CURSO BÁSICO DE CITOMETRÍA DE FLUJO

GRUPO RIOPLATENSE DE CITOMETRIA DE FLUJO (GRCF)

22 al 26 de Septiembre, 2014

CITOMETRíA DE FLUJO

Aplicaciones en investigación

Dra. Carolina JANCIC

Laboratorio de Inmunidad Innata

IMEX - CONICET, Academia Nacional de Medicina

Buenos Aires

• Fenotipo y detección de antígenos celulares: de superficie y citosólicos.

• Ensayos de viabilidad celular: apoptosis y necrosis.

• Monitoreo del ciclo celular.

• Proliferación celular in vitro e in vivo.

• Conjugados celulares.

• Determinación de asociaciones moleculares (FRET).

• Fagocitosis – Endocitosis.

• Flujos citoplasmáticos de Calcio.

• Producción de metabolitos del oxígeno (superóxido, peróxido y ON).

Citometría de Flujo en Investigación

• Cambios de pH intracelular.

• Actividad de proteasas: degradación de proteínas.

• Expresión de proteínas de membrana en fagosomas.

• Caracterización de vías de señalización.

• Identificación de genes reporteros.

• Estudio de microvesículas.

• Evaluación de los cambios en el potencial de membrana plasmática.

• Cross-match.

• Y más…

Citometría de flujo en Investigación

• Flujos citoplasmáticos de Calcio.

• Proliferación celular in vitro e in vivo.

• Fagocitosis – Endocitosis.

• Maduración de fagosomas: degradación de proteínas, pH, etc.

• Estrés oxidativo: producción de IROs.

• Apoptosis y necrosis.

• Genes reporteros.

• Conjugados celulares y asociaciones moleculares (FRET).

• Potencial de membrana plasmática.

Más en detalle:

MOVILIZACION DE CALCIO

Movilización de Calcio

El análisis de los transientes de calcio por citometría de flujo:

• Provee información de células individuales.

• Permite identificar una respuesta particular en una población heterogénea.

• Analiza células vivas.

Colorantes utilizados para la detección de calcio intracelular por citometría de flujo

ColoranteExcitación

(nm)

Emisión

(nm)LASER

indo-1 346 390/520UV 5-W argón

UV helio-cadmio

fura red 488 660 argón

fluo-3 488 530 argón

fluo-3/fura red 488 530/660 argón

Marcación de células con Fluo-3

•Fluo-3 AM: acetoximetil éster (AM) del Fluo-3

Fluo-3 AM

Clivaje por esterasas

citoplasmáticas

Fluo-3 AM

Fluo-3 Forma sensible a la

unión con el calcio

Hay que evitar el exceso de marca ya que:

1) disminuye la sensibilidad y

2) puede resultar en

compartimentalización del colorante

Movilización de Calcio

Adquisición de las muestras

Escala lineal:• para intervalos regulares• apropiada para señales que oscilan en un rango limitado (0-1.000)

Escala logarítmica:• para intervalos crecientes• cubre un rango más amplio de variación de la señal (0-10.000)

EJEMPLOS:

Neutrófilos estimulados con fMLP

fMLP 10-7 M

PMN

Linfocitos

fMLP 10-7 M

fMLP 10-9 M

PMN

Tiempo (segundos)

FL

1

EJEMPLOS:

Linfocitos B activados por entrecruzamiento de la Ig de superficie

Anti-IgM (Fab´2)

Tiempo (segundos)

FL

1

Anti-ratón (Fab´2)

PROLIFERACION CELULAR

Proliferación linfocitaria

Los linfocitos proliferan activamente en respuesta a estímulos

Linfocitos T/B

Proliferación linfocitaria

Activación policlonal y antígeno especifica de linfocitos

Estímulos más frecuentes:

1) policlonales: mitógenos (PHA, ConA, PWM)

anticuerpos anti-CD3

PMA + ionomicina

LPS

2) específicos: antígenos (toxoide tetánico, hemaglutinina, etc)

