTES
CANCERi
o LEUCEMIAS Y LINFOMASo ENFERMEDAD MINIMA RESIDUALo SUBPOBLACIONES LINFOIDES
(INMUNODEFICIENCIAS)o RAZON LtCD4/CD8(VIH-SIDA)
o CONTENIDO DE DNA (ploidia DNA)o FASES DEL CICLO CELULARo PROTEINAS DEL CICLO CELULARo ONCOGENES (p53 y otros)
o GLICOPROTEINAS (TROMBASTENIA DE GLANZMANN)
o FISIOLOGIA PLAQUETARIAo Igs ASOCIADAS A PLAQUETAS
(PURPURA TROMBOCITOPENIA INMUNE)
o CELULAS PROGENITORAS(CD34, CD117)
o CROSS MATCH
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ESTUDIOS FUNCIONALES
CUANTIFICACION DE MOLECULAS
DETECCION DE CITOQUINAS
SOLUBLES
• Citocinas Intracelulares• Fagocitosis• Estallido respiratorio• pH intracelular• Potencial de membrana
• En base a partículas cubiertas con Ig anticitocinas
• Recuento absoluto de células• CD 64 en granulocitos(infeccion)
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APLICACIÓN DE LA CITOMETRIA EN HEMATOLOGIA
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VENTAJAS EN HEMATOLOGIA Análisis multiparamétrico
Acceso mínimamente invasivo a parámetros celulares
Analiza grandes cantidades en poco tiempo. Aprox: 500-4000 cel/seg.
Resolución de heterogeneidad celular
Selección fenotípica de subpoblaciones
Selección manual de marcadores: Permite separar subpoblaciones celulares. (Clasificación de patologías).
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INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS
“Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”
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RETENCION DE ANTIGENOS
Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados. Ejm:
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CD10CD34CD8
HLA-DR
TIMOCITOLINFOCITOPRE B
CD10CD19CD34CD38
LINFOCITO BCD19CD20CD22IgM
LINFOCITO TCOOPERADOR
CD4 CD3CD28 TCRCD5
CD1 CD8CD2 CD71CD3 CD38CD4 TCR
LINFOCITO TCITOTOXICO
CD8CD3CD28CD5
NK MADUROCD2CD8+/-CD16CD56CD57
MADURACION DE LINEA LINFOIDE
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BIBLIOGRAFIA1. BARRERA RAMÍREZ LOURDES MARÍA, DRAGO SERRANO MA. ELISA, PÉREZ RAMOS
JULIA, SAINZ ESPUÑES TERESITA DEL ROSARIO, ZAMORA ANA CECILIA, GÓMEZ ARROYO FABIOLA et al . CITOMETRÍA DE FLUJO: VÍNCULO ENTRE LA INVESTIGACIÓN BÁSICA Y LA APLICACIÓN CLÍNICA. Rev. Inst. Nal. Enf. Resp. Mex. [revista en la Internet]. 2004 Mar [citado 2012 Mar 12] ; 17(1): 42-55. Disponible en: http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007&lng=es
2. Statistical file matching of flow cytometry data, ELSEIVER, Journal and biomedical Informatics, Gyemin Lee a, William Finn, Clayton Scott
3. Maryalice Stetler-Stevenson. Flow cytometry in lymphoma diagnosis and prognosis: useful? Best Practice & Research Clinical Haematology Vol. 16, No. 4, pp. 583–597, 2003
4. Diagnosing PNH with FLAER and Multiparameter Flow Cytometry, D. Robert Sutherland,1 Nancy Kuek, Cytometry Part B (Clinical Cytometry) 72B:167–177 (2007)
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