Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.
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Chip a
DNA: un
esempio
pratico
Alessia StellLaboratorio A. Maggi9 Novembre 2010
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Cosa sono
Come si producono
Microarray e Tiling Arrays
Quali utilizzi hanno
Chip a DNA
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• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
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• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
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• I chip a DNA sono costituiti da un array di microscopiche aree, ciascuna contenente 107 sonde identiche di 20-50 pb, covalentemente fissate al supporto (vetro, plastica, silicio o beads di polistirene)
• Sfruttano una tecnica di ibridazione inversa: le probe sono fissate al supporto (in una posizione nota), mentre i frammenti di DNA da analizzare (target) sono marcati con biotina o con marker fluorescenti e ibridizzati alle sonde
• Il DNA target, legato alla sonda, può essere identificato utilizzando uno scanner, capace di rivelare il segnale emesso
Cosa sono i chip a DNA
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• FOTOLITOGRAFIA (in situ):Fasci di luce e maschere fotolitografiche sono utilizzati per produrre le sonde direttamente sul supporto;
• SPOTTED MICROARRAYS:Le sonde sono sintetizzate prima della loro deposizione sull’array, e solo successivamente “spottati” sul supporto.
Come si producono
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Microarray e Tiling array
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: le sonde utilizzate rappresentano porzioni di trascritti noti
Gene 1 Gene 2
• TILING ARRAYS: coprono l’intero genoma o porzioni definite di genoma (tutti i promotori, solo alcuni cromosomi…)
Gene 1 Gene 2
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Quali utilizzi hanno
• MICROARRAY DI ESPRESSIONE: utilizzati quasi esclusivamente per l’analisi dei livelli di espressione di trascritti noti, confrontata in diverse condizioni (es. controllo-trattamento, cellula sana-cellula tumorale etc.)
Gene 1 Gene 2
• TILING ARRAYS: Utilizzati per• analisi unbiased dell’espressione genica (geni non noti e miRNA);• ChIP-on-chip (chromatin immunoprecipitation on a chip)• Array CGH (comparative genomic hybridization): tecnica usata in diagnostica per l’individuazione di copy number variations e anomalie del DNA
Gene 1 Gene 2
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da dove siamo partiti
dove volevamo arrivare
quali tecnologie abbiamo usato
I gruppi sperimentali
Il mio
esperimento
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• Gli estrogeni sono i principali ormoni sessuali nella donna ed influenzano la fisiologia femminile sotto vari aspetti
• Gli estrogeni permeano nelle cellule e legano il loro specifico recettore, una proteina intracellulare che , una volta attivata, è in grado di dimerizzare e attivare la trascrizione di specifici geni
Da dove siamo partiti
Osso
Cervello
Sistema Riproduttivo
Sistema Cardiovascolare
Osso
Cervello
Sistema Riproduttivo
Sistema Cardiovascolare
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• Il modello animale utilizzato nel nostro laboratorio per lo studio dell’attivazione del recettore degli estrogeni in vivo è il modello ERE-Luc
Da dove siamo partiti
Estrogen Receptor Responsive Element
Luciferasi
Estrogen Receptor Responsive Element
LuciferasiFotoni
Luciferina+ ATP
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• Con questo modello abbiamo osservato l’attività del recettore degli estrogeni in condizioni fisiologiche nell’animale femmina ciclante, e ci siamo focalizzati sullo studio del ruolo del recettore degli estrogeni nel fegato
Da dove siamo partiti
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
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dove volevamo arrivare
Femmine adulte ciclanti
Gravide
> 22 mesi (menopausa)
Prepuberi
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quali tecnologie abbiamo usato
Tiling Arrays
Analisi delle regioni di binding sulla cromatina di ERalfa nelle due diverse condizioni
Dove si localizza ERalfa?La sua localizzazione è influenzata dagli
estrogeni circolanti?
Microarray di espressione
Analisi delle differenze di espressione genica nelle due diverse condizioni
I livelli di estrogeni circolanti influenzano l’espressione genica? Quali sono i geni
differenzialmente espressi?
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40 pg/ml
80 pg/ml
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1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
I gruppi sperimentali
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
40 pg/ml
80 pg/ml
10 pg/ml
1500 pg/ml
CONDIZIONE FISIOLOGICA OVARIECTOMIA + induzione con ESTRADIOLO
METESTRO
Bassi livelli di estrogeno circolante
PROESTRO
Alti livelli di estrogeno circolante
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Workflow
Output
Analisi dei Dati
Risultati
Microarray
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Workflow
Congelamento
Estrazione RNA
RetrotrascrizioneMic
roarr
ays
Marcatura Ibridazione
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Output
Quasi 40.000 trascritti conosciuti
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Output
I dati grezzi vengono raccolti in un file: File CELE normalizzati: file RMA
… e analizzati grazie all’aiuto del team di bioinformatici
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Output
Met > Pro
Met < Pro
Met
Pro
Live
llo E
2
Lista dei geni individuati
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Analisi dei dati
Come otteniamo informazioni da questa lista di geni?