Métodos para medir proliferación celular

1. Aumento del número celular.

2. Incorporación al ADN de timidina marcada con tritio.

3. Incorporación al DNA de Br-deoxi-uridina y marcación con un

anticuerpo anti-BrdU

4. Marcación con CFSE y seguimiento por citometría de flujo

Marcación con CFSE

CF

SE

Pro

life

ració

nFluorescencia CFSE

N°

de

cé

lula

s

Marcación con CFSE: análisis de datos

control sin estimularautofluorescencia

7 6 5 4 3 2 1

generaciones

Fluorescencia CFSE

N°

de c

élu

las

Citometría de flujoVideo-microscopía

EJEMPLO

Benvenuti, F. et al. Science (2004), 305:1150-3

Interacción celular y proliferación en un modelo murino

wt

Rac1/2KO

EJEMPLO, doble marcación

CD4+CD25-

CD4+CD25+

PBMC => sorting de CD4+CD25- y CD4+CD25+, estimulación con anti-CD3/CD28 durante 7días

Ensayos in vivo

Estudio de la respuesta

inmune

marcación de linfocitos T

Estudio de la

migración celular

marcación de células

dendríticas u otras

wt B6

i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE

footpad= 50 µl de microsesferas

16 h

CD69

ganglio popliteo :

EJEMPLO: respuesta antígeno específica

12,5%

6,9%

Respuesta inmune in vivo contra OVA

BSA (popliteo)

8,6%

6,6%

OVA (popliteo)

60,7%

56,9%n 2

n 1

CFSE

CD

69

ganglio no drenate

i.v.= 2x10e6 OT2-CFSE

footpad= 1x10e6 OVA-CD o péptido

control

16 h

CD69

visualizacion de CD

CD + OVA: 15’ pulse & 4h

> lavar & marcar con CMTMR

Ganglio popliteo

7%

58% 5%

45% 16%

54%

CFSE

CD

69

ganglio popliteo ganglio no drenante

n 2:

OVA

n 1:

OVA

n 3:

peptide

Transferencia de células dendríticas

EJEMPLO: respuesta antígeno específica

EJEMPLO: estudio de la migración celular

Migración de células dendríticas a órganos linfáticos

wt Ly5.1

i.v. o s.c.= CD inmaduras Ly5.2+

20 h

visualización de CD por marcación Ly5.2

Bazo y ganglios popliteos: Mittelbrunn, M. et al. Blood (2009), 113:75-84

ENDOCITOSIS- FAGOCITOSIS

Captura de antígenos

ANTIGENOS PARTICULADOS

microesferas de latex

fluorescentesdextrán fluorescente

ANTIGENOS SOLUBLES

Eve

nto

s (

nº

de

cé

lula

s)

Dextrán-FITC

Intensidad de fluorescencia

– dextrán-FITC

+ dextrán-FITC 4°C

+ dextrán-FITC 37°C

EJEMPLO

Microsesfera fluorescentes

Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas

Dilución de beads (1/dilution)

% d

e fa

go

citosis

400 200 1000

5

10

15

FIT

C

FluoProbe 647

Eve

nto

s (

nº

de

cé

lula

s)

Dextrán-FITC

Intensidad de fluorescencia

– dextrán-FITC

+ dextrán-FITC 4°C

+ dextrán-FITC 37°C

EJEMPLO

Microsesfera fluorescentes

Fagocitosis y endocitosis en células dendríticas

Dilución de beads (1/dilution)

% d

e fa

go

citosis

400 200 1000

5

10

15

FIT

C

FluoProbe 647

EJEMPLO

Bacterias fluorescentes

Fagocitosis de bacterias

quenching

(azul tripan o cristal violeta)

lavar y lisar GR

fijar

teñir DNA

FL

1

leucocitos

bacterias

n°

de

cé

lula

s

Fluorescencia IP

10 min

0°C o 37°C

bacterias-FITC + PBMC

MADURACION DE FAGOSOMAS

Maduración de fagosomas

Vieira et al.

endosomas

tempranos

MVB

endosomas

tardíos

lisosomas

ER

vesículas cubiertas

de clatrina

vesículas

endocíticas

F-actin

microtubulos

calcio

VIA ENDOCITICA FAGOCITOSIS

• degradación de proteínas

• expresión de proteínas en fagosomas

• pH fagosomal

Maduración de fagosomas

CD + microesferas cubiertas de OVA

lisisMarcación y análisis

por citometría de flujo

Degradación de proteínas

OVA no degradaOVA degrada

Estudio de la actividad de proteasas por citometría de flujo

Metodología y análisis de datos

4 horas a 37°C

control negativo – NH4Cl

OVA – NH4Cl

OVA + NH4Cl

Intensidad de fluorescencia

Fa

go

so

ma

s

+ NH4Cl

Basal

2 horas

4 horas

Intensidad de fluorescencia

Eve

nto

s (

nº

de

fa

go

so

mas)

