Chuong 1 2 3

- 0 -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Bài giảng

CÁC PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI

ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Biên soạn: TS.GVC. HOÀNG THỊ HUỆ AN

NHA TRANG, 10/2012

- 1 -

Chương 1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ

KỸ THUẬT PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

I. SỰ CẦN THIẾT PHẢI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THỰC PHẨM

Hiện nay, ngành công nghiệp thực phẩm ở nước ta đang phát triển nhanh chóng.

Xã hội càng phát triển, yêu cầu của người tiêu dùng đối với chất lượng thực phẩm

ngày càng cao. Việc đánh giá đúng chất lượng thực phẩm sẽ giúp cơ sở sản xuất phát

hiện những xác định được nguyên nhân không đảm bảo phẩm chất lượng (sai sót trong

khâu sử dụng nguyên liệu, qui trình chế biến thực phẩm, trong các thao tác trong sản

xuất,…) để điều chỉnh kịp thời quá trình sản xuất nhằm nâng cao chất lượng sản phẩm.

Vì vậy, việc đánh giá các chỉ tiêu chất lượng thực phẩm là công tác rất cần thiết trong

công nghiệp chế biến thực phẩm.

Đặt biệt ở Việt Nam hiện nay, trong tình trạng các cơ sở sản xuất chưa tuân thủ

nghiêm ngặt các quy định luật pháp về an toàn thực phẩm, việc kiểm soát chất lượng

thực phẩm là vấn đề lớn đặt ra đối với các cơ quan quản lý an toàn vệ sinh thực phẩm.

II. KHÁI QUÁT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Các phương pháp phân tích định lượng được chia làm 2 nhóm lớn:

II.1. Phương pháp phân tích hóa học (phương pháp phân tích cổ điển): dựa trên việc

sử dụng phản ứng hóa học giữa chất cần phân tích với thuốc thử nào đó:

aX + bR = cP + dQ

Phương pháp phân tích hóa học gồm:

II.1.1. Phương pháp phân tích thể tích (phương pháp chuẩn độ):

II.1.1.1. Nguyên tắc:

Đo thể tích VR của dung dịch chuẩn R

(có nồng độ NR đã biết chính xác) cần dùng

để phản ứng vừa đủ với một thể tích chính

xác VX của mẫu phân tích (chứa chất X cần

xác định) theo phản ứng tổng quát:

aX + bR = nP + d Q

Dựa vào các thể tích VX, VR; NR có thể

tính được hàm lượng chất X có trong mẫu

phân tích.

R: dung dịch chuẩn

VR (ml); NR

X: dung dịch phân tích

Vx ml; Nx

- 2 -

II.1.1.2. Phân loại phương pháp phân tích thể tích:

a) Phương pháp chuẩn độ acid – baz (phương pháp trung hòa):

* Nguyên tắc: dựa trên việc sử dụng phản ứng trung hòa

A1 + B2 = B1 + A2

(A1/B1 và A2/B2 là 2 cặp acid - baz liên hợp)

b) Phương pháp chuẩn độ kết tủa:

* Nguyên tắc: dựa trên việc sử dụng phản ứng tạo thành hợp chất khó tan giữa

chất cần xác định X với thuốc thử tạo tủa R (dung dịch chuẩn):

nX + mR = XnRm↓

Thông dụng nhất là phép đo bạc: xác định các halogenur (Cl -, Br-, I-, SCN-) bằng

dung dịch chuẩn là AgNO3 (phương pháp Mohr; phương pháp Fajans; phương

pháp Charpentier-Volhard)

c)Phương pháp chuẩn độ phức chất:

* Nguyên tắc: dựa trên việc sử dụng phản ứng tạo thành một phức chất bền,

không màu giữa chất cần xác định (X) với dung dịch chuẩn là một thuốc thử tạo

phức R nào đó:

nX + mR = [XnRm] (phức chất)

Thông dụng nhất là phương pháp chuẩn độ complexon: sử dụng dung dịch chuẩn

là complexon III (muối dinatri của EDTA; EDTA) để chuẩn độ các cation kim

loại.

d) Phương pháp chuẩn độ oxy hóa – khử

* Nguyên tắc: Dựa trên việc sử dụng phản ứng oxy hóa – khử:

aOx1 + bKh2 = cKh1 + dOx2

(Ox1/Kh1 và Ox2/Kh2 là 2 cặp oxy hóa – khử liên hợp)

Các phép chuẩn độ oxy hóa – khử thông dụng là:

- Phép đo permanganat: dùng dung dịch chuẩn là KMnO4

- Phép đo Dicromat: dùng dung dịch chuẩn là K2Cr2O7

- Phép đo Iod – Thiosulfat: dùng dung dịch chuẩn là I2 chuẩn độ chất khử

(chuẩn độ trực tiếp; chuẩn độ ngược) hay dùng dùng dịch chuẩn Na2S2O3

(chuẩn độ gián tiếp chất oxy hóa).

II.1.1.3. Ưu – nhược điểm và phạm vi ứng dụng của phương pháp chuẩn độ:

- Ưu điểm: nhanh, khá chính xác (sai số khoảng 0,1–1%), dụng cụ đơn giản, rẻ

tiền

- Nhược điểm: giới hạn định lượng cao (cỡ 10 – 4 M).

- Phạm vi ứng dụng: xác định các cấu tử đa lượng (hàm lượng 0,1 – 100%)

- 3 -

II.1.2. Phương pháp phân tích khối lượng

* Nguyên tắc:

Chuyển cấu tử cần phân tích X có trong mẫu nghiên cứu vào trong thành phần

của một chất thành phần hóa học xác định (gọi là dạng cân, ký hiệu: C).

Dựa vào khối lượng dạng cân C (mc, gam), khối lượng mẫu phân tích (a, gam),

công thức phân tử của dạng cân, có thể tính được hàm lượng chất phân tích X trong

mẫu nghiên cứu.

* Ưu – nhược điểm:

- Ưu điểm: độ chính xác khá cao (0,1%).

- Nhược điểm: mất nhiều thời gian

- Phạm vi ứng dụng: ít dùng (chỉ dùng khi yêu cầu kết quả phân tích có độ đúng

cao).

II.2. Phương pháp phân tích vật lý – hóa lý (phương pháp phân tích hiện đại; phương

pháp phân tích công cụ)

II.2.1. Nguyên tắc chung: dựa trên việc sử dụng các thiết bị phân tích để đo

cường độ của một đại lượng vật lý nào đó liên quan đến cấu tử phân tích, từ đó xác

định hàm lượng của cấu tử phân tích.

II.2.2. Phân loại các phương pháp phân tích công cụ:

II.2.2.1. Phương pháp phân tích quang học: dựa trên sự tương tác giữa các tiểu

phân chất phân tích với bức xạ điện từ.

Các phương pháp phân tích quang học thường dùng trong phân tích thực phẩm

gồm:

- Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis (UV-Vis Spectrometry)

- Phương pháp quang phổ phát xạ nguyên tử (AES: Atomic Emission

Spectrometry)

- Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS: Atomic Absorption

Spectrometry)

b) Phương pháp phân tích điện hóa: dựa trên những hiện tượng liên quan đến

tính chất điện hóa của mẫu khảo sát.

Các phương pháp điện hóa thường dùng trong phân tích thực phẩm bao gồm:

* Phương pháp đo thế (Potentiometry):

- Phương pháp trực tiếp:

Nguyên tắc: Đo thế của điện cực chỉ thị đối với ion cần xác định.

Ứng dụng: Đo pH; định lượng các cation và anion khác nhau trong dung dịch

Ví dụ: Định lượng Na+; K+; Ca2+; Pb2+; NO3-, F-; Cl- , CN-, …

- 4 -

- Phương pháp chuẩn độ điện thế:

Nguyên tắc: Đo sự thay đổi thế của điện cực chỉ thị đối với ion cần xác định

trong quá trình chuẩn độ. Vẽ đường chuẩn độ, từ đó xác định chính xác điểm

tương đương.

Ứng dụng:

- Chuẩn độ chọn lọc các ion (ngay cả khi dung dịch có màu)

- Cho phép chuẩn độ cả các cấu tử đa lượng và vi lượng (nồng độ lớn hơn 10 – 5 –

10– 6 M)

* Phương pháp phân tích cực phổ (Polarography):

Nguyên tắc: Nghiên cứu sự phụ thuộc của cường độ dòng khuếch tán (gây ra do

sự khuếch tán các cation trong dung dịch đến catod) khi tăng dần điện thế áp đặt lên

catod (gọi là sóng cực phổ). Định lượng các cation dựa vào chiều cao sóng cực phổ.

c) Phương pháp phân tích sắc ký:

Nguyên tắc: Tách hỗn hợp cấu tử phân tích dựa trên khả năng tương tác khác

nhau của các cấu tử đối với pha tĩnh (pha đứng yên) và pha động (pha khí hay lỏng, di

chuyển liên tục qua pha tĩnh) rồi định lượng các cấu tử tách ra nhờ phương pháp phân

tích hóa lý (đo quang; đo độ dẫn diện; chỉ số khúc xạ,…)

Các phương pháp phân tích sắc ký thông dụng trong phân tích thực phẩm là:

- Sắc ký bản mỏng

- Sắc ký lỏng hiệu năng cao

- Sắc ký khí

Hình 1.1. Phân loại các phương pháp phân tích công cụ

- 5 -

II.2.3. Ưu - nhược điểm của phương pháp phân tích công cụ

Ưu điểm:

- Độ chính xác cao

- Giới hạn định lượng thấp, do đó có thể sử dụng lượng mẫu nhỏ và phân tích các

cấu tử vi lượng và vết.

- Độ chọn lọc cao, do vậy có thể phân tích các mẫu có thành phần phức tạp

- Tốc độ phân tích nhanh nhờ hệ thống thiết bị được tự động hóa

Nhược điểm:

- Thiết bị đắt tiền

- Người phân tích cần có chuyên môn sâu để sử dụng hiệu quả thiết bị

Ứng dụng: dùng để định lượng các cấu tử vi lượng (hàm lượng cỡ 0,01- 0,1%)

hay cấu tử vết (hàm lượng < 0,01%) trong các mẫu thực phẩm, dược phẩm, môi

trường, sinh học,…

Ngoài ứng dụng trong phân tích định lượng, một số phương pháp phân tích vật lý

và hóa lý còn được dùng trong nghiên cứu cấu trúc vật chất như:

- Phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại - khả kiến (phổ UV-Vis): Nhận biết

phân tử chất hấp thụ nhờ hình dạng phổ hấp thụ và các đỉnh hấp thụ đặc trưng.

- Phương pháp quang phổ hồng ngoại (phổ IR): Xác định sự có mặt và vị trí của

các nhóm chức trong các phân tử hợp chất hữu cơ dựa vào các tần số dao động đặc

trưng cho nhóm chức xuất hiện trong phổ IR.

- Phương pháp phổ khối lượng (phổ MS): Bắn phá phân tử thành các ion. Xác

định phân tử lượng và cấu trúc phân tử dựa vào khối lượng và điện tích (tỷ số m/z) của

mảnh ion phân tử và các mảnh ion được tạo thành.

- Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (phổ NMR): Đặt mẫu phân tích (khá

tinh khiết) chứa phân tử chất nghiên cứu cấu trúc vào trong một từ trường ngoài, kích

thích các hạt nhân nguyên tử (thường là hạt nhân 1H hay 13C) trong phân tử bằng một

bức xạ vô tuyến có tần số thích hợp để xảy ra sự chuyển hạt nhân lên trạng thái có mức

năng lượng từ cao hơn (gọi là sự cộng hưởng từ hạt nhân). Xác định sự có mặt của các

nhóm chức có trong phân tử dựa vào cường độ và vị trí (độ chuyển dịch hóa học) của

các tín hiệu cộng hưởng đặc trưng cho các nhóm chức này.

- Phương pháp phổ nhiễu xạ tia X: Ghi phỗ nhiễu xạ tia X của chất rắn tinh thể.

Xác định cấu trúc mạng lưới tinh thể chất rắn dựa vào các chỉ số đặc trưng.

III. PHÂN LOẠI CÁC THÀNH PHẦN HÓA HỌC TRONG THỰC PHẨM –

NGUYÊN TẮC CHỌN PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THỰC PHẨM

Có thể phân loại các chỉ tiêu chất lượng thực phẩm thành các nhóm sau dựa theo

hàm lượng của cấu tử cần phân tích trong mẫu:

- 6 -

a) Các thành phần đa lượng: là các thành phần hóa học cơ bản có trong nguyên

liệu chế biến thực phẩm hay các thành phần khác được hình thành trong quá trình chế

biến, bảo quản thực phẩm

Để định lượng các thành phần đa lượng này có thể dùng các phương pháp phân

tích hóa học (phương pháp chuẩn độ; phương pháp phân tích khối lượng).

Ví dụ:

- Xác định đạm thối (NH3); N tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; xác định acid

amin tổng số bằng phương pháp chuẩn độ formol,…(chuẩn độ acid – baz)

- Xác định hàm lượng muối ăn bằng phương pháp Mohr (chuẩn độ kết tủa)

- Định lượng Ca2+ , Mg2+ trong các mô thực vật; xác định độ cứng của nước,…

bằng phương pháp chuẩn độ complexon (chuẩn độ phức chất)

- Xác định glucid (đường khử, saccharose, đường tổng, tinh bột,…) bằng phương

pháp Bertrand hay phương pháp Xanh Metylen; xác định etanol bằng phép đo

dicromat…; định lượng vitamin C, SO2 bằng phép chuẩn độ Iod – Thiosulfat (chuẩn

độ oxy hóa – khử)

- Xác định hàm lượng nước (hay chất khô tổng số), khoáng tổng số, lipid tổng số

bằng phương pháp phân tích khối lượng.

b) Các thành phần vi lượng: thường là các phụ gia được đưa vào trong quá

trình chế biến thực phẩm.

Ví dụ: Chất chống vi sinh vật; chống oxy hoá, các chất chống đóng vón; chất điều

chỉnh độ ẩm; chất làm trong; chất làm đặc và tạo gel; chất điều chỉnh độ chua; chất

điều vị; chất ngọt nhân tạo; chất tạo mùi; chất tạo màu; các enzyme,…

Các phụ gia thực phẩm thường được định lượng bằng phương pháp phân tích công

cụ thông thường (trắc quang – so màu; sắc ký bản mỏng; GC; HPLC,…)

c) Các thành phần vết: bao gồm các độc tố có trong thực phẩm do nguyên liệu

chế biến không đảm bảo chất lượng, hoặc bị thôi nhiễm từ các thiết bị sản xuất/bao bì

trong quá trình chế biến và bảo quản, hoặc được hình thành do các phản ứng sinh hóa

xảy ra trong quá trình chế biến thực phẩm không đúng cách,…

Ví dụ: Kim loại nặng (Pb, Hg, Cd, As, Se, Cu, Sn, Cr,…); độc tố do vi sinh vật

tiết ra (aflatoxin); dư lượng thuốc trừ sâu; dư lượng kháng sinh; dư lượng chất kích

thích tăng trưởng; độc chất gây ung thư (3-MCPD),…

Các độc tố thực phẩm thường được bằng phương pháp phân tích công cụ có độ

nhạy cao (GF-AAS; ICP-MS; GC-MS; LC-MS,…).

Trong các chương sau sẽ giới thiệu một số phương pháp phân tích hiện đại ứng

dụng trong định lượng các phụ gia và độc tố thực phẩm.

- 7 -

Chương 2.

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ PHÂN TỬ UV-Vis

Đây là phương pháp phân tích được ứng dụng rất rộng rãi trong phân tích thực

phẩm. Phương pháp này dựa trên hiện tượng hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử chất

nghiên cứu.

II.1. Sự hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử:

Chiếu một chùm bức xạ đơn sắc có bước sóng thích hợp đi qua một hệ đồng nhất

(ở thể khí hay dung dịch) chứa các phân tử chất nghiên cứu. Nếu năng lượng của bức

xạ sử dụng tương ứng với năng lượng cần cung cấp để chuyển dời các electron trong

phân tử từ trạng thái cơ bản (mức năng lượng thấp nhất: E0) lên trạng thái kích thích

(có mức năng lượng cao hơn: E*) thì sẽ xảy ra hiện tượng hấp thụ ánh sáng:

Hình 2.1. Điều kiện để xảy ra hiện tượng hấp thụ ánh sáng

Hình 2.2. Các kiểu chuyển dời electron cơ bản trong phân tử hợp chất hữu cơ

Khi phân tử bị kích thích bởi bức xạ UV hay Vis, có thể xảy ra một số các kiểu

chuyển dời electron trong phân tử chất hữu cơ khi bị kích thích:

- Chuyển dời σ σ*: xảy ra ở những hợp chất có liên kết đơn, đòi hỏi năng

lượng lớn nhất, ứng với vùng UV xa (λ < 190 nm)

- Chuyển dời π π*: rất quan trọng, xảy ra ở những hợp chất có liên kết bội và

có cấu trúc nối đôi liên hợp (các hợp chất thơm). Chuyển dời này ứng với bức

E*

E0

h = E = E* - E0

- 8 -

xạ có bước sóng khoảng 200 nm. Mạch liên hợp phân tử càng dài thì bước sóng

hấp thụ càng chuyển về vùng sóng dài.

- Chuyển dời n σ* hay n π*: liên quan tới những phân tử chứa cặp electron

không phân chia trong các dị tố N, O, xảy ra ở vùng gần 300 nm.

Những bước sóng hấp thụ trên thay đổi đáng kể khi có mặt các nhóm thế trong

phân tử.

Cùng một mức năng lượng điện tử, trong phân tử còn có nhiều mức năng lượng

dao động và quay. Do đó, phổ hấp thụ điện tử của phân tử khá rộng (là phổ đám,

không phải phổ vạch)

Trong phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sử dụng dãi bức xạ thuộc

vùng tử ngoại gần (λ = 200 – 400 nm) hay vùng khả kiến (λ = 400 – 800 nm).

II.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis - Định

luật Bouguer – Beer - Lambert

Chiếu một chùm ánh sáng đơn sắc (cường độ I0) vuông góc với một cuvet (chậu

đo) đựng dung dịch chứa các phân tử chất nghiên cứu. Trên đường đi của tia sáng, có

thể xảy ra các hiện tương sau:

- sự phản xạ ánh sáng trên bề mặt cuvet

- sự hấp thụ ánh sáng bởi vật liệu làm cuvet

- sự hấp thụ ánh sáng bởi các phân tử có trong dung dịch

Kết quả là cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch sẽ giảm đi.

Nếu xem rằng không xảy ra sự phản xạ ánh sáng trên bề mặt cuvet (sử dụng có bề

mặt rất nhẵn) và sự hấp thụ ánh sáng bởi vật liệu làm cuvet (chọn vật liệu thích hợp)

thì:

I0 = IA + IT

trong đó:

IA: cường độ bức xạ bị hấp thụ

IT: cường độ bức xạ sau khi đi qua dung dịch

Sự hấp thụ ánh sáng tuân theo các định luật của Bouguer (1729), Beer (1760) và

Lambert (1852):

I0

(λ)IT

l

Dung dịch hấp thụ (nồng độ C)

IA

- 9 -

Độ giảm cường độ ánh sáng sau khi đi qua dung dịch tỷ lệ với bề dày lớp dung

dịch ánh sáng truyền qua và nồng độ chất hấp thụ:

IT = I0.e- k C l ( : hệ số tỷ lệ)

hay:

Để đánh giá cường độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch, người ta dùng các đại

lượng sau:

- Độ truyền suốt (transmitance, ký hiệu là T): là tỷ số giữa cường độ tia ló (IT)

và cường độ tia tới (I0)

- Độ hấp thụ (absorbance ; ký hiệu là A) hay còn gọi là mật độ quang (optical

density, ký hiệu là OD):

A = .l.CVậy :

A = - = - lg T

Hệ thức A = .l.C thường được gọi là biểu thức toán học của định luật Lambert-

Beer.

được gọi là hệ số hấp thụ, nó chỉ phụ thuộc vào bản chất của phân tử chất hấp

thụ, vào bước sóng tia tới, dung môi sử dụng và nhiệt độ.

Nếu [l] = cm, [C] = mol/lít thì [] = lít.mol– 1.cm– 1 được gọi là hệ số hấp thụ

mol (hay hệ số tắt phân tử gam)

Nếu [l] = cm, [C] = g/lit thì [] = lít.g– 1.cm– 1 được gọi là hệ số hấp thụ

riêng.