Analizzandoli uno ad uno…. … o utilizzando specifici software che consentono di ottenere in
modo semplice informazioni sulla funzione dei geni identificati
CATEGORIE DI GENE ONTOLOGY
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• GENE ONTOLOGY: può essere considerato una specie di enciclopedia che raccoglie tutte le informazioni disponibili sui geni noti, attraverso delle definizioni e delle parole chiave condivise.
• E’ suddiviso in 3 categorie:• Processi biologici • Funzioni molecolari • Componenti cellulari
Un prodotto genico ha una o più funzioni cellulari, può essere coinvolto in diversi processi biologici e infine potrebbe essere associato a diversi compartimenti cellulari.
http://www.geneontology.org/
http://www.geneontology.org/GO.tools.browsers.shtml
http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp
Analisi dei dati
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Risultati
Met > Pro
Met < Pro
REGOLAZIONE della TRASCRIZIONE dell’mRNA(pVal=4.80 e-2)ILM
BIOSINTESI DEI LIPIDI e COLESTEROLO(pVal=5.10 e-6)ABCDEF
DETOXIFICATION(pVal=1.20 e-4)GH
16%
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Risultati
Ciclo Krebs
B
X
J
C
D
….
TG
Biosintesi degli acidi grassi Biosintesi del colesterolo
Z
W
Y
E
F
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Workflow e messa a punto
Output
Analisi dei dati
Risultati
ChiPOnchip
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Workflow e messa a punto
Sonicazione
Ch
IP-c
hip
Crosslinking
500
100
Immunopre-cipitazione DNA
mRNA
Binding RegionsDNA
mRNA
Binding Regions
Y
Crosslinking inversoPurificazione DNA
LM-AmplificationFrammentazione
Marcatura Ibridazione
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Output
Cutoff
1. Rilevazione del segnale relativo alle sequenze Chipped, e posizionamento sul DNA
2. Definizione dei picchi relativi alle regioni di binding tramite specifico algoritmo
3. Normalizzazione e analisi dei picchi che superano il limite di cutoff
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Output
Chr 10
23476246 23477332
BED file
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Analisi dei dati
http://cistrome.dfci.harvard.edu/ap/
Analizzandoli uno ad uno…. … chiedendo l’aiuto dei bioinformatici che hanno creato di sicuro qualche software che ti sarà
d’aiuto
![Page 30: Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022070312/5542eb4f497959361e8bf26d/html5/thumbnails/30.jpg)
Analisi dei dati
Chr 10> > > >
• Dove si localizzano (cromosomi)
• Dove si localizzano rispetto a geni noti
• Quali sequenze legano
• Quali sono i geni che si trovano nelle vicinanze?
• http://genome.ucsc.edu/
![Page 31: Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022070312/5542eb4f497959361e8bf26d/html5/thumbnails/31.jpg)
Risultati
553 siti di binding
444 siti di binding
15%
![Page 32: Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022070312/5542eb4f497959361e8bf26d/html5/thumbnails/32.jpg)
Risultati
18%
51%
27%
12%
58%
28%
Proestro Metestro
Geni che presentano un sito di binding a METESTRO nell’intorno di 20kb
Metabolismo dei lipidi e del colesterolo (pVal=1.30 e-3)Reagolazione dell’attività riproduttiva (pVal=1.40 e-3)
Geni che presentano un sito di binding a PROESTRO nell’intorno di 20kb
Regolazione dell’espressione genica (pVal=8.50 e-5)Regolazione dell’attività riproduttiva (pVal=3.90 e-4)
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Significato biologico
Real time PCR
Esperimenti sull’animale
Come
vengono
utilizzati i
dati ottenuti
nei due
esperimenti?
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Real Time PCR
FASN
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1
2
3
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ACLY
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3
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* ***
MVD
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2
3
4
5 ***
ELOVL6
P E M D0
1
2
3***
***
PMVK
P E M D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5 ***
DHCR7
P E M D0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5***
***
***
Fatty acid biosynthetic pathway Cholesterol biosynthetic pathway
• I geni epatici coinvolti nel metabolismo degli acidi grassi e del colesterolo mostrano un andamento regolare durante il ciclo regolato dalla fluttuazione di estrogeni circolanti
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Real Time PCR• I geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna
FASN
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![Page 36: Chip a DNA: un esempio pratico Alessia Stell Laboratorio A. Maggi 9 Novembre 2010.](https://reader036.fdocument.pub/reader036/viewer/2022070312/5542eb4f497959361e8bf26d/html5/thumbnails/36.jpg)
Successivi esperimenti sull’animale
Femmine adulte ciclanti
Gravide
> 22 mesi (menopausa)
Prepuberi
• Il livello di espressione dei geni epatici coinvolti nel metabolismo lipidico e del colesterolo appaiono sregolati durante le diverse fasi fisiologiche della vita di una donna
• Si modifica anche il contenuto di lipidi del sangue e del fegato?
• Qual è la conseguenza biologica?
• Come può essere ripristinato il profilo lipidico corretto?