EJEMPLO

Degradación de proteínas en células dendríticas

Incre

me

nto

en

la

de

gra

da

ció

n

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

2.4

2 4Tiempo (horas)

Expresión de proteínas en fagosomas

Incubación de CD con

microesferas

Purificación de fagosomas

Marcación y análisis

por citometría de flujo

20’ pulse & 30’ incubación a 37ºC

Estudio de la expresión de marcadores lisosomales/fagosomales

Metodología y análisis de datos

Intensidad de fluorescencia

Fagosom

as

Mocroscopía electrónica

EJEMPLO

0

3

6

9

12

15

La

mp

2 p

or

µm

de

me

mb

rana fa

go

som

al

wt KO

**

Expresión de Lamp2

Eve

nto

s (

n°

de

fa

go

som

as)

Basal

wt

KO

1 hora

15 min

2 horas

Citometría de flujo

Expresión de Lamp2 en fagosomas de células dendríticas

200nm

wt

KO

R2

Flu

oP

rob

e 6

47

FITC

pH fagosomal

FITC (sensible al pH)

FluoProbe 647 (insensible al pH)

Fagocitosis &

Citometría de flujo

FITC

Fa

go

so

mas

bajo pH alto pH

baja IFM alta IFM

Gate en células conteniendo una sóla bead:

Estudio del pH fagosomal por citometría de flujo

EJEMPLO

Mac DC6

6.5

7

7.5

8

pH

Mac

DC

FITC

Eve

nto

s (

nº

de

fa

go

so

mas)

20’ pulse + 30’ incubación a 37ºC

bajo pH alto pH

10 60 120 180

5

6

7

8

Tiempo (minutos)pH

DCRaw 264.7

pH en fagosomas pH en el tiempo

pH fagosomal en células dendríticas y macrófagos

pH citoplasmático

Colorantes utilizados

Colorante pKaExcitación

(nm)

Emisión

(nm)

Fluorescein diacetate (FDA) 6.3 436/495 525

Carboxyfluorescein diacetate (COFDA) 6.4 441/488 535

Bis-carboxyethyl-carboxyfluorescein

acetoxymethyl ester (BCECF AM)6.98

439/490

520/620

535

488

Hydroxycoumarin (4-methylumbelliferone)

(4-MU)7.8

430/470

450/560

350

350

Diacetoxy-dicyanobezene (ADB) 8.0 425/540 350

Carboxy SNARF-1 acetoxymethyl ester 7.5 575/670 514 o 530

Células Jurkat + SNARF-1, en presencia de

nigericina a diferentes pH

Excitación a 514nm

Ratio 670/575

Consideraciones importantes durante el

estudio del pH intracelular:

• Curva de calibración: células tratadas con

nigericina (ionóforo: pH externo = pH interno).

• Adquisición con amplificación lineal.

• Trabajar con la relación entre IFM de emisión a

dos longitudes de onda => nos independizamos

de variaciones en la carga del colorante en

células de diferentes tamaños.

pH citoplasmático

Espectro de emisión de SNARF-1

a diferentes pH

Cambios en fluorescencia en respuesta a

nigericina. Células CCRF-CEM+SNARF-1

ESTRÉS OXIDATIVO

Fagocitosis y destrucción de microorganismos

Función desempeñada principalmente por los neutrófilos

Mecanismos de destrucción de microorganismos

Mecanismos microbicidas que no involucran al oxígeno

(oxígeno-independientes)

Mecanismos microbicidas que involucran la producción de

intermediarios reactivos del oxígeno (oxígeno-dependientes)

Mecanismos O2 dependiente

Adaptado a partir de Roos et al. Science

neutrófilo

bacteria

4e-

membrana plasmática

H+

K+

citosol

4e-

4O2-

4H+

2O2

4O2

2H2O2

NOX2

pH

fusión de

gránulo y

fagosoma

pH

catalaseMPO

H2O + O2HOCl + HO-

Cl-

NADPH oxidasa

Colorantes utilizados para evaluar IRO

ColoranteExcitación

(nm)

Emisión

(nm)

H2O2:

Dichlorofluorescin diacetate488 525

Dehydrorhodamine 488 525

O2-:

hydroethidine488 590

EJEMPLO: estrés oxidativo en neutrófilos

Análisis de datosMetodología

Control

dador sano + PMA

Intensidad de fluorescencia

n°

de

cé

lula

s

paciente

+ PMA

paciente + PMA

Producción de IRO en neutrófilos

Incubación de PMN con

DHR (5 min a 37ºC)

Lavado y estímulo con PMA

Análisis

por citometría de flujo

APOPTOSIS

Alteraciones morfológicas en células apoptóticas

CARACTERISTICAS DE LA APOPTOSIS:

• No hay pérdida de integridad de membrana ni se altera la permeabilidad.