Đối với một dung dịch chất hấp thụ khảo sát, khi bề dày dung dịch không đổi (cố

định bề dày cuvet) thì quan hệ A - C là tuyến tính: A = k.C. Đây chính là cơ sở của

phép định lượng bằng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis.

II.2. Một số lưu ý khi sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV - Vis:

1/ Hệ số hấp thụ phụ thuộc vào bước sóng ánh sáng đơn sắc sử dụng

Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của vào bước sóng λ được gọi là phổ hấp thụ

của chất nghiên cứu (Hình II.2). Phổ hấp thụ của các phân tử chất hữu cơ trong vùng

UV-Vis thường là một dãi rất rộng gây ra bởi rất nhiều chuyển dời của các electron

giữa các mức năng lượng rất gần nhau. Phổ hấp thụ của các chất thường có một hay

vài cực đại. Bước sóng tại đó xảy ra sự hấp thụ cực đại được gọi là bước sóng hấp thụ

cực đại (wavelength of maximum absorbance ; ký hiệu là λmax). Giá trị λmax phụ thuộc

- 10 -

bản chất của phân tử chất hấp thụ, đây là một trong các đặc trưng để nhận biết một hợp

chất.

Để tăng độ nhạy và độ chính xác của phép định lượng lượng bằng phương pháp

đo quang UV – Vis, cần đo ở độ hấp thụ của dung dịch ở bước sóng ứng với sự hấp

thụ cực đại của chất nghiên cứu.

Hình 2.3. Phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

2/ Độ hấp thụ có tính cộng tính:

Độ hấp thụ của một hỗn hợp các chất bằng tổng độ hấp thụ của từng chất hấp thụ

có trong hệ: A 1+2+…+ n = ∑Ai = A1 + A2 +.....+ A0

Do đó, độ hấp thụ của một dung dịch bằng tổng độ hấp thụ của chất tan và dung

môi.

A dung dịch = Achất hấp thụ + A dung môi

Trong thực tế, dung dịch không chỉ chứa chất hấp thụ cần nghiên cứu X và

dung môi mà có thể có một số các thành phần khác (các chất lạ, tác nhân điều pH môi

trường, thuốc thử tạo phức,...). Dung dịch chứa tất cả các chất như trong dung dịch

phân tích ngoại trừ chất phân tích được gọi là dung dịch nền (blank solution).

Vì vậy, một cách tổng quát có thể xem rằng:

A dung dịch = Achất hấp thụ + A dung dịch nền

Để đo được độ hấp thụ gây ra bởi riêng chất hấp thụ X, cần pha chế dung dịch

nền để hiệu chỉnh máy (đưa độ hấp thụ nền về giá trị 0). Khi đó, độ hấp thụ gây ra chỉ

do chất hấp thụ sẽ đúng bằng giá trị độ hấp thụ của dung dịch đem đo:

3/ Định luật Lambert – Beer chỉ đúng trong điều kiện:

- Bức xạ sử dụng phải đơn sắc

- Dung dịch đo phải trong suốt và đồng nhất.

- Không có sự tương tác giữa các phân tử chất hấp thụ. Vì vậy, thường chỉ áp

dụng để định lượng các các dung dịch có nồng độ hấp hơn 10– 2 M.

λ (nm)λma

x

- 11 -

4/ Trong nhiều trường hợp, thường sử dụng bức xạ khả kiến để định lượng các

chất (phương pháp trắc quang - so màu: photocolorimetry). Muốn vậy, dung dịch chất

hấp thụ phải có màu đậm và bền. Trong thực tế, đa số dung dịch chứa cấu tử cần định

lượng (X) không màu hay có màu rất nhạt. Khi đó, để tăng độ nhạy của phép phân tích

bằng phương pháp trắc quang - so màu, cần chuyển X về dạng phức có màu đậm bằng

phản ứng với một thuốc thử R thích hợp:

X + HR XR + H+

Để phép phân tích đạt kết quả chính xác, có độ nhạy và độ chọn lọc cao, cần lưu

ý các điểm sau:

- Phản ứng tạo phức phải xảy ra một cách định lượng (phản ứng xảy ra hoàn

toàn để chuyển toàn bộ chất X vào trong phức màu). Muốn vậy, nên dùng dư thuốc thử

tạo phức HR. Tuy nhiên, lượng thuốc thử tạo phức cũng cần đảm bảo sao cho phức tạo

ra có thành phần ổn định.

- Phức XR phải dễ tan. Nếu phức tạo thành kém tan trong dung môi nước thì có

thể chiết phức này sang dung môi hữu cơ thích hợp. Ví dụ: chiết phức dithizonate của

Pb2+, Cu2+, Zn2+… sang dung môi CCl4; chiết phức [Co(SCN)4]2- sang dung môi alcol

isoamylic,…

- Phức XR tạo thành có màu càng đậm càng tốt (hệ số hấp thụ phải đủ lớn, cỡ

103 trở lên)

- Phức XR phải khá bền màu. Đối với các phức không bền màu, cần tiến hành

đo trong khoảng thời gian thích hợp sao độ độ hấp thụ của phức đạt giá trị ổn định và

cực đại.

- pH dung dịch ảnh hưởng nhiều đến độ hấp thụ của dung dịch phức màu. Do

đó, phải đo trong khoảng pH sao cho độ hấp thụ của phức XR ổn định và cực đại.

- Định luật Lambert – Beer thường chỉ đúng trong một vùng nồng độ nào đó

của chất nghiên cứu.

Hình 2.4. Khoảng tuyến tính của

định luật Lambert - Beer

Nguyên nhân là do ở vùng nồng độ thấp

của chất nghiên cứu xảy ra sự phân ly

phức màu mạnh hay sự thay đổi bản chất

phức màu do tương tác giữa phức màu

với phân tử dung môi; còn ở nồng độ lớn

có thể xảy ra sự liên hợp phân tử làm

thay đổi bản chất chất hấp thụ, dẫn đến

sự thay đổi hệ số hấp thụ ε.

Do đó, cần tiến hành định lượng trong

vùng nồng độ trong đó xảy ra sự tuyến

tính A – C.

A

- 12 -

- Nồng độ các ion cản trong dung dịch không được vượt quá giới hạn cho phép

để tránh ảnh hưởng đến độ hấp thụ của dung dịch. Nếu cần, phải loại bỏ các ion cản

bằng các biện pháp trước khi tiến hành đo quang (ví dụ: che, chọn bước sóng đo thích

hợp, dùng thuốc thử chọn lọc,...)

- Sự thay độ nhiệt độ cũng có thể làm thay đổi bản chất của phân tử chất màu, và

ảnh hưởng đến cường độ màu của phức. Do vậy, cần tạo tiến hành tạo phức và đo độ

hấp thụ dung dịch trong khoảng nhiệt độ thích hợp, sao cho độ hấp thụ của phức lớn

nhất và ổn định nhất.

- Để loại trừ ảnh hưởng của các cấu tử cản đến độ hấp thụ dung dịch, thành phần

nền của dung dịch nghiên cứu và các dung dịch chuẩn phải càng giống nhau càng tốt.

II.3. Cấu tạo của quang kế UV-Vis

II.3.1. Các bộ phận chính của quang kế UV-Vis

Quang kế gồm các bộ phận chính sau đây (hình 2.3)

a) Nguồn sáng (light source): là các loại đèn có khả năng phát ra các bức xạ

UV/Vis.

* Đèn halogen (hay đèn Tungsten / đèn Wolfram, ký hiệu: W): bóng đèn bằng

thủy tinh, bên trong chứa khí trơ và hơi Iod; dây tóc bằng wolfram; phát ra bức xạ khả

kiến – hồng ngoại gần (λ = 380 – 2500 nm)

* Đèn Deuteri (ký hiệu: D): bóng đèn bằng thạch anh, bên trong chứa hơi thuỷ

ngân ở áp suất thấp 2 -3 torr, phát xạ nhờ tạo ra hồ quang điện. Dãi bức xạ phát ra nằm

trong vùng tử ngoại gần (λ = 180 – 375 nm)

* Đèn Xenon: phát ra bức xạ chủ yếu trong vùng khả kiến và một phần bức xạ tử

ngoại gần. Đèn Xenon hiện đại có thể phát ra dãi bức xạ rất rộng, bào gồm cả vùng

UV –Vis và IR gần (λ = 190 – 1100 nm)

b) Hệ thống thấu kính (lens): cho phép tập trung chùm sáng và hướng tia sáng

theo đường đi nhất định.

c) Bộ phận đơn sắc (monochromator): là các kính lọc màu, lăng kính hay cách tử

nhiễu xạ cho phép phân tách chùm bức xạ đa sắc phát ra từ các nguồn sáng thành bức

xạ đơn sắc.

d) Chậu đo (cuvet): để chứa dung dịch đo, có thể làm bằng thủy tinh (nếu đo

trong vùng Vis) hay thạch anh (nếu đo trong vùng UV).

Cũng có loại cuvet bằng polymer dùng để đo trong vùng Vis nhưng chỉ nên dùng

1 lần.

e) Detector: thường là tế bào quang điện hay tế bào quang dẫn cho phép chuyển

ánh sáng thành tín hiệu điện.

f) Bộ phân khuếch đại (Amplificator) : để khuếch đại tín hiệu điện.

- 13 -

g) Bộ phận xử lý và hiển thị tín hiệu (Signal Processing and Readout): cho phép

xử lý tín hiệu và hiển thị kết quả đo tự động trên màn hình.

Hình 2.5. Các bộ phận chính trong quang kế UV – Vis

II.3.2. Phân loại các thiết bị đo quang:

a) Phân loại theo bản chất của bộ đơn sắc:

Tùy theo bản chất và đặc tính của bộ đơn sắc, người ta chia các máy đo quang

UV-Vis thành các loại sau:

- Máy so màu (colorimeter): sử dụng bộ đơn sắc là các kính lọc màu; cho độ

đơn sắc kém (Δλ = 10 – 50 nm)

- Quang kế (photometer): tạo ra bức xạ đơn sắc bằng các lăng kính; độ đơn sắc

cao hơn (Δλ = 5 - 10 nm)

- Quang phổ kế (spectrophotometer): là loại máy thông dụng nhất hiện nay,

trong đó bức xạ đơn sắc được tạo ra bằng lăng kính hay cách tử nhiễu xạ nên cho độ

đơn sắc cao (Δλ = 1- 2 nm).

b) Phân loại theo sơ đồ quang học của thiết bị

Chia làm 2 loại:

* Máy 1 chùm sáng (single beam): ánh sáng sau khi qua bộ đơn sắc được đi theo

1 đường duy nhất đến cuvet chứa dung dịch đo.

Cách vận hành:

- Mở máy.

- Chọn đèn (nếu máy có 2 đèn)

- Chọn bước sóng đo. Chờ 15 -30 min rồi bắt đầu đo.

- Dùng màn chắn đen (shutter) để ngăn toàn bộ ánh sáng chiếu vào cuvet. Điều

chỉnh %T = 0 %.

- Đưa cuvet chứa dung dịch nền ngăn đựng mẫu. Điều chỉnh %T = 100% (hay:

độ hấp thụ A = 0).

- Đưa dung dịch đo vào. Đọc kết quả đo.

- 14 -

Hình 2.6. Sơ đồ quang kế UV-Vis 1 chùm sáng

* Máy 2 chùm sáng (dual beam / double beam): ánh sáng sau khi qua bộ đơn sắc

được tách thành 2 chùm tia song song y hệt nhau (1 chùm đi qua ngăn chứa dung dịch

nền; 1 chùm đi qua ngăn chứa dung dịch mẫu)

Cách vận hành:

- Mở máy.

- Chọn đèn (nếu máy có 2 đèn)

- Chọn bước sóng đo. Chờ 15 -30 min rồi bắt đầu đo.

- Dùng màn chắn đen (shutter) để ngăn toàn bộ ánh sáng chiếu vào cuvet. Điều

chỉnh %T = 0%.

- Đưa 2 cuvet chứa dung dịch nền vào cả 2 ngăn đựng mẫu. Điều chỉnh

%T = 100% (hay: độ hấp thụ A = 0).

- Cho dung dịch mẫu vào cuvet trong ngăn chứa dung dịch mẫu. Đọc kết quả đo

Hệ thống 2 chùm sáng đắt tiền hơn hệ 1 chùm sáng nhưng cho kết quả chính xác hơn.

Hình 2.7. Sơ đồ quang kế UV-Vis 2 chùm sáng

Lưu ý:

Độ chính xác của phép đo độ hấp thụ phụ thuộc vào thiết bị đo quang

và vào bản chất của phân tử chất hấp thụ. Khi độ hấp thụ của dung dịch quá cao

(A > 1) cường độ bức xạ đi đến detector rất nhỏ, do đó cần khuếch đại tín hiệu lên rất

nhiều lần để đo được nên sai số lớn. Ngược lại, nếu độ hấp thụ quá nhỏ (A < 1) thì ảnh

- 15 -

hưởng của nhiễu nền đến tín hiệu đo sẽ lớn. Vì vậy, để sai số tương đối của phép định

lượng nhỏ thường chỉ nên đo độ hấp thụ trong khoảng A = 0,1 – 1,0.

Hình 2.8. Sự phụ thuộc của sai số

vào độ hấp thụ với các loại

detector khác nhau:

a) photovoltaic detector;

b) photomultiplier detector

II.4. Các cách định lượng trong phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis

Các phương pháp này đều dựa trên việc áp dụng định luật Lambert-Beer:

A = .l.CII.4.1. Phương pháp trực tiếp:

Đo độ hấp thụ Ax của dung dịch nghiên cứu rồi tính nồng độ chất hấp thụ theo

công thức:

trong đó: l - bề dày cuvet sử dụng;

ε : hệ số hấp thụ của chất nghiên cứu ở bước sóng sử dụng (tra cứu tài liệu)

Phương pháp này cho kết quả kém chính xác (do hệ số hấp thụ phụ thuộc rất

nhiều vào điều kiện đo) do đó ít được sử dụng. Tuy nhiên, nếu không cần định lượng

chính xác nồng độ chất hấp thụ mà chỉ cần theo dõi quy luật biến đổi hàm lượng chất

nghiên cứu trong một quà trình xử lý nào đó thì có thể áp dụng được.

II.4.2. Phương pháp so sánh

Giả sử cần định lượng chất X trong dung dịch phân tích (nồng độ CX)

Khi đó, theo phương pháp này, cần pha chế một dung dịch chuẩn chứa chất

nghiên cứu X (nồng độ C0). Tạo màu cho cả dung dịch phân tích1 (chứa cấu tử X cần

xác định) và dung dịch chuẩn trong điều kiện y hệt nhau. Đo độ hấp thụ của 2 dung

dịch trong dung dịch mẫu và dung dịch chuẩn trong cùng điều kiện.

Gọi AX và A0 là độ hấp thụ của dung dịch phân tích và chuẩn.

Theo định luật Lambert - Beer:

A0 = lC0

1 hay còn gọi là dung dịch mẫu (sample)0

0

CA

AC x

x

- 16 -

Ax = lCx

II.4.3. Phương pháp đường chuẩn

Pha chế một dãy chuẩn của chất nghiên cứu X với nồng độ tăng dần theo cấp số

cộng: C1, C2, ..., Cn (n = 5 – 8)

Tạo màu cho các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu rồi đo độ hấp thụ trong

cùng điều kiện.

Dựng đường chuẩn A – C (dùng phương pháp bình phương tối thiểu). Từ đó, xác

định nồng độ chất hấp thụ trong dung dịch mẫu bằng phương pháp nội suy tuyến tính.

Hình 2.9. Phương pháp đường chuẩn

Ghi chú:

- Thường dùng các phần mềm để xác định phương trình đường chuẩn, từ đó

tính được nồng độ chất nghiên cứu.

- Trong thực tế, đường chuẩn có thể không đi qua gốc tọa độ và có dạng:

A = aC + b

Khi đó, tính nồng độ chất hấp thụ trong dung dịch mẫu bằng công thức :

- Để áp dụng được phương pháp này, nồng độ của dãy chuẩn và của dung dịch

mẫu phải nằm trong vùng tuyến tính này phải nằm trong vùng nồng độ tuyến tính của

định luật Lambert – Beer.

- Phương pháp này chỉ cho kết quả đúng nếu mẫu có thành phần nền đơn giản

(chỉ chứa ít cấu tử hay không có cấu tử ảnh hưởng).

II.4.4. Phương pháp thêm

Đối với trường hợp mẫu có thành phần nền phức tạp (chứa nhiều cẩu tử ảnh

hưởng đến phép đo hay chưa biết có cấu tử nào có trong nền mẫu) thì nên định lượng

bằng phương pháp thêm. Trong phương pháp này mẫu chuẩn thêm được pha chế bằng

- 17 -

cách lấy chính dung dịch phân tích làm nền và thêm vào đó lượng xác định dung dịch

chuẩn của chất phân tích.

Có 2 trường hợp áp dụng phương pháp thêm:

a) Phương pháp thêm một mẫu chuẩn

Giả sử cần xác định nồng độ chất X trong một mẫu phân tích (có nồng độ Cx).

Pha chế dung dịch chuẩn thêm bằng cách thêm một lượng chính xác (CX) của

chất nghiên cứu vào dung dịch phân tích. Vậy, nồng độ chất X trong dung dịch chuẩn

thêm sẽ là: C0 = Cx + CX

Tạo màu rồi đo độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu trong điều kiện

y hệt nhau.

Gọi A0 và Ax lần lượt là độ hấp thụ của dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu, ta có:

Ax = lCx

A0 = lC0 = l (Cx + C)

b) Phương pháp đường chuẩn thêm

Pha chế một dãy n dung dịch chuẩn thêm bằng cách lấy một lượng mẫu nhất định

rồi thêm những lượng xác định C1, C2, ..., Cn của chất phân tích (lượng thêm tăng

theo cấp số cộng).

Tạo màu và đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn và mẫu trong cùng điều kiện.

Dựng đường chuẩn thêm: A = f (C).

Hình 2.10. Phương pháp đường chuẩn thêm

Nồng độ chất nghiên cứu trong mẫu phân tích có thể được xác định bằng các

phương pháp sau:

- Cách 1: Kéo dài đồ thị về bên trái, cắt trục hoành tại đâu, đó là Cx.

CAA

AC

x

xx

0

- 18 -

- Cách 2: Từ O kẻ 1 đường phụ song song với đồ thị. Từ Ao kẻ 1 đường thẳng

song song trục hoành, cắt đường phụ tại M. Từ M kẻ vuông góc trục hoành đó tại Cx.

- Cách 3: Dùng phần mềm EXCEL xác định được phương trình đường chuẩn

thêm có dạng: A = aC + b. Có thể chứng minh được rằng:

CX = b/a

II.4.5. Định lượng một hỗn hợp cấu tử bằng phương pháp đo quang UV –

Vis

Xét một dung dịch chứa 2 cấu tử (I) và (II), có cực đại hấp thụ tương ứng là 11 và

2.

Gọi A1 và A2 lần lượt là độ hấp thụ của dung dịch đã cho đo ở bước sóng 1 và 2

với cuvet có bề dày l = 1 cm. Dựa vào tính chất cộng tính của độ hấp thụ, ta có:

Các hệ số hấp thụ ; ; và có thể được xác định bằng cách đo độ hấp

thụ của các dung dịch chuẩn của các cấu tử (I) và (II) lần lượt ở các bước sóng 1 và

2. Giải hệ phương trình 2 ấn trên sẽ tính được nồng độ của các cấu tử (I) và (II) trong

dung dịch.

Dựa trên nguyên tắc này, có thể định lượng các hỗn hợp nhiều cấu tử. Hiện nay,

một số máy đo quang hiện đại đã cài đặt các phần mềm cho phép định lượng đồng thời

hỗn hợp 8 cấu tử.

II.5. Đánh giá phương pháp đo quang UV – Vis:

- Độ đúng và độ chính xác:

Độ đúng của phương pháp đo quang UV-Vis phụ thuộc vào 3 yếu tố: thiết bị, hóa

chất, phương pháp phân tích và người phân tích. Trong điều kiện lý tưởng (xem rằng

sử dụng thiết bị và hóa chất tốt nhất, phương pháp đúng ; người phân tích có thành

thạo) thì kết quả phân tích có thể đạt độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối) khoảng

0,5%.

- Giới hạn phát hiện (LOD : limit of detection):

Giới hạn phát hiện (LOD) của một phương pháp phân tích là nồng độ nhỏ nhất

có thể cho tín hiệu ghi nhận được.

