Charakterisierung Styrol exponierter Arbeitnehmer mittels ...

Charakterisierung Styrol exponierter Arbeitnehmer mittels

biochemischem Effekt- und Dosismonitoring anhand

aromatischer Carbonsäuren,

Mercaptursäuren und Hämoglobinaddukten

Von der Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften der

RWTH Aachen University zur Erlangung des

akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Diplom-Biologe

Marcus Reska

aus Geilenkirchen

Berichter:

Universitätsprofessor Dr. med. Thomas Kraus

Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Andreas Schäffer

Tag der mündlichen Prüfung: 26.09.2011

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.

Widmung

Meinen Eltern

Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. Thomas Kraus gilt mein besonderer Dank. Nicht nur für seine

wissenschaftliche Unterstützung, aufmunternden Worte und Betreuung dieser Arbeit,

sondern auch dafür, deren Durchführung am Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin

Aachen ermöglicht zu haben.

Ich bedanke mich herzlich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Andreas Schäffer von der Fakultät

für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften für die Betreuung und die

Begutachtung dieser Arbeit.

Ebenso möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. rer. nat. Hans Toni Ratte bedanken, der sich

bereit erklärt hat, sich als weiterer Prüfer seitens der Fakultät für Mathematik,

Informatik und Naturwissenschaften zur Verfügung zu stellen.

Besonderer Dank gilt auch Herrn Dr. rer. nat. Thomas Schettgen für die thematische

Betreuung dieser Arbeit und der Beratung in allen chemischen und analytischen

Fragestellungen.

Ich möchte mich ebenfalls sehr herzlich bei meinen Kollegen und Freunden Dr. Elke

Ochsmann und Dr. Jessica Lang für die immer willkommenen Ratschläge, Disskussionen

und erheiternden Worte bedanken.

Für ihr immer offenes Ohr, ihre Unterstützung und der Versorgung mit guter Laune im

Labor möchte ich mich bei meinen Kollegen Dr. Angela Tings, Jens Bertram, Petra Dewes,

Kerstin Gerards und Anne Alt bedanken.

Rosi Kohl möchte ich danken für die immer wiederkehrende Versorgung mit Keksen und

allen erdenklichen Dingen um nicht nur im Labor sondern auch im Büro ein „zweites zu

Hause“ vorzufinden.

Ich möchte mich bei allen Mitgliedern des Institutes für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin

für die gute und erfahrungsreiche interdisziplinäre Zusammenarbeit bedanken.

Natürlich obliegt ein grosser Dank den kooperierenden Firmen und deren Geschäftsleitung,

die nach längerer Suche gefunden werden konnten und mit der Bereitstellung von

Räumlichkeiten und dem Zugang zu ihren Mitarbeitern unterstützend zur Seite standen.

Ebenfalls grosser Dank an die freiwilligen Probanden, für die Teilnahme an den

Untersuchungen.

Mein Dank auch an meine Freunde am Universitätsklinikum Dr. Marcel Esser und Agnes

Dreier für den institutsübergreifenden fachlichen als auch privaten Austausch.

Ich möchte mich sehr bei meiner guten Freundin Dr. Kristin Michael für private

Unterstützung mittels amerikanischer Leckereien, tollen redsamen Abenden und

motivierenden Worten bedanken.

Besonders danke ich meinen Eltern und dem Rest meiner Familie.

Mein herzlichster Dank an meine Frau Anna. Danke, dass Du da warst und bist.

Die grössten Ereignisse - das sind nicht unsre lautesten, sondern unsre stillsten Stunden

Friedrich Nietzsche

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung ............................................................................................................. 1

2 Grundlagen .......................................................................................................... 3

2.1 Styrol ..................................................................................................................... 3

2.1.1 Stoffeigenschaften ................................................................................................. 3

2.1.2 Entdeckung ............................................................................................................ 4

2.1.3 Belastung und Vorkommen ................................................................................... 4

2.1.4 Metabolismus und Toxikologie ............................................................................. 6

2.1.5 Suszeptibilität ........................................................................................................ 9

2.2 Schadstoffexposition und ihre Erfassung am Arbeitsplatz.................................. 10

2.2.1 Biomarker der Exposition.................................................................................... 10

2.2.2 Monitoring von Gefahrstoffexpositionen ............................................................ 10

2.2.3 Ambient Monitoring ............................................................................................ 11

2.2.4 Dosismonitoring .................................................................................................. 12

2.2.5 Biochemisches Effektmonitoring ........................................................................ 14

2.2.6 Biologisches Effektmonitoring............................................................................ 15

2.2.6.1 Mercaptursäuren als Dosismarker der inneren Exposition .............................. 15

2.2.6.2 Addukte als biochemische Effektmarker ......................................................... 16

Hämglobinaddukte als Langzeitmarker ........................................................... 17

Humanes Hämoglobin ..................................................................................... 18

Entstehung eines Hämoglobinaddukts ............................................................. 19

2.2.7 Cotinin als Marker des Raucherstatus ................................................................. 22

3 Zielsetzung der Arbeit....................................................................................... 23

4 Analytik der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren im Urin ...................... 25

4.1 Grundlage des Verfahrens ................................................................................... 25

4.2 Geräte, Chemikalien, Lösungen .......................................................................... 25

4.2.1 Geräte................................................................................................................... 25

4.2.2 Chemikalien......................................................................................................... 26

4.2.3 Lösungen ............................................................................................................. 27

4.3 Probennahme und Probenaufbereitung................................................................ 29

4.3.1 Probenaufbereitung des Urins ............................................................................. 29

4.4 Instrumentelle Arbeitsbedingungen..................................................................... 30

4.4.1 Hochleistungschromatographische Arbeitsbedingungen .................................... 30

4.4.2 Identifizierung der Analyte.................................................................................. 32

Inhaltsverzeichnis

4.4.3 Massenspektrometrische Arbeitsbedingungen .................................................... 33

4.5 Kalibrierung und Ermittlung der Analyseergebnisse .......................................... 34

4.6 Standardisierung und Qualitätssicherung ............................................................ 35

4.7 Beurteilung des Verfahrens ................................................................................. 35

4.7.1 Präzision in Serie und von Tag zu Tag................................................................ 35

4.7.2 Richtigkeit ........................................................................................................... 36

4.7.3 Frier-Auftau-Stabilität der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren...................... 38

4.7.4 Methodenspezifische Störeinflüsse ..................................................................... 39

4.8 Applikabilität der Methode.................................................................................. 40

4.9 Diskussion der Methode ...................................................................................... 42

5 Analytik der Hämoglobinaddukte im Blut...................................................... 43

5.1 Grundlage des Verfahrens............................................................................................... 43

5.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen................................................................................ 44

5.2.1 Geräte.............................................................................................................................. 44

5.2.2 Chemikalien .................................................................................................................... 45

5.2.3 Lösungen......................................................................................................................... 45

5.3 Probennahme und Probenaufbereitung ........................................................................... 48

5.3.1 Gewinnung des Erythrozythämolysats ........................................................................... 48

5.3.2 Globinisolierung ............................................................................................................. 48

5.3.3 Herstellung der Kalibrierstandards ................................................................................. 49

5.3.4 Derivatisierung des Globins............................................................................................ 50

5.3.5 Acetylierung des Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates .......................................... 50

5.4 Gaschromatographische Arbeitsbedingungen................................................................. 52

5.5 Analytische Bestimmung................................................................................................ 53

5.6 Kalibrierung .................................................................................................................... 57

5.7 Berechnung der Analyseergebnisse ................................................................................ 59

5.8 Standardisierung und Qualitätssicherung ....................................................................... 59

5.9 Beurteilung des Verfahrens............................................................................................. 59

5.9.1 Präzision in Serie und von Tag zu Tag ........................................................................... 59

5.9.2 Richtigkeit....................................................................................................................... 61

5.9.3 Methodenspezifische Störeinflüsse................................................................................. 62

5.10 Diskussion der Methode ................................................................................................. 64

Inhaltsverzeichnis

6 Analytik der aromatischen Carbonsäuren...................................................... 65

6.1 Grundlage des Verfahrens............................................................................................... 65

6.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen................................................................................ 65

6.3 Geräte.............................................................................................................................. 65

6.4 Chemikalien .................................................................................................................... 66

6.5 Lösungen......................................................................................................................... 67

6.6 Probennahme und Probenaufarbeitung ........................................................................... 68

6.6.1 Probenaufbereitung......................................................................................................... 68

6.7 Gaschromatographische Arbeitsbedingungen................................................................. 69

6.8 Analytische Betimmung ................................................................................................. 70

6.9 Kalibrierung und Berechnung der Analyseergebnisse.................................................... 70

7 Humanbiomonitoring belasteter Personengruppen und der

Allgemeinbevölkerung....................................................................................... 73

7.1 Kollektivbeschreibung .................................................................................................... 73

7.1.1 Beruflich belastete Personengruppen.............................................................................. 73

7.1.2 Kontrollkollektiv der Allgemeinbevölkerung................................................................. 74

7.1.3 Auswertung..................................................................................................................... 74

7.2 Ergebnisse des Humanbiomonitorings ........................................................................... 76

8 Diskussion des Humanbiomonitorings ............................................................ 94

9 Zusammenfassung ........................................................................................... 101

10 Abbildungsverzeichnis .................................................................................... 105

11 Tabellenverzeichnis ......................................................................................... 109

12 Literaturverzeichnis ........................................................................................ 111

13 Anhang.............................................................................................................. 121

13.1 Information und Einverständniserklärung für Probanden............................................. 121

13.2 Fragebogen für Probanden............................................................................................ 123

13.3 Veröffentlichungen ....................................................................................................... 124

Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis 4-ViP 4-Vinylphenol

3,4 SO Styrol 3,4-oxid

% Prozent

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

Abb. Abbildung

AGW Arbeitsplatzgrenzwert

AUC area under curve

BAR Biologischer Arbeitsstoff-Referenzwert

BAT Biologischer Arbeitsstoff-Toleranzwert

BER Basenexcisionsreparatur

BGW Biologischer Grenzwert

BLW Biologischer Leitwert

BMAS Bundesministerium für Arbeit und Soziales

bspw. beispielsweise

bzw. beziehungsweise

ChemG Chemikaliengesetz

cm Zentimeter

CYP P450 Cytochrom P450 Monooxygenasen

DE Deutschland

DFG Deutsche Forschungsgesellschaft

DGAUM Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin

DNA Desoxyribonucleinsäure (engl.: deoxyribonucleicacid)

DNA-ssb DNA Einzelstrangbrüche (engl. DNA single strand breaks)

EI electron impact

EKA Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe

EPHX1 Epoxidhydrolase 1

ERCC Gen des DNA Reparatursystems

(engl. excision repair cross-complementing)

Fa Firma

FDA Food and Drug Administration

FPB(-G) 4-Fluoryphenetylbromid (-Globin)


g Gramm

GC Gaschromatographie

GefStoffV Gefahrstoffverordnung

GfPI Glasfaserverstärkende Plastikindustrie

Glu Glutamat

Gly Glycin

GSH Glutathion

GST Glutathion-S-Transferase

Hb Hämoglobin

HbA Hämoglobinaddukt

Hb-Val Valin Addukt des Hämoglobins

HPB(-G) 4-Hydroxyphenetylbromid (-Globin)

HPV 2-Hydrox-2-Phenylethyl-Valin

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(engl.: high performance liquid chromatography

HPRT Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase

i.d.R. in der Regel

IARC International Agency for Research on Cancer

IFCC International Federation of Clinical Chemistry

ISTD interner Standard

kDa Kilodalton

kg Kilogramm

Kon Kontrollen

l liquid

L Liter

LC/MS/MS Tandem-Massenspektrometrie

m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis

MA Mandelsäure (engl.: mandelic acid)

MAK maximale Arbeitsplatzkonzentration

mg Milligramm

min Minute(n)

ml Milliliter

MSD massenselektiver Detektor

NATs N-Acethyltransferasen


NER Nukleotidexcisionsreparatur

nm Nanometer

NS Nachschicht

OSHA Occupational Safety and Health Administration

PE Phenoxyethanol

PFPITC Pentafluorphenylisothiocyanat

PFPTH Pentafluorphenylthiohydantoin

PGA Phenylglyoxylsäure (engl.: phenylglyoxylic acid)

PHEMA Phenylhydroxyethylmercaptursäuren

(engl.: phenylhydroxyethylmercapturic acids)

pmol Picomol

ppm parts per million

RT Raumtemperatur

R(t) Retentionszeit

RAM Restricted Access Material

RT Raumtemperatur

S Styrol

s solid

s. siehe

s.u. siehe unten

SIM single ion monitoring

SG Styrolglykol

SO Styrol 7, 8-Oxid

t Zeit

Tab. Tabelle

TRGS Technische Richtlinien für Gefahrstoffe

TRK technische Richtkonzentration

vgl. vergleichend

Vol% Volumenprozent

vs versus

VS Vorschicht

WFR Wiederfindungsrate

XRCC Gen des DNA Reparatursystems

(engl. X-ray repair cross-complementing)

Einleitung 1

1 Einleitung

Die meiste Zeit des Tages verbringt der Mensch an seinem Arbeitsplatz. Hier sollte er

Bedingungen vorfinden, in denen auf ihn bezogene Gesundheits- und Sicherheitsrisiken

kontrolliert und bestmöglich eliminiert werden. Die praktische Umsetzung stellt, in diesem

Fall an den Arbeitgeber, höchste Anforderungen, denn die Gestaltung des Arbeitsplatzes,

ist vielschichtig. Komplex sind zahlreiche Gesetzestexte, Richtlinien und Verordnungen

und zu klein sind oft die finanziellen Mittel bspw. für neuere Gerätschaften oder

Umbaumassnahmen. Notwendiges medizinisches, biochemisches und technisches

Fachwissen ist darüber hinaus beim Arbeitgeber meist nicht vorhanden. Diesen Aufgaben

unter Berücksichtigung aller Gesundheits- und Sicherheitsaspekte gerecht zu werden, ist

daher Ziel der Arbeitsmedizin. Sie ist Schnittstelle zwischen Betrieb und Individuum mit

Ihrem zentralen Schwerpunkt der Verhältnis- und Verhaltensprävention.

Gerade wenn im Betrieb die Exposition und die Gesundheitsgefährdung überprüft werden

soll, stellt die Arbeitsmedizin eine wichtige Beratungsstelle für Arbeitgeber und

Arbeitnehmer dar.

Gefahrstoffe sind allgegenwärtig. Wir nehmen sie in Form des kanzerogenen Acrylamids

mit der Nahrung oder über den Zigarettenrauch auf (Schettgen et al, 2002), sind u.a. in

vielen alten Gebäuden einer kontinuierlichen Belastung mit polychlorierten Biphenylen

ausgesetzt und müssen uns Gedanken machen, ob die Nanotechnologie revolutionierenden

carbon-nanotubes mit ihrem asbestähnlichen Pathomechanismus die Mesotheliom-

inzidenzen des 21. Jahrhundert bestimmen werden (Poland et al, 2008). Für etwa 15% der

europäischen Arbeitnehmer ist der direkte Umgang mit Gefahrstoffen Teil ihrer täglichen

Arbeit. In der EU kommt es jährlich zu geschätzten 167.000 berufsbedingten Todesfällen,

von denen ~ 44% auf den Gebrauch und die Nutzung von Gefahrstoffen zurückzuführen

sind (OSHA, 2009). Hier besteht grosses Potential für Prävention.