• Hay cambios en la distribución de fosfolípidos: Flip-Flop y Zeiosis.

• Disminución en el tamaño celular.

• Condensación de la cromatina.

Zeiosis

Flip-Flop

EJEMPLO: neutrófilos apoptóticos

Microscopía de fluorescencia:

células viables células apoptóticas

Tinción: naranja de acridina – bromuro de etidio

Vía de las caspasas

pro-caspasa 8 caspasa 8 activa

caspasa 3, 6, 7

Receptor de muerte, ej: Fas/CD95 y TNFR

(vía extrínseca)

Proteínas antiapoptóticas

Bcl-2, Bcl-XI, Mcl-1, Bfl-1/A,

Bcl-W, Bcl-G

Poteínas proapoptóticas

Bax, Bak, Bad, Bid, Bik,

Bok, Bim, Bcl-XS, Bcl-B, etc

citocromo c

pro-caspasa 9

caspasa 9 activa

• Reorganización del citoesqueleto

• Exposición de fosfatidilserina en la membrana plasmática

• Ruptura del DNA

Herramientas para el estudio de la apoptosis por citometría de flujo

• Cambios en el FSC-SSC

• Cambios mitocondriales: TMR (tetrametilrodamina). Apoptosis muy temprana

• Niveles de moléculas pro-apoptóticas o anti-apoptóticas => con anticuerpos

monoclonales

• Nivel de caspasas activas => anticuerpos monoclonales

• Detección de fosfatidilserina en la membrana plasmática. Apoptosis temprana

=> Annexina V conjugada.

• Fragmentación del ADN. Apoptosis tardía => Ioduro de Propidio (PI) /

Incorporación de análogos de nucleótidos a los extremos 3’ OH terminal

catalizado por TdT exógena, biotinilados o detectados con anticuerpos

monoclonales (Técnica de TUNEL)

• Estudiar receptores de muerte en la superficie celular => Fas (CD95),TNFR1 y

otros. Apoptosis por activación.

EJEMPLO: apoptosis temprana y tardía

Células B en medio de cultivo 1% de SBF Células Jurkat + anti-FAS

Inducción de apoptosis:

EJEMPLO: expresión de Bcl-2 en LLC

Bcl-2: marcación intracitoplasmática

Bcl-2 bajo

Bcl-2 alto

Control negativo

LLC viables

LLC apoptóticas

n°

de

cé

lula

s

fluorescencia

GENES REPORTEROS

Transfección de células y genes reporteros

CARACTERISTICAS DE LOS VECTORES DE EXPRESION

Vectores de origen eucariota aptos para la replicación en células de mamíferos.

Codifican un gen reportero en general GFP.

Permiten generar proteínas de fusión dada la estructura de los plásmidos.

Selección de transfectantes estables (resistencia a neomicina).

Permiten estudios de expresión, localización y dinámica celular.

Nueva generación adaptados para obtener máxima expresión en células de

mamífero.

Transfección de células y genes reporteros

DESCRIPCION DE LOS VECTORES DE EXPRESION

EJEMPLOS: pmaxFP-Green, pmaxFP-Red, pmaxFP-Yellow

• Señal de poliadenilación de SV40

• Origen de replicación de SV40

• Gen de resistencia a kanamicina/neomicina

• Promotor de CMV

• Gen GFP células transfectadascon GFP

Transfección de células y genes reporteros

Procedimiento experimental para la transfección de células

selección y cultivo

células + ADN/siARN

TRANSFECCIONcultivo celular

EJEMPLO: transfección de PBMC

1. Transfección de células con un vector codificando GFP.

2. 24 horas post-transfección se analizaron las células por citometría de flujo.

A: gate de linfocitos

B: a partir de (A) gate en anti-CD3

C: exclusión de células muertas en CD3+

D y E: expresión de GFP en células T vivascontrol GFP

Proteínas de fusión en modelos murinos

EJEMPLO: animales transgénicos

MHC II-GFP Rab27a-EGFP

CDLB

INTERACCIONES CELULARES

Determinación de asociaciones moleculares

FRET: “fluorescence resonance energy transfer”

Fundamento:

El espectro de emisión y absorción de los colorantes usados están superpuestos.