Đối với phương pháp trắc quang, theo định luật Lambert - Beer :

- 19 -

Đối với đa số chất hấp thụ, ta có: max 103 l.mol –1 .cm –1 . Nếu dùng thiết bị đo

hoàn thiện nhất (với độ chính xác của thang đo độ hấp thụ là 0,001), ch và cuvet có bề

dày 1 cm, thì:

- Độ chọn lọc: không cao do cùng một thuốc thử tạo phức màu có thể tác dụng

với một số ion khác nhau tạo nên màu sắc gần giống nhau. Để tăng độ chọn lọc của

phép phân tích trong một số trường hợp phải tách chiết để loại bỏ cấu tử cản trở.

II.6. Mộ số ứng dụng của phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis trong

phân tích thực phẩm

Do thiết bị tương đối rẻ tiền, thao tác khá đơn giản, nhanh chóng nên phương

pháp này có ứng dụng rộng rãi trong phân tích nói chung và phân tích thực phẩm nói

riêng.

Nhờ sử dụng các thuốc thử tạo phức màu, phương pháp cho phép định lượng đa

số các ion vô cơ (Fe2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+, Sn2+, …) và một số hợp chất hữu cơ (dung dịch

protein, peptid, acid amin, acid nuleic,…) ở hàm lượng vi lượng.

II.6.1. Định lượng protein:

1) Phương pháp Biuret :

Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa protein và Cu+2 trong môi trường kiềm tạo

phức màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540 nm.

Phương pháp này được sử dụng đối với dung dịch mẫu phân tích có hàm lượng

protein tương đối lớn (khoảng 20 – 2.000 µg/ml)

a) Phương pháp Lowry:

Hầu hết các protein đều chứa Tyrosin và Tryptophan. Hàm lượng của những acid

amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng một loại với nhau có

hàm lượng các acid amin này giống nhau.

Phức đồng (II)-biuret

- 20 -

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu

xanh đặc trưng (λmax = 750 nm). Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng

Tyrosin và Tryptophan (và cũng là hàm lượng protein). Vì thế, có thể đo cường độ

màu của phức này để xác định hàm lượng protein (dùng phương pháp đường chuẩn).

b) Phương pháp Bradfort: Dựa phản ứng tạo màu xanh (λmax = 595 nm) giữa

protein với thuốc thử Coomassie (Coomassie Brilliant Blue G-250: có màu

cam đỏ) trong môi trường axit Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ protein trong

dung dịch. Định lượng protein trong dung dịch bằng phương pháp đường

chuẩn.

II.6.2.Định lượng acid amin bằng thuốc thử ninhydrin

Ninhydrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) là thuốc thử có màu vàng. Phản

ứng ninhydrin là với acid amin được dùng để định tính và định lượng axit amin, imino

axit và amin. Nguyên tắc :

Khi đun nóng ninhydrin với amin bậc 1 trong môi trường kiềm sẽ thu được sản

phẩm có màu tím đậm (λmax = 570 nm).

Phản ứng qua các giai đoạn sau:

- 21 -

Các acid amin, protein và peptid đều chứa nhóm chức amin bậc 1. Tuy nhiên,

phản ứng decarboxyl hóa (phản ứng đầu tiên) chỉ xảy ra khi có mặt -amino acid tự do

nên chỉ có thể dùng phản ứng này để định tính hay định lượng dung dịch acid amin tự

do. Độ hấp thụ của sản phẩm tạo ra phụ thuộc tuyến tính vào số lượng nhóm amin tự

do nên có thể dùng phương pháp trắc quang – so màu (dựng đưởng chuẩn) để định

lượng hàm lượng acid amin tự do.

Dung dịch protein hay peptid có thể được định lượng bằng cách thủy phân trong

môi trường kiềm tạo thành amino acid rồi định lượng như trên (chuẩn bị mẫu trắng là

mẫu chứa dịch protein hay peptid chưa bị thủy phân)

II.6.3. Định lượng một số kim loại nặng

a) Xác định Cu2+ bằng phương pháp trắc quang-so màu với thuốc thử natri

dietyldithiocacbamat (NaDDC; DDC)

Nguyên tắc:

Trong môi trường kiềm yếu (pH = 9 – 9,2), ion Cu2+ tạo với thuốc thừ DDC phức

càng cua (chelate) có màu đỏ nâu khó tan trong nước nhưng tan tốt trong các dung môi

hữu cơ như CHCl3, CCl4. Trong CHCl3 phức có màu đỏ nâu ánh vàng (λmax = 430 nm).

Cường độ màu của phức Cu-DDC sau khi chiết tỷ lệ với nồng độ Cu2+ trong một

khoảng khá rộng.

Do đó, để định lượng Cu2+ bằng thuốc thử DDC, người ta dùng phương pháp

chiết – trắc quang như sau:

Cho Cu2+ tạo phức với DDC trong môi trường NH4OH kiềm có mặt amonicitrat

và complexon III để che các ion cản. Chiết phức Cu-DDC sang CHCl3 rồi đo quang ở

430 nm.

b) Xác định Zn2+ bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizone

(DTZ)

Dithizon (tức Diphenylthiocacbazone) là thuôc thử hữu cơ có khả năng tạo với

nhiều ion kim loại các phức dithizonat khó tan trong nước nhưng tan tốt trong các

dung môi hữu cơ như CHCl3, CCl4. DTZ tan trong CCl3 tạo thành dung dịch có màu

Phức màu tím (λmax = 570 nm)

- 22 -

xanh, không cản trở việc đo quang các phức tạo thành. Do đó, người ta thường dùng

phương pháp chiết trắc quang với DTZ để xác định chúng.

Nguyên tắc:

Trong môi trường pH = 4 – 7, Zn2+ tạo với DTZ một phức có màu đỏ kém tan

trong nước nhưng tan tốt trong CCl4. Ở pH này các ion Cu2+, Cd2+, Pb2+, Co2+, Bi3+,

Hg2+, Ag+ … cũng tạo phức với DTZ. Để tránh ảnh hưởng của các ion này, tiến hành

tạo phức Zn-DTZ ở pH = 5 có dư SCN- và CN-. Loại các chất có khả năng oxy hóa

DTZ (Cl2, Br2, I2, H2O2) bằng cách đun sôi dung dịch. Một số hợp chất vô cơ gây đục

dung dịch CCl4 được loại bằng cách vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4, HNO3, H2O2. Đo độ

hấp thụ của phức Zn-DTZ ở 530 nm.

c) Xác định Pb2+ bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizone

Nguyên tắc:

Tạo phức Pb-Dithizonate (Ký hiệu: Pb-DTZ) trong môi trường pH = 8 – 9 có mặt

CN- để che các ion kim loại khác. Chiết phức Pb-DTZ sang dung môi CCl4 rồi đo độ

hấp thụ ở 520 nm.

Lưu ý:

- Trong môi trường ph = 8 – 9, Sn2 và Bi3+ cũng bị chiết cùng với Pb-DTZ nên

trước đó phải chiết các phức Sn-DTZ và Bi-DTZ trong môi trường acid (Pb-DTZ

không bị chiết, còn lại trong pha nước). Tách Sn2+ và Bi3+ trước như sau:

Thêm hidrazin vào dung dịch mẫu nước, đun nóng để khử Sn4+ về Sn2+ và khử

các chất khác. Để nguội, thêm dung dịch natri tactrat vào và chỉnh pH về 2,5 – 3 bằng

dung dịch axit tactric. Tiến hành chiết nhiều lần, mỗi lần bằng 5 ml dung dịch

Dithizone 0,1% trong CHCl3 cho đến khi pha hữu cơ vẫn giữ nguyên màu xanh của

Dithizone. Cuối cùng, lắc pha nước vài lần với CHCl3 đến khi pha hữu cơ không còn

màu xanh. Bằng cách này có thể loại bỏ cá Hg2+, Ag+, Cu2+.

- Nếu trong mẫu nước chứa lượng đáng kể các chất hữu cơ, cần phải vô cơ hóa

chúng bằng cách cho vào vài ml HNO3 đặc và HClO4 đặc rồi cô mẫu đến khô, sau đó

tẩm ướt bằng HNO3 và hòa tan bằng nước cất.

- Các chất có khả năng oxy hóa được khử trước bằng hidrazin.

d) Xác định Cd bằng phương pháp chiết - trắc quang với thuốc thử Dithizon

Nguyên tắc:

Tạo phức Cd-Dithizonate trong môi trường kiềm mạnh có mặt tartrat rồi chiết

sang dung môi CCl4. Đo độ hấp thụ của dung dịch phức tạo thành (có màu đỏ) ở bước

sóng 515 nm. Loại các ion cản (Ag+, Ni2+, Co2+, Cu2+) bằng cách chiết chúng bằng

Dithizone trong môi trường acid trước khi xác định Cd2+.

- 23 -

Chương 3.

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ NGUYÊN TỬ

III.1. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ

(AAS: Atomic Absorption Spectrophotometry)

III.1.1. Nguyên tắc phương pháp :

Khi chiếu một chùm bức xạ đơn sắc có bước sóng thích hợp qua một đám hơi

nguyên tử thì các nguyên tử sẽ hấp thụ một phần năng lượng của chùm bức xạ này và

chuyển từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. Đó là hiện tượng hấp thụ

nguyên tử.

Sự hấp thụ nguyên tử chỉ xảy ra nếu như năng lượng của các photon trong chùm

bức xạ sử dụng đúng bằng hiệu các mức năng lượng kích thích và năng lượng cơ bản

của bước chuyển dời trong nguyên tử :

E* - E0 = h = hc/λ

Do đó, mỗi nguyên tố chỉ có thể hấp thụ một số bức xạ có tần số xác định đặc

trưng cho cấu trúc electron của nguyên tố đó. Dựa vào tần số của bức xạ bị hấp thụ, có

thể định tính các nguyên tố có trong mẫu phân tích.

Ngoài ra, do hiện tượng hấp thụ, cường độ của ánh sáng sau khi qua dung dịch sẽ

bị giảm đi. Độ hấp thụ phụ thuộc vào số lượng các nguyên tử gây ra hiện tượng hấp

thụ, tức là phụ thuộc vào nồng độ nguyên tử và đoạn đường ánh sáng đã đi qua đám

hơi nguyên tử. Thực nghiệm cho thấy giữa độ hấp thụ A và nồng độ nguyên tố hấp thụ

trong mẫu phân tích có mối mối quan hệ sau:

A = - lg (I/ I0) = k.a.Cb ( * )

trong đó :

A : độ hấp thụ

I0, I : cường độ tia tới và tia ló

k : hệ số hấp thụ, đặc trưng cho bản chất của nguyên tố hấp thụ

a : hằng số, phụ thuộc vào cấu tạo thiết bị và điều kiện phân tích

C : nồng độ các nguyên tử hấp thụ có trong đám hơi nguyên tử

b : hệ số phụ thuộc vào nồng độ các nguyên tử hấp thụ có trong đám hơi (nếu C

đủ nhỏ thì b = 1 ; nếu C lớn thì 0 < b < 1)

Hệ thức (*) chính là cơ sở của phép định lượng bằng phương pháp AAS.

III.1.2. Sơ đồ cấu tạo và nguyên lý hoạt động của thiết bị AAS

E*

E0

h = E = E* - E0

- 24 -

Sơ đồ cấu tạo thiết bị AAS được trình bày ở hình 3.1, gồm những bộ phận chính

sau đây:

Hình 3.1. Sơ đồ cấu tạo của thiết bị AAS

- Nguồn sáng (Light Sorce)

- Bộ phận điều biến (Modulator ; Chopper)

- Bộ phận nguyên tử hóa (Atomization ; Atomizer)

- Bộ đơn sắc (Monochromator)

- Detector

- Bộ phận xử lý và hiển thị tín hiệu (Signal Processor/Readout)

Nguyên lý hoạt động:

Chùm bức xạ đơn sắc phát ra từ nguồn phát xạ có cường độ mạnh, đặc trưng cho

nguyên tố phân tích sẽ được điều biến và chiếu qua đám hơi nguyên tử được tạo ra

bằng cách cung cấp nhiệt cho mẫu phân tích. Khi đó, chùm bức xạ này sẽ bị hấp thụ

một phần bởi các nguyên tử của nguyên tố cần định lượng. Bức xạ sau khi bị hấp thụ

sẽ được phân tách bởi một bộ phận đơn sắc, rồi qua bộ phận ghi nhận, khuếch đại, xử

lý và hiển thị tín hiệu dưới dạng các vạch hấp thụ. Dựa vào vị trí vạch hấp thụ đặc

trưng và cường độ tín hiệu hấp thụ có thể định tính và định lượng các nguyên tố có

trong mẫu phân tích.

Hình 3.2. Sự hấp thụ và phổ hấp thụ nguyên tử

III.1.3. Các thành phần chính bộ phận chính trong thiết bị AAS

- 25 -

II.1.3.1. Nguồn sáng: cho phép tạo ra các bức xạ nhạy, đặc trưng đối với nguyên

tố cần phân tích. Chùm tia này phải có cường độ ổn định, không bị nhiễu lọan bởi các

yếu tố vật lý và có thể điều chỉnh được.

Hiện nay các thiết bị AAS có thể dùng 3 loại nguồn sáng như sau :

a) Đèn cathod lõm (HCL: hollow cathode lamp): là loại nguồn phát bức xạ đơn

sắc được dùng sớm và phổ biến nhất trong các thiết bị AAS. Đây là 1 bóng đèn bằng

thủy tinh hay thạch anh, bên trong chứa khí trơ có độ tinh khiết cao (Ne, Ar, N2) dưới

áp suất rất thấp (5 – 15 mmHg). Trong đèn có một cathod lõm làm bằng nguyên tố cần

đo có độ tinh khiết rất cao (99,99%) và một anod là một sợi dây kim loại trơ và bền

(Pt, W). Cả hai điện cực được gắn chặt trên bệ đỡ và catốt phải nằm đúng trục xuyên

tâm của đèn.

Khi đặt 2 cực của đèn dưới một hiệu thế cao, các nguyên tử khí trơ sẽ bị ion hóa,

sinh ra các cation bắn phá cathod đang nóng đỏ, làm cho một số nguyên tử trên bề mặt

cathod bị hóa hơi, chuyển lên trạng thái kích thích. Khi trở về trạng thái cơ bản, các

nguyên tử này sẽ phát ra các bức xạ đặc trưng cho nguyên tố làm cathod. Một bộ phận

đơn sắc sẽ cho phép chọn lọc trong chùm bức xạ phát ra này này những tia có tần số

đặc trưng nhất.

Hình 3.3. Cấu tạo đèn HCL

Các đèn HCL có cấu tạo như đã mô tả ở trên là các đèn đơn, mỗi đèn chỉ phục vụ

cho phân tích một nguyên tố. Hiện nay các hãng đã chế tạo được các đèn kép đôi (Ca

+ Mg; Cu + Mn; K + Na …) , kép ba (Cu + Pb + Zn) hay kép sáu nguyên tố (Cu + Mn

+ Cr + Fe + Co + Ni), trong đó cathod của đèn là hợp kim của các nguyên tố đó và

thành phần phù hợp sao cho cường độ phát xạ của các nguyên tố là gần tương đương

như nhau, không ảnh hưởng lẫn nhau. Các đèn kép thường có độ nhạy kém hơn các

đèn đơn tương ứng và chế tạo cũng khó hơn đèn đơn nên đến nay cũng chỉ có một số

loại mà thôi.

b) Đèn phóng điện không điện cực (EDL: Electrodeless Discharge Lamp)

Đèn EDL là một ống thạch anh chịu nhiệt, dài 15 ÷ 18cm, đường kính 5 ÷ 6cm,

bên trong chứa khí trơ (Ne, Ar, N2 có áp suất vài mmHg) và lượng nhỏ nguyên tố cần

phân tích (kim loại hay muối dễ bay hơi của nguyến tố đó) với nồng độ nhất định phù

- 26 -

hợp để tạo ra chùm tia phát xạ chỉ bao gồm một số vạch phổ nhạy, đặc trưng của

nguyên tố phân tích. Đèn nối với một cuộn cảm ứng bằng đồng nối với nguồn điện cao

tần. Khi đèn làm việc, dưới tác dụng của năng lượng cao tần cảm ứng, đèn được nung

nóng đỏ, kim loại hay muối kim loại trong đèn được hóa hơi và bị nguyên tử hóa, các

nguyên tử tự do được sinh ra đó sẽ bị kích thích và phát ra phổ phát xạ của nó. Đó

chính là vạch phát xạ nhạy, đặc trưng của kim loại chứa trong đèn.

Hình 3.4. Cấu tạo đèn EDL So với đèn HCL, đèn EDL cho độ nhạy cao hơn, ổn định hơn, bền hơn và vùng

tuyến tính của phép đo cho một nguyên tố cũng rộng hơn so với đèn HCL. Tuy nhiên

số đèn EDL được sản xuất ít hơn (hơn 30 đèn) và giá thành lại cao hơn.

c) Đèn phổ liên tục có biến điệu (Continous Sources): được phát triển gần đây và

được sử dụng nhiều hiện nay trong các thiết bị AAS. Đây là các đèn phát bức xạ liên

tục nhưng được biến điêu và lọc giao thoa nhờ một hệ thống quang học để tạo ra chùm

bức xạ đơn sắc.

Loại đèn này có ưu điểm là dễ chế tạo, rẻ tiền và có độ bền tương đối cao, chỉ cần

một đèn có thể xác định đồng thời hay liên tiếp nhiều nguyên tố trong cùng một mẫu

phân tích mà không phải thay đèn. Nhược điểm là có độ đơn sắc và độ nhạy kém hơn

các đèn HCL hay EDL.

III.1.3.2. Bộ phận điều biến (modulator = chopper): cho phép loại trừ các bức xạ

nhiễu gây ra bởi sự phát xạ của đám hơi nguyên tử trong ngọn lửa. Đây là một gương

xoay có 2 phần hở và rắn cho phép ngắt chùm sáng khỏi đi đến detector khi nó đập vào

mặt rắn của gương.

Khi chùm sáng do đèn phát ra bị ngắt thì tín hiệu đến detector chỉ do chùm tia

sinh ra do hiện tượng phát xạ của các nguyên tử trong mẫu (Pe):

Tín hiệu 1 = Pe

Khi chùm sáng do đèn phát ra không bị ngắt thì tín hiệu đến detector sẽ gồm tổng

tín hiệu của chùm tia sau khi bị hấp thụ được truyền qua mẫu (P) và chùm tia phát ra

do hiên tượng phát xạ của các nguyên tử trong mẫu (Pe):

Tín hiệu 2 = P + Pe

- 27 -

Do đó, hiệu 2 tín hiệu này sẽ cho giá trị cường độ bức xạ truyền qua mẫu sau khi

bị hấp thụ:

Tín hiệu điều chỉnh = Tín hiệu 2 - Tín hiệu 1 = (P + Pe) – Pe = P

Bộ điều biến (Chopper)

Hình 3.5. Bộ điều biến và nguyên lý hoạt động

II.1.3.3. Bộ phận nguyên tử hóa (atomization device): cho phép tạo ra một đám

hơi đồng nhất chứa các nguyên tử tự do ở trạng thái cơ bản (hạn chế tối đa hiện tượng

ion hóa) từ dung dịch cần đo.

Hiện nay có một số kỹ thuật nguyên tử hóa sau:

a) Kỹ thuật nguyên tử hóa bằng ngọn lửa (FAAS: Flame Atomic Absorption

Spectrophotometry):

Hệ thống nguyên tử hóa bằng ngọn lửa bao gồm:

* Buồng phun sương (Nebulizer): trong đó dung dịch đo được phân tán thành sol

khí chứa các giọt chất lỏng nhỏ li ti có kích thước khá đồng nhất.

Hình 3.6. Buồng phun sương

Dung dịch mẫu được hút vào

buồng phun nhờ một dòng khí áp

suất cao gồm bởi khí đốt. Khi ra khỏi

đầu ống hút, chất lỏng bị đập vào

một bầu thủy tinh (glass impact

bead) tạo ra aerosol. Các hạt lớn sẽ bị

loại bỏ và thải ra nhờ một hệ thống

cản đặc biệt.