Im Teilgebiet der klinisch orientierten arbeitsmedizinischen Toxikologie sind

Präventionsmassnahmen und Forschungsansätze vereint. Wissenschaftlich bedient sie sich

biochemischen, toxikologischen und molekularbiologischen Methoden. Zur Ermittlung und

Risikoabschätzung von Gefahrstoffexpositionen am Arbeitsplatz dienen das Instrument des

Biological- und Ambientmonitorings sowie das gesetzliche Regelwerk des

Chemikaliengesetzes (ChemG), der Gefahrstoffverordnung (GefstoffV) und der

technischen Regeln für Gefahrstoffe (TRGS), sowie der Verordnung zur

Einleitung 2

arbeitsmedizinischen Vorsorge (ArbMedVV) Die grösste Bedeutung, in Hinblick auf

Gesundheitsgefährdungen am Arbeitsplatz, kommt den Substanzen zu, die mit dem Erbgut

in Wechselwirkung treten und somit als potentielle Karzinogene eine erhebliche Gefahr

darstellen können. Der Nachweis verschiedener Metabolite, die unterschiedlichen

Abbauwegen eines Gefahrstoffes repräsentieren, zur Bestimmung der inneren individuellen

Dosis liefert für die Risikobewertung beim Umgang mit bestimmten Substanzen ein

umfassenderes Bild belasteter Personen an ihrem Arbeitsplatz und erlaubt z.T. eine

spezifischere Risikoabschätzung.

Das Ziel der aktuellen Forschung im Bereich des Biomonitorings muss es daher sein, durch

ein kontinuierliches Voranschreiten der biomedizinischen Anwendungs- und

Grundlagenforschung (bspw. die Identifizierung neuer/alternativer Abbauwege) eine

stetige Verbesserung des präventiven Arbeitsschutzes zu gewährleisten.

Styrol 3

2 Grundlagen

2.1 Styrol

2.1.1 Stoffeigenschaften

Tab.1: Die Stoffeigenschaften des Styrols

Styrol

IUPAC Phenylethen

CAS-Nummer 9003-53-6

Summenformel C8H8

Molekulargewicht (g/mol) 104.15

Eigenschaften farblose, niedrigviskose, süsslich riechende

Flüssigkeit (RT)

Dichte 0,91 g·cm-3

Schmelzpunkt −33 °C

Siedepunkt 145 °C

Dampfdruck 6,5 mbar (20°C)

log Pow 3,0

Wasserlöslichkeit 320 mg·l-1 (20 °C)

AGW 86 mg·m-3 ; 20ppm (TRGS 900 (DE))

„MAK“-Kommission Schwangerschaftsrisikogruppe C

Krebserzeugend Kategorie 5

CH2

Styrol 4

2.1.2 Entdeckung

Styrol (s. Tab.1) wurde 1839 durch den Berliner Pharmazeuten Eduard Simon zufällig

entdeckt, als er aus einem Pflanzenextrakt des orientalischen Amberbaums durch

Wasserdampfdestillation eine klare, ölige und farblose Flüssigkeit gewann. Diese von ihm

als Styrol benannte Flüssigkeit entwickelte nach Erhitzen einige Tage später eine gelartige

Konsistenz (Scheirs, 2003) – eine Reaktion, die viele Jahre später die Basis für die

Kunststoffauskleidung in Autos dienen, Bootrümpfe eine hohe Wiederstandsfähigkeit

verleihen und als Hauptbestandteil in Spielzeug (bspw. Playmobil®) Generationen von

Kindern erfreuen sollte. 1922 beschrieb Hermann Staudinger erstmals Simons Entdeckung

als Polymerisationsprozess zu Polystyrol und erhielt 1953 für seine Arbeit zu Polymeren

den Nobelpreis (Staudinger, 1953). Staudingers Entdeckung revolutionierte die gesamte

Kunststoffindustrie.

2.1.3 Belastung und Vorkommen

Der umweltbedingte Kontakt der Allgemeinbevölkerung mit Styrol kommt meist durch

Inhalation und über die Nahrung zustande. Schätzungen ergaben, dass hierbei über die

Nahrung Mengen zwischen 0,3-0,8 µg/kg Körpergewicht aufgenommen werden. Bei einer

Studie der Food and Drug Administration (FDA) konnten bei 49 von 320 untersuchten

Lebensmitteln Grössenordnungen von Styrol zwischen 10 µg/kg (bei Eiern) bis hin zu 274

µg/kg (bei Erdbeeren) bestimmt werden (IARC, 2002). Steele et al. konnten die grössten

Mengen Styrol in indonesischem Zimt finden (39,2 mg/kg). Die Gründe für Styrol in der

Nahrung können speziell bei Zimt auf metabolische Effekte (Steele, 1994) oder

Mikroorganismen (Lafeuille et al, 2009) zurückgeführt werden. Gerade bei kleinen

Mengen kann jedoch auch eine Migration von Styrol aus polymerhaltigen

Lebensmittelverpackungen als Grund erachtet werden (Tang et al, 2000).

Die inhalative Aufnahme von Styrol geschieht meist durch Emissionen industrieller

Styrolverarbeitungen, Autoabgasen oder Zigarettenrauch (Adam et al, 2009; IARC, 2002).

Es konnte gezeigt werden, dass Tabakrauch schätzungsweise 0,2-7,2 µg Styrol pro

Zigarette enthält (Darrall et al, 1998). In einer US amerikanischen Befragung zur

Exposition von Kindern durch flüchtige organische Substanzen wurden

Innenraumvorkommen von Styrol mit Durchschnittswerten von 1,2 µg/m³ und

Aussenbereichvorkommen von 0,5 µg/m³ angegeben (Adgate et al, 2004).

Styrol 5

Die industrielle Hauptanwendung von Styrol liegt in der Polystyrolherstellung,

Plastikverarbeitung, Fiberglas-Produktion als auch in der Gummiproduktion sowie bei

Laminierarbeiten und der Herstellung von Isolierstoffen (Rybak, 1992). Zu den durch

Styrol erzeugten Produkten zählen Verpackungsmaterialien (Schaumstoff, Füllmittel),

Konstruktionselemente (Rohre, Formstücke, korrosionsgeschützte Materialien),

Fahrzeugbestandteile (Autoreifen) und Haushaltswaren (Fussbodenbeläge,

Kunststoffschalen hitzebeständiger Küchengeräte). Styrol wird meist zu Polystyrolgranulat

verarbeitet. Dies ist kompatibel mit einer Vielzahl von Farbstoffen und stellt den Rohling

für die weitere Verarbeitung dar. Darüber hinaus werden auch Granulate hergestellt, in

denen Styrol als Copolymer mit anderen Polymeren vorliegt (Acrylnitril-Butadien-Styrol,

Styrol-Acrylnitril) und dem Material je nach Anwendung zusätzliche Eigenschaften

verleiht (Transparenz, Hitzebeständigkeit, Stossfestigkeit). Die vielfältige Verwendung

erhöht gleichfalls die Wahrscheinlichkeit von hohen Belastungen und gesundheitlichen

Gefährdungen beim Menschen am Arbeitsplatz. Dabei treten die grössten Expositionen in

der Produktion von glasfaserverstärktem Plastiks (GfP) und bei Styrol basierten Laminier-

und Lackierarbeiten auf. Allein im Jahr 1994 wurden weltweit 5,1 Millionen Tonnen

Styrol produziert (WHO, 2000).

Styrol 6

2.1.4 Metabolismus und Toxikologie

Die Aufnahme von Styrol in den Körper geschieht oral, inhalativ und dermal. Die Mengen

des dermal aufgenommenen Styrols können jedoch als nicht signifikant angesehen werden

(Brooks et al, 1980). Eine Schlüsselfunktion und gleichzeitig der initiale Schritt der

Biotransformation kommt der Proteinsuperfamilie der ubiquitären Cytochrom P450

Monooxygenasen (CYP P450) zu, die sich in der Phospholipidmatrix des

endoplasmatischen Retikulums eukaryotischer Zellen befinden. Diese Enzyme gehören zu

den Hämproteinen, die im menschlichen Genom von mindestens 50 P450-Genen codiert

werden und sich in 10 Familien aufspalten (Laffon et al, 2003). Bedeutend für den

humanen Styrolmetabolismus sind CYP2B6 und CYP2E1 in der Leber sowie CYP1A1,

CYP2F1, CYP2B1 und CYP2B6 in der Lunge (Nakajima et al, 1994). Die Epoxidierung

des Styrols durch Cytochrom P450 führt in geringen Mengen zu Styrol 3,4-oxid und weiter

zu 4-Vinylphenol, dem kürzlich entdeckten 2-,3- Venylphenol (Linhart et al, 2010) und

hauptsächlich zum sehr reaktiven Styrol 7,8-oxid (SO) welches in der Folge, überwiegend

über die mikrosomale Epoxidhydrolase EPHX1, zu Styrolglykol (SG) hydrolysiert wird.

Abschliessend entstehen Mandelsäure (MA) und Phenylglyoxylsäure (PGA) durch

Oxidation mittels Aldehyd- und Alkoholdehydrogenase und repräsentieren dabei 95% der

sich im Urin befindlichen Styrolmetabolite. Ein weiterer Stoffwechselweg ist die

Konjugierung von SO am reaktiven Epoxidring mit Glutathion (GSH), katalysiert durch

die Gluthation-S-Transferase (GST) zu den Glutathionkonjugaten GSH Konjugat 1 und

GSH Konjungat 2. Die Phenylhydroxyethylmercaptursäuren (PHEMA) N-Acetyl-S-(2-

Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein (PHEMA1) und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-

Cystein (PHEMA2) stellen die Endmetaboliten der zuvor durch γ-Glutamyltranspeptidase,

Cystein-Glycin-Dipeptidase und der N-Acetyl-S-Transferase katalysierten Reaktionen am

Glutathionkojugat dar (Sumner & Fennell, 1994). Ein weiterer reaktiver Schritt zwischen

SO und Hämoglobin führt zum Hämoglobinaddukt N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin

(HPV) und N-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Valin (Abb.1).

Styrol 7

CH 2

S

O

SO

SG

MA

O H

O H

O

O H

O H

O

O H

O

PGA

GSH 1- konjugat GSH 2- konjugat

OH

SG

GS

O H

OH O

N H

O O H

S

O H

PHEMA 1 PHEMA 2

O H

ON H

OOH

SOH

Γ-glutamyltranspeptidase

cysteinylglycine dipeptidase

N-acetyltransferase

GST

CYP P450Hauptweg

Nebenweg

Glu

CH 2

OO H

CH 2

3,4 SO 4-ViP

CYP P450Nebenweg

Gly

Nachweis im Urin

Hauptweg

NH

O CH3

CH3NH

OH

Globin

HPV

Nebenweg

Nachweis im Blut

EPHX1

Abb.1:Styrol Metabolismus mit Hauptstoffwechselwegen (grüne Pfeile)

S (Styrol); 3,4 SO (Styrol 3,4-Oxid);4-ViP (4-Vinylphenol); HPV (N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin); SO (Styrol 7,8-oxid); SG (Styrolglykol); MA (Mandelsäure); PGA (Phenylglyoxylsäure); GST (Gluthation-S-Transferase); GSH-1(2)-konjugat (Glutathionkonjugat 1(2)); Glu (Glutamat); Gly (Glycin); PHEMA 1 (N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein); PHEMA2 (N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Cystein); CYP P450 (Cytochrom P450 Monooxygenase); EPHX1 (Epoxidhydrolase EPHX1)

Styrol 8

Die Auswirkungen von Styrolexpositionen beinhalten mannigfaltige, toxikologische

Effekte. So kann eine Belastung zu Augen- Rachen- und Atemwegsreizungen führen.

Beeinträchtigende Effekte des zentralen und peripheren Nervensystems in Form

dopaminerger, psychischer und funktionaler Anomalien konnten bei Konzentrationen ab

100 parts per million (ppm) beobachtet werden (IARC, 2002). Störungen des Farbsehens

wurden ebenfalls auf styrolbedingten neuronalen (Campagna et al, 1996; Gobba, 2000)

aber reversiblen (Triebig et al, 2001) Funktionsverlust zurückgeführt. Unterschiedliche

Autoren untersuchten die Ototoxizität von Styrol (Morioka et al, 1999; Sliwinska-

Kowalska et al, 2003) und beschreiben im Rattenversuch einen grösseren Verlust der

Cochleafunktion und der Haarsinneszellen bei kombinierter Exposition von Lärm und

Styrol als bei Einzelexposition gegenüber einem der beiden Faktoren (Chen & Henderson,

2009; Lataye et al, 2000).

In Vitro (Bastlova et al, 1995; Dypbukt et al, 1992; Fracasso et al, 2009) als auch in vivo

Versuche (Maki-Paakkanen et al, 1991) zeigten, dass Styrol und sein reaktiver Metabolit

Styrol 7,8-Oxid (SO) DNA-Einzelstrangbrüche und Doppelstrangbrüche hervorrufen kann

und somit Einfluss auf die Differenzierungsfähigkeit von Zellen hat. Durch die

Behandlung mit SO konnte eine signifikante Erhöhung der Mutationsrate der

Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) humaner T-Zellen herbeigeführt

werden (Bastlova et al, 1995). In Mäusestudien wurde ein erhöhtes Auftreten von

Lungenadenomen und Karzinomen beobachtet: Weiblichen, trächtigen O20-Mäusen wurde

vom 17. Trächtigkeitstag an wöchentlich 1,35 g/kg Styrol zugeführt. Die Jungtiere

erhielten diese Dosis ab dem Geburtszeitpunkt weiterhin für über 100 Wochen

(Ponomarkov & Tomatis, 1978). Vermehrtes Auftreten von Lungenkarzinomen und

bronchoalveolären Adenomen wurde auch bei Styrol exponierten CD-10 Mäusen

beobachtet (Cruzan et al, 2001). Epidemiologische Studien zum Einfluss von Styrol

bedingten Krebsentstehungen bei Arbeitern aus Firmen, in denen glasfaserverstärktes

Plastik verarbeitet und produziert wird, konnten bisher keinen klaren Beweis für einen

kausalen Zusammenhang zwischen Styrol und dem Auftreten von Krebs erbringen. So

konnten Kogevinas et al. in einer Studie an 40.000 Arbeitern aus 8 Ländern Europas keine

Korrelation zwischen Exposition und erhöhtem Neoplasien-bedingtem Sterblichkeitsrisiko

finden. Zu ähnlichen Ergebnissen kamen Wong et al., bei denen bei einer Untersuchung

von 15.826 Arbeitern keine Korrelation zwischen Styrolexposition und Sterberate zu

finden war. Vielmehr gab es die grössten Sterblichkeiten bei den niedrig exponierten

Styrol 9

Arbeitern, was in der Folge nicht mit Styrol in Verbindung gebracht werden konnte

(Kogevinas et al, 1994; Wong et al, 1994).