La energía emitida tras la excitación de la proteína fluorescente dadora puede directamente

excitar a la proteína fluorescente receptora sólo cuando ambas están lo suficientemente

cerca. Por lo tanto uno de los fluoróforos será excitado como consecuencia de la excitación

previa del otro.

FRET permite distinguir células fusionadas de las agregadas. Sólo las células fusionadas

muestran FRET.

FRET: Espectros de excitación y emisión

Dador y aceptor:

superposición de espectros

Transferencia de la energía de

resonancia

FRET intramolecular

APLICACIONES: algunos ejemplos

3- Interacciones ligando-receptor 4- Fusión de vesículas o células

1- Cambios conformacionales 2- Hidrólisis de proteínas

dador aceptor

Células multinucleadas o sincicios Análisis de la fusión celular

EJEMPLO: fusión celular

Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV

Sincicios (flechas) producidos in vitro por la

fusión entre células linfoides humanas CD4+ y

células que expresan las proteínas de fusión del

VIH (células Env+).

Rojo: células CD4+ no fusionadas

Verde: células Env+ no fusionadas

Azul: sincicios

Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23

Fluorescencia verde

Flu

ore

scencia

roja

EJEMPLO: fusión celular

Análisis de la fusión celular mediada por las proteínas de la envoltura del HIV

Huerta et al. J Virol. Methods (2003), 138:17-23

SS

C-H

FSC-H

Cocultivos de células CD4+ marcadas con DiI y células Env+ marcadas con DiO

DiI-CD4+ y DiO-Env+ 30ug/ml anti-CD4 mutación en gp41

IFM

ro

jo

IFM verde

fusión

agregados

14% 1,6% 0,4%

Determinación de asociaciones moleculares

Conjugados celulares

Fundamento:

Los espectros de emisión de los colorantes utilizados para marcar los diferentes tipos

celulares deben estar separados.

Es una metodología rápida y confiable para evaluar interacciones celulares.

Permite analizar gran número de células en corto tiempo a diferencia de la microscopía.

LTAPC

CD

y

LT

EJEMPLO: agregados celulares

Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco

Fluorescencia roja: células YTS (línea celular NK) marcadas con PKH26

Fluorescencia verde: células blanco marcadas con PKH67

Tiempo: 0 min Tiempo: 10 min a 37ºC

Burshtyn et al. Current Biology (2000), 10:777-780

EJEMPLO: agregados celulares

Formación de conjugados entre NK efetoras y células blanco

NK target

Marcación y citometría de flujo:

Ioduro de propidio (VIABILIDAD)

MitoTracker (EFECTORAS: NK)

MitoTracker green FM (FL1)

Iod

uro

de

pro

pid

io (

FL

2)

MitoTracker (FL1)

IP (

FL

2)

MitoTracker: marca mitocondrias en células vivas

EJEMPLO, “RFADCC: Rapid Fluorescent ADCC”

Gomez-Roman, et al. J Immunol Methods (2006), 308:53-67

Detección de anticuerpos anti-HIV

CBPKH26

gp140

Gate en PKH26+

Análisis de CFSE

PBMC

PBMC

PBMC

PBMC

plasma HIV+

lisis

PBMC: células efectoras

CB: células blanco

EJEMPLO: Expresión de CD107a en NK

Activación y degranulación de células NK

Chung, AW. et al. J Immunol (2009), 182:1202-10

NK+ K562 (1:1) + anti-CD107a

monensina y/o brefeldina

1 h a 37°C

5 h a 37ºc

Marcación:

anti-CD56

anti-CD3

citoquinas

Metodología y análisis de datos

Ejemplo 1

Ejemplo 2

NK: células efectoras

K562: células blanco

control gp140

POTENCIAL DE MEMBRANA

Potencial de membrana

--

-+

+

+

-

- -

- ---

+++

+

+Hiperpolarización

(Valinomicina)

++

+

-

-

-

Despolarización

(Gramicidina)

estado normal

cyanina (+)

oxonol (-)

oxonol (-)

cyanina (+)

Colorantes utilizados para estudiar el potencial de membrana

+

-

Despolarización e hiperpolarización en células

CCRF-CEM

Despolarización de PMN (cyanina)

luego del tratamiento con PMA

EJEMPLO: cambios en potencial de membrana

HIPERPOLARIZACIONDEPOLARIZACION

GRACIAS