Buồng phối trộn và đầu đốt: Sol khí được hình thành sẽ được phun trực tiếp

vào ngọn lửa (đối với loại đèn đốt toàn diện) hay được dẫn vào một buồng để phối trộn

với khí đốt và chất oxy hóa (đối với loại đèn đốt trộn trước) rồi đốt cháy. Khi đó, các

hạt dung môi bị bay hơi hay bốc cháy. Dưới tác dụng nhiệt của ngọn lứa, các phân tử

muối tạo thành sẽ bị phân ly thành các nguyên tử tự do. Đèn đốt là một khe hẹp, có

chiều dài cỡ 10 cm, được đặt dọc theo đường đi của chùm sáng tới. Có thể thay đổi

cường độ hấp thụ của mẫu bằng cách điều chỉnh chiều cao của đèn.

- 28 -

Hình 3.7. Buồng phun sương, buồng phối trộn và đầu đốt trong đèn đốt trộn trước

Để ngăn cản hiện tượng tái kết hợp thành các phân tử (recombination) và hiện

tượng ion hóa (ionization), sự kích thích nguyên tử bởi nhiệt của ngọn lửa tạo nên sự

phát xạ, cần chọn nhiệt độ ngọn lửa thích hợp cho việc định lượng nguyên tố đã cho

bằng cách thay đổi bản chất khí đốt và chất oxy hóa cũng như điều chỉnh lưu lượng và

tỷ lệ của chúng. Để đạt được nhiệt độ ngọn lửa cỡ 23000C, người ta thường dùng hỗn

hợp không khí – acetylen với lưu lượng acetylen là 1,6 m/s. Muốn có nhiệt độ ngọn

lửa cao hơn (khoảng 3000°C) thì dùng hỗn hợp C2H2 + O2 hay C2H2 + N2O (Bảng 3.1)

Hình 3.8. Các giai đoạn nguyên tử hóa bằng ngọn lửa

Hệ thống nguyên tử hóa ngọn lửa có ưu điểm là độ lặp lại tốt, dễ tối ưu hóa điều

kiện nguyên tử hóa mẫu. Nhược điểm là độ nhạy thấp do hiệu suất nguyên tử hóa kém.

Nguyên nhân là do đa số các hạt aeerosol tạo ra khá lớn để có thể đốt cháy bằng khí

đốt (95% mẫu không thể đi đến ngọn lửa) và sự pha loãng mẫu đáng kể bởi khí đốt.

Ngoài kỹ thuật nguyên tử hoá bằng ngọn lửa như trên, có thể dùng các kỹ thụật

nguyên tử hóa không ngọn lửa.

- 29 -

b) Kỹ thuật nguyên tử hóa không ngọn lửa: ra đời sau kỹ thuật nguyên tử hóa

bằng ngọn lửa, nhưng phát triển rất nhanh và hiện nay đang được ứng dụng rất phổ

biến. Ưu điểm của kỹ thuật này là cho phép định lượng một cách chọn lọc, có độ nhạy

rất cao (cỡ ppb), định lượng được các nguyên tố cấu tạo nên các hợp chất rất bền nhiệt.

mà kỹ thuật FAAS không cho phép (Bảng 3.2). Vì vậy, kỹ thuật này thường dùng để

phân tích các vết kim loại, đặc biệt là khi xác định các loại mẫu y học, sinh học, dược

phẩm, thực phẩm…

*Nguyên tắc và các giai đoạn của quá trình nguyên tử hóa mẫu không ngọn lửa

Nguyên tắc: sử dụng kỹ thuật nguyên tử hóa nhiệt điện (ETA:

electrothermal atomization), trong đó quá trình nung nóng, hóa hơi và nguyên

tử hóa mẫu phân tích xảy ra rất nhanh (60 – 80 giây) trong một ống graphit nhỏ (GF:

Graphite furnace) hay trong một thuyền tantan (Ta) nhỏ. Nguồn năng lượng thường

dùng là dòng điện có cường độ dòng rất cao (50 – 600 A) và thế thấp (< 12V) hay

năng lượng của dòng cao tần cảm ứng (ICP). Dưới tác dụng của các nguồn năng lượng

này, cuvét chứa mẫu sẽ được nung nóng đỏ tức khắc, hóa hơi và nguyên tử hóa mẫu để

tạo ra các nguyên tử tự do ở trạng thái hơi có khả năng hấp thụ bức xạ đơn sắc tạo ra

phổ hấp thụ nguyên tử của nó.

Như vậy, hệ thống nguyên tử hóa mẫu theo kỹ thuật không ngọn lửa gồm có:

- Buồng nguyên tử hóa: là cuvét chứa mẫu phân tích.

- Nguồn năng lượng để nung nóng đỏ lò graphit đến nhiệt độ nguyên tử hóa

mẫu.

- Bộ điều khiển để cài đặt chương trình và kiểm soát quá trình nguyên tử hóa

mẫu.

Hình 3.9. Lò graphite

Quá trình nguyên tử hóa mẫu: xảy ra theo 3 giai đoạn kế tiếp nhau: sấy khô

mẫu, tro hóa luyện mẫu, nguyên tử hóa mẫu.

* Sấy khô mẫu: phải đảm bảo dung môi hòa tan mẫu bay hơi nhẹ nhàng và hoàn

toàn, không làm bắn mẫu, mất mẫu. Nhiệt độ và thời gian sấy khô của mỗi mẫu phụ

thuộc vào bản chất của các chất ở trong mẫu và dung môi hòa tan nó. Thực nghiệm

- 30 -

cho thấy rằng không nên sấy khô quá nhanh ở nhiệt độ quá cao. Nói chung, nhiệt độ

sấy khô phù hợp với đa số các mẫu vô cơ trong dung môi nước vào khoảng từ 100 -

150oC trong thời gian từ 25 - 40 giây với lượng mẫu bơm vào cuvét nhỏ hơn 100 μl.

Các mẫu hữu cơ trong dung môi hữu cơ phải sấy ở nhiệt độ thấp hơn và tốc độ tăng

nhiệt độ cũng phải chậm hơn.

* Tro hóa luyện mẫu: là giai đoạn tiếp theo để đốt cháy các hợp chất hữu cơ và

mùn có trong mẫu sau khi đã sấy khô, đồng thời cũng để nung luyện mẫu ở một nhiệt

độ thuận lợi cho giai đoạn nguyên tử hóa tiếp theo đạt hiệu suất cao và ổn định. Giai

đoạn này ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả phân tích nếu chọn điều kiện tro hóa không

phù hợp.

Thực nghiệm cho thấy mỗi nguyên tố đều có một nhiệt độ tro hóa luyện mẫu tối

ưu, đó là nhiệt độ mà sự tro hóa luyện mẫu tại nhiệt độ đó hoặc nhỏ hơn nó thì cường

độ vạch phổ hấp thụ là không đổi, còn nếu tro hóa ở nhiệt độ lớn hơn thì cường độ

vạch phổ bị giảm và không ổn định (điều này có thể lý giải là do mẫu bị phân hủy

mất). Nhiệt độ tro hóa tối ưu của mỗi nguyên tố phụ thuộc vào bản chất, dạng hợp chất

mà nguyên tố đó tồn tại, kể cả matrix mẫu (nền mẫu). Nói chung, các nguyên tố bền

nhiệt và tồn tại ở dạng hợp chất bền nhiệt thường phải tro hóa luyện mẫu ở nhiệt độ

tương đối cao. Ví dụ: Si có nhiệt độ tro hóa tối ưu là 1100oC; Ni: 1000oC, Pb: 600oC…

Ngoài ra, tốc độ tăng nhiệt trong quá trình tro hóa luyện mẫu cũng rất quan

trọng vì nếu tốc độ tăng nhiệt quá lớn sẽ làm bắn mẫu. Thông thường, người ta dành

1/3 tổng thời gian tro hóa luyện mẫu được dùng để gia nhiệt từ nhiệt độ sấy mẫu đến

nhiệt độ tro hóa (tốc độ khoảng 60oC ÷ 100oC/giây); còn 2/3 thời gian còn lại là giữ

nhiệt độ không đổi đã chọn để luyện mẫu. Đối với những mẫu của hợp chất hữu cơ

hay trong dung môi hữu cơ thì giai đoạn này càng phải cẩn thận để tránh sự bay hơi

trước của nguyên tố phân tích ở dạng hợp chất cơ kim. Nói chung, với mỗi loại mẫu,

trong mỗi loại dung môi đều phải khảo sát để phát hiện nhiệt độ tro hóa, tốc độ tăng

nhiệt độ cho phù hợp.

* Nguyên tử hóa mẫu: là giai đoạn quyết định cường độ vạch phổ và bị ảnh

hưởng bởi hai giai đoạn trên. Giai đoạn này được thực hiện trong thời gian rất ngắn

(thường từ 3- 6 giây, đôi khi 8 - 10 giây) nhưng tốc độ gia nhiệt độ rất lớn (1800oC ÷

2500oC/giây hay tốc độ tối đa mà máy có thể cho phép) để đạt ngay tức khắc nhiệt độ

nguyên tử hóa.

Trong các tài liệu kèm theo thiết bị AAS thường giới thiệu để người sử dụng

tham khảo về nhiệt độ sấy mẫu, nhiệt độ tro hóa luyện mẫu và nhiệt độ nguyên tử hóa

mẫu. Tuy nhiên, khi phân tích các mẫu cụ thể nên dựa vào các giá trị đó để khảo sát

hoặc kiểm tra lại.

- 31 -

Kỹ thuật hóa hơi lạnh (CV-AAS: Cold Vapour AAS)

Một số nguyên tố có thể được nguyên tử hóa bằng cách sử dụng phản ứng hóa

học để tạo thành hợp chất dễ bay hơi ở nhiệt độ thường.

Ví dụ: As, Se, Sb, Bi, Ge, Sn, Te, Pb tạo thành hydrur dễ bay hơi khi phản ứng

với NaBH4 trong môi trường acid. Sau đó, hơi hydrur được một dòng khí trơ dẫn đến

ngọn lửa hay một cuvet thạch anh được đốt nóng đặt trên đường đi của chùm sáng của

hệ thống đo mẫu (kỹ thuật Hydride Gas AAS = HG-AAS)

Hình 3.10. Sơ đồ bộ hydrur hóa kim loại

Thủy ngân có thể được xác định bằng phương pháp hóa hơi lạnh (Cold Vapour

AAS = CV-AAS), trong đó nó được khử về Hg kim loại (dạng hơi) SnCl2 sau đó hơi

Hg đượcmột dòng khí trơ dẫn đến một cuvet đựng mẫu không đốt nóng đặt trên đường

đi của chùm sáng của hệ thống đo mẫu.

Hình 3.11. Sơ đồ bộ hóa hơi thủy ngân

- 32 -

Bảng 3.2.

Giới hạn phát hiện của một số nguyên tố bằng các kỹ thuật F-AAS và ET-AAS

- 33 -

III.1.4. Tối ưu hóa điều kiện định lượng bằng phương pháp AAS

Để chọn điều kiện tối ưu cho việc định lượng một nguyên tố trong một đối

tượng mẫu phân tích nào đó, cần qua các bước khảo sát sau:

a) Chọn phương pháp nguyên tử hóa mẫu: tùy thuộc vào nồng độ nguyên tố cần

phân tích có trong mẫu.

- Kỹ thuật FAAS cho phép xác định nhanh hơn và có độ chính xác cao hơn nếu

hàm lượng nguyên tố cần xác định trong mẫu lớn hơn nhiều so với giới hạn

phát hiện của kỹ thuật này.

- Kỹ thuật ETA-AAS có độ nhạy cao hơn nên thường áp dụng cho các nguyên

tố khó bay hơi, khi phân tích vết nguyên tố hay với lượng mẫu nhỏ

b) Chọn bước sóng phân tích và độ rộng vạch phổ: Độ nhạy của vạch phổ AAS

của một nguyên tố phụ thuộc vào nồng độ của nguyên tố đó trong mẫu và bước

sóng phân tích. Mỗi nguyên tố có một nồng độ đặc trưng (characteristic

concentration) ứng với một bước sóng xác định, đó là nồng độ chất phân tích

cho độ hấp thụ bằng 0,00436 (ứng với %T = 99%).

Ví dụ : Bước sóng và nồng độ đặc trưng của Cu

Việc chọn bước sóng phân tích được chọn lựa tùy thuộc vào nồng độ nguyên tố

phân tích trong mẫu và sao cho đạt độ nhạy cao nhất, vạch phổ ít bị cản trở bởi các yếu

tố vật lý (phát xạ nền của nguồn sáng) và hóa học (sự có mặt của các nguyên tố khác).

c) Chọn phương pháp xử lý mẫu phân tích: Kỹ thuật FAAS và ETA-AAS điều đòi

hỏi mẫu ở dạng lỏng hay dung dịch. Do đó, mẫu rắn cần được hòa tan trong

dung môi thích hợp hay vô cơ hóa bằng HNO3, H2SO4, hay HClO4 (dùng bếp

điện, lò vi sóng). Mẫu lỏng có thể phân tích trực tiếp hoặc được pha loãng bằng

dung môi hoặc được chiết - làm giàu chất cần phân tích nếu nền mẫu chứa các

thành phần cản trở việc phân tích. Ví dụ: Chiết và làm giàu Cd2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, Pb2+, Ni2+, Zn2+ bằng dung dịch

ammonium pyrrolidine dithiocarbamate trong methyl isobutyl ketone (MIBK)

- 34 -

d) Tối thiểu hóa các yếu tố ảnh hưởng quang phổ và hóa học

* Tối thiểu hóa ảnh hưởng quang phổ:

- Nếu vạch hấp thụ của nguyên tố cản chồng lấp vạch hấp thụ của nguyên tố cần

phân tích chồng thì chọn bước sóng phân tích sao cho không bị ảnh hưởng.

- Sự hấp thụ do các phân tử có trong ngọn lửa (do sự nguyên tử hóa chưa hoàn

toàn) hay sự tán xạ bởi các hạt kích thước lớn (tập hợp nguyên tử) có thể xảy ra. Đặc

biệt, sự hấp thụ và tán xạ bởi các phân tử hydoxid hay oxid của các chất có trong nền

mẫu xảy ra mạnh ở < 300 nm. Trong những trường hợp này, độ truyền suốt kém và

làm tăng biểu kiến sự hấp thụ của mẫu. Nếu thành phần nền của mẫu đã biết thì có thể

loại trừ ảnh hưởng này bằng cách phân tích mẫu trắng, chuẩn bị các mẫu chuẩn có

thành phần nền giống mẫu phân tích. Nếu thành phần nền không biết rõ thì có thể hiệu

chỉnh sự hấp thụ nền (sự hấp thụ gây ra do nền mẫu) bằng cách tăng nhiệt độ ngọn lửa

để phân ly các oxyt, hydroxid (ví dụ: tăng lưu lượng nhiên liệu – chất oxy hóa, điều

chỉnh tỷ số nhiên liệu: chất oxy hóa, thay đổi tổ hợp nhiên liệu - chất oxy hóa…). Biện

pháp khác là hiệu chỉnh nền bằng đèn phát xạ liên tục D2.

* Tối thiểu hóa ảnh hưởng hóa học :

Việc định lượng một số nguyên tố rất phức tạp do ảnh hượng của các yếu tố hóa

học trong quá trình nguyên tử hóa.

- Ảnh hưởng của dung môi:

Nếu dùng dung môi là nước thì quá trình nguyên tử hóa xảy ra chậm do tốn nhiều

năng lượng để hóa hơi nước, do đó phép đo kém nhạy. Để nâng cao độ nhạy của phép

đo, thường dùng dung môi MIBK (methyl isobutyl keton). Khi đó, quá trình chuyển

hóa xảy ra nhanh hơn do dung môi này dễ hóa hơi và phản ứng đốt cháy chất hữu cơ

sinh ra một lượng nhiệt đáng kể, làm tăng độ nhạy phép đo lên từ 2 - 6 lần so với dùng

dung môi nước.

- Ảnh hưởng của sự ion hóa:

Ở nhiệt độ cao, những nguyên tố có năng lượng ion hóa thấp (ví dụ: các kim loại

kiềm hay kiềm thổ) chủ yếu tồn tại ở trạng thái ion. Vì vậy, khi định lượng những

nguyên tố này, cần thêm vào mẫu đo một lượng dư muối của các nguyên tố dễ bị ion

hóa hơn (thường dùng muối K+, Cs+).

- Ảnh hưởng của dạng anion liên kết:

Một số anion (như PO4 3-, SO4

2-,…) có thể tạo với ion kim loại cần phân tích các

hợp chất bền nhiệt nên khó bị ngyên tử hóa. Trong trường hợp này, cần thêm vào dung

dịch phân tích một lượng dư chất tạo phức bền dễ bay hơi với ion kim loại cần phân

tích (gọi là tác nhân bảo vệ: protecting agent) hay thêm các muối của các nguyên tố

khác có thể kết hợp với các anion trên những hợp chất bền nhiệt (gọi là tác nhân phóng

thích: releasing agent).

- 35 -

Những muối được thêm vào với một lượng dư nhằm ổn định sự nguyên tử hóa

các nguyên tố như trên được gọi chung là chất đệm hóa - quang phổ (spectrochemical

buffer).

Ví dụ:

- Khi định lượng Pb có thể thêm EDTA vào dung dịch đo để tạo phức bền PbY2 –

nhằm tránh tạo thành các muối bền nhiệt Pb(NO3)2, Pb3(PO4)2, PbCO3,...

- Khi định lượng Calci thêm một lượng thừa LaCl3 vào dung dịch Ca2+ để tạo

thành LaPO4 nhằm tránh tạo hợp chất bền nhiệt Ca3(PO4)2.

e) Chọn phương pháp định lượng

Có thể dùng 1 trong 3 cách sau:

Phương pháp đường chuẩn :

Trong thực tế, khi định lượng bằng phương pháp AAS, đường chuẩn A = f (C)

chỉ tuyến tính trong một khoảng nồng độ khá giới hạn. Trong một số trường hợp, cần

phải xây dựng đường chuẩn không tuyến tính có dạng bậc 2 hay bậc 3 (có ít nhất 8

điểm chuẩn).

a) tuyến tính b) tuyến tính một phần c) không tuyến tính

Hình 3.12. Một số dạng đường chuẩn AAS

Khi sử dụng phương pháp đường chuẩn này cần lưu ý pha chế mẫu chuẩn có

tính chất nguyên tử hóa giống như mẫu phân tích. Nếu không, cần điều chỉnh thành

phần nền mẫu chuẩn cho tương ứng bằng các chất đệm quang phổ.

Phương pháp kẹp chuẩn: áp dụng khi nồng độ chất phân tích trong mẫu đo

nằm ngoài vùng tuyến tính của đường chuẩn

Trong phương pháp này, chỉ dùng 2 mẫu

chuẩn có nồng độ nguyên tố cần phân tích là C1

và C2 rất gần với nồng độ có trong mẫu phân tích

(Cx). Khi đó, có thể xem là xảy ra sự tuyến tính A

– C trong khoảng nồng độ (C1; C2) có thể tính

nồng độ chất phân tích trong mẫu theo công thức:

A

C

C1 Cx C2

- 36 -

Phương pháp thêm :

Cả 2 kỹ thuật đường chuẩn và kẹp chuẩn đều đòi hỏi thành phần nền của mẫu

chuẩn và mẫu phân tích phải tương tự nhau. Đối với mẫu chưa biết rõ thành phần nền

hay có những chất cản trở phức tạp đến việc phân tích thì nên dùng phương pháp

thêm. Trong phương pháp này sử dụng ngay chính dung dịch mẫu phân tích làm nền

và thêm vào đó những lượng khác nhau của chất phân tích (tiến hành tương tự trong

phương pháp trắc quang – so màu).

Tuy nhiên, kỹ thuật này cũng chỉ áp dụng được khi đường chuẩn thêm là tuyến

tính.

III.1.6. Đánh giá phương pháp AAS

Phạm vi áp dụng: Phương pháp AAS thích hợp cho việc định lượng các cấu tử

vết và siêu vết (nếu dùng kỹ thuật ETA). Bằng cách pha loãng mẫu, phương pháp

AAS cũng có thể áp dụng để phân tích cấu tử vi lượng.

Độ đúng: Khi tối thiểu hóa các ảnh hưởng quang học và hóa học, độ đúng có

thể đạt được 0,5 – 5%. Sai số hệ thống khi dùng kỹ thuật ETA-AAS thường lớn hơn

khi dùng kỹ thuật FAAS.

Độ chính xác: Với độ hấp thụ lớn hơn 0,1 – 0,2 thì độ lệch chuẩn tương đối của

phương pháp AAS cỡ 0,3 – 1% đối với kỹ thuật FAAS và là 1 – 5% với kỹ thuật ETA-

AAS.