Trotz des Mangels eindeutiger Belege für einen direkten Zusammenhang zwischen einer

Styrolexposition und der Inzidenz von Krebs beim Menschen, stufte die International

Agency for Research on Cancer (IARC) auf Basis des (1) Auftretens von Styrol bedingten

malignen Lungenerkrankungen bei Mäusen, (2) dem kanzerogenen Potential des SO im

Tierversuch und (3) dem Auftreten von DNA Addukten nach Exposition beim Menschen

Styrol als möglicherweise (Gruppe 2B) humankanzerogen und seinen Metaboliten SO als

wahrscheinlich (Gruppe 2A) humankanzerogen ein (IARC, 1994; IARC, 2002).

2.1.5 Suszeptibilität

Die Gesundheitsrisiken hängen nicht nur von der Häufigkeit und Konzentration einer

Umwelt- bzw. Arbeitsplatzexposition ab, sondern auch von den Charakteristika eines

Gefahrstoffes individuell genotoxisch zu wirken. Genetische Prädispositionen, die sich in

Form unterschiedlicher Polymorphismen zeigen, können Auwirkung auf die spätere

Funktion eines Proteins oder Enzyms haben und deren Funktion nachteilig beeinflussen

(z.B. Enzyme, die verantwortlich für die Aktivierung und Detoxifizierung von

Schadstoffen oder der DNA Reparatur sind) (Godderis et al, 2006; Laffon et al, 2003).

Relevante Polymorphismen sind bspw. Gene der Gluthation-S-Transferasen (GSTs), N-

Acetyltransferasen (NATs), Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYPs) (Raunio et al,

1995) als auch Gene der Basenexcisions- (BER) und Nukleotid-Exzisions-Reparatur

(NER) XRCC (X-ray repair cross-complementing) und ERCC (Excision repair cross-

complementing) (Duell et al, 2000).

Schadstoffexposition und ihre Erfassung am Arbeitsplatz 10

2.2 Schadstoffexposition und ihre Erfassung am Arbeitsplatz

2.2.1 Biomarker der Exposition

Messungen von Änderungen spezifischer Parameter (Biomarker) im biologischen System

eines Organismus als Indikator einer bestimmten Krankheit (bspw. Kreatinkinasen oder

Troponine bei einem Herzinfarkt) haben eine lange Vergangenheit. Im Gegensatz dazu ist

die Messung und Bestimmung von biologischen Markern einer Gefahrstoffexposition oder

die durch aufgenommene Chemikalien verursachte Ermittlung toxikologischer Effekte ein

relativ neuer Ansatz in der Medizin. Diese, als „toxikologische Biomarker“ bezeichneten

Parameter, haben ihren Ursprung in der arbeitsmedizinischen Forschung und der

forensischen Toxikologie. Innerhalb der toxikologischen Biomarker wird zwischen den

Expositionsbiomarkern, den Effektbiomarkern und den Prädispositionsbiomarkern (auch

Suszeptibilitätbiomarkern) unterschieden. Als Expositionsbiomarker gelten Chemikalien,

ihre Metabolite oder das Produkt aus einer Reaktion zwischen Molekül oder

Makromolekül und einer Chemikalie. Der Effektbiomarker beschreibt hingegen eine

strukturelle oder funktionale Veränderung im Organismus, die mit einer spezifischen

gesundheitlichen Beeinträchtigung bzw. Krankheit in Verbindung gebracht werden kann.

Die Bezeichnung des Prädispositionsbiomarkers beinhaltet alle genetischen Faktoren, die

für eine individuelle Suszeptibilität verantwortlich sind und bestimmt werden können.

Trotz des Versuchs verschiedene Biomarker zu definieren, ist es nicht immer möglich sie

einer bestimmten Kategorie zuzuordnen. Für eine Definition ist vielmehr der gesamte

Kontext, in dem der zu untersuchende Marker steht, zu beurteilen. So stellen bspw.

Benzol-Addukte der DNA Expositionsmarker dar. Benzol als genotoxisches kanzerogen

kann jedoch auch als Effektbiomarker gesehen werden.

2.2.2 Monitoring von Gefahrstoffexpositionen

Der Schutz vor Gesundheitsgefahren, insbesondere auch der Schadstoffexpositionen am

Arbeitsplatz ist eines der Hauptziele der Arbeitsmedizin. Als analytische Instrumente um

diese Gefahren frühzeitig aufzudecken und somit präventiv handeln zu können, stellen das

Biological Monitoring und das Ambientmonitoring die Methoden der Wahl dar. Das

Biological Monitoring kann als ein Instrument der individuellen Prävention angesehen

werden. Durch seine Anwendung ist es möglich die Reichweite einer Schadstoffbelastung


beim Menschen und der daraus folgenden Gesundheitlichen Effekte abzuschätzen (Angerer

& Gundel, 1996; Kommission „Human-Biomonitoring“des Umweltbundesamtes, 1996;

Schaller & Angerer, 1998; Zielhuis, 1980). Unterteilt wird das Biological Monitoring in

das Dosismonitoring, das biochemische Effektmonitoring sowie das biologische

Effektmonitoring. Die prädiktive Bedeutung im Hinblick auf eine gesundheitliche

Risikoabschätzung steigt dabei vom Ambientmonitoring bis zur arbeitsmedizinischen

Vorsorgeuntersuchung stetig an (Abb.2).

Abb.2: Monitoring von Gefahrstoffen in der Arbeits- und Umweltmedizin (Angerer,

2001)

2.2.3 Ambient Monitoring

Das Ambientmonitoring hat die Aufgabe Gefahrstoffe in der Umwelt (Luft, Boden,

Wasser, Lebensmitteln, Staub) zu ermitteln. Dabei gibt es stationäre Messungen, die an

beliebiger Stelle im Raum stattfinden, als auch personengebundene Messungen, die direkt

an der Expositionsquelle bzw. dem direkten Aufnahmeort des Schadstoffes (bspw. orale

Aufnahme) stattfinden. Zur Bestimmung des Schweregrades werden im Ausschuss für

Gefahrstoffe des Bundesministerium für Arbeit und Soziales (BMAS) so genannte

Arbeitsplatzgrenzwerte (AGWs) festgelegt, die anschliessend in den technischen Regeln

für Gefahrstoffe 900 (TRGS 900) veröffentlicht werden. Der AGW definiert sich als „Der

Grenzwert für die zeitlich gewichtete durchschnittliche Konzentration eines Stoffes (mg/m³

und ml/m³ (ppm)) in der Luft am Arbeitsplatz in Bezug auf einen gegebenen

Referenzzeitraum. Er gibt an bei welcher Konzentration eines Stoffes akute oder

chronische schädliche Auswirkungen auf die Gesundheit im Allgemeinen nicht zu erwarten

sind (§ 3 Abs. 6 GefStoffV).“. Die Reformierung der Gefahrstoffverordnung (GefStoffV)


und die Einführung der AGWs traten am 1. Januar 2005 in Kraft und ersetzten damit die

bis zu diesem Zeitpunkt gültige maximale Arbeitsplatzkonzentration (MAK) und die

technische Richtkonzentration (TRK). Diese beiden Parameter wurden von der

„Senatskommission zur Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe“ der Deutschen

Forschungsgesellschaft (DFG) vorgegeben (DFG, 2009).

Innerhalb der TRGS 900 werden Grenzwerte auf Einzelsubstanzen bezogen. Bei

Produktionsarbeiten kommt es allerdings häufiger zu Expositionen gegenüber

Stoffgemischen. Die Richtlinien zum Schutz des Arbeitnehmers und zur

Risikoabschätzung von Stoffgemischen werden den TRGS 403 entnommen. Bei

Substanzen, die noch nicht in die TRGS 900 übertragen wurden, ist zur Bewertung

weiterhin der MAK bzw. der entsprechende TRK-Wert zu verwenden. Diese haben

allerdings keine rechtliche Grundlage mehr. Beim Ambientmonitoring ist es nicht möglich

die eigentliche pathologische, molekulare Wirkung eines Schadstoffes zu analysieren und

zu quantifizieren, denn das bspw. kanzerogene Potential einer Chemikalie kann nicht durch

ihr Vorhandensein in der Raumluft bestimmt werden. Ebenso ist die Ermittlung der

tatsächlichen Stoffmengenkonzentrationen im Körper, die dermal oder inhalativ

aufgenommen wurde, nicht möglich.

2.2.4 Dosismonitoring

Das Dosismonitoring dient dem Nachweis von Schadstoffen oder ihrer Metaboliten in

Körperflüssigkeiten. Als Matrices dienen Vollblut, Plasma, Serum oder Urin. Hierbei wird

die so genannte „innere Dosis“ bestimmt, deren ermittelte Werte bspw. mit Referenzwerten

des Umweltbundesamtes oder dem 2008 von der DFG vorgestellten Biologischen

Arbeitsstoff-Referenzwert (BAR) zu vergleichen sind (DFG, 2009). Beide beruhen auf

Hintergrundbelastung bei Menschen der Allgemeinbevölkerung, die beruflich nicht mit

einer Exposition mit dem jeweiligen zu vergleichenden Stoff in Verbindung stehen. Im

Vergleich mit diesen Referenzwerten für die Allgemeinbevölkerung (definiert über das 95.

Perzentil), können überdurchschnittliche Belastungen und gesundheitliche Risiken durch

zwischenzeitliche Belastungen am Arbeitsplatz mit den zu vergleichenden Noxen

aufgedeckt werden. Folglich wird der Referenzwert für die Allgemeinbevölkerung zur

toxikologischen Begründung abgelehnt. Hintergrundbelastungen treten hier meist durch die

ubiquitären und unvermeidbaren Belastungen mit jeweiligen Noxen der Umwelt auf.

Darüber hinaus können Hintergrundbelastungen durch das Alter, Gewicht oder individuelle


Lebensgewohnheiten bspw. Rauchen und Alkohol beeinflusst werden. Hier kann der

Referenzwert Hinweise bieten, ob eine eventuelle zusätzliche Belastung gegenüber dem

Schadstoff am Arbeitsplatz oder in der Umwelt vorliegt (Lewalter & Neumann, 1998).

Als Richtlinie zur Bestimmung arbeitsplatzbezogener Konzentrationsüberschreitungen

diente bis zum 1. Januar 2005 der Biologische Arbeitsplatztoleranzwert (BAT) aus dem

sich der seit dem rechtlich verbindliche Biologischen Grenzwert (BGW) (veröffentlicht in

der TRGS 903) ableitet. Er stellt die toxikologisch-arbeitsmedizinisch abgeleitete

Konzentration eines Stoffes, seines Metaboliten oder eines Beanspruchungsindikators im

entsprechenden biologischen Material dar, bei dem im Allgemeinen die Gesundheit eines

Beschäftigten nicht beeinträchtigt wird (§ 3 Abs. 7 GefStoffV). Da die im Bereich der

BAT (BGW)-Werte liegenden, beobachteten Effekte voll reversibel sein müssen, wurden

und werden für kanzerogene Substanzen der Kategorien 1, 2 und 3 keine BAT (BGW)-

Werte erstellt. Eine toxikologisch unbedenkliche Dosis kann hier nicht festgelegt werden.

Anstelle des BAT (BGW) wurden für diese Gruppe und ihren Konzentrationen so genannte

EKAs (Expositionsäquivalente für krebserzeugende Arbeitsstoffe) definiert. Diese wurden

aus zahlreichen Daten zu Luftanalysen und Biomonitoringergebnissen gewonnen, die

gegeneinander korreliert und anschliessend zu einem EKA abgeleitet wurden. Dieser

definierte sich darüber, welche innere Belastung bei ausschliesslich inhalativer

Stoffaufnahme vorliegen würde (Bender, 2008). Als relevanter EKA wurde der Wert

bestimmt, der am ehesten dem jeweiligen TRK entspricht. So gibt es bspw. für einige

kanzerogene Expositionsäquivalente auf Basis von Hämoglobinaddukt-Analysen

(Acrylnitril (7 mg/m3 ≙ EKA 420 µg/L Blut, Ethylenoxid 1,83 mg/m3

≙ EKA 90 µg/L Blut,

Dimethylsulfat 0,20 mg/m3 ≙ EKA 40 µg/L Blut)). Durch die Gefahrstoffverordnung 2005

wurde den TRK Werten (und sich daraus ableitenden EKA-Werten) die gesetzliche

Grundlage entzogen, da sich die TRK Werte auf den Stand der Technik beziehen, nicht

gesundheitsbasiert sind und somit ein Schutz vor gesundheitlichem Schaden nicht

auszuschliessen war. In der Bewertung bei der arbeitsmedizinischen Praxis können sie

jedoch weiterhin als Anhaltspunkte angesehen werden. Ist es für bestimmte Stoffe nicht

möglich einen BAT (BGW)-Wert zu definieren und die Datenlage zu gering um EKA

Korrelationen aufzustellen, kann für die praktische Arbeitsmedizin der sog. Biologische

Leitwert (BLW) für eine Beurteilung hinzugezogen werden. Er definiert sich auf Basis von

toxikologischem Wissen sowie arbeitsmedizinischen und umwelthygenischen Erfahrungen,

kann jedoch auch bei gemessenen Werten unterhalb des BLW eine Gesundheitsgefährdung

nicht ausschliessen (DFG, 2009) .


Zur Evaluation oder Aufstellung bspw. neuer AGWs, BGWs oder EKA Korrelationen

müssen grosse Mengen von Messdaten aus Expositionen mit Schadstoffen verschiedener

Kollektive und Firmen ermittelt und zusammengetragen werden. Darüber hinaus müssen

die dazu benötigten analytischen Methoden etabliert/entwickelt und in regelmässigen

Abständen extern verifiziert werden. Zur Einhaltung und Prüfung der Entwicklung

einheitlicher analytischer und valider Messmethoden, nahm die Senatskommission zur

Prüfung gesundheitsschädlicher Arbeitsstoffe der DFG bereits 1975 eine Vorreiterrolle ein.

Mit dem Ziel der Sicherung der Qualität des Biomonitorings führt die Deutsche

Gesellschaft für Arbeitsmedizin und Umweltmedizin (DGAUM) seit 1984 jährliche

Ringversuche für arbeitsmedizinisch-toxikologische Laboratorien durch. Im Hinblick auf

Styrol nimmt das Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin ebenfalls jedes Jahr

erfolgreich an der Bestimmung der Hauptmetaboliten MA und PGA teil und bestätigt

damit die Validität dieser Methode.

2.2.5 Biochemisches Effektmonitoring

Angerer definiert das biochemische Effektmonitoring als die Quantifizierung von

Reaktionsprodukten aus mutagenen Substanzen mit der Erbsubstanz: Erst ein direkter oder

indirekter Nachweis dieser Reaktion kann einen validen Schluss über das tatsächliche

Risiko für die Gesundheit des Beschäftigten zulassen. Das biochemische Effektmonitoring

gibt, wie auch das Dosismonitoring, eine Auskunft über die innere Dosis, allerdings

spezifisch über die innere effektive Dosis. Diese Nachweismethode zeigt demnach nicht

nur das Vorhandensein des Schadstoffes im Körper an, sondern liefert gleichzeitig den

Beweis seiner potentiell toxikologischen Wirksamkeit. Geeignete Analysekandidaten sind

Metabolite, Aminosäuren, Enzyme, Protein und DNA-Addukte (Angerer, 2001).