Độ nhạy: Độ nhạy của kỹ thuật FAAS bị ảnh hưởng nhiều bởi thành phần và vị

trí ngọn lửa tại đó quan sát sự hấp thụ. Thông thường, độ nhạy được tôi ưu hóa bằng

cách hút mẫu chuẩn và điều chỉnh các điều kiện đo (tỷ số nhiên liệu-chất oxy hóa, tốc

độ phun sương, chiều cao của đèn đốt) sao cho đạt độ hấp thụ lớn nhất. Với kỹ thuật

ETA-AAS, độ nhạy chịu ảnh hưởng bởi các giai đoạn sấy khô mẫu và tro hóa mẫu

trước khi nguyên tử hóa. Độ nhạy cũng phụ thuộc vào nền mẫu: độ nhạycó thể giảm

do các ảnh hưởng hóa học. Có thể tăng độ nhạy bằng cách thêm vào dung dịch một

alcol, ester hay ceton hay dung môi hữu cơ nào đó.

Độ chọn lọc: Do bề rộng vạch phổ hấp thụ hẹp nên phượng pháp AAS có độ

chọn lọc rất tốt. Vì vậy, phương pháp AAS có thể áp dụng để phân tích trên 60 nguyên

tố khác nhau với nồng độ dưới mức ppm.

Thời gian, chi phí và yêu cầu thiết bị: Kỹ thuật FAAS cho phép phân tích nhanh

(có thể 250 – 350 lần đo/giờ khi dùng thiết bị tự động), còn kỹ thuật ETA-AAS chỉ đạt

20 – 30 lần đo/giờ).

III.1.7. Ứng dụng của phương pháp AAS trong phân tích thực phẩm

- 37 -

Phương pháp AAS được dùng phổ biến để phân tích vết kim loại trong nhiều

loại thực phẩm. Sau đây giới thiệu nguyên tắc phân tích một số kim loại nặng trong

thực phẩm bằng phương pháp AAS.

a) Xác định As:

* Dùng kỹ thuật HG-AAS

Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá trong lò phá mẫu vi sóng đã cài đặt chương

trình theo từng đối tượng. Sau đó, As (V) được khử về As (III) và phản ứng với

NaBH4 để tạo thành hợp chất hydrua arsen (AsH3):

3BH4- (dd) + 3H+ (dd) + 4H3AsO3 (dd) 3H3BO3 (dd) + 4AsH3 (k) + 3H2O (l)

Sau đó, AsH3 được dẫn tới một cuvet chữ T bằng thạch anh để nguyên tử hóa và

đo phổ hấp thụ của As.

Điều kiện đo máy

Vạch phổ phân tích As 193,70 nm

Cường độ dòng đèn HCL của nguyên tố Arsen 10 mA (80% I Max)

Khe đo 1 nm

Chiều cao đầu đốt Chế độ auto (5 - 6 mm)

Khí ngọn lửa Không khí nén & Acetylen & Ar

Tôc độ dẫn mẫu 5 – 6 mL/phút

Tôc độ dẫn thuốc thử (NaBH4, HCl 5 M) 2 – 3 mL/phút

Thời gian đo 5 giây

* Dùng kỹ thuật GFAAS

Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá trong lò phá mẫu vi sóng có cài đặt chương trình

theo từng đối tượng. Xác định hàm lượng arsen trong dung dịch tạo thành bằng đo phổ

hấp thụ nguyên tử lò graphit.


Vạch phổ phân tích arsen 193,70 nm

Cường độ dòng của đèn HCL của As 10 mA (80%IMax)

Khe đo 1,0 nm

Chiều cao đầu đốt Chế độ auto

Khí môi trường Argon

Loại cuvét High density graphite

Môi trường dung dịch HNO3 2 %

Lượng mẫu nạp (ml) 20

Chương trình nhiệt độ cho lò Graphite T (oC) Time Heat mode Flow rate

- 38 -

1 150 20 Ramp 0,1

2 250 10 Ramp 0,1

3 600 10 Ramp 1,0

4 600 10 Step 1,0

5 600 3 Step 0,0

6 2200 2 Step 0,0

7 2500 2 Step 1,0

c) Xác định hàm lượng Se

* Dùng kỹ thuật HG-AAS

Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hóa trong lò vi sóng theo từng đối tượng. Các ion

Se(IV) và Se(VI) phản ứng với NaBH4 trong môi trường axít sinh ra hợp chất Selen

hydrua (SeH4 và SeH6), các hợp chất này được dẫn vào cuvet thạch anh để nguyên tử

hoá thành Se và đo phổ hấp thụ của Se.


Cường độ dòng của đèn HCL của Se 23 mA (70% IMax)

Vạch phổ đo Se-196,0 nm

Khe đo 1,0 nm

Chiều cao đèn đốt (Burner Head) 16 mm

Khí ngọn lửa: Acetylen - Không khí nén 2 L/phut

Tốc độ dẫn mẫu 5~6 ml/ph.

Tốc độ dẫn thuốc thử 2~3ml/ph

Tốc độ dẫn HCl (5 M) 2~3ml/ph


* Dùngkỹ thuật GFAAS

Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá trong lò phá mẫu vi sóng có đặt chương trình

theo từng đối tượng. Xác định hàm lượng selen trong dung dịch tạo thành bằng đo phổ

hấp thụ nguyên tử lò graphit


Vạch phổ đo selen 196,0 nm

Cường độ dòng của đèn HCL của Se 20 mA (80% IMax)

Khe đo 1,0 nm

Chiều cao đo Chế độ auto

- 39 -

Khí môi trường Argon

Loại Cuvét High density Graphite

Môi trường dung dịch HNO3 2 %

Lượng mẫu nạp (ml) 20

Chương trình nhiệt độ cho lò Graphite T (oC) Time Heat mode Flow rate

1 150 20 Ramp 0,1

2 250 10 Ramp 0,1

3 600 10 Ramp 1,0

4 600 10 Step 1,0

5 600 3 Step 0,0

6 2200 2 Step 0,0

7 2400 2 Step 1,0

d) Xác định hàm lượng Hg

* Dùng kỹ thuật CV-AAS

Nguyên tắc: Mẫu được vô cơ hoá trong lò phá mẫu vi sóng có đặt chương trình

theo từng đối tượng. Hg(II) được chuyển về Hg kim loại bằng SnCl2. Hơi Hg bay lên

được đưa tới hệ thống quang phổ hấp thụ nguyên tử để đo phổ.

* Điều kiện đo máy

Vạch phổ đo thủy ngân 253,70 - nm

Cường độ dòng đèn HCL của Hg 4 mA (80 % IMax)

Khe đo 1 nm

Chiều cao đầu đốt Chế độ auto (16 mm)


III.2. PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÁT XẠ NGUYÊN TỬ

(AAS : Atomic Emission Spectrometry)

III.2.1. Nguyên tắc phương pháp: dựa trên hiện tượng phát xạ nguyên tử như sau

Khi cung cấp một năng lượng (thường là dưới dạng nhiệt) cho một đám hơi chứa

các nguyên tử tự do, các electron trong nguyên từ sẽ chuyển từ mức năng lượng cơ bản

(E°) lên mức năng lượng kích thích (E* ):

M0 + ΔE M*

Sau 10–8s, chúng lại quay trở về trạng thái cơ bản ban đầu và giải phóng một năng

lượng dưới dạng bức xạ điện từ có tần số :

M* M0 + h

trong đó : h = E* - E°

- 40 -

Hình 3.13. Sự phát xạ nguyên tử

Nếu thu và phân ly chùm bức xạ này thành các bức xạ đơn sắc, sẽ thu được phổ

phát xạ nguyên tử của nguyên tố bị kích thích.

Dựa vào hiện tượng này, người ta đã xây dựng phương pháp quang phổ phát xạ

nguyên tử, cho phép định tính và định lượng hơn 60 nguyên tố khác nhau.

- Định tính: Phổ phát xạ của một nguyên tố gồm các vạch phát xạ đặc trưng

nguyên tố đó. Nhờ đó, có thể nhận biết sự có mặt của các nguyên tố có trong mẫu phân

tích.

Thông thường, để nhận biết sự có mặt của một nguyên tố nào đó trong mẫu

thường dựa vào sự có mặt hay vắng mặt của các vạch phân tích hay vạch cuối cùng

của nguyên tố nghiên cứu, đó là các vạch rất nhạy và đặc trưng cho nguyên tố đã cho

(chúng là một hay vài vạch còn lại trong quang phổ của nguyên tố đó khi hàm lượng

của nguyên tố khảo sát trong mẫu phân tích giảm xuống đến một giới hạn nào đó).

- Định lượng: Cường độ của vạch phát xạ tỷ lệ với số nguyên tử ở trạng thái kích

thích và do đó phụ thuộc vào nồng độ nguyên tố phát xạ. Lomakin đã tìm được mối

quan hệ này như sau: Iλ = kCb

trong đó:

k là hằng số thực nghiệm, phụ thuộc vào điều kiện hóa hơi

mẫu và kích thích nguyên tử. Nếu cố định các điều kiện này thì k

= const

Hình 3.13. Quan hệ giữa cường độ vạch

b: hằng số phụ thuộc vào bản chất

nguyên tố, bước sóng của vạch phát xạ

và nồng độ của nguyên tố trong mẫu.

Đối với mỗi nguyên tố trong điều kiện

đo xác định thì tồn tài một giá trị nồng

độ tới hạn C0 trong đó khi Cx < C0 thì

đường biểu diễn Iλ – C là tuyến tính (tức

b = 1x) và khi Cx > C0 thì đường biễu

diễn không tuyến tính (b < 1). Nồng độ

C0 gọi là nồng độ giới hạn của cùng

- 41 -

phát xạ và nồng độ nguyên tố trong mẫu tuyến tính.

Dựa vào quan hệ Iλ – C, có thể xác định được nồng độ nguyên tố phát xạ trong

mẫu bằng cách đo cường độ vạch phát xạ đặc trưng của nguyên tố đó.

Để định lượng, người ta thường dùng phương pháp kẹp chuẩn, phương pháp

đường chuẩn hay phương pháp thêm tương tự như trong phương pháp AAS.

III.2.2. Sơ đồ thiết bị EAS và nguyên lý hoạt động :

Sơ đồ thiết bị EAS (Hình 3.14) cũng tương tự như thiết bị AAS, chỉ khác là

không có bộ phận đầu tiên là nguồn phát xạ.

Hình 3.14. Sơ đồ thiết bị AES

Nguyên lý hoạt động của thiết bị AES :

Các hợp chất trong mẫu phân tích được hóa hơi, nguyên tử hóa và chuyển sang

trạng thái kích thích bằng một nguồn nhiệt lượng kích thích Q (ví dụ: ngọn lửa đèn

khí, nguồn hồ quang điện, nguồn tia lửa điện cao tần, nguồn plasma hay nguồn laser) :

MeX (rắn, dd) + Q MeX (hơi)

MeX (hơi) + Q Me (hơi) + X (hơi)

Me (hơi) + Q Me* (hơi)

Nguyên tử bị kích thích sau đó sẽ phát xạ khi quay về trạng thái cơ bản :

Me* (hơi) Me (hơi) + h

Bức xạ phát ra sẽ được phân tách bằng một hệ thống đơn sắc và chọn lọc bức xạ

có tần số đăc trưng cho nguyên tố cần đo để đi vào tế bào quang điện và bộ phận

khuếch đại tín hiệu, cuối cùng được hiển thị trên thiết bị đo.

III.2.3. Phân loại loại thiết bị AES

Thường phân loại thiết bị AES dựa trên nguồn năng lượng được sử dụng để hóa

hơi, nguyên tử hóa và kích thích nguyên tử.

- 42 -

a) Thiết bị quang phổ phát xạ nguyên tử ngọn lửa (FAES: Flame Atomic

Emission Spectrometer):

Trong thiết bị này nguồn năng lượng sử dụng để kích thích nguyên tử là ngọn lửa

đèn khí được tạo từ sự đốt cháy các khí đốt (axetylen, propan,...) với chất oxy hóa

(không khí, oxy, H2, N2O,...). Nhiệt độ của ngọn lửa đèn khí phụ thuộc vào bản chất và

tỷ lệ các khí sử dụng, lưu lượng khí đốt và thường đạt khoảng 1700 – 30000C. Nhiệt

độ này khá thấp, chỉ đủ để kích thích các nguyên tố kim loại kiềm và kiềm thổ.

Bảng 3.3. Nhiệt độ của một số hỗn hợp khí đốt

Cấu tạo của ngọn lửa gồm 3 phần:

- Phần tối: ở sát miệng đèn, có nhiệt độ thấp

- Phần giữa: gần như không màu, nhiệt độ cao nhất. Do đó, nên đưa mẫu vào vị

trí này

- Phần trên cùng (vỏ và đuôi của ngọn lửa); màu vàng, nhiệt độ thấp nhất, tại đó

ảy ra nhiều quá trình phụ. Do đó, thiết bị phải được chế tạo sao cho phần này nhỏ nhất

và tránh đưa mẫu vào phần này để hạn chế quá trình phụ.

Hệ FAES cấu tạo đơn giàn, rẻ tiền, cho ngọn lửa ổn định nên kết quả thường có

độ chính xác tốt. Tuy nhiên, do đặc điểm chỉ tạo ra nhiệt độ thấp nên thiết bị này chỉ

dùng để phân tích các kím loại kiềm (Li, Na, K, Rb, Cs) và 1 vài kim loại kiềm thổ

(Ca, Mg) với độ nhạy cỡ 1 – 10 g/ml.

- 43 -

Hình 3.15. Cấu tạo và nhiệt độ các vùng của ngọn lửa đèn khí

b) Thiết bị quang phổ phát xạ nguyên tử dủng hồ quang điện và tia lửa điện : sử

dụng các nguồn kích thích sau:

- Hồ quang điện (arc): dùng sự phóng điện liên tục giữa 2 điện cực (kim loại hay

graphite) để làm bay hơi và kích thích nguyên tử.

Nếu mẫu là thanh kim loại thì nó được dùng làm 1 điện cực phóng điện

Nếu mẫu không dẫn điện thì nó được nghiền với bột than chì và nhồi vào phần

rỗng bên trong điện cực graphite.

Hình 3.16. Các loại điện cực tạo hồ quang điện

- Tia lửa điện (spark): dùng xung điện để kích thích. Hiện nay, thường thay

nguồn này bởi nguồn laser hay plasmar.

Loại thiết bị này hiện nay ít dùng do độ nhạy không cao, kém ổn định. Thường

chỉ dùng để định tính và bán định lượng.

- 44 -

c) Thiết bị quang phổ plasma cao tần cảm ứng ghép khối phổ (ICP-MS)

(ICP-AES: Inductively-Coupled Plasma – Mass Spectrometer)

Hình 3.17. Nguồn ICP

Nguồn kích thích là một

nguồn cao tần cảm ứng (ICP)

được tạo ra bởi máy phát cao tần

(phát sóng vô tuyến, thường có

công suất 1-5 kW, tần số 27

MHz). Nguồn này có khả năng

tạo ra nhiệt độ rất cao (lên đến

10.0000K), do đó có khả năng

làm bay hơi dung môi, hóa hơi

mẫu, kích thích và ion hóa các

nguyên tử. Khi đó, mẫu được

chuyển sang trạng thái plasma

trong đó chứa các cation và

electron.

Nguyên lý hoạt động của thiết bị ICP-MS như sau:

Đèn plasmar gồm có các ống thạch anh đồng tâm. Mẫu được phun thành

aerosol và được dòng khí mang (Ar hay hỗn hợp He - Ar) dẫn vào phần bên trong của

ống. Phần vỏ bên ngoài của ống được làm mát bởi khí mang. Một máy phát cao tần

sinh ra một dòng diện dao động trong một cuộn cảm ứng (induction coil) bao quang

ống thạch anh. Cuộn cảm ứng này tạo ra một từ trường; từ trường này lại sinh ra một

dòng điện dao động trong các ion và electron của khí mang. Các ion này lại va chạm

với các nguyên tử khác trong khí mang và mẫu, kích thích chúng chuyền thành các

ion tạo ra plasmar. Các ion sau đó được đưa vào detector khối phổ qua một khe hẹp

(bên trong detector có độ chân không rất cao). Các ion sau đó được tăng tốc và tập

trung thành một dòng ion bằng một hệ thống các thấu kính tĩnh điện (electrostatic

lenses, là các nam châm tạo ra từ trường để định hướng đường đi của các ion). Dòng

ion sau đó được phân tách bởi một bộ lọc khối tứ cực (quadrupole mass filter). Bộ lọc

này sẽ chọn lọc các ion dựa trên tỷ số khối lượng/điện tích của chúng (m/z) sao cho chỉ

có các hạt ứng với giá trị m/z đã cho mới có thể đi vào detector nhân ion đặt ở phần

cuối của ống tứ cực, tạo ra dòng điện, được ghi nhận và thể hiện dưới dáng các peak

trong phổ khối lượng.

Mỗi ion có một giá trị m/z đặc trưng cho khối lượng và điện tích của nó m/z, nhờ

đó có thể nhận biết sự có mặt của nguyên tố đó trong mẫu phân tích. Cường độ của

- 45 -

peak tín hiệu phụ thuộc vào nồng độ ion đó trong mẫu, điều này cho phép định lượng

nguyên tố có trong mẫu dựa vào cường độ vạch phổ MS (dùng mẫu chuẩn)

Hình 3.18. Sơ đồ thiết bị ICP-MS

III.3. So sánh phương pháp AAS và EAS :

Các phương pháp AAS và EAS cho phép định tính và định lượng khoàng 60

nguyên tố (gồm tất cả các kim loại và một số nguyên tố không kim loại như B, Si,

P, ..) thuộc nhiều đối tượng phân tích khác nhau (hợp kim, kim loại, khoáng vật, các

mẫu sinh học, ...). Đối với đa số nguyên tố, sai số của phương pháp FAAS thường vào

khoảng 0,6 -3%. Các phương pháp AAS không ngọn lửa thường cho sai số dưới 2%.

So với phương pháp AES cổ điển (dùng nguồn kích thích là ngọn lửa đèn khí, hồ

quang, tia lửa điện), phương pháp AAS có ưu điểm là:

- độ nhạy cao hơn nhiều lần (AES: cỡ 1 ppm; AAS : cỡ 0,1 – 0,005 ppm).

- độ chính xác và độ chọn lọc cao do ít vạch phổ hơn (AES cho rất nhiều vạch

phổ, có thể nhầm lẫn khi phân tích)

- điều kiện kích thích phổ tương đối dễ dàng

Tuy nhiên phương pháp AAS có một số hạn chế:

- không áp dụng được cho C, P, các halogen, ...

- thường phải hòa tan mẫu trước khi đo làm kéo dài thời gian phân tích và

không thể xác định đồng thời nhiều nguyên tố (mỗi nguyên tố cần một đèn

kích thích tương ứng)

Trong phân tích thực phẩm, các kim loại nặng như Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Cr,

thường được phân tích bằng phương pháp FAAS. Các độc tố dễ bay hơi như Pb, As,

- 46 -

Sb, Hg... thường được chiết bằng dung môi hữu cơ rồi định lượng bằng phương pháp

AAS hóa hơi lạnh (CV-AAS). Đối với đa số nguyên tố, sai số của phương pháp FAAS

thường vào khoảng 0,6 -3%. Các phương pháp AAS không ngọn lửa thường cho sai số

dưới 2%.

Hiện nay, nhờ khả năng tạo ra được nhiệt độ rất cao cho phép ion hóa hầu hết các

nguyên tố và nền mẫu, thiết bị ICP-MS là một công cụ AES rất hữu hiệu để phân tích

nguyên tố (ngay cả các nguyên tố bền nhiệt, áp dụng cho nhiều nền mẫu khác nhau).

Phương pháp này cho độ nhạy khá cao (0,1 – 10 ng/ml), độ lặp lại tốt, sai số nhỏ, vùng

tuyến tính rộng, tốc độ phân tích lớn, ảnh hường của nền mẫu không có hoặc rất ít.

Tuy nhiên, thiết bị ICP-MS rất đắt tiền nên vẫn chưa phổ biến bằng các thiết bị AAS.

Chương 4.

PHÂN TÍCH THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ

IV.1. LỊCH SỬ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Phương pháp sắc ký được phát minh vào

năm 1906 bởi Tswett - một nhà sinh vật học

người Nga.