Reagieren genotoxische Substanzen mit nukleophilen Bereichen der DNA-Nukleotide

bilden sie ein sogenanntes Addukt. Diese Addukte liefern nicht nur einen „Fingerabdruck

der Exposition“, sondern sind auch Indikator eines prokarzinogenen DNA-Schadens

(Perera, 1997). Die Bestimmung von DNA-Addukten birgt allerdings einige

Schwierigkeiten. So wirkt sich das essentielle DNA-Reparatursystem modulierend auf das

Messergebnis aus. Betroffene DNA Nukleotide werden entfernt und ersetzt, gehen nicht

mehr in die Konzentrationsbestimmung mit ein, verfälschen somit die Aussage des

Messergebnisses und machen besonders retrospektive Risikoabschätzungen oft schwierig.

Zielgewebe eines toxikologischen oder kanzerogenen Effektes ist beim lebenden


Menschen in der Regel nicht zugänglich und verhindert die Durchführung routinemäßiger

Screenings betroffener Personengruppen (Angerer, 2001).

2.2.6 Biologisches Effektmonitoring

Das Biologische Effektmonitoring beschreibt Funktionsstörungen als Reaktion auf

Schadstoffbelastungen. Zu den standardmäßigen Untersuchungen zählt der Nachweis von

DNA Einzel- und Doppelstrangbrüchen, chromosomalen Aberrationen (bspw.

Schwesterchromatidaustausch) und veränderten Enzymaktivitäten. Der größte Nachteil der

alleinigen Anwendung des Biologischen Monitorings ist die mangelnde Substanzspezifität,

da sich auftretende Mutationen oder Funktionsstörungen nicht eindeutig auf eine Substanz

zurückführen lassen und daher als Marker nur begrenzt eingesetzt werden können.

Interindividuelle Schwankungen erschweren zudem die Aussagekraft, weshalb eine

Anwendung des Biologischen Effektmonitorings nur bei sehr großen Studien und

mindestens mit einem ergänzenden Dosismonitoring zu empfehlen ist.

2.2.6.1 Mercaptursäuren als Dosismarker der inneren Exposition

Elektrophile Substanzen oder Intermediate gelten als potentiell toxisch. Glutathion (GSH)

stellt die Komponente dar, die als nukleophiles Tripeptid zusammen mit dem Elektrophil

zu einem reaktionsträgen und wasserlöslichen Molekül reagiert, dadurch detoxifiziert wird

und vom Körper über den Urin ausgeschieden werden kann. Diese durch Glutathion-S-

transferasen katalysierten Glutathionkonjugationsreaktionen dienen daher dem natürlichen

Schutz vor Elektrophilen und Radikalen.

Mercaptursäuren leiten sich aus weiteren Umwandlungsreaktionen des zuvor mit GSH

konjugierten Elektrophils ab (Abb.1) und weisen damit direkt auf eine „toxikologisch

relevante absorbierte Dosis“ hin, während andere Metabolite (MA, PGA) gewöhnlich nur

auf die „absorbierte Dosis“ hinweisen. Aus diesem Grund stellen die Mercaptursäuren

wichtige Biomarker der inneren Exposition durch am Arbeitsplatz und in der Umwelt

vorkommende, relevante Substanzen dar (Boettcher & Angerer, 2005; Hecht et al, 2008;

Kellert et al, 2006; Kopp et al, 2008). Zur quantitativen Bestimmung der Mercaptursäuren

von Styrol beim Menschen, gibt es derzeit nur wenige Arbeiten. Hallier et al. untersuchten

20 Arbeiter der Polyesterindustrie, konnten jedoch, durch die vergleichsweise wenig

sensitive Dünnschichtchromatographie, nur bei einer Person das Vorhandensein von Styrol


spezifischen Mercaptursäuren detektieren (Hallier et al, 1995). Eine nicht ausreichende

Sensitivität lag auch bei Verwendung der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit

gekoppelter elektronischer Detektion vor. Hier konnten bei sechs mit Styrol exponierten

Probanden keine Mercaptursäuren detektiert werden. (Norström et al, 1992). Methoden der

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie basierend auf Fluoreszenzdetektion (Ghittori et

al, 1997) oder Flüssigkeitschromatographie gekoppelte Tandem-Massenspektrometrie

(LC/MS/MS) (Fustinoni et al, 2008; Manini et al, 2000) schienen vielversprechender zur

Analyse Styrol bedingter PHEMAs zu sein. Problematisch war hier jedoch der intensive

Zeitaufwand der Probenaufarbeitung, was Belastungsuntersuchungen in der Routine nicht

möglich macht (Maestri et al, 1997) oder die fehlende Hinzunahme interner Standards

(Fustinoni et al, 2008; Manini et al, 2000), was Quenching Effekte kompensieren und die

Richtigkeit der Ergebnisse sichern würde.

2.2.6.2 Addukte als biochemische Effektmarker

Als Addukt wird in der arbeitsmedizinischen Toxikologie die Reaktion zwischen einem

Schadstoff oder seinem Metaboliten mit Makromolekülen (Proteine, DNA) des Körpers

bezeichnet. Dieses zusammengesetzte Molekül repräsentiert in der Analytik einen Effekt

des Schadstoffes auf den Organismus und dient als Parameter der Genotoxizität und damit

der gesundheitlichen Risikoabschätzung. Indikatoren können demnach ein nach

Schadstoffexposition vermehrtes Auftreten von Protein oder DNA Addukten sein.

Im Hinblick auf eine kanzerogene Wirkung kann nur von Auftrittswahrscheinlichkeiten

gesprochen werden, da DNA-Addukte mittels Reparaturmechanismen entfernt werden

können. Dabei ist die Persistenz eines Adduktes stark von der Bindungsstelle abhängig. So

finden Adduktbildungen, hervorgerufen durch SO, in vitro bevorzugt am N7, N2–Guanin

als auch am N3-Adenin statt (Koskinen & Plna, 2000; Vodicka & Hemminki, 1988) Beim

Menschen wird die stärkste Bindung am O6 –Guanin vermutet (Vodicka et al, 1994). In der

Vergangenheit haben verschiedenste Humanstudien bspw. durch den Nachweis

styrolbedingter N2- und O6-Guaninaddukt Konzentrationen (Horvath et al, 1994; Vodicka

et al, 1995; Vodicka et al, 1999; Vodicka et al, 1994) sowie von Addukten des 1-Adenins

(Koskinen et al, 2001) in Lymphozyten von Laminierern den Nachweis eines

genotoxischen Potentials von Styrol erbracht.

Die von Törnqvist et al. entwickelte Methode zur Bestimmung von Addukten des

Hämoglobins (Törnqvist et al, 1986), wurde bereits mehrfach eingesetzt, um styrolbedingte


Expositionen nachzuweisen (Christakopoulos et al, 1993; Teixeira et al, 2008; Vodicka et

al, 1999; Yeowell-O'Connell et al, 1996). Speziell Untersuchungen der Addukte am N-

terminalen Valin des Hämoglobins (Hb-Val) im Tierversuch (Osterman-Golkar et al, 1995;

Pauwels et al, 1997) als auch beim Menschen (Christakopoulos et al, 1993; Teixeira et al,

2008) konnten diese Addukte als geeignete Biomarker der internen Exposition bestätigen.

Gleichwohl gab es in der Vergangenheit unterschiedlichste Meinungen zur Wahl des

Proteinaddukts, da sie sich in ihrem Detektionslimit als auch in ihrem

Korrelationsverhalten von anderen Metaboliten des Styrols unterscheiden. Christakopoulos

et al. konnten signifikante Erhöhungen von N-terminalen Valin Addukten des

Hämoglobins bei hoch exponierten Arbeitern der glasfaserverstärkenden Plastikindustrie

(GfPI) nachweisen (Christakopoulos et al, 1993), während Brenner et al. keine

signifikanten Unterscheide zwischen exponierten Arbeitern und Kontrollen feststellen

konnte (Brenner et al, 1991). Severi et al. konnten bei 52 Arbeitern mit Styrolexposition

keine Erhöhungen der Adduktkonzentration von N-terminalen Valin Addukten des

Hämoglobins nachweisen, was einerseits auf die geringen Expositionsbedingungen

andererseits auf das Detektionslimit von 10 pmol/g Globin zurückzuführen war (Severi et

al, 1994). Kein Beweis für eine Korrelation zwischen Exposition und einem erhöhten

Auftreten von Hämoglobinaddukten an der Cystein Seitenkette und an Carbonsäuren

konnte durch die Studie von Yeowell-O’Connell et al. erbracht werden. Sie analysierten

Addukte von 48 Bootsbauern, die mit Styrol und Styroloxid exponiert waren.

Konzentrationen von Cystein Addukten des Albumins stiegen allerdings signifikant mit der

Exposition an (Yeowell-O'Connell et al, 1996).

Hämoglobinaddukte als Langzeitmarker

1974 führte Lars Ehrenberg Versuche an Ethylenoxid exponierten Mäusen durch und

untersuchte das Bindungsverhalten an DNA und Hämoglobin (Hb) mit dem Ziel ein neues

Messinstrument für die Bewertung des Risikos der Schadstoffbelastung zu generieren. Sein

begründetes Konzept der „Tissue-Dose“ war der Beginn des Effektmonitoring, bei dem die

effektive innere Dosis direkt oder indirekt durch das Addukt beschrieben wird (Ehrenberg

et al, 1974). Die Bestimmung der inneren Belastung anhand von Hämoglobinaddukten

(HbA) bietet Vorteile gegenüber der von DNA-Addukten.

Bereits 1953 konnten Jackson und Thompson zeigen, dass die Bindung einer elektrophilen

Substanz an Hb sehr stark ist und nur durch die Degradierung des Erythrozyten eliminiert


werden kann (Jackson, 1953). Die stabile Bindung von Hb innerhalb des Erythrozyten wird

durch die Bildung des Addukts insbesondere am endständigen Hb-Valins nicht beeinflusst

(Osterman-Golkar et al, 1995). Der Abbau von Hb wird demnach nur durch die eigene

Lebensdauer (ca. 120 Tage beim Menschen, ca. 40 Tage bei der Maus) bestimmt und

verläuft nach einer Reaktion nullter Ordnung. Durch ein nicht vorhandenes

Reparatursystem bleibt die Adduktbildung bestehen und kann somit über den maximalen

Lebenszeitraum nachgewiesen werden. Durch den langen Akkumulationszeitraum können

Expositionen im Niedrig-Dosis-Bereich als auch weiter zurück liegende

Expositionsereignisse detektiert werden. Für die Bestimmung der Alkylierung wird eine

wesentlich größere Menge DNA im Blut benötigt; im Gegensatz zur hohen Konzentration

des Hb (Ehrenberg & Osterman-Golkar, 1980). In der praktischen Anwendung bietet das

Blut als Matrix somit nicht nur Vorteile der Verfügbarkeit, sondern in Hinblick auf

belastete Personen auch eine weniger invasive Form der Probenbeschaffung, als bspw. eine

spezifische Gewebebiopsie. Diese würde sicherlich den Mehrwert an Information

quantitativ steigern, ist jedoch in der Anwendungsforschung nicht praktikabel.

Humanes Hämoglobin

Physiologisch hat Hämoglobin die Funktion des Sauerstofftransportes sowie in geringen

Mengen des Kohlendioxid- und Protonentransportes in den Erythrozyten des Blutes. Es

besitzt eine Gesamtmolekülmasse von ungefähr 64,5 Kilodalton (kDa) und besteht als

Proteintetramer aus 4 Polypeptidketten (2 alpha-Ketten mit je 141 Aminosäuren und 2

beta-Ketten mit je 146 Aminosäuren), die primär durch schwache nicht kovalente

Bindungen (bspw. Van der Waals Kräfte oder Wasserstoffbrückenbindungen)

zusammengehalten werden. Die letzte Aminosäure der 4 Ketten ist Valin. Innerhalb der

vier Globinketten befinden sich ebenfalls vier prosthetische Gruppen (Häm), die über das

proximale Histidin mit der entsprechenden Aminosäurekette verbunden sind. Hier ist der

eigentliche Bindungsort des Sauerstoffs lokalisiert (Schechter, 2008).

Die kovalente Bindung eines Gefahrstoffes oder eines seiner Metaboliten an das

Hämoglobin (Abb. 3) setzt ganz allgemein die Verfügbarkeit elektrophiler und

nukleophiler Gruppen voraus.


Entstehung eines Hämoglobinaddukts

Die meisten Karzinogene gehören zu den elektrophilen, alkylierenden Substanzen. Ihr

gesundheitsgefährdendes, toxisches Potential wird primär bestimmt durch ihre direkte oder

indirekte (exogen oder endogen induzierte) Reaktivität und die daraus resultierende

Fähigkeit eine kovalente Verbindung mit nukleophilen Bereichen in Makromolekülen

bspw. Proteinen oder der DNA einzugehen. Die Nukleophilie einzelner Aminosäuren ist

abhängig vom Grad ihrer Protonierung, denn nur im unprotoniertem Zustand kommt die

Adduktbildung zustande. Die verschiedenen Seitenketten des Hämoglobins eignen sich

daher unterschiedlich gut für einen nukleophilen Angriff. Die stark basische Aminogruppe

von Lysin oder Arginin besitzt pKa-Werte im Bereich zwischen 9.5-12.5. Bei einem

physiologischen pH-Wert von 7.4 liegt diese Aminogruppe fast vollständig protoniert vor.

Bedeutender für die Bindungsreaktion sind dagegen die Aminosäuren, deren pKa sich im

naheliegenden Bereich des Blut-pH-Wertes befinden. Dazu zählen die Aminogruppen des

N-terminalen Valins, Histidins und die Thiol-Gruppe des Cysteins (Törnqvist et al, 2002),

deren durch verschiedene Alkylantien (bspw. Styrol-7,8-oxid) entstandenen Addukte als

Marker biochemischer Effekte verwendet werden können.

Abb. 3: Mechanismus einer Hämoglobinadduktbildung an das N-terminale Valin

(skizziert) am Beispiel des Epoxids Styrol-7,8-oxid

nukleophiler Angriff +

-

Styrol - 7,8 - oxid

Addukttragendes

Globin

2 - Hydroxy-2-Phenyl-Ethyl-

Globin

UmlagerungenN-terminales Valin der

Globin Aminos ä ure Globin

O

C H 3 C H 3

N H OH

HH

Globin

O

CH3

CH3

H

H

N+

O C-

+ Globin

C H 3 C H 3

N H 2 O

O


Zur Bestimmung von Addukten des N-terminalen Valins wird meistens ein modifizierter

Edman-Abbau verwendet. Anschließend erfolgt eine chromatographische Trennung mittels

Gaschromatographie und massenspektrometrischer Detektion. Pehr Edman entwickelte

1949 eine Methode zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Proteins. Diese gehört

seither zum Standardrepertoire vieler molekularbiologischer und biochemischer

Untersuchungsmethoden (Edman, 1949). Durch eine Abänderung des Verfahrens konnte

Törnqvist et al. im Jahr 1986 erstmals ein praktikable Bestimmung von Addukten des N-

terminalen Valins zeigen. Anstelle des ursprünglich eingesetzten Sequenzierungsreagenz

Phenylisothiocyanat verwendeten sie Pentafluorphenylisothiocyanat (PFPITC). Während

beim klassischen Edman-Abbau die elektrophile Addition des Phenylisothiocyanats im

wässrigen Milieu bei einem pH-Wert von etwa 9-10 abläuft, findet die Reaktion an das N-

terminale Valin bei modifiziertem Edman-Abbau unter neutralen, nicht-wässrigen

Bedingungen statt. Die Bildung des Thiocarbamoylderivat wird durch die veränderten pH

Bedingungen nicht gestört, da das endständige Valin deprotoniert vorliegt (pks = 6,8-7,8).

SN

F

F

F

F

F

++

NH

O

CH3

CH3

N

H

R

Globin

PFPITC Endständige Aminosäure Valin mit gebundenem Addukt „R“

R

S

NH

O

CH3

CH3

N

NHF

F

F F

F

Globin

Thiocarbamoylderivat

Abb. 4: Bildung des Thiocarbamoylderivats durch die Reaktion von PFPITC mit der

Aminogruppe des N-terminalen Valins

Nachdem sich das Thiocarbamoylderivat gebildet hat (Abb. 4), kommt es zwischen dem

Schwefel- und dem Sauerstoffatom zu einer Zyklisierungsreaktion, die bevorzugt an dem

addukt-tragendem Valin (im Gegensatz zum unsubstituierten) stattfindet. Dies liegt an der

alkylierten Aminofunktion, die bedingt durch den elektronenliefernden Substituenten die

auftretende negative Ladung am Schwefelatom stabilisieren kann und zu einer selektiven

Abspaltung des addukt-tragenden Valins führt. Diese Gegebenheit führt gleichzeitig zu

einer verbesserten Analytik, da das unsubstituierte N-terminale Valin mehrere

Größenordnungen oberhalb des addkut-tragenden Valins liegt und so das

Hintergrundrauschen vermindert wird. Das entstandene Thiazolinonderivat erfährt durch

Temperaturerhöhung eine Umlagerung in das stabilere Pentafluorphenylthiohydantoin

(PFPTH)-Derivat, welches den Analyten zur Identifizierung der Hämoglobinaddukte


Metabolite im Urin

DNA-Addukte

Hb-Addukte

rela

tive

Bio

mar

kerk

no

nze

ntr

atio

n

Zeit nach Exposition (Tage)

darstellt (Abb. 5). Der Substituent „R“ definiert die alkylierende Substanz, die am

Hämoglobin gebunden war und damit den Schadstoff der Exposition (Schettgen, 2006;

Törnqvist et al, 2002; Törnqvist et al, 1986).

R

S O

CH3

CH3N

NHF

F

F F

F

R

SO

CH3

CH3N

NF

F

F F

F

- H

+ H - OH

+ OH

CH3

CH3

R

OH

O

N

S

NHF

F

F F

F

- OH

+ OH

O

CH3

CH3

RS

NN

FF

F

F F

Thiazolinonderivat Pentafluorphenylthiohydantoinderivat (Analyt)

Abb. 5: Zyklisierungsreaktion des Thiocarbamoylderivates und Entstehung eines

Thiazolinderivates unter Abspaltung des Hämoglobinrestes. Umlagerung des

Thiazolinderivates in das Pentafluorphenylthiohydantoinderivat (Analyten)

Abb. 6: Unterschiedliche turn-over Zeiten von Expositionsbiomarkern nach

(Henderson et al, 1989)

R

S

NH

O

CH3

CH3

N

NHF

F

F F

F

Globin

R

S

NH

O

CH3

CH3

N

NHF

F

F F

F

Globin

Globin

Thiocarbamoylderivat


Untersuchungen zur Bindung kanzerogener Substanzen an Proteine, insbesondere

Hämoglobin, konnten im Tierversuch (Li et al, 2003; Osterman-Golkar et al, 2003; Wu,

1997) als auch beim Menschen (Czene et al, 2002) zeigen, dass diese proportional zur

DNA-Bindung geschieht. Hämoglobinaddukte können daher als geeignete DNA-Addukt-

Surrogate angesehen (Angerer, 2001; van Sittert et al, 2000a) und als Risikoparameter

eines makromolekularen Schadens verwendet werden.

2.2.7 Cotinin als Marker des Raucherstatus

Tabakrauch kann Einfluss haben auf die Ergebnisse von Expositionsanalysen. Oft sind

bereits im Tabak verschiedenste Gefahrstoffe enthalten oder entstehen während der

Pyrolyse beim Rauchvorgang selbst. Speziell für Styrol konnte bereits nachgewiesen

werden, dass es auch während des Rauchvorgangs gebildet wird (Adam et al, 2009;

Wallace et al, 1987). Der Beitrag dieser Stoffe zur Gesamtbelastung kann marginal sein

oder aber auch weitreichende Bedeutung haben (Hagmar et al, 2001; Schettgen et al,

2003). Beim Biomonitoring ist es deshalb essentiell den individuellen Raucherstatus über

den Nikotin Metaboliten Cotinin zu erfassen und den Einfluss des Rauchens auf bestimmte

Expositionsäquivalente hin zu überprüfen.

Zielsetzung der Arbeit

23

3 Zielsetzung der Arbeit

Um den Arbeitnehmer an seinem Arbeitsplatz vor einer Belastung mit Gefahrstoffen zu

schüzten oder etwaige Expositionen zu ermitteln, wird am Arbeitsplatz klassischerweise

ein konventionelles Luftmonitoring durchgeführt. Hierbei erfolgt die Abschätzung der

potentiellen Gefahrstoffbelastung nur über Messungen der jeweiligen Substanz in der

Raumluft. Diese Messungen geben aber keinen Aufschluss über das tatsächliche

Vorkommen des Schadstoffes im Körper des Betroffenen und sind zudem stark anfällig für

Störeffekte.

Im Gegensatz dazu liefern das Dosis- und biochemische Effektmonitoring Informationen

zu den tatsächlich aufgenommenen Mengen eines Gefahrstoffes im Körper. Erfassungen

von Styrol bedingten Belastungen, bei denen alle genannten Parameter (MA_PGA, Hb-

Val, PHEMAs) zur gleichen Zeit beim Menschen erfasst wurden, um eine möglichst

umfassende Risikoabschätzung durchführen zu können, lagen bislang nicht vor.

Vor diesem Hintergrund war die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ein

Humanbiomonitoring an einem Styrolexponierten Kollektiv und einem Referenzkollektiv

durchzuführen, bei denen sowohl die als Standardparameter des Dosismonitorings

beschriebenen aromatischen Carbonsäuren (Mandelsäure und Phenylglyoxylsäure)

bestimmt wurden sowie die Addukte am endständigen Valin der Hämoglobinseitenkette als

Langzeitmarker. Als spezifischer Marker eines durch Glutathion vermittelten Schutzes vor

körperständigen elektrophilen Substanzen wurde zudem die Bestimmung styrolbedingter

Mercaptursäuren durchgeführt. Diese Parameter repräsentieren unterschiedliche

Abbauwege im Metabolismus des Styrols. Weiterhin galt es den potentiellen Einfluss des

Rauchens auf die Metabolitkonzentrationen zu berücksichtigen und das Verhalten der

Metabolite innerhalb eines Vorschicht-Nachschichtsystems zu untersuchen.

Um eine Expositionserfassung durchzuführen war ein weiteres Ziel dieser Arbeit zunächst

die Etablierung und Validierung einer Methode zur Bestimmung des Hämoglobinaddukts

N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin des Styrols und weiterhin aufbauend auf Methoden

zur Bestimmung von Mercaptursäuren des 1,3-butadiens und des Acrylonitrils eine

Methode zur Bestimmung der Mercaptursäuren N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-

Cystein und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Cystein zu etablieren und validieren.

Zielsetzung der Arbeit 24

Nach abschließender Validierung beider Methoden war ein Firmenkollektiv mit

produktionsbedingten Styrolexpositionen zu akquirieren und die dortigen Belastungen

mittels des oben genannten Humanbiomonitorings zu erfassen.

Analytik der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren im Urin

25

4 Analytik der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren

im Urin

4.1 Grundlage des Verfahrens

Dieses Verfahren diente der Messung und der daraus resultierenden

Konzentrationsbestimmung der Styrol spezifischen Mercaptursäuren N-Acetyl-S-(2-

Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein (PHEMA1) und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-

Cystein (PHEMA2). Die Mercaptursäuren wurden mittels HPLC online selektiv an einer

RAM-Phase (Restricted Access Material) konzentriert und von restlichen

Matrixkomponenten isoliert. Durch das Prinzip des Größenausschlusses können kleinste

Moleküle durch Poren in das Innere des Säulenmaterials gelangen, während

Makromoleküle (bspw. Proteine) eluieren und die Säule verlassen. Das Prinzip der

Adsorptionschromatographie hält kleine Moleküle (bspw. Analyt) im inneren, alkylierten

Bereich des Säulenmaterials zurück. Im so genannten Backflush-Verfahren werden die

Analyte auf die analytische Säule übertragen und nach erfolgter Trennung tandem-

massenspektrometrisch detektiert. Die Kalibrierung erfolgte mittles Vergleichsstandards,

die in Poolurin angesetzt und in der gleichen Weise behandelt wurden wie die zu

analysierenden Proben. Als interner Standard wurde den Urinproben eine 1:1 Mischung

aus N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein-13C6 und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-

Phenylethyl)-Cystein-13C6 zugefügt.

4.2 Geräte, Chemikalien, Lösungen

4.2.1 Geräte

HPLC-Apperatur (Agilent 1100 Series):

binäre Gradientenpumpe (G 1312A)

Isokratische Pumpe mit Vorrichtung zum Entgasen der jeweiligen Eluenten

Säulenthermostat

Injektionsventil

Probenschleife 100 µl, Pumpenkopf 100 µl

Analytik der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren im Urin 26

Automatisierter Probengeber (G 1313A)

Sixport-Ventil (Valco Systems)

Tandem-massenspektrometrischer Detektor (Applied Biosystems API 3000)

Computersystem zur Datenauswertung

HPLC-Säule (Phenomenex): Luna C8, 150 mm; Ø innen 4,6 mm; Teilchendurchmesser 3

µm

Vorsäulenfilter (Supelco) (0,5 µm)

Vorsäule (Phenomenex): C8 3 mm, Ø innen 4 mm, Teilchendurchmesser 3 µm

RAM-Phase (Merck): LiChroSpher RP-8 ADS; 25 mm; Ø innen 4 mm;

Teilchendurchmesser 25 µm

Magnetrührer (IKA Labortechnik)

1,8 ml Schraubgläser mit dazugehörigen PTFE-kaschierten Septen und Schraubkappen

(Macherey-Nagel)

Verschlusszange (Macherey-Nagel)

pH-Meter mit Einstabmesskette (Mettler-Toledo)

Mikroliterpipetten, verstellbar 10-100 µl (100- 1000) µl (Eppendorf)

Messkolben 10- und 25-ml (Brand)

Zentrifuge Rotina 420R (Hettich)

Erlenmeyer Kolben 10 ml (Brand)

Labor „Blaukopfflaschen“ 1 Liter (Schott)

4.2.2 Chemikalien

Sofern keine weiteren Angaben gemacht werden, sind alle benannten Chemikalien in der

Reinheit von mindestens p.a.-Qualität verwendet worden.

Standards: N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-

Phenylethyl)-Cystein (Verhältnis 1:1) (Toronto Research Chemicals Inc)

Interne Standards: N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein-13C6 und N-Acetyl-S-

(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Cystein-13C6 (Verhältnis 1:1) (Toronto Research Chemicals

Inc)


Ameisensäure; 100% (Merck)

Chromatographie-Wasser (LiChrosolv®) (Merck)

Acetonitril; HPLC grade (J.T. Baker)

aqua bidest (Millipore®)

4.2.3 Lösungen

1% Ameisensäure

50 ml aqua bidest wurden in einem 100-ml Messkolben vorgelegt. 1 ml 100%

Ameisensäure wurde hinzugegeben und der Kolben mit aqua bidest bis zur Marke

aufgefüllt. Die Lösung war bei 4°C ca. 1 Monat haltbar.

Eluent A (0,1% Ameisensäure, pH 2.5)

500 ml aqua bidest wurde in einem 1000-ml Messkolben vorgelegt. 100 ml der 1%

Ameisensäure (siehe oben) wurden mit Hilfe eines Standzylinders abgemessen und in den

Messkolben hinzugegeben. Anschließend wurde der Messkolben mit ca. weiteren 400 ml

aqua bidest aufgefüllt und der pH-Wert der Lösung unter Rühren mittels Magnetrührer

unter ständiger Kontrolle des pH-Meters tropfenweise mit Ameisensäure (100%) auf

pH 2.5 eingestellt. Der Messkolben wurde anschließend mit aqua bidest Wasser bis zur

Marke aufgefüllt.

Eluent B (Acetonitril)

Eluent C

(isokratische Pumpe, 95:5 0,1% Ameisensäure pH 2.5 / Acetonitril):

475 ml des hergestellten Eluenten A wurden mit Hilfe eines Standzylinders in einen

500 ml-Messkolben gefüllt. Anschließend wurde der Messkolben mit Acetonitril bis zur

Marke aufgefüllt.

Alle Eluenten wurden vor der Benutzung zur Vermeidung von Luftblasen für 10 min in ein

Ultraschallbad gestellt.


Lösungen der Standards

Stammlösung:

10 mg der PHEMA Standards wurden in 10 ml Methanol gelöst (1 g/L). 100 µl dieser

Stammlösung wurden anschließend in einen 10-ml Messkolben mit 5 ml vorgelegter 0,1%

Ameisensäure gegeben und bis zur Marke weiter aufgefüllt Dotierlösung 1 (10 mg/L)

500 µl der Dotierlösung 1 wurden anschließend in einen 10-ml Messkolben mit 5 ml

vorgelegter 0,1% Ameisensäure gegeben und bis zur Marke weiter aufgefüllt

Dotierlösung 2 (500 µg/L).

Lösungen der internen Standards

Stammlösung:

1 mg der 13C6 PHEMAs (komplette erworbene Menge) wurde in 1 ml Methanol gelöst

(1 g/L). 10 µl dieser Stammlösung wurden anschließend in einen 10-ml Messkolben mit 5

ml vorgelegter 0,1% Ameisensäure gegeben und bis zur Marke weiter aufgefüllt

Gebrauchslösung (1 mg/L)

Alle Lösungen wurden bei –20°C in braunen Schraubgläschen gelagert. Die

Vergleichsstandardlösungen wurden in angesäuertem, filtriertem Mischharn von vier

unbelasteten Personen der Allgemeinbevölkerung angesetzt. Um die Hintergrundbelastung

der Mercaptursäuren im verwendeten Poolurin (Kreatinin 0,56 g/L) möglichst niedrig zu

halten, sollte hier lediglich Urin von Nichtrauchern verwendet werden. Zur Herstellung des

Mischharns wurden Harnproben der Probanden in einem geeigneten Gefäß gesammelt, gut

durchmischt und bis zur Herstellung der Standards und des Kontrollmaterials bei -20°C

gelagert. Nach dem Auftauen wurde der Mischharn durch einen Faltenfilter filtriert, um

ausgefallene Proteine abzutrennen, mit 1 % Ameisensäure (100%) angesäuert und dann

zum Ansetzen der Standards benutzt.