Khi cho hỗn hợp dịch chiết sắc tố của lá cây

trong hòa tan trong eter dầu mỏ (chứa chlorophyll

và các xanthophyll) hấp phụ lên đầu cột chứa

CaCO3 nghiền mịn rồi cho dung môi eter dầu mỏ

liên tục chảy qua cột, Tswett nhận thấy rằng

trong quá trình di chuyển từ trên xuống dưới cột

hỗn hợp trên (lúc đầu nhìn thấy có màu lục) dần

dần được tách ra thành những dãi màu khác nhau

(lục, lục lam, vàng). Như vậy, bằng cách này đã

phân tách hỗn hợp sắc tố lá thành các phân đoạn

chứa các sắc tố riêng biệt. Tswett gọi phương

pháp tách này là phương pháp sắc ký và tập hợp Hình 4.1. Thí nghiệm tách hỗn

- 47 -

các dãi màu tách ra trên cột là sắc ký đồ. hợp sắc tố lá cây của Tswett

Phương pháp này sau đó bị lãng quên trong một thời gian dài. Mãi đến năm

1931 và về sau, nhờ những công trình của Vinterstin, Lederer, Izmailov, Shraiber,

Synge, Martin,... nghiên cứu cơ sở lý thuyết của quá trình tách sắc ký và phát triển các

thiết bị ghép đầu ra của cột sắc kí với những detector cho phép định tính và định

lượng các cấu tử tách ra thì phương pháp này mới được chú ý. Từ đó đến nay, phương

pháp sắc ký đã phát triển mạnh mẽ và trở thành phương pháp rất hiệu nghiệm để định

tính và định lượng các cấu tử trong mẫu thuộc nhiều đối tượng phân tích khác nhau

(vô cơ, hữu cơ, sinh học, thực phẩm, môi trường,...)

IV.2. MỘT SỐ KHÁI NIỆM LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ

- Pha tĩnh (stationary phase): là pha rắn, xốp, đứng yên, gồm các hạt mịn,

được nhồi vào một cột (bằng thủy tinh kim loại) hay là một pha lỏng được phủ hay gắn

lên bề mặt một chất mang rắn nào đó.

- Pha động (mobile phase): là pha lỏng hay khí được di chuyển liên tục qua

pha tĩnh dưới tác dụng của một trường lực nào đó như trọng lực (ví dụ: trong phép sắc

ký cột cổ điển), lực mao dẫn (như trong sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng), hoặc nhờ áp

suất (sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí,...)

- Rửa giải (elution): là quá trình tách các cấu tử phân tích được lưu giữ trên

pha tĩnh bằng cách cho một pha động di chuyển liên tục qua pha tĩnh.

IV.3. NGUYÊN TẮC CHUNG CỦA PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

IV.3.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký:

Mặc dù cơ chế tách có thể khác nhau đối với từng phương pháp sắc ký, nhưng

các quá trình sắc ký đều tuân theo định luật phân bố Nernst:

Ở một nhiệt độ nhất định, tỷ số nồng độ của một cấu tử A nào đó trên pha tĩnh và

pha động là một hằng số

trong đó :

[A] S và [A]M lần lượt là nồng độ cấu tử A nào đó trên pha tĩnh và pha động

KD là hằng số phân bố, phụ thuộc vào nhiệt độ và bản chất của mỗi cấu tử, bản

chất của pha tĩnh và pha động.

Vậy, cấu tử nào có ái lực với pha tĩnh càng lớn so vớI pha động thì giá trị KD

càng lớn và sẽ bị giữ lại trên pha tĩnh càng mạnh.

Sự khác nhau về hằng số phân bố KD của các cấu tử trong một hỗn hợp đối với

một hệ pha tĩnh và pha động nào đó chính là cơ sở cho phép tách chúng ra khỏi nhau

bằng phương pháp sắc ký.

- 48 -

IV.3.2. Giải thích sự tách hỗn hợp cấu tử trong quá trình sắc ký:

Khi cho hỗn hợp mẫu phân tích lên đầu cột sắc ký, sẽ xảy ra sự lưu giữ các cấu tử

trên pha tĩnh.

Trong quá trình sắc ký, khi cho pha động di chuyển qua pha tĩnh, các cấu tử trong

hỗn hợp phân tích sẽ di chuyển dọc theo pha tĩnh cùng với pha động nhưng với tốc độ

khác nhau tùy thuộc vào hằng số phân bồ của nó giữa pha tĩnh và pha động: cấu tử

nào có ái lực với pha tĩnh càng lớn (tức KD càng lớn) sẽ bị lưu giữ càng chặt và di

chuyển với tốc độ càng chậm, và ngược lại. Nếu hằng số phân bố KD của các cấu tử

phân tích khác nhau đủ lớn thì hỗn hợp nghiên cứu dần dần sẽ được tách thành các

vùng riêng biệt, mỗi vùng tương ứng với một cấu tử.

Nếu đầu ra của cột sắc ký được ghép nối với một detector có khả năng ghi nhận

các tín hiệu đặc trưng nào đó của các cấu tử phân tích (như độ hấp thụ ánh sáng, chiết

suất, độ dẫn điện, cường độ phát huỳnh quang, ...) và biễu diễn sự thay đổi của nồng

độ chất phân tích theo thời gian rửa giải, ta sẽ thu một sắc ký đồ chứa các peak (mũi

tín hiệu). Nếu quá trình phân tách tốt (các cấu tử được phân tách hoàn toàn) thì mỗi

peak sẽ đặc trưng cho một cấu tử trong hỗn hợp. Ngoài ra, diện tích peak sẽ tỷ lệ với

nồng độ cấu tử này trong dung dịch phân tích. Dựa vào đó, có thể định tính và định

lượng các cấu tử có trong hỗn hợp phân tích.

Hình 4.2. Sự tách hỗn hợp cấu tử trong quá trình sắc ký và sắc ký đồ

IV.3.3. Các đại lượng cơ bản trong sắc ký - Tối ưu hóa quá trình sắc ký

IV.3.3.1. Các đại lượng cơ bản trong sắc ký :

- 49 -

a) Khả năng lưu giữ của một cấu tử trên một hệ sắc ký được đặc trưng bằng các

đại lượng sau

* Thời gian lưu (tR: retention time): là thời gian cần thiết để một cấu tử nào đó đi

từ đầu cột đến cuối cột và được phát hiện bởi detector. Tùy thuộc bản chất của pha tĩnh

và pha động có trong hệ sắc ký mà mỗi cấu tử sẽ bị lưu giữ khác nhau và do đó có thời

gian lưu tR khác nhau.

Hình 4. 3.

Sắc ký đồ của hỗn hợp 2 cấu tử

với một cấu tử không bị lưu giữ

Trên sắc ký đồ (Hình 4.3), thời gian lưu của

một cấu tử (tR) là khoảng thời gian từ lúc bắt

đầu bơm mẫu (t0 = 0) đến lúc cấu tử đó ra khỏi

cột sắc ký và được phát hiện bằng detector (ứng

với lúc xuất hiện đỉnh của peak sắc ký tương

ứng)

Nếu hỗn hợp sắc ký chứa một cấu tử hoàn

toàn không bị lưu giữ trên cột thì nó sẽ đi ra

khỏi cột ngay cùng với pha động và cho một

peak đầu tiên. Thời gian lưu của cấu tử này rất

nhỏ, được gọi là thời gian chết (ký hiệu là tm).

Thời gian chết chính là thời gian cần thiết để pha động đi từ đầu cột đến detector

nên:

trong đó :

L - chiều dài pha tĩnh

u : tốc độ tuyến tính trung bình của pha động

Để đánh giá thời gian lưu thực sự của một cấu tử trong pha tĩnh phải dùng thời

gian lưu hiệu chỉnh tR’:

tR’ = tR – tm

* Thừa số dung lượng của một cấu tử i trên pha tĩnh được định nghĩa bởi công

thức:

với:

mS, mM và CS, CM: khối lượng và nồng độ cấu tử i trong pha tĩnh và pha động

VS, VM - thể tích của pha tĩnh và pha động

KD = CS/CM : hằng số phân bố của i giữa pha tĩnh và pha động

- 50 -

Có thể chứng minh được rằng:

Vậy, có thể tính được k' của một cấu tử dựa vào sắc ký đồ.

Giá trị k' tối ưu cho quá trình tách sắc ký: k’= 1- 5

Với hỗn hợp phân tích phức tạp có thể chấp nhận: k’ = 1 - 10

b) Hiệu năng của cột sắc ký: Hiệu năng của một cột sắc ký là khả năng tách các

cấu tử trong hỗn hợp ra khỏi nhau, nó được đặc trưng bởi các đại lượng sau:

* Số đĩa lý thuyết:

Theo lý thuyết đĩa (Martin và Synge, 1942), mỗi cấu tử A trong hỗn hợp sắc ký

sẽ di chuyển liên tục trên pha tĩnh theo những bước rất nhỏ, trong mỗi bước như vậy

thiết lập rất nhanh một cân bằng phân bố của A giữa pha tĩnh và pha động:

AS AM

Mỗi phần pha động đưa thêm vào sẽ làm chuyển dịch cân bằng trên và tách một

phần cấu tử A trong pha tĩnh chuyển sang bước tiếp theo, tại đó lại thiết lập một cân

bằng phân bố mới. Mỗi bước chuyển dời ứng với một cân bằng phân bố được thiết lập

giữa pha tĩnh và pha động được gọi là một đĩa lý thuyết. Quá trình cứ tiếp diễn liên

tục, kết quả cấu tử A sẽ được phân bố trên một số đĩa theo phân bố Gauss, trong đó

nồng độ A đạt sẽ cực đại ứng với các đĩa ở bố giữa.

Như vậy, một cột sắc ký có chiều dài L được tưởng tượng chia thành N đĩa lý

thuyết có cùng độ cao H được đánh số từ 1 đến N (H được gọi là chiều cao của một đĩa

lý thuyết ).

- 51 -

Vậy:

Hiệu năng tách của cột sắc ký càng cao nếu N càng lớn (hay H càng nhỏ).

Điều này cũng được thể hiện trên sắc ký đồ: Hiệu năng tách của hệ thống sắc ký

càng tốt thì các peak sắc ký thu được càng nhọn, hẹp, không bị giãn rộng.

Có thể tính được số đĩa lý thuyết dựa vào sắc ký đồ thu được theo công thức:

W: độ rộng chân peak

: độ rộng ứng với một nửa chiều cao của peak

Độ phân giải của cột (resolution - ký hiệu Rs)

Hình 4.4. Các ví dụ về sự phân giải các

peak sắc ký

Rs ≥ 1: các peak được tách rời nhau

phân giải được.

(Tốt nhất là Rs ≥ 1,5. Khi đó, có thể

định lượng chính xác các cấu tử )

Rs < 1: các peak bị chồng lấn lên

nhau phân giải không tốt khó

định lượng chính xác

* Độ chọn lọc (selectivity – ký hiệu α):

với:

k'1, k''2 và t'R1, t'R2: thừa số dung lượng và thời gian lưu hiệu chỉnh của hai cấu tử

(1 và 2) có peak nằm cạnh nhau trên sắc ký đồ.

α > 1 chọn lọc tốt (phân biệt được các cấu tử 1 và 2)

α < 1 chọn lọc không tốt khó phân biệt được các cấu tử 1 và 2

Độ phân giải của cột phụ thuộc vào N, k' , α:

- 52 -

(*)

Trong sắc ký khí, k' thường rất lớn (từ 30 - 50), nên:

IV.3.3.2. Tối ưu hóa quá trình sắc ký: nghĩa là chọn điều kiện sắc ký như nhiệt

độ, pha tĩnh (bản chất pha tĩnh, kích thước hạt, độ xốp, chiều dài cột), pha động (bản

chất pha động, tôc độ, lưu lượng pha động, chế độ rửa giải,...) sao cho đạt được độ

phân giải tốt nhất cón thể được với thời gian chấp nhận được.

Thông thường, thay đổi các thông số trên như sau:

- Thay đổi k' và α : bằng cách thay đổi nhiệt độ (đặc biệt hay dùng trong sắc ký

khí) hay thay đổi thành phần pha động (hay dùng trong sắc ký lỏng)

- Thay đổi N bằng cách thay đổi một hay vài thông số như: chiều dài cột sắc

ký (L), tốc độ pha động (u), chiều cao đĩa lý thuyết H (thay đổi kích thước hạt pha

tĩnh, độ nhớt pha động, thay đổi bề dày lớp film mỏng tráng trên pha tĩnh.

IV. 4. Phân loại các phương pháp sắc ký

Các cách phân loại được sử dụng nhiều nhất là:

a) Phân loại theo trạng thái tập hợp của pha động

Đây là cách phân loại được sử dụng rộng rãi nhất

- S ắc ký khí (viết tắt GC: Gas Chromatograhy): pha động ở trạng thái khí

- S ắc ký lỏng (viết tắt LC: Liquid Chromatograhy): pha động ở trạng thái lỏng

- S ắc ký siêu tới hạn (viết tắt SFC: Supercritical Fluid Chromatograhy): pha

động là một chất lỏng ở trạng thái siêu tới hạn (ví dụ: CO2 ở 500C, áp suất 150 bars)

b) Phân loại theo phương tiện tách:

- S ắc ký cột (Column Chromatograhy): pha tĩnh được nạp vào cột (thủy tinh, kim

loại) hay được tráng ở thành bên trong của cột mao quản.

- S ắc ký phẳng (Plannary Chromatograhy): pha tĩnh được tráng lên bề mặt của

một bản phẳng (ví dụ: sắc ký giấy, sắc ký bản mỏng)

c) Phân loại theo cơ chế tách: dựa trên bản chất tương tác giữa chất sắc ký với

pha tĩnh và pha động.

- Sắc ký hấp phụ (Adsorption Chromatography): dựa trên khả năng hấp phụ khác

nhau của pha tĩnh (rắn) đối với các cấu tử trong hỗn hợp sắc ký.

- Sắc ký phân bố (Partition Chromatography): sử dụng khả năng phân bố (hay độ

tan) khác nhau của các cấu tử đối với pha tĩnh (lỏng) và pha động (lỏng).

- Sắc ký trao đổi ion (Ionic Chromatography): dựa trên khả năng trao đổi ion

khác nhau của các ion trong hỗn hợp sắc ký với các ion linh động trên bề mặt pha tĩnh

- 53 -

- Pha tĩnh ở đây là các chất hấp phụ trao đổi ion (thường là các nhựa trao đổi ion tổng

hợp)

- Sắc ký loại trừ (Size-Exclusion Chromatography): là phương pháp tách dựa trên

sự khác nhau về kích thước phân tử của các cấu tử phân tích.

IV.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ ĐƠN GIẢN (Đọc thêm)

IV.5.1. Sắc ký cột (CC: Column Chromatography)

Đây là phương pháp sắc ký cổ điển nhất, đã được Tswett áp dụng lần đầu tiên vào

năm 1903.

IV.5.1.1. Phương tiện tách: là các cột hình trụ bằng thủy tinh, kim loại hay hợp

kim, chất dẻo... đầu dưới có khóa (tương tự một burette), Đường kính khoảng 1- 2 cm

trở lên. Tỷ lệ giữa chiều dài L và đường kính d của cột phải theo tỷ lệ thích hợp để đạt

hiệu quả tách tốí ưu.

Pha tĩnh được cấu tạo từ các hạt mịn được nhồi vào cột sắc ký.

IV.5.1.2. Kỹ thuật triển khai sắc ký cột: thường dùng phương pháp rửa giải

(elution)

- Chuẩn bị cột: Lót một lớp

bông thủy tinh dày 2 - 3 mm vào đầu

dưới của cột rồi nhồi pha tĩnh vào cột

(nhồi khô hay nhồi ướt; chú ý không làm

nứt cột). Đầu trên của cột pha tĩnh cũng

lót một lớp bông thủy tinh để tránh làm

xáo trộn pha tĩnh khi rửa giải. Cho dung

môi trơ thích hợp đi qua cột để thấm ướt

pha tĩnh.

- Nạp mẫu: Mẫu cô đặc được

cho lên đầu cột pha tĩnh.

- Rửa giải: Cho pha động liên tục đi

qua cột, hỗn hợp sắc ký sẽ được tách

thành các vùng khác nhau trên cột và lần

lượt ra khỏi cột. Để tăng hiệu quả tách và

rút ngắn thời gian sắc ký, có thể tăng dần

lực rửa giải của pha động sử dụng (thay

đổi độ phân cực của pha động).

Hình 4.5. Chuẩn bị cột sắc ký với pha tĩnh là silicagel

Để định tính và định lượng các cấu tử trong hỗn hợp sắc ký, ở đầu ra của cột,

ngưới ta hứng các phân đoạn ứng với từng cấu tử tách được rồi đem xác định bằng các

phương pháp phân tích thích hợp.

- 54 -

IV.5.1.3. Ứng dụng và hạn chế của phương pháp sắc ký cột:

Ứng dụng: dùng để tách và điều chế các cấu tử từ một hỗn hợp

Hạn chế:

- Thời gian phân tích khá dài

- Tốn nhiều mẫu, pha tĩnh và dung môi pha động.

- Khả năng tách không hiệu quả, nhất là đối với các hỗn hợp mẫu phức tạp

IV.5.1.4. Các phương pháp sắc ký cột

a) Sắc ký cột hấp phụ:

Pha tĩnh: là các chất hấp phụ như cellulose, tinh bột, đường, Na2CO3, CaCO3,

Ca3(PO4)3, MgCO3, MgO, silicagel, florisil, alumin (Al2O3), C hoạt tính. Silicagel và

alumin với cỡ hạt 50 – 230 mm (tức 70 –290 mesh) là các chất hấp phụ thông dụng

dùng để tách hỗn hợp các chất không phân cực có bán sẵn trên thị trường

- Pha động: là dung môi có độ tinh khiết cao, trơ với chất tan và chất hấp phụ, có

khả năng hòa tan tương đối tốt các chất nghiên cứu trong hỗn hợp phân tách.

- Rửa giải: Quá trình rửa giải được thực hiện theo thứ tự tăng dần khả năng giải

hấp.

Đối với pha tĩnh phân cực, sự rửa giải xảy ra theo thứ tự tăng dần độ phân cực

của dung môi pha động.

Ngược lại, đối với pha tĩnh không phân cực, sự rửa giải xảy ra theo thứ tự giảm

dần độ phân cực của pha động

Trật tự tăng dần độ phân cực của các dung môi thường dùng như sau:

Ether dầu mỏ < hexan < cyclohexan < CCl4 < benzen < toluen < diclorometan,

CHCl < dietyl ete < acetat etyl < aceton < pyridin < propanol < etanol < metanol <

nước < acid acetic.

- Kỹ thuật tách: Thường thực hiện theo phương pháp đi xuống (cho pha động

chảy từ trên xuống dưới cột dưới tác dụng của trọng lực hay dùng áp lực).

b) Sắc ký cột phân bố :

Pha tĩnh là một pha lỏng (nước hay dung môi hữu cơ) được hấp phụ trên bề mặt

chất mang rắn hay liên kết hóa học với chất mang (phổ biến nhất là bằng phương pháp

ghép nhánh trên nhóm silanol của silicagel)

Pha tĩnh phân cực sắc ký pha thường (NP: normal phase). Ví dụ: diatomite,

silicagel, oxyt nhôm, …

Pha tĩnh không phân cực hay kém phân cực sắc ký pha ngược (RP: reversed

phase). Ví dụ: RP-8, RP-18, …

Chọn pha tĩnh: căn cứ trên bản chất hỗn hợp cấu tử cần tách sao cho tương tác

giữa pha tĩnh với chất cần tách không mạnh quá (chất sẽ bị giữ quá chặt khó rửa

- 55 -

giải, thời gian phân tích quá dài) cũng không yếu quá (chất gần như ra khỏi cột ngay độ phân giải sẽ kém)

Chọn pha động theo các nguyên tắc sau:

+ phải hòa tan tốt cấu tử cần tách

+ tùy theo bản chất pha tĩnh:

Pha tĩnh phân cực (NP) pha động là dung môi hữu cơ ít phân cực đến phân cực

trung bình

Pha tĩnh không phân cực hay kém phân cực (RP) pha động là dung môi phân

cực đến phân cực trung bình

+ có lực rửa giải trung bình

+ thành phần pha động phải không bị thay đổi trong quá trình sắc ký

+ có độ nhớt càng thấp càng tốt

Ví dụ:

- Pha tĩnh là H2O /silicagel để tách hỗn hợp acid amin pha động là phenol

được bão hòa nước

- Pha tĩnh là cột C18 (không phân cực) để tách các carotenoid, pha động có thể

là metanol, acetonitril hay hỗn hợp MeOH –H2O, acetonitril –H2O,…

c) Sắc ký cột trao đổi ion (viết tắt IC: Ionic Chromatography):

Pha tĩnh là các chất trao đổi ion (ionit) bao gồm:

- Ionit vô cơ: gồm ionit vô cơ tự nhiên (nhóm zeolit, đất sét, glauconit,…) và

ionit vô cơ tổng hợp (gồm các alumosilicat như zeolit, permutit,…)

- Ionit hữu cơ: gồm ionit hữu cơ tự nhiên (cellulose, than bùn,…) và ionit hữu

cơ tổng hợp (tức nhựa trao đổi ion).