Aus den Dotierlösungen wurden durch Verdünnen mit dem filtrierten Mischharn (bzw.

aqua bidest für den Matrixeffektvergleich) Vergleichsstandards in einem

Konzentrationsbereich von 0,5 – 250 µg/L nach dem Pipettierschema in Tab.2 hergestellt.

Als Leerwert wurden der filtrierte Mischharn und ein Wasserblindwert in jeder Serie

mitgeführt.


Tab.2: Pipettierschema zur Herstellung von Vergleichstandards

Volumen der Dotierlösung 1


Endvolumen Konzentration

[µl] [µl] [ml] [µg/L]

- - 25 0

- 25 25 0,5

- 100 25 2

- 250 25 5

50 - 25 20

125 - 25 50

250 - 25 100

625 - 25 250

Die Vergleichsstandards wurden in 1,8 ml Schraubgläschen für die HPLC zu je 1 ml

aliquotiert und bei -20 °C gelagert.

4.3 Probennahme und Probenaufbereitung

Die Urinproben wurden in verschließbaren dafür vorgesehenen Kunststoffbehältern

gesammelt und nach Harnabgabe (Mittelstrahl) unverzüglich bis zur Benutzung bei -20 °C

gelagert.

4.3.1 Probenaufbereitung des Urins

Vor der Analyse wurden die Proben bei Raumtemperatur equilibriert, gut durchmischt und

1 ml der Probe (bzw. aqua bidest für den Matrixeffektvergleich) in ein 1,8 ml-

Schraubgläschen für die HPLC pipettiert und mit 20 µl Ameisensäure (100%) sowie 20 µl

der Arbeitslösung des internen Standards (13C6 PHEMAs, 1 mg/L) versetzt. Das Gläschen

wurde anschließend kurz gut durchmischt und bei 1500 g für 10 min zentrifugiert. Bei

sichtbarem Sediment wurde der Überstand in ein neues 1,8 ml Schraubgläschen überführt.

Für die quantitative Analyse wurden anschließend 100 µl in das LC-MS-MS System

injiziert. Die Kreatininkonzentrationen des Urins wurden photometrisch nach Larsen et al.

bestimmt (Larsen, 1972).


4.4 Instrumentelle Arbeitsbedingungen

Die analytischen Messungen erfolgten an einer Gerätekopplung, bestehend aus einer

HPLC-Gradientenpumpe Agilent 1100 Series und einem API-3000 LC-MS-MS-System

der Firma Applied Biosystems. Die

100 µl Probe wurden mittels

isokratischer Pumpe zur

Anreicherung auf eine RAM Phase

befördert. Anschließend wurde der

Analyt im Rückflussmodus mittels

der Eluenten der Gradientenpumpe

über ein zeitgesteuertes 6-fach

Ventil (Tab.3) auf die analytische

Umkehrphasensäule transferiert

(Abb.7). Um die Lebensdauer der

analytischen Säule zu steigern

waren hier ein Vorfilter und eine

„Wächter“-Säule vorgeschaltet.

Abb.7: Anreicherungsschaltung (A) und Transferschaltung (B) des 6-fach Ventils

4.4.1 Hochleistungschromatographische Arbeitsbedingungen

Anreicherungssäule: Material: Stahl Länge: 25 mm Innerer Durchmesser: 4 mm Säulenfüllung: LiChroSpher RP-8 ADS Trennsäule: Material: Stahl Länge: 150 mm innerer Durchmesser: 4,6 mm Säulenfüllung: Phenomenex Luna C 8 (2), 3 µm


Trennprinzip: Reversed phase Temperatur: 35°C Detektion: Tandem-Massenspektrometrischer Detektor Mobile Phase: Eluent A: 0,1 % Ameisensäure pH 2,5 Eluent B: 100 % Acetonitril Eluent C: 95 % Eluent A, 5 % Acetonitril (Die Eluenten wurden vor ihrem Einsatz entgast) Methode: PHEMA (Projekt: Mercaptursäuren) Isokratische Pumpe: Eluent C Flussrate: 0,3 ml/min Gradientenpumpe: Eluent A bzw. Eluent B Gradient: s. Tabelle Tab.3: Programm der Gradientenpumpe

Zeit (min) Eluent A (vol.%) Eluent B (vol. %) Ventilposition

0 70 30 A

1,95 70 30 B

3,15 70 30 A

3,8 70 30 A

7,8 0 100 A

13,8 0 100 A

17,8 70 30 A

21,0 80 20 A

Stopzeit für das MS: 17 Minuten Flussrate: 0,3 ml/min Injektionsvolumen: 100 µl


4.4.2 Identifizierung der Analyte

Die Identifizierung der Mercaptursäuren erfolgte anhand Ihrer Retentionszeit und der

charakteristischen Ionenzerfälle, die für diese bestimmt wurden (Tab.4). Abgeglichen

wurden Zeit und Zerfall mit denen des internen markierten Standards. Abbildung 8 zeigt

exemplarisch zwei Massenspektren mit denen für PHEMA1 als auch 13C6 PHEMA1

spezifischen Mutter- bzw. Tochterionen.

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z, amu

4.0e5

8.0e5

1.2e6

1.6e6

2.0e6

2.4e6

2.8e6

3.2e6

3.6e6

Inten

sity, cps

281.9

152.9

123.1

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280

m/z, amu

4.0e5

8.0e5

1.2e6

1.6e6

2.0e6

2.4e6

2.8e6

3.2e6

3.6e6

Inten

sity, cps

288.1

159.1

128.9

O

OH

S

O

O-

NH CH3

OH

S

O

O-

NH CH3

O

OH

S

O

O-

NH CH3

O

OH

S

O

O-

NH CH3

O

13

13

13

13

13

13

OH

S

O

O-

NH CH3

O

13

13

13

13

13

13

OH

S

O

O-

NH CH3

O

13

13

13

13

13

13

Abb. 8: Massenspektren von PHEMA1 (oben) und 13C6 PHEMA1 (unten) mit

Ionenzerfällen (rot)


4.4.3 Massenspektrometrische Arbeitsbedingungen

Folgende Einstellungen wurden für die Ionenquelle verwendet: Ionisationmode: ESI negativ Source-Temperature: 450°C Ionspray-Voltage: -4500 V NEB (nebulizer gas): 12 CUR (curtain gas): 8 CAD (collisionally activated dissociation gas): 10 Einstellungen des Analysers: Q 1 Resolution: high Q 3 Resolution: high Scan Type: MRM (Multiple-Reaction-Monitoring) Dwell Time: 300 msec Parameterspezifische Einstellungen: Tab.4: Retentionszeit (RT), Ionenübergänge (Q1,Q3), DP, EP, FP, CE und CXP der

markierten und nicht markierten PHEMAs

RT Q 1 Q 3 DP EP FP CE CXP

PHEMA1 11,94 282 152,9 -36 -100 -10 -18 -7

122,9 -36 -100 -10 -18 -7

PHEMA2 12,22 282 152,9 -36 -100 -10 -18 -7

13C6PHEMA 1 11,92 288 158,9 -36 -100 -10 -18 -7

13C6 PHEMA 2 12,21 288 158,9 -36 -100 -10 -18 -7

DP (declustering potential), FP (focusing potential), EP (entrance potential), CE (collision energy), CXP (collision exit potential)


Die Trennleistung bedingt durch die HPLC-Säule und die daraus resultierenden

Retentionszeiten der verwendeten Substanz (Tab.4) können Schwankungen unterliegen

Deshalb wurde bei jeder Messung die Trennleistung überprüft.

4.5 Kalibrierung und Ermittlung der Analyseergebnisse

Von denen nach Kapitel 4.2.3 hergestellten Vergleichsstandards wurden 100 µl in die

HPLC injiziert. Die Kalibrierkurve wurde generiert, indem die Quotienten aus den

Peakflächen der Vergleichsstandards (PHEMA1 + PHEMA2) und des markierten internen

Standards (13C6 PHEMA1 + 13C6 PHEMA2) gegen die Konzentration aufgetragen wurden.

Die Kalibrierkurven waren im beschriebenen Konzentrationsbereich (Tab.2) linear.

Anschließend wurden mit Microsoft Excel die Regressionskoeffizienten ermittelt.

Abbildung 9 zeigt zwei exemplarische Kalibrierkurven. Zur Ermittlung der

Konzentrationen der unbekannten Proben wurde aus jeder Probe der Quotient der

Peakflächen der ermittelten gefundenen PHEMA1 + PHEMA2 und denen der Peakflächen

der internen Standards (13C6 PHEMA1 + 13C6 PHEMA2) bestimmt. Mit Hilfe der erstellten

Kalibrierkurve (vgl. 5.5) konnte die zugehörige Konzentration der Summe

PHEMA1+PHEMA2 (µg/L) der unbekannten Probe berechnet werden.

PHEMA gesamt im Urin

y = 0,0282x + 0,0129

R2 = 0,9995

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 50 100 150 200 250 300

PHEMA gesamt (µg/l Urin)

Qu

oti

ent


PHEMA gesamt im Urin

y = 0,0311x + 0,0493

R2 = 0,9993

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 50 100 150 200 250 300


Qu

oti

ent

Abb. 9: Darstellung zweier Kalibrierkurven

4.6 Standardisierung und Qualitätssicherung

Um die Qualität der Analyseergebnisse zu sichern, wurden zwei Präzisionskontrollproben

hergestellt, die in jedem Lauf mit analysiert wurden. Hierzu wurde eine Urinprobe eines

Nichtrauchers mit 3 (Q3) und 30 (Q30) µg/L Urin PHEMA hergestellt, aliquotiert und bis

zur jeweiligen Verwendung bei -20°C gelagert. Zusätzlich wurde eine Urinprobe einer

Person mit styrolbedingter Kurzzeitexposition im Rahmen einer Firmenbegehung als

weitere Kontrollprobe verwendet. Diese „Real-Probe“ hatte eine PHEMA-Konzentration

von 4,2 µg/L Urin (QReal).

4.7 Beurteilung des Verfahrens

4.7.1 Präzision in Serie und von Tag zu Tag

Die unter 4.6. beschriebenen Kontrollproben wurden zur Bestimmung der Präzision in

Serie acht Mal hintereinander analysiert. Zur Ermittlung der Präzision von Tag zu Tag

wurden die gleichen Kontrollproben an acht verschiedenen Tagen analysiert und ihre

Konzentrationen ermittelt. Die Ergebnisse hierzu sind in der Tabelle 5 aufgeführt.


Tab.5: Ergebnisse der Präzision in Serie und von Tag zu Tag

Präzision in Serie (n=8), MW Präzision von Tag zu Tag (n=8), MW

Konz. (µg/L) Stdabw. (%) Konz. (µg/L) Stdabw. (%)

Q3 3.3 4.4 3.4 6.3

Q30 31.2 1.5 31.6 3.0

QReal 4.2 3.7 4.3 6.6

Stdabw. (Standardabweichung), Konz. (Konzentration), MW (Mittelwert)

4.7.2 Richtigkeit

Um die Richtigkeit der Methode zu überprüfen, die durch unterschiedliche

Matrixbeschaffenheiten der Probe beeinflusst werden kann, wurden zum einen in Wasser

und Urin (Dotierung 0 – 250 µg/L), erstellten Kalibrierkurven miteinander verglichen.

Zum anderen wurden sieben individuelle Urinproben mit 10 µg/L der Analyte dotiert und

sowohl diese als auch die entsprechende Probe ohne Dotierung gemessen. Beide

Kalibrierkurven, sowohl im Wasser als auch im Urin verliefen linear. Ihre

Korrelationskoeffizienten waren gleich und die Steigungen besaßen nur eine Abweichung

von 3%, was sich im Rahmen der Variation befand. Die mittlere Wiederfindung der sieben

dotierten Individualurinproben lag bei 107% (Bereich 96,7 – 114,7 %), was unter den

gegebenen Bedingungen als ein sehr gutes Ergebnis zu betrachten war. Folglich kann

gesagt werden, dass der markierte interne Standard unterschiedliche Matrixeffekte sehr

effizient kompensieren kann und gleichzeitig unabdingbar für die Generierung

wiederholbarer und gesicherter Ergebnisse ist. Nach Abschätzung des Signal-Rausch

Verhältnisses ergab sich eine Nachweisgrenze von 0,3 µg/L. Abbildung 11 zeigt ein

Chromatogramm einer Nichtraucher Urinprobe ohne vorhandene Styrolexposition. Sowohl

die chromatografischen Peaks der 13C6- markierten internen Standards von PHEMA 1 und

PHEMA 2 als auch die Peaks der physiologisch vorhandenen PHEMA Konzentrationen

deutlich zu erkennen.


PHEMA gesamt Kalibrierkurve im Urin und im Wasser

y = 0.0316x + 0.0088

R2 = 0.9998Urin

y = 0.0307x + 0.0131

R2 = 0.9998Wasser

0

1

2

3

4

5

6

7

8

0 50 100 150 200 250 300


Qu

oti

ent

Abb. 10: Kalibrierkurven dargestellt in Urin ( ) und Wasser (- - - -)

Tab.6: Bestimmung der Richtigkeit in sieben verschiedenen Urinproben

Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4

Kreatinin (g/L) 0.37 0.53 0.76 1.05

PHEMA undotiert (µg/L) 0.40 < 0.3 < 0.3 < 0.3

PHEMA dotiert (µg/L) 10.1 10.6 11.5 10.8

Richtigkeit (%) 96.7 105.6 114.7 108.4

Urin 5 Urin 6 Urin 7

Kreatinin (g/L) 1.65 2.03 3.01

PHEMA undotiert (µg/L) < 0.3 < 0.3 < 0.3

PHEMA dotiert (µg/L) 10.9 10.9 10.7

Richtigkeit (%) 108.8 109.4 107.4


XIC of -MRM (6 pairs): 288.1/158.9 amu from Sample 24

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Zeit, min.

0.0

1.0e5

2.0e5

3.0e5

4.0e5

5.0e5

6.0e5

7.0e5

8.0e5

Inten

sität

13C6-PHEMA 212.21

XIC of -MRM (6 pairs): 282.0/152.9 amu from Sample 24

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16Zeit, min.

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

Inten

sität

PHEMA 212.22

PHEMA 111.94

13C6-PHEMA 111.92

Abb. 11: Exemplarische Darstellung eines Chromatogramms einer Nichtraucher

Urinprobe (Cotinin 4,8 µg/L) ohne arbeitsbedingter Styrolexposition und einer

PHEMA Konzentration von 0,4 µg/L

4.7.3 Frier-Auftau-Stabilität der Phenylhydroxyethyl Mercaptursäuren

Um die Stabilität der Mercaptursäuren beim Einfrieren und Auftauen zu testen, wurden

jeweils drei Proben jeder Qualitätskontrolle (Q3, Q30, QReal) einem Einfrier-Auftau-Prozess

an drei verschiedenen Tagen unterzogen. Anschließend wurden die Proben wie oben

beschrieben analysiert und mit den Ergebnissen der Präzision von Tag zu Tag verglichen.

Die sind in Tabelle 7 aufgeführt. Hierbei konnten keine signifikanten Abweichungen vom

Mittelwert beobachtet werden. Daraus lässt sich schließen, dass die Stabilität der PHEMAs

innherhalb der Einfrier- und Auftauprozesse erhalten bleibt.


Tab.7: Stabilitäten der Qualitätskontrollen Q3, Q30, QRea

Einfrier-Auftau-Stabilität (n=3x3)

Konz. (µg/L), MW Stdabw. (%)

Q3 3.4 2.7

Q30 32.3 4.5

QReal 4.5 3.8

Q (Qualitätskontrolle), MW (Mittelwert), Stdabw. (Standardabweichung)

4.7.4 Methodenspezifische Störeinflüsse

Die Beschaffenheit der Probenmatrix kann einen negativen Einfluss auf die

Ionisierungseffizienz haben, in dem Sinne, dass diese unterdrückt wird. Dadurch erhöht

sich das Signal-Rausch-Verhältnis und die Nachweisgrenze verschlechtert sich. Dieser

Effekt, der als sog. Quenching bezeichnet wird, kann in seltenen Fällen, speziell bei sehr

proteinreichen Proben, auftreten. Hier ist nach dem zentrifugieren darauf zu achten, das

Zentrifugat in ein neues Probengefäß zu überführen, so dass möglichst wenig Protein

verschleppt wird. Zusätzlich ist die Vorschaltung einer RAM-Phase empfehlenswert, da

hier ebenfalls übrig gebliebene Proteinreste zurückgehalten werden können. Verunreinigte

Standards verfälschen ggf. das Ergebnis. Besonders bei Bestimmungen von

Hintergrundbelastungen bspw. der Allgemeinbevölkerung, bei denen erwartungsgemäß

kleinste Konzentrationen bestimmt werden, kann eine Verunreinigung im Standard die

Analyse beeinflussen.


4.8 Applikabilität der Methode

Um die Applikabilität der Methode zu testen, wurden Urinproben von 40 Personen der

Allgemeinbevölkerung ohne berufliche Belastung mit Styrol auf das Vorhandensein

styrolspezifischer Mercaptursäuren untersucht. Bis zur Analyse waren alle Proben bei

-20°C gelagert.

Cotinin

Zusätzlich zu den von den Probanden angegebenen Informationen zum Raucherstatus,

wurde dieser mittels urinständigem Cotinin bestimmt. Die zu messenden Proben wurden

bei Raumtemperatur equilibriert, durchmischt und in ein 1,8 ml Schraubglas pipettiert.

Hinzugegeben wurden ein deuterierter interner Standard (d-3-Cotinin),

Ammoniumacetatpuffer und Acetonitril. Es folgte ein mehrmaliges resuspendieren mit

anschließender Zentrifugation der Proben. Der Überstand wurde bei Auftreten eines

sichtbaren Sediments vorsichtig in ein neues Probenglas pipettiert. Für die Analyse wurden

10 µl der Probe flüssigkeitschromatographisch aufgetrennt und anschließend tandem-

massenselektiv quantifiziert (Schettgen, 2009). Bei Messungen von Cotinin in Harnproben

wurde zur Bestimmung von Rauchern / Nicht-Rauchern ein Proben cut-off von 100 µg/L

definiert (Haufroid & Lison, 1998).

Alle Personen mussten im Vorfeld für die weitere Analyse ihrer Urinproben ihr

Einverständnis erklären. Zum direkten Vergleich mit einer akzidentellen Belastung

konnten noch Urinproben von zwei Personen, durch die im Rahmen einer

Betriebsbesichtigung einer styrolverarbeitenden Firma aufgekommenen Kurzzeitexposition

(~ 1,5 h) mit Styrol, hinzugezogen werden. Die Ergebnisse sind in Tab.8 zusammengefasst.

Die Urinproben der exponierten Personen zeigten deutlich erhöhte PHEMA

Konzentrationen im Vergleich zum Median der nicht exponierten. Auch im Vergleich der

Raucher zu den Nichtrauchern zeigte sich ein signifikanter Unterschied (p< 0,05) in der

PHEMA Konzentration.


Tab.8: Ergebnisse des Biomonitorings von Personen der Allgemeinbevölkerung

PHEMA

(µg/g Kreatinin)

Cotinin

(µg/L Urin)

Nichtraucher (n=22) Median

Spannbreite

< 0.3

< 0.3 – 1.4

4.0

2.9 – 7.7

Raucher (n=18) Median

Spannbreite

0.35

< 0.3 – 1.4

1398

283 - 4943

Exp.Person 1

Exp.Person 2

3.0

2.7

4.4

3.0


4.9 Diskussion der Methode

In der hier etablierten Methode konnte gezeigt werden, dass diese zuverlässige Messungen

der urinständigen Mercaptursäuren des Styrols erlaubt. Durch den Nutzen eines

markierten, internen Standards war es möglich potentielle Matrixeffekte zu kompensieren

und quantitativ sichere Ergebnisse zu generieren. Die Ergebnisse der Präzisionen als auch

der Richtigkeit mit sehr geringen Standardabweichungen zeigten die sehr gute

Wiederholbarkeit und Robustheit der Methode. Andere Autoren berichteten über die

chromatographische Auftrennung der beiden PHEMA Isomere in ihre Diastereomere, was

als Resultat 4 Peaks ergab (Manini et al, 2000). Unter den beschriebenen

chromatographischen Bedingungen konnte diese Auftrennung nicht nachvollzogen werden.

Definierte Standards der Diastereomere waren zudem nicht käuflich zu erwerben. Darüber

hinaus konnte der Zulieferer keine Angaben zum vorliegenden Verhältnis der einzelnen

Diastereomere zueinander machen, so dass hier kein weiterer Informationsgewinn zu

erwarten war. Hier wurde der Schwerpunkt auf die Optimierung der Methode für eine

maximale Sensitivität gelegt, durch die sogar PHEMA-Konzentrationen in der

Normalbevölkerung (Raucher und Nichtraucher) nachgewiesen werden konnten. Eine

signifikante Korrelation zwischen der Subgruppe der Raucher und dem spezifischen

Marker Cotinin, konnte nicht beobachtet werden (r=0,36; p=0,13), was auch auf andere

Expositionsquellen als durch Rauchen oder interindividuelle Aktivitäten von Styrol

metabolisierenden Enzymen (bspw. Glutathion S-transferasen) zurückgeführt werden

könnte. Bisher wurden Hintergrundbelastungen im Bereich der Nachweisgrenze von 0,7-

1.0 µg/L bei nicht-exponierten Personengruppen der Allgemeinbevölkerung nachgewiesen.

Dies allerdings ausschließlich bei dem rauchenden Anteil des untersuchten Kollektivs

(Manini et al, 2000). Auch Fustinoni et al. wiesen PHEMAs in ihrem Kontrollkollektiv

nach (<1,6-8 µg/L), allerdings ohne eine explizite Auftrennung von Rauchern und

Nichtrauchern (Fustinoni et al, 2008). Im Kollektiv, das innerhalb dieser Arbeit untersucht

wurde, konnte neben den Konzentrationen der Subgruppe der Raucher auch das

Vorkommen von Mercaptursäuren bei den Nichtrauchern ermittelt und definiert werden

(s.Tab.8) Beide Gruppen unterschieden sich signifikant voneinander (p<0.05). Die im

Vergleich zu den Werten der nicht exponierten Personen deutlich höheren Konzentrationen

der Kurzzeitexponierten zeigt die hohe Sensitivität der Methode.

Analytik der Hämoglobinaddukte im Blut

43

5 Analytik der Hämoglobinaddukte im Blut


Das Verfahren welches hier Anwendung fand, diente zur Bestimmung der

Hämoglobinaddukte des Styrols bei Personengruppen, die beruflich oder umweltbedingt

mit dieser Substanz in Kontakt kamen. Um die Addukte am N-terminalen Valin bestimmen

zu können, mussten die Erythrozyten aus gewonnenem Vollblut isoliert und von den

Plasmabestandteilen abgetrennt werden. Anschließend erfolgte die Lyse der Zellen. Über

Ethylacetat wurde in der Folge aus dem durch die Lyse gewonnenen Erythrozythämolysat

die Proteinfraktion, das Globin, ausgefällt und durch organisches Lösemittel getrocknet.

Der modifizierte Edmann-Abbau diente der Abspaltung des an die Proteinkette alkylierten

Valins, wodurch das sog. Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivat entstand. Durch eine

flüssig-flüssig Extraktion konnte dieses mittels Diethylether aus der Proteinmatrix

extrahiert werden. Weitere Waschschritte dienten der Eliminierung von Störsubstanzen.

Abschließend entstand der Analyt durch die Acetylierung des 2-Hydrox-2-Phenylethyl-

Valin-Pentafluorphenylthiohydantoin. Mittels kapillarer Gaschromatographie wurden

weitere Störsubstanzen vom Analyten abgetrennt. Die weitere Detektion und

Quantifizierung erfolgte massenspektrometrisch im electron-impact (EI) Modus.

Zur Quantifizierung wurden Kalibrierkurven vom Poolglobin von Nichtrauchern der

Allgemeinbevölkerung mit keiner bekannten arbeitsspezifischen Styrolbelastung erstellt

und verwendet. Dieses Poolglobin wurde mit unterschiedlichen Konzentrationen eines

Dipeptidstandards versetzt, der die letzten beiden N-terminalen Aminosäuren der

Hämoglobinkette simuliert, an denen sich das Addukt bildet. Diese Kalibrierstandards

wurden analog mit den zu untersuchenden Proben aufgearbeitet. Als interner Standard

wurde den Proben eine Substanz zugegeben, welche ein Valin-Addukt bildet, das sowohl

arbeitsmedizinisch als auch umweltmedizinisch nicht vorkommt (4-Hydroxyphenethyl-

bromid, 4-Fluorphenethylbromid).


44

5.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen

5.2.1 Geräte

Gaschromatograph-System (Hewlett Packard 6890 Series):

mit Split/Splitless-Injektor (7683 Series)

massenselektiver Detektor (MSD 5973)

Autosampler

Kapillargaschromatographische Säule:

DB-17HT; Länge 30 m; Ø innen 0,25 mm; Filmdicke 0,15 µm (Wicom)

Vortex Mixer (Heidolph)



Probenwippe (Ortho Diagnostic Systems)

EDTA Monovetten (Sarstedt)

Schraubgläschen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubdeckel (Grössen 5 ml,

20 ml) (Macherey-Nagel)

Bördelkappen für 1,5 ml Rollrandampullen (Macherey-Nagel)

Rollrandampullen 1,5 ml und Mikrovials (1 ml) (Macherey-Nagel)

Bördelzange (Macherey-Nagel)

Wasserbad (Memmert)

Reacti-Vap III Evaporatorstation (Pierce)


Mikroliterpipetten, verstellbar 10-100 (100- 1000) µl (Eppendorf)

Messkolben 10- und 25-ml (Brand)

Falcon Tubes; 50 ml (BD)


45

5.2.2 Chemikalien

Sofern keine weiteren Angaben gemacht werden, wurden alle benannten Chemikalien in

der Reinheit von mindestens p.a.-Qualität verwendet.

Natriumchlorid (Merck)


Salzsäure konzentriert 37 % (Merck)

2-Propanol (Merck)

Ethylacetat (Merck)

n-Hexan (Gaschromatographie) (Merck)

Formamid ultrapure (United States Biochemicals)

Natriumhydroxid (Merck)

Pentafluorphenylisothiocyanat (Fluka)

Diethylether (Merck)

Toluol (Gaschromatographie) (Merck)

Natriumhydrogencarbonat (Merck)

Acetonitril; HPLC grade (J.T. Baker)

Essigsäureanhydrid (Merck)

N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Val-Leu-anilid (Bachem)

4-Hydroxyphenetylbromid (Sigma-Aldrich)

4-Fluorphenethylbromid (Sigma-Aldrich)

Aceton (Gaschromatographie) (Merck)

5.2.3 Lösungen

50 mM HCl in 2-Propanol

In einen 1000 ml Messkolben wurden ca. 500 ml 2-Propanol vorgelegt. Es wurden 4,1 ml

konzentrierte Salzsäure (37%) zugegeben und der Messkolben mit 2-Propanol bis zur

Messmarke aufgefüllt.

0,9 %ige NaCl-Lösung

9 g NaCl wurden in einen 1000 ml Messkolben eingewogen und der Kolben mit aqua

bidest bis zur Messmarke aufgefüllt.


46

1 M NaOH-Lösung

2 g NaOH wurden in einem Becherglas eingewogen und mit ca. 30 ml aqua bidest

aufgelöst. Die Lösung wurde unter mehrmaligem Nachspülen mit aqua bidest in einen

50-ml Messkolben überführt und der Kolben mit Wasser bis zur Messmarke aufgefüllt.

Diese Lösung war im Kühlschrank ca. 3 Tage haltbar und sollte nach diesem Zeitraum

frisch angesetzt werden.

0,1 M Na2CO3-Lösung

530 mg Na2CO3 (wasserfrei) wurden in einem Becherglas eingewogen und in ca. 30 ml

aqua bidest aufgelöst. Die Lösung unter mehrmaligem Nachspülen mit aqua bidest in einen

50-ml Messkolben überführt und der Kolben mit aqua bidest bis zur Messmarke aufgefüllt.

Lösung des Standards

Lösung N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Val-Leu-anilid (1mM):

NH

O

CH3

CH3

CH3CH3

NH

OOH

NH

NH

O

CH3

CH3

CH3CH3

NH

OOH

NH

Abb.12: Molekülstruktur des N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Val-Leu-anilid

Stammlösung

10 ml Ethanol wurden in einem 20 ml Rundkolben vorgelegt, 8,51 mg des

Dipeptidstandards anschließend eingewogen und in den Rundkolben überführt.

Anschließend wurde dieser bis zur Messmarke mit Ethanol aufgefüllt, bis zur Lösung auf

dem Magnetrührer vermischt und bei -20° gelagert.

10 µl dieser Stammlösung wurden in einen mit bereits 5 ml Ethanol vorgelegten 10-ml

Rundkolben pipettiert und bis zur Messmarke mit Ethanol aufgefüllt Dotierlösung 1

(1 µM/L)


47

Zur Herstellung der Dotierlösung 2 (0,1 µM/L) wurden 5 ml Ethanol in einen 10 ml-

Rundkolben vorgelegt und 1 ml der Dotierlösung 1 hinzupipettiert. Anschließend wurde

der Rundkolben bis zur Messmarke mit Ethanol aufgefüllt.

Herstellung der internen Standards (ISTDs):

4-Hydroxyphenetylbromid (s) und 4-Fluorphenethylbromid (l)

10 mg bzw. 10 µl wurden in 100 µl Ethanol gelöst. Anschließend wurden diese zu 2,5 ml

Erythrozythämolysat und 100 µl 0,1 M Na2CO3 hinzugegeben und für 20 Stunden

durchmischt. Aus der Bindung an das N-terminale Valin des Globins entsteht das Addukt

(interner Standard) des 4-Hydroxyphenetylbromids (4-Hydroxyphenetylbromid-Globin,

HBP-G) bzw. des Fluorphenethylbromids (4-Fluorphenethylbromid-Globin, FBP-G). Im

Anschluss wurden die Globine isoliert (s.u. Globinisolierung). 100 mg des isolierten

Globins wurden in 3 ml Formamid gelöst und aus dieser Stammlösung eine Verdünnung

von 1:5 mit Formamid hergestellt.