Loại ionit được sử dụng nhiều nhất là các loại nhựa trao đổi ion tổng hợp, bao

gồm hai loại là cationit và anionit

Cân bằng trao đổi ion:

- Cân bằng trao đổi cation trên nhựa cationit:

Giả sử dùng nhựa sulphonat R’SO3- H+. Khi cho nhựa tiếp xúc với dung dịch chứa

cation Mn+ sẽ xảy ra phản ứng trao đổi:

nR’SO3- H+

(R) + Mn+ (dd) (R’SO3- )nMn+

(R) + nH+(dd)

hay viết đơn giản:

nH+(R) + Mn+

(dd) Mn+(R) + n H+

(dd)

Hằng số trao đổi ion của nhựa được định nghĩa như sau:

Hệ số phân bố DM của cation Mn+ giữa hai pha là:

- 56 -

DM đặc trưng cho ái lực của nhựa đối vớI cation Mn+: Cation có ái lực với cationit

càng lớn thì bị hấp phụ trao đổi càng mạnh, do đó DM càng lớn.

Mặt khác:

Ái lực của nhựa đối với cation phụ thuộc vào pH của dung dịch tiếp xúc: môi

trường càng acid càng thì ái lực của nhựa đối với các cation càng kém

- Cân bằng trao đổi trên nhựa anionit:

Tương tự, cân bằng trao đổi anion trên nhựa anionit (loại amonium) xảy ra như

sau:

nRNH3+OH –

(R) + A n – (dd) nRNH3+An-

(R) + nOH –(dd)

hay: nOH –(R) + A n – (dd) An -

(R) + nOH –(dd)

Hằng số trao đổi ion của anionit và hệ số phân bố của anion A n - giữa hai pha là

cũng được định nghĩa tương tự như đối với nhựa cationit.

Các giai đoạn của quá trình sắc ký trao đổi ion :

- Chuẩn bị cột:

Cột sắc ký trao đổi ion dùng trong phòng thí nghiệm thường là các cột bằng thủy

tinh, có tỷ lệ đường kính và chiều dài lớn hơn 10, đầu dưới có khóa (giống như

burette). Để tránh ionit làm nghẽn cột, phần dưới cột được lót bằng bi thủy tinh hay

bông thủy tinh dày 3-10 mm.

Nhựa ionit sạch được ngâm trương trong nước và rót vào cột cùng với nước để

tránh xuất hiện bọt khí bao quanh hạt ionit. Lượng ionit chỉ nên chiếm khoảng 2/3 thể

tích cột. Phía trên lớp ionit lót một lớp bông thủy tinh để tránh xáo trộn cột khi rót

dung dịch khảo sát vào.

- Hấp thu ion trong dung dịch phân tích lên ionit:

Cho dung dịch khảo sát lên cột ionit với vận tốc thích hợp (2 - 3 ml/phút). Thể

tích dung dịch được lấy chính xác và tính toán sao cho các ion cần trao đổi được hấp

thụ hết trên nhựa (lượng ionit nên lấy thừa so với lượng tính toán)

- Giải hấp ion bị hấp thu trên ionit

Tách các ion bị hấp thu khỏi ionit bằng các dung dịch thích hợp (như dung dịch

acid có nồng độ khác nhau, hoặc dung dịch các hợp chất hữu cơ có khả năng tạo phức

với ion cần tách...)

Rửa tiếp ionit bằng các dung dịch thích hợp để đuổi hết dung dịch giải hấp còn

sót trong các khe hở của các hạt ionit.

- Tái sinh ionit

- 57 -

Tái sinh cationit: cho dung dịch HCl 2 - 4% chảy qua cột (đối với nhựa RH),

hoặc dung dịch NaCl 2 - 4% (đối với nhựa RNa)

Tái sinh anionit: cho qua cột dung dịch NaOH 2 - 4% (đối với nhựa RNH2) hay

dung dịch HCl, NaCl 2 - 4 % (đốI với nhựa RCl)

Cuối cùng, rửa lại bằng nước cất để đuổi hết dung dịch tái sinh nằm trong cột.

d) Sắc ký loại trừ (viết tắt SEC: Size Exclusion Chromatography): còn gọi là sắc

ký rây phân tử, sắc ký gel, hay lọc qua gel, thấm qua gel.

Nguyên tắc:

Trong sắc ký loại trừ, pha tĩnh là những loại vật liệu rắn, có khả năng ngấm dung

môi (nước hay dung môi hữu cơ) và trương lên tạo thành bộ khung gel có độ xốp cao

với kích thước các lỗ xốp xác định.

Khi cho dung dịch các phân tử chất tan qua cột, phân tử nào có kích thước nhỏ

hơn kích thước lỗ xốp của gel sẽ chui sâu vào các lỗ này và bị giữ lại; phân tử nào có

kích thước lớn hơn lỗ gel sẽ chảy qua những khe hở giữa các hạt xốp của gel. Do đó,

khi cho pha động đi qua cột, các phân tử lớn hơn kích thước lỗ xốp của gel sẽ ra khỏi

cột nhanh hơn, còn các phân tử nhỏ sẽ đi ra chậm hơn..

Do vậy, thứ tự rửa giải trong SEC sẽ theo chiều giảm dần kích thước phân tử.

Nếu kích thước phân tử gần giống nhau thì thứ tự rửa giải sẽ theo chiều giảm

dần phân tử lượng.

Như vậy, cơ chế tách dựa trên sự khác biệt về kích thước và khối lượng phân tử

của các cấu tử có trong dung dịch. Do đó, phương pháp này còn được gọi là sắc ký rây

phân tử (Molecular Sieve Chromatography).

Hình 4.5. Tách bằng sắc ký loại trừ

Các loại gel và rây phân tử:

- Rây hữu cơ: dextran mạng (tức sephadex), polyacrylamit, polyvinylacetat,

polystyrol,..). Ưu điểm của rây hữu cơ là có kích thước lỗ xốp đa dạng và không có

hoạt tính hấp phụ, nhưng nhược điểm là trương nở mạnh gây nén chặt cột.

- 58 -

- Rây vô cơ: các zeolit tổng hợp, thủy tinh xốp, silicagel xốp cao,… Rây vô

cơ không có nhược điểm trên nhưng có khả năng hấp phụ mạnh nên phải khử hoạt tính

bề mặt mới sử dụng.

Yêu cầu quan trọng đối với chọn lựa các rây phân tử là kích thước lổ xốp của gel

phải bằng hay lớn hơn kích thước các phân tử cần tách. Nếu hỗn hợp cần tách chứa các

phân tử có kích thước thay đổi trong một vùng rất rộng thì tách bằng cách ghép nhiều

cột liên tiếp, mỗi cột chứa một loại rây phân tử có kích thước lỗ xốp khác nhau.

Pha động (dung môi rửa giải):

- phải hòa tan các cấu tử trong hỗn hợp cần tách

- có khả năng làm trương gel

- tương thích với detector sử dụng

Pha động ưa nước: để tách các polymer sinh học có phân tử lượng lớn (như

polysaccharid, protein) để không làm biến tính chúng

Pha động hữu cơ: để tách các phân tử hữu cơ tổng hợp (ví dụ: toluen để tách cao

su, polystyrol ; chloroform để tách silicon, nhựa epoxy, polyeter béo, …)

Kỹ thuật thực nghiệm:

- Thiết bị: có thể dùng cột sắc ký thông thường (phương pháp cổ điển) hay thiết

bị sắc ký lỏng cao áp (phương pháp hiện đại) để phân tích.

Hình 4.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký loại trừ hiện đại

- Tiến hành:

Trong phương pháp cổ điển, dùng cột sắc ký thủy tinh dài 20 – 200 cm, đường

kính 5 – 50 mm. Đầu dưới cột lót một lớp bông thủy tinh để ngăn không cho gel lọt

xuống.

- 59 -

Nạp gel vào cột dưới dạng “vữa”: trộn một lượng thích hợp gel hay rây phân tử

với dung môi, lắc đều cho đến hết bọt khí và tạo thành vữa; rót vữa vào cột, vừa rót

vừa gõ nhẹ. Mở khoá cho dung môi chảy qua cột (lưu ý lúc nào cũng phải giữ lại một

ít dung môi trên gel để không khí không lọt vào làm nứt cột),

Dùng micropipet để nạp mẫu vào cột (lượng mẫu phụ thuộc vào độ hiệu nghiệm

của cột và độ nhạy của detector) đồng thời vẫn cho dung môi chảy qua cột. Khi đưa

mẫu vào thì đặt bình hứng (có khắc vạch thể tích) ở cuối cột. Thông thường, người ta

hứng cứ 0,5 – 1,0 ml cho một phân đoạn (tương ứng với một cỡ kích thước phân tử)

SEC là phương tiện rất hiệu quả để:

- tinh chế các dịch chiết sinh học trước khi phân tích sắc ký (ví dụ: loại các phân

tử lớn như chlorophyll, các chất mùn, …, chỉ giữ lại các phân tử nhỏ)

- tách và xác định sự phân bố phân tử lượng của các polymer tự nhiên

(polysaccharid, protein, polypeptid, nucleotid…) và polymer tổng hợp.

SẮC KÝ BẢN MỎNG (TLC: Thin Layer Chromatography)

Pha tĩnh: là các hạt chất mịn chất rắn (kích thước cỡ 0,5 - 0,25 mm) được tráng

thành lớp mỏng (dày 100 - 200 mm) trên bề mặt của một bản thủy tinh, nhôm hay nhựa

polyester.

Các chất dùng làm pha tĩnh có thể là: silicagel, oxyt nhôm, CaCO3, cellulose, tinh

bột, sephadex, hay nhựa trao đổi ion, hoặc các dạng silicagel được biến tính hoá học.

Trong một số trường hợp, có thể trộn với thạch cao hay tinh bột để làm chất kết dính.

Cơ chế tách có thể là hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay rây phân tử tùy vào bản

chất của pha tĩnh và chất sắc ký (tương tự như trường hợp sắc ký cột)

Pha động: việc chọn lựa pha động cũng tương tự như trường hợp sắc ký cột

tương ứng

Quá trình thực hiện gồm các giai đoạn:

- Chuẩn bị bản mỏng: có thể dùng loại bản mỏng bán sẵn trên thị trường hay

tự chuẩn bị. Dùng bút chì kẻ 2 vạch dài song song dọc theo 1 cạnh của bản (cách mép

bản khoảng 0,5 – 1 cm) để đánh dấu tuyến xuất phát và tuyến dung môi.

- Nạp mẫu: dùng một mao quản thủy tinh để chấm mẫu lên bản ở vị trí tuyến

xuất phát sao cho tạo thành vết mẫu có đường kính cỡ 1 - 3 mm. Để khô.

- Triển khai sắc ký: đặt bản đã chuẩn bị vào một buồng triển khai, tức là một

chậu thủy tinh có nắp đậy kín, chứa sẵn pha động (mức pha động phải nằm dưới tuyến

- 60 -

xuất phát). Để bão hoà khí quyển trong buồng triển khai bằng pha động, có thể dùng

một miếng giấy lọc tẩm pha động ép lên thành bình.

Dưới tác dụng của lực mao dẫn, pha động sẽ đi lên qua pha tĩnh kéo theo hỗn hợp

phân tích và tách chúng thành các vệt (Nếu tách tốt thì mỗi cấu tử sẽ ứng với một vệt

tròn). Khi pha động di chuyển vừa đến tuyến dung môi thì lấy bản ra, đánh dấu các vết

cấu tử và để cho dung môi bay hơi.

Kỹ thuật triển khai

Sắc ký một chiều : dung môi di chuyển theo một chiều nhất định, gồm 2 loại:

- Sắc ký đi lến: pha động di chuyển lên trên do lực mao dẫn như đã mô tả ở

trên

- Sắc ký xuyên tâm: Mẫu được chấm vào tâm của một bản mỏng hình tròn rồi

được đặt trong bình triển khai (cũng hình tròn, như bình hút ẩm). Pha động được dẫn

đến tâm bản mỏng nhờ một sợi bấc và đẩy hỗn hợp sắc ký đi từ tâm bản ra ngoài theo

các vành tròn đồng tâm.

- Sắc ký gradient: để tách hiệu quả hơn, người ta tiến hành sắc ký nhiều lần

theo cùng một chiều, trong đó thay đổi dần dần độ phân cực của pha động.

Hình 4.7.

Sắc ký bản mỏng đi lên

Hình 4.8. Ví dụ về tách hỗn hợp lipid đơn giản và

phospholipids trong huyết thanh bằng kỹ thuật

TLC 1 chiều hiệu năng cao

CE: cholesterol esters; TG: triacylglycerols;

FFA: acid béo tự do; C: cholesterol;

PE: phosphatidylethanolamine;

PC: phosphatidylcholine;

SPH, sphingomyelin;

LPC: lysophosphatidylcholine

- 61 -

Sắc ký hai chiều: Mẫu sắc ký được chấm ở 1 góc của một bản mỏng hình vuông

và lần lượt triển khai theo hai chiều vuông góc với nhau hai hệ dung môi khác nhau

sao cho các vết cấu tử tách ra phải nằm ở phần bên trong của bản

Kỹ thuật này cho phép tách tốt hơn hỗn hợp phân tích nhằm tránh nhầm lẫn trong

nhận biết các vết chất.

Hình 4.9. Sắc ký bản mỏng hai chiều

Hình 4.10. Ví dụ về tách hỗn hợp lipid

phức tạp bằng kỹ thuật TLC 2 chiều

MGDG: monogalactosyldiacylglycerols;

DGDG: digalactosyldiacylglycerol;

SQDG: sulfoquinovosyldiacylglycerol;

DPG: diphosphatidylglycerol;

PG: phosphatidylglycerol;

PE: phosphatidylethanolamine;

PI: phosphatidylinositol;

PS: phosphatidylserine;

PC: phosphatidylcholine.

Cách phát hiện vết cấu tử sau khi sắc ký

- Đối với các cấu tử có màu: có thể nhận biết bằng mắt thường dễ dàng

- Đối với các cấu tử không màu: phát hiện bằng cách phun thuốc thử hiện màu

thích hợp (dung dịch I2, H2SO4 đặc;… ) thích hợp hay thuốc thử có khả năng tạo với

chất phân tích một hợp chất có khả năng phát huỳnh quang dưới tác dụng tia tử ngoại.

Định tính và định lượng

Định tính :

- 62 -

Mỗi cấu tử được đặc trưng bằng đại

lượng thừa số giữ (Rf: retention factor)

tương ứng với quãng đường di chuyển của nó

trên bản mỏng và được định nghĩa như sau:

với:

x – khoảng chạy của vết cấu tử nghiên

cứu, tính từ tuyến xuất phát đến tâm vệt chất

x0 - khoảng chạy của dung môi Hình 4.11. Xác định Rf của cấu tử

phân tích

Rf phụ thuộc vào bản chất của từng chất, bản chất của pha tĩnh và pha động. Do

đó, về nguyên tắc, có thể nhận biết các chất trong hỗn hợp sắc ký dựa vào việc so sánh

giá trị Rf xác định bằng thực nghiệm và giá trị đã được công bố.

Tuy nhiên, Rf còn thay đổi theo điều kiện sắc ký (nhiệt độ, độ ẩm,...) nên tốt hơn

là dùng phương pháp đồng sắc ký mẫu và chất chuẩn trên cùng một bản mỏng.

Định lượng :

Tiến hành đồng sắc ký mẫu và chuẩn (có nồng độ các chất cần định lượng đã biết

chính xác). Sau khi phát hiện các vết chất, có thể định lượng bằng các cách sau:

- Đo diện tích các vết bằng máy đo diện tích (densitometer): diện tích vết chất

tỷ lệ với hàm lượng của nó trong mẫu :

Do đó, có thể định lượng bằng phương pháp so sánh hay phương pháp đường

chuẩn

- Cạo các vết chất mẫu và chuẩn tương ứng và hòa tan bằng dung môi thích

hợp và định lượng chúng bằng các phương pháp phân tích công cụ nào đó (ví dụ: trắc

quang)

Ứng dụng

Phương pháp này thường dùng để nhận biết các cấu tử trong một hỗn hợp hay

kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất tách được.

Ưu điểm của phương pháp này là:

- nhanh, đơn giản

- phân giải khá tốt, có khả năng tách và nhận biết đồng thời nhiều cấu tử

- có độ lặp lại và độ chọn lọc cao

- 63 -

- Ngày nay, nhờ ghép nối với các thiết bị cho phép nhận biết và định lượng

các cấu tử tách được (ví dụ: TLC-HPLC), phương pháp này đã trở nên rất hiệu nghiệm

trong việc phân tích các mẫu sinh học.

IV.6. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ HIỆN ĐẠI

IV.6.1. Sắc ký lỏng hiệu năng cao

(HPLC : High performance Liquid Chromatography)

Để tăng hiệu quả tách của phương pháp sắc ký cột, cần tăng số đĩa lý thuyết của

cột bằng cách giảm kích thước các hạt pha tĩnh (xuống khoảng 3 - 5 μm). Tuy nhiên,

khi đó cột được nén rất chặt nên phải dùng hệ thống bơm cao áp để đẩy pha động đi

qua cột. Kết quả là hình thành một kỹ thuật sắc ký mới: kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp

(High pressure liquid chromatography) hay chính xác hơn là sắc ký lỏng hiệu năng

cao 2(High performance liquid chromatography), viết tắt là HPLC.

a) Thiết bị HPLC

Hình 412. Sơ đồ thiết bị HPLC đơn giản

Thiết bị HPLC gồm những bộ phận quan trọng sau: hệ thống bơm cao áp, cột sắc

ký, detector, hệ thống thu nhận và xử lý tín hiệu.

- Hệ thống bơm cao áp: có thể là một bơm hay nhiều bơm dùng để bơm pha động

từ bình chứa vào cột .

Các loại bơm cao áp hiện nay được chế tạo với kỹ thuật hiện đại nhằm đảm bảo

tốc độ dòng của pha động ổn định liên tục.

Có 2 chế độ bơm là đẳng áp (constant pressure) và đẳng dòng (constant flow)3.

Tùy thuộc vào chế độ rửa giải, có thể dùng một hay nhiều bơm .2 gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao chính xác hơn vì hiệu quả tách và phân tích cao của hệ thống HPLC không phải quyết định bởi áp suất cao mà do nhiều yếu tố : cấu tạo pha tĩnh nhồi cột, hệ thống detector, hệ thống bơm mẫu, hệ thống bơm cao áp,…3 Thường sử dụng chế độ constant flow hơn

- 64 -

+ Rửa giải isocratic: pha động có thành phần không đổi (được chuẩn bị sẵn trong

các chai đựng dung môi) chỉ cần dùng một bơm

+ Rửa giải gradient: thành phần pha động thay đổi trong quá trình rửa giải.

Có 2 trường hợp :

- Gradient áp suất thấp (low pressure gradient): các dung môi từ các bình chứa

được hút và trộn với nhau ở áp suất thấp trong bộ trộn dung môi (mixer) theo tỷ lệ xác

định (tỷ lệ này thay đổi trong quá trình sắc ký theo một chương trình lập sẵn, gọi là

chương trình gradient dung môi), sau đó mới được bơm qua cột bằng một bơm cao áp

- Gradient áp suất cao (high pressure gradient): mỗi dung môi trong thành phần

pha động được hút vào các bơm cao áp riêng rẽ, sau đó mới được trộn với nhau ở áp

suất cao trong bộ trộn dung môi theo tỷ lệ xác định (theo chương trình gradient dung

môi) rồi đi qua cột sắc ký cần nhiều bơm

Lưu ý: Để tránh làm hỏng cột sắc ký và xảy ra hiện tượng nhiễu nền,.trước khi

bơm dung môi pha động vào cột sắc ký, cần khử các bọt khi hòa tan trong pha động

(degass) bằng cách siêu âm, hút chân không, hay sục khí He (helium purge) qua dung

môi. Để tránh sử xâm nhập của không khí, nên giữ dung môi dưới khí quyển He.