Abb.13: Molekülstruktur des 4-Hydroxyphenetylbromid (HPB) (a), 4-Fluor-

phenethylbromid (FPB) (b) und der daraus hergestellten internen Standards 4-

Hydroxyphenetylbromid-Globin sowie 4-Hydroxyphenetylbromid-Globin

Br

OH+ Globin

CH3 CH3

NH2

O

OH Globin

NH

O

Addukt tragendes Globin4-Hydroxyphenetylbromid -

Globin

CH3

CH3

N-terminales Valin der

Globinseitenkette

(A) 4-Hydroxyphenetylbromid (HPB)

Br

F+ Globin

CH3 CH3

NH2

O

F Globin

NH

O

CH3

CH3

Addukt tragendes Globin4-Hydroxyphenetylbromid -

Globin

N-terminales Valin der

Globinseitenkette

(B) 4-Fluorphenetylbromid (FBP)


48

5.3 Probennahme und Probenaufbereitung

5.3.1 Gewinnung des Erythrozythämolysats

5 ml Vollblut wurden dem Probanden mittels einer EDTA Monovette entnommen.

Anschließend wurde die Monovette 10 min bei 800 g zentrifugiert, danach der obere

Flüssigkeitsstand an der Monovette markiert und die Plasamafraktion entnommen und

verworfen. Mit 0,9% NaCl wurde die Fraktion der Erythrozyten wieder auf das

Ursprungsvolumen aufgefüllt, kurz mit dem Vortexer durchmischt für 10 min bei 800 g

zentrifugiert. Erneut wurde der Überstand bis zur Erythrozytfraktion verworfen. Der

Vorgang wurde wiederholt, bis der Überstand der NaCl-Lösung klar und farblos war

(i.d.R. 2-3 Mal). Die Lyse der Erythrozyten wurde durch Auffüllen mit Wasser auf das

Ursprungsvolumen durchgeführt. Die erhaltenen Erythrozythämolysate konnten

abschließend bis zur weiteren Nutzung bis zu 12 Monate bei -20° C gelagert werden.

5.3.2 Globinisolierung

2 ml Erythrozythämolysat pro Probe wurden in ein 50 ml Plastikreaktionsgefäß pipettiert

und 12 ml 50 mM HCl - 2-Propanol hinzugegeben. Anschließend erfolgte ein 1-minütiges

vortexen der Proben. Um Zellreste zu sedimentieren erfolgte im Anschluss ein

Zentrifugationsschritt von 10 min bei 2773 g. Der klare, braune Überstand wurde in ein 20

ml Schraubglas dekantiert. Zur Ausfällung des Hämoglobins wurden langsam mittels

Tropftrichter 8 ml Ethylacetat zu jeder Probe hinzugegeben und diese anschließend für 60

Minuten bei 4°C gelagert. Es folgte ein 5-minütiges zentrifugieren bei 800 g, um das

ausgefällte Globin zu sedimentieren. Der Überstand wurde verworfen und das

sedimentierte Globin in 10 ml Ethylacetat resuspendiert, 2 min mit dem Vortexer

vermischt, erneut bei 800 g für 5 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser

Vorgang wurde wiederholt und das Globin abschließend in 5 ml n-Hexan aufgenommen

und für 2 min durchmischt. Nachdem die Proben nochmal für 5 min bei 800 g zentrifugiert

wurden, lag das gereinigte Globin als weißlich-graues Pulver vor, welches über Nacht im

Vakuumexsikkator getrocknet wurde.


49

Herstellung von Poolglobin

Um bei späteren Messergebnissen eine Kalibrierung durchführen zu können, wurde

Poolglobin hergestellt. Isoliertes Globin von verschiedenen Proben wurde hierzu vereinigt.

Wichtig war hierbei, dass das zu verwendende Kalibrierglobin von Personen stammte, die

Nichtraucher waren und keine bekannte berufliche oder umweltbezogenen Belastung durch

Styrol besaßen. Für die Kalibrierung wurden 1000 mg gepooltes Globin in einem

Becherglas eingewogen und unter langsamem Rühren auf dem Magnetrührer mit 30 ml

Formamid versetzt und gelöst. In 5 ml Schraubglasgefässen wurden Aliquots mit jeweils

3 ml dieser Lösung (≙ 100 mg Globin / 3 ml Formamid) angesetzt und bei -20°C gelagert.

5.3.3 Herstellung der Kalibrierstandards

Zur Herstellung der Kalibrierstandards wurden aus den in Kap. 5.2.3 beschriebenen

Lösungen des Standards und der internen Standards verschiedene Volumina zu den

aliquotierten Poolglobinen gegeben und somit Kalibrierpunkte nach folgendem

Pipettierschema erstellt.




Volumen der ISTDs

Konzentration

[µl] [µl] [ml] [pmol/g Globin]

- - 20 0

- 1 20 1

- 5 20 5

- 10 20 10

- 20 20 20

- 50 20 50

10 - 20 100

20

50

100

-

-

-

20

20

20

200

500

1000


50

5.3.4 Derivatisierung des Globins

100 mg des zuvor isolierten Globins der jeweiligen Probe wurden in ein 5 ml Schraubglas

abgewogen und in 3 ml Formamid bis zur Lösung auf dem Wippschüttler durchmischt.

Nach Lösung des Globins wurden 40 µl 1 M NaOH, 20 µl der Lösung der internen

Standards und 15 µl Pentafluorphenylisothiocyanat hinzugegeben und die Probe bis zum

nächsten Tag auf dem Wippschüttler durchmischt. Anschließend wurde die Probe für 90

Minuten im Wasserbad bei 45°C inkubiert. Nachdem die Proben abgekühlt waren, wurden

weitere 75 µl NaOH hinzugegeben und die Formamidphase zwei Mal mit jeweils 3 ml

Diethylether extrahiert. Dafür wurden die Proben zwischen jedem Extraktionsschritt

jeweils für eine Minute mit dem Vortex-Mixer durchmischt bevor sie anschließend bei

2773 g zentrifugiert wurden. Die aus jedem Extraktionsschritt gewonnen Etherphasen

wurden in einem neuen 5 ml Schraubglas gesammelt und unter einem leichten

Stickstoffstrom bis zur Trockenheit eingedampft. Die trockenen Rückstände der Proben

wurde anschließend in 1,5 ml Toluol und 2 ml aqua bidest aufgenommen, 1 Minute auf

dem Vortex-Mixer durchmischt und 10 min bei 1083 g zentrifugiert. Die Wasserphase

wurde verworfen, der Vorgang ein weiteres Mal mit 2 ml aqua bidest und ein

abschließendes Mal mit 2 ml 0,1 M Na2CO3-Lösung wiederholt. Nach diesem letzten

Schritt wurde die Toluolphase entnommen und in ein neues 5 ml Schraubglas überführt.

Bei geringer Wärmezufuhr wurde das Toluol unter leichtem Stickstoffstrom bis zur

Trockene eingeengt.

5.3.5 Acetylierung des Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivates

Der unter 5.3.4 erhaltene trockene Rückstand wurde in 150 µl Acetonitril, 20 µl Pyridin

und 20 µl Essigsäureanhydrid gegeben und über Nacht auf dem Wippschüttler

durchmischt. Anschließend wurden 1,5 ml Toluol und 2 ml aqua bidest hinzugegeben, 1

Minute auf dem Vortex-Mixer durchmischt und 10 min bei 1083 g zentrifugiert. Die

Wasserphase wurde verworfen der Vorgang ein weiteres Mal wiederholt. Danach wurde

die Toluolphase abgenommen, in eine 2 ml Rollrandampulle überführt und unter geringer

Wärmezufuhr bei leichtem Stickstoffstrom bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand

wurde in 50 µl Toluol resuspendiert und in ein Mikrovial überführt, dieses in die

Rollrandampulle gestellt und mit einer teflonkaschierten Aluminiumverschlusskappe

verschlossen. 1 µl dieser Lösung wurde in den Gaschromatographen injiziert.


51

Abbildung zeigt die Entstehung des am Globin gebundenen N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-

Valin über die Acetylierung zum Analyten – dem N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin-

Pentafluorphenylthiohydantoin.

NH

O

CH3

CH3

NHOH Globin

SN

FF

F

FF

O

CH3

OS

NF

F

F

F

FN

O

CH3

CH3

OHS

NF

F

F

F

FN

O

CH3

CH3

R

O

CH3

Modifizierter

Edman-Abbau

Acetylierung

2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin PFPTH-Derivat des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin

Acetyliertes PFPTH-Derivat des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin

Abb. 14: Entstehung des N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin- Pentafluorphenyl-thiohydantoin (Analyten)


52

5.4 Gaschromatographische Arbeitsbedingungen

Kapillarsäule DB 17-HT

30 m x 0,25 mm, 0,15 µm Filmdicke (Wicom)

Trägergas Helium 5.0

Flussgeschwindigkeit 1,20 ml/min (constant flow)

Injektion 1 µl, splitless

Inlet purge off time 1 min

Gerätetemperaturen

Injektor 300°C

Transferline 300°C

Säulenofen 90°C, 1 min halten

25 °C/min auf 120°C

10°C/min auf 255 °C

5°C/min auf 290°C, 20 min halten

25°C/min auf 310°C, 5 min halten

Ionisierung Negative chemische Ionisation(NCI)

Ionisierungsenergie 100,5 eV

Detektion Selected Ion Monitoring (SIM)

Messzeit pro Ion (dwell time) 100 ms

Elektronenmultiplier 306 V rel (~2106 V)


53

5.5 Analytische Bestimmung

Zunächst wurde ein sog. „Scan“ durchgeführt. Dies ist sinnvoll, um zum einen die Massse

als auch die Retentionszeit eines unbekannten Stoffes zu bestimmen; in diesem Fall der

Kalibrierstandard (N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Val-Leu-anilid) und die beiden zu

testenden internen Standards (4-Hydroxyphenetylbromid, 4-Fluorphenethylbromid).

Jeweils 10 µl der nach 5.2.3 erstellten Stammlösungen des Standards und der internen

Standards wurden mit Poolglobin verarbeitet und 1 µl splitless in den Gaschromatographen

injiziert. Die Pentafluorphenylthiohydantoine (PFPTH) wurden anhand ihrer

Retentionszeiten und ihrem Fragmentzerfall identifiziert. Zur Quantifizierung

herangezogene Ionenspuren sind unterstrichen. Die in Tabelle 10 angegebenen

Retentionszeiten können abhängig von der Trennleistung der verwendeten Kapillarsäule

Schwankungen unterliegen. Deshalb wurden das Trennverhalten und die daraus

resultierenden Retentionszeiten bei jeder Messung überprüft. Abbildung 15 zeigt die Scan-

Massenspektren und die dazugehörigen Mutterionen (komplett rot) mit den gebildeten

Fragmentionen (roter Bereich des Moleküls), die als Analyte verwendet wurden. Aus dem

N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin-PFPTH entstand mit größter Häufigkeit das

Fragmention mit einem Massen-Ladungs Verhältnis (m/z) von 322 (a), für

4-Hydroxyphenetyl-valin-PFPTH das Fragmention mit einem m/z von 323 (b) und für

4-Fluorphenethyl - valin – PFPTH das Fragmention mit einem m/z von 323 (c).

Tab.10: Darstellung der Retentionszeiten und detektierten Ionenspuren der Analyte

Analyt R (t)

(min) Registrierte Ionenspuren (m/z)

4-Hydroxyphenetyl-Valin-PFPTH 19.95 383

4-Fluorphenethyl - Valin - PFPTH 15.26 323

N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin-PFPTH 17.57

17.63 322, 383


54

240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 5000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

m/z

Abundanz 322

383296

466406 485276258 438352 364337307 454 498394

O

CH3

OS

NF

F

F

F

FN

O

CH3

CH3

O

CH3

OS

NF

F

F

F

FN

O

CH3

CH3

O

CH3

OS

NF

F

F

F

FN

O

CH3

CH3

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 5000

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

2000000

2200000

383

424

485

466

362 438305 318 404277 344263 332288 452 498252

Abundanz

m/z

O

SN

F

F F

F

F

NO

CH3CH3 O

CH3

O

SN

F

F F

F

F

NO

CH3CH3 O

CH3

a

b


55

260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 5000

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

5000000

323

296 311 351 370 386276 413446

258 402337 484472461431 498

Abundanz

m/z

F

SN

F

F F

F

F

NO

CH3CH3

F

SN

F

F F

F

F

NO

CH3CH3

Abb. 15: Massenspektrum mit Analyt-Fragmenten und Mutterion (komplett rot) des

2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin–PFPTH (a), 4-Hydroxyphenetyl-Valin-PFPTH (b),

4-Fluorphenethyl-Valin–PFPTH (c); Elektronenstoßionisation

Abbildung Abb. 16 zeigt ein exemplarisches Chromatogramm einer mit 50 pmol

Standardlösung dotierten Poolglobin-Probe. 20 µl der internen Standards wurden

hinzugegeben. Abgebildet sind hier die Retentionszeiten der Analyten 2-Hydroxy-

2-phenylethyl-Valin–PFPTH (oben), 4-Fluorphenethyl-Valin–PFPTH (mitte) und des

4-Hydroxyphenetyl-Valin-PFPTH (unten).

c

Ana

lyti

k de

r H

ämog

lobi

nadd

ukte

im B

lut

56

15.0

015

.50

16.0

016

.50

17.0

017

.50

18.0

018

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19.0

019

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20.0

020

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0

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00

100

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150

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000

Ab

un

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n 32

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21.7

0 to

322

.70)

: 50

.D 17.

5717

.63

15.0

015

.50

16.0

016

.50

17.0

017

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18.0

018

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19.0

019

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20.0

020

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0

500

00

100

000

150

000

200

000

Ion

323

.00

(322

.70

to 3

23.7

0): 5

0.D

15.2

6

15.0

015

.50

16.0

016

.50

17.0

017

.50

18.0

018

.50

19.0

019

.50

20.0

020

.50

0

500

00

100

000

150

000

200

000

Ion

383

.00

(382

.70

to 3

83.7

0): 5

0.D

19.9

5

Zei

t

Zei

t

Zei

t

Pe

nta

fluor

phen

ylth

ioh

ydan

toin

-De

rivat

des

2-H

ydro

xy-

2-P

he

nyl

eth

ylva

lin

Pe

nta

fluor

phen

ylth

ioh

ydan

toin

-De

rivat

des

4-F

luo

rph

en

eth

ylb

rom

id

Pe

nta

fluor

phen

ylth

ioh

ydan

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-De

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6: C

hro

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bin

pro

be

(50

pm

ol)


57

5.6 Kalibrierung

Die Kalibrierung erfolgte mit Vergleichsstandards, die in gelöstem Pooglobin zugegeben

wurden und genauso behandelt wurden, wie die zu analysierenden Proben. Es wurden zwei

interne Standards verwendet, die im Rahmen der Präzision in Serie und der Präzision von

Tag zu Tag auf ihrer Effizienz