- Bộ phận bơm mẫu (injector): có khả năng bơm lượng mẫu cỡ 0,1 – 100 ml với

độ lặp lại tốt (sai số không quá 0,2%) và phải làm việc dưới áp suất cao đến 7000 psi.

Muốn vậy, thường dùng valve bơm mẫu (injector valve) hay bộ phận bơm mẫu tự

động (autosampler)

Loại valve này có 6 cổng, với 1 vòng chứa mẫu có thể tích xác định tuỳ chọn (gọi

là loop, có nhiều loại 10, 20, 50, 100 μl,…). Một núm xoay cho phép chuyển đổi

valve từ vị trí nạp mẫu vào vòng chứa mẫu (LOAD) sang bơm mẫu vào cột (INJECT):

+ khi để núm xoay ở vị trí LOAD (Hình 4.13, a), nạp mẫu vào (dùng syringe

Hamilton), mẫu sẽ được chứa trong loop (thể tích mẫu thừa sẽ được thải ra ngoài).

+ Nạp mẫu xong, lập tức xoay núm vặn của valve (xoay cùng chiều kim đồng hồ)

sang vị trí INJECT (Hình 4.13, b) - đồng thời bấm nút START để hệ thống bắt đầu

tính thời gian phân tích. Khi đó mẫu sẽ được bơm cao áp đẩy qua cột sắc ký cùng với

pha động.

- 65 -

a) b)

Hình 4.13. Valve Rheodyne 6 cổng với các vị trí:

a) NẠP MẪU (LOAD); b) BƠM MẪU (INJECT)

Valve bơm mẫu bằng tay Rheodyne:

Hình 4.14 . Valve bơm mẫu bằng tay

Hệ thống bơm mẫu tự động (autosampler): đắt tiền, thường sử dụng khi phân tích

hàng loạt mẫu. Nó được kết nối với bộ vi xử lý cho phép điều khiển tự động quá trình

bơm mẫu.

Dung dịch mẫu chứa trong các lọ nhỏ đậy kín (vial) được hút với một thể tích

xác định bằng syringe đặc biệt và được đẩy vào loop có thể tích tương đối lớn

(~100 ml) trong một valve 6 cổng (tương tự như trong valve bơm mẫu bằng tay).

Hình 4.15. Agilent 1100 Series Autosampler

- 66 -

Việc chuẩn bị mẫu trong sắc ký lỏng cao áp rất quan trọng. Mẫu phải được chuẩn

bị ở dạng dung dịch. Các mẫu rắn nên được hòa tan trong dung môi thích hợp (tốt nhất

là bằng dung môi pha động), sau đó phải loại bỏ các hạt rắn không tan (bằng cách siêu

lọc hay ly tâm) trước khi bơm vào cột để tránh làm nghẹt hệ thống bơm mẫu hay cột

sắc ký. Những cấu tử cản trở quá trình phân tích cũng cần đươc loại bỏ bằng các

phương pháp chiết tách thích hợp.

- Cột sắc ký: là một ống thẳng thường làm bằng một loại thép không gỉ đặc biệt,

dài cỡ 3 – 25 cm, đường kính trong từ 2,6 – 4,6 mm (đối với cột phân tích) hay từ 6,4

– 12,7 mm (đối với cột sắc ký điều chế).

Hình 4.16. Cột sắc ký tiêu chuẩn

Các hạt pha tĩnh được nhồi vào cột và được giữ giữa 2 đĩa xốp ở hai đầu cột. Đối

với cột có đường kính trong 2,6 mm, kích thước hạt pha tĩnh thích hợp là 30 μm. Pha

tĩnh nhồi trong cột có thể có bản chất khác nhau tùy thuộc vào kỹ thuật tách sử dụng

(sắc ký hấp phụ rắn- lỏng, sắc ký phân bố lỏng – lỏng, sắc ký lỏng trao đổi ion, sắc ký

rây phân tử).

Để kết quả phân tích ổn định, đặc biệt khi phân tích định lượng hay phân tích các

polymer bằng kỹ thuật sắc ký rây phân tử, cột sắc ký thường được giữ trong lò điều

nhiệt (dao động nhiệt độ không quá 0,20C) chứa không khí nóng tuần hoàn với tốc độ

cao.

Để tăng tuổi thọ cột sắc ký, trước cột phân tích được lắp thêm một cột bảo vệ

(guard column) dài khoảng 1 cm để giữ những tạp chất không mong muốn và giảm bớt

tác động xấu đến cột do sự thay đổi áp suất đột ngột. Lưu lượng pha động không nên

vượt quá vài ml/phút.

- Detector: Sau khi qua cột sắc ký, các hợp chất trong mẫu phân tích sẽ được tách

thành từng phân đoạn và đi vào detector ghi nhận tín hiệu. Các tín hiệu thu được sẽ

được thể hiện dưới dạng các peak trên sắc ký đồ.

Các loại detector dùng trong HPLC bao gồm:

Detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến (UV-Vis detector): đo cường độ hấp thụ bức

xạ tử ngoại của pha động đi ra khỏi cột sắc ký (ở một bước sóng.hay nhiều bước sóng)

Loại detector này được dùng phổ biến nhất vì dễ sử dụng, ít phụ thuộc vào nhiệt

độ và lưu lượng pha động. Tuy nhiên, nó chỉ sử dụng cho các chất có khả năng hấp thụ

- 67 -

bức xạ tử ngoại – khả kiến trong vùng 190 - 600 nm (pha động sử dụng phải không

hấp thụ bức xạ trong vùng bước sóng nghiên cứu)

Để phát hiện những chất không hấp thụ tử ngoại, có thể chuyển chúng thành

dạng dẫn xuất có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại.

Detector chiết suất (RI detector: Refractive index detector): đo sự thay đổi chiết

suất của của pha động ra khỏi cột sắc ký. Detector này vạn năng nhưng kém nhạy,

không chọn lọc, thường dùng trong sắc ký rây phân tử..

Detector huỳnh quang (FD: Fluorescence detector): đo sự thay đổi cường độ

phát huỳnh quang của các hợp chất phân tích sau khi hấp thụ bức xạ tử ngoại thích hợp

của pha động sau khi qua cột tách. Detector này rất nhạy và rất chọn lọc

Ngoài ra, còn có những detector khác như detector điện hóa (electrochemical

detector), detector khối phổ (mass spectrometric detector)…, nhưng chúng ít thông

dụng hơn

- Hệ thống điều khiển và xử lý dữ liệu: là máy vi tính với các phần mền chuyên

dụng và giao diện (interface) cho phép điều khiển hoạt động của từng bộ phận trong hệ

thống như điều chỉnh chế độ bơm pha động (tốc độ dòng, chế độ rửa giải), nhiệt độ

cột, bước sóng bức xạ phát ra của detector, tính kết quả phân tích, lưu trữ dữ liệu …

b) Chọn pha tĩnh và pha động trong phân tích HPLC

Việc chọn pha tĩnh tùy thuộc bản chất hỗn hợp cần tách và cơ chế sắc ký lựa chọn

và theo nguyên tắc tương tự trong sắc ký cột cổ điển.

Đa số trường hợp là phân tích các hợp chất hữu cơ có độ phân cực yếu hay trung

bình cơ chế tách thường là sắc ký phân bố lỏng – lỏng.

Khi đó, có thể chọn 1 trong 2 loại cột sắc ký:

- cột pha thường (normal phase) nhồi bởi các hạt pha tĩnh phân cực (cấu tạo từ

silicagel ghép với các nhóm phân cực như aminopropyle, cyanopropyl, benzyl,…).

Khi đó, pha động phải không phân cực (ví dụ: hexan) hay kém phân cực (hỗn hợp

hexan với dung môi kém phân cực như CHCl3, CH2Cl2, THF, …)

Các cấu tử sẽ lần lượt được tách ra theo thứ tự tăng dần độ phân cực.

- cột pha ngược (reversed phase): nhồi bởi các hạt pha tĩnh không phân cực (cấu

tạo từ silicagel gắn với các dây nhánh không phân cực như C8 hay C18)

Khi đó, pha động phải là dung môi phân cực (ví dụ: metanol, acetonitril) hay hỗn

hợp của chúng với nước (ví dụ MeOH : H2O 40 : 60; …) hay phân cực trung bình

Các cấu tử sẽ lần lượt được tách ra theo thứ tự giảm dần độ phân cực.

c) Ứng dụng

Phương pháp HPLC có thể được dùng để phân tích các từ kém phân cực đến

phân cực, các hợp chất ion, vô cơ hay hữu cơ với phân tử lượng từ 300 – 2000 dalton,

tức là chiếm tới 80 % các ứng dụng trong kỹ thuật sắc ký. Vì vậy, phương pháp này

- 68 -

được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: hóa học, sinh hóa, môi trường, dược

phẩm, nông lương thực phẩm (ví dụ: kiểm tra độ tinh khiết của dược phẩm, phân tích

dư lượng và vết độc tố trong môi trường và thực phẩm,…).

IV.6.2. PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ (GC: Gas Chromatography)

Sắc ký khí là một trong các phương pháp tách và phân tích rất nhạy và hữu hiệu,

ra đời vào những năm 1940 nhưng thực sự bắt đầu phát triển mạnh từ năm 1952 nhờ

các công trình nghiên cứu của giáo sư Keulemann (Hà Lan). Ngày nay, nó là một

trong các công cụ được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực: hóa học, hóa sinh,

thực phẩm, dược phẩm, môi trường, và nhiều lĩnh vực khoa học kỹ thuật khác.

IV.6.2.1. Nguyên tắc:

Trong sắc ký khí, sự tách dựa trên sự khác nhau về độ tan của các cấu tử trong

hỗn hợp phân tích trong pha tĩnh lỏng được tráng lên bề mặt của một chất mang rắn.

trơ. Pha động là một khí trơ không tương tác với pha tĩnh và mẫu phân tích (ví dụ : H2,

N2, CO2, He hay Ar, được chứa trong một bom khí hay được tạo ra nhờ một máy sinh

khí), đóng vai trò là một khí mang (carrier gas) dẫn mẫu (ở trạng thái hơi) đi vào cột

sắc ký.

Quá trình xảy ra trong phân tích sắc khí khí như sau:

Mẫu phân tích được hóa hơi và được chuyển vào cột sắc ký nhờ dòng khí mang

(có áp suất từ 0,2 - 4 bars). Tại đó xảy ra quá trình sắc ký, tách hỗn hợp phân tích

thành các cấu tử riêng rẽ. Sau khi rời khỏi cột tách, các cấu tử lần lượt đi vào detector

ở các thời điểm khác nhau, tại đó chúng được ghi nhận như những tín hiệu điện. Các

tín hiệu này được khuếch đại rồi chuyển sang máy ghi và xử lý dữ liệu (vẽ sắc ký đồ,

tính diện tích các peak, lưu kết quả, in kết quả, …).

Cũng tương tự như trong phương pháp HPLC, dựa vào sắc ký đồ thu được có thể

định tính và định lượng các cấu tử trong hỗn hợp phân tích như sau :

- Định tính : dựa vào thời gian lưu của cấu tử nghiên cứu (so sánh với thời gian

lưu của mẫu chuẩn; phương pháp đồng sắc ký)

- Định lượng: dựa vào diện tích peak (hay chiều cao peak) của cấu tử nghiên cứu

(phương pháp so sánh; phương pháp đường chuẩn; phương pháp thêm)

IV.6.2.1. Thiết bị GC

Hình 4.16 trình bày sơ đồ cấu tạo (a) và hình ảnh (b) của thiết bị GC.

- 69 -

(a) Sơ đồ thiết bị GC

(b) Thiết bị GC ghép nối với máy tính

Hình 4.17. Sơ đồ cấu tạo (a) và hình ảnh (b) của thiết bị GC

Thiết bị GC gồm các bộ phận chính sau đây:

+ Buồng bơm mẫu (Injector) có các chức năng sau:

- hóa hơi mẫu (nếu mẫu ở trạng thái lỏng)

- đưa mẫu vào đầu cột sắc ký nhờ dòng khi mang.

Mẫu được bơm vào injector bằng một microsyringe có kim dài và nhọn, xuyên

qua một septum cao su và được khí mang đưa vào buồng bay hơi (vapourisation

chamber). Tại đó, mẫu sẽ được hóa hơi ngay lập tức và được dòng khí mang đưa vào

đầu cột sắc ký. Nhiệt độ hóa hơi mẫu phải cao hơn 500C so với nhiệt độ hóa hơi của

cấu tử khó bay hơi nhất trong mẫu.

Để đạt độ phân giải tốt (các peak của sắc ký đồ sắc nhọn, không bị giãn rộng),

lượng mẫu đưa vào cột không được lớn quá. Đối với các loại cột mao quản (là loại cột

thông dụng nhất trong sắc ký khí hiện nay) thì thể tích mẫu bơm vào chỉ cần khoảng

10 – 3 μl.

- 70 -

a) b)

Hình 4.18. Microsyringe (a) và injector (b) dùng trong sắc ký khí

Có thể chọn 1 trong 2 chế độ bơm mẫu sau đây :

- split (chia dòng): sử dụng khi lượng mẫu bơm vào lớn quá. Ở chế độ này, mẫu

sau khi hóa hơi sẽ được chia thành 2 dòng theo tỷ lệ chọn lựa (sao cho sắc ký đồ đạt độ

phân giải tốt), một phần sẽ theo khí mang vào đầu cột sắc ký, phần còn lại sẽ được khí

mang đẩy ra ngoài (qua split oulet)

- splitless (không chia dòng): sử dụng khi lượng mẫu phân tích nhỏ hay vừa

phải.

+ Cột sắc ký: Hiện nay thường dùng cột mao quản FSOT (Fused Silica Open

Turbular Column) có đường kính trong khoảng 0,1- 0,35 mm và dài 15 - 100 m. Cột là

một ống mao quản bằng silicagel, bên trong phủ một màng mỏng dày 0,25 - 0,5 mm

(thực chất màng này là dây nhánh hữu cơ ghép trên bề mặt silicagel bởi liên kết hoá

học), bên ngoài phủ bằng một lớp polyimid. Nhờ vậy, cột rất bền đối với các tác nhân

lý - hóa học và rất dẻo (cột dài có thể cuộn thành vòng xoắn, rất gọn). Ngoài ra, cột

mao quản còn có những ưu điểm sau:

- hiệu quả tách rất cao (cho phép tách những hỗn hợp rất phức tạp với độ

phân giải cao)

- lượng mẫu phân tích ít ; lưu lượng khí mang sử dụng nhỏ

Hình 4.19. Cấu tạo của cột mao quản dùng trong sắc ký khí

Trong sắc ký khí, nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả tách, do đó để đạt kết

quả phân tích chính xác, cột phải được đặt trong một lò điều nhiệt (sai số nhiệt độ

không quá 0,10C). Nhiệt độ tối ưu của lò phụ thuộc vào điểm sôi của các hợp chất

- 71 -

trong mẫu phân tích. Nhiệt độ lò thường cao hơn một ít so với nhiệt độ sôi của cấu tử

khó bay hơi nhất, nhưng phải thấp hơn nhiệt độ tối đa cho phép của cột khoảng vài

chục độ.

Lưu ý :

- Nhiệt độ cột càng cao thời gian sắc ký càng ngắn nhưng hiệu quả tách

giảm đi; nhiệt độ thấp có thể cho kết quả tách tốt hơn nhưng thời gian sắc ký kéo dài.

Do vậy, cần khảo sát để chọn nhiệt độ tối ưu cho quá trình tách.

- Nếu mẫu chứa các hợp chất có điểm sôi rất khác nhau thi nên rửa giải bằng

dùng chương trình nhiệt (nhiệt độ cột tăng liên tục hay từng bước trong quá trình tách)

+ Detector: có nhiều loại, với độ nhạy và độ chọn lọc khác nhau.

Việc chọn detector chủ yếu phụ thuộc bản chất mẫu phân tích, ngoài ra còn phụ

thuộc bản chất khí mang sử dụng.

Bảng sau trình bày đặc tính của một số detector thông dụng.

Detector LoạiKhí

sử dụngĐộ nhạy và độ chọn lọc

Khả năng phát hiện

Khoảng tuyến tính

Ion hóa ngọn lửa

(Flame Ionization

Detector : FID)

Phụ thuộc dòng

khối lượng

(Mass flow

dependent)

H2 và không

khí

Vạn năng cho hầu hết các

hợp chất hữu cơ có nhóm

-CH2 - ; độ nhạy cao

100 pg 107

Bắt giữ điện tử

(Electron capture

detector: ECD)

Phụ thuộc nồng

độ (Concentration

dependent)

Khí Ar

Đặc trưng và nhạy, dùng

cho các hợp chất hữu cơ

chứa các nguyên tố âm

điện (N, Cl, P, ..) phân

tích thuốc trừ sâu, thuốc

diệt cỏ, …

50 fg 105

Nitrogen – Phosphore

detector: NPD)

Phụ thuộc dòng

khối lượng

(Mass flow

dependent)

H2 và không

khí

Hợp chât chứa N, P (phân

tích dược phẩm, dư lượng

thuốc trừ sấu, …)

10 pg 106

- 72 -

Hình 4.20. Detector FID

Hình 4.20. là sơ đồ detector FID.

Các cấu tử ra khỏi cột sắc ký được

trộn với khí H2 (khí mang) và không

khí, bị đốt cháy ở nhiệt độ cao, tạo

thành dòng ion và electron dẫn điện.

Các ion và electron này chuyển về các

bản cực trái dấu nằm ở 2 phía của

ngọn lửa (hiệu thế giữa 2 bản cực này

khoảng 250 – 300 V) và sinh ra dòng

điện. Dòng này được khuếc đại và ghi

nhận thành các tín hiệu dưới dạng

peak sắc ký.

Ngoài ra, còn có những loại detector khác như detector quang kế ngọn lửa

(Flame Photometric Detector – FPD), detector khối phổ (Mass Spectrometric Detector

– MS)

b) Ưu, nhược điểm - Ứng dụng:

Phương pháp sắc ký khí là phương pháp hữu hiệu để phân tích những hỗn hợp

phức tạp trong thời gian rất ngắn. So với phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao,

phương pháp này có độ nhạy cao hơn, ít tốn kém hơn.

Tuy nhiên, phương pháp này chỉ áp dụng để phân tích các hợp chất dễ bay hơi

(ví dụ các ester, hợp chất trong sản phẩm hóa dầu, hương liệu,…) hay có khả năng

chuyển thành dẫn xuất dễ bay hơi (như các acid béo, …).

Đối với những hợp chất kém bền nhiệt (như các hợp chất sinh học) thì không

thể áp dụng phương pháp này mà phải dùng phương pháp HPLC.

Phương pháp GC được ứng dụng rộng rãi để phân tích thực phẩm (ví dụ: thành

phần hương liệu, acid béo trong thực phẩm; thành phần acid amin,…). Đặc biệt, dùng

kỹ thuật GC-MS cho phép phân tích dư lượng độc tố ở mức ppb (ví dụ: 3-MCPD trong

nước tương, nước mắm, phân tích dư lượng kháng sinh, thuốc bảo vệ thực vật,...trong

thực phẩm.).

- 73 -

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt:

1) Nguyễn Thị Thu Vân, Phân tích định lượng, 2004, ĐHQG TP. Hồ Chí Minh.

2) Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết của phép đo phổ hấp thụ phân tử UV-Vis, 1994,

ĐHQG Hà Nội.

3) Phạm Luận, Cơ sở lý thuyết phương pháp phân tích phổ hấp thụ nguyên tử,

1999, ĐHQG Hà Nội.

4) J. H. Kenedy, Cơ sở hóa học phân tích - Ch.19-Phương pháp sắc ký, 1994,

(Hoàng Minh Châu dịch)

5) Phạm Hùng Việt, Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký khí, 2003, NXB.

Khoa học và Kỹ thuật

Tiếng Anh

6) L. Ebdon, E. H. Evans; A. Fisher, S. J. Hill, An Introduction to Analytical

Atomic Spectrometry, 1998, J. Wiley.

7) Marvin C. McMaster, 2003, HPLC A Practical User’s Guide, 2 Ed. 2007, J.

Wiley

8) Harold M.; Mc. Nair; James M. Miller, Basic Gas Chromatography, 1997,

J.Wiley

Chuong 1 2 3

Documents

Transcript of Chuong 1 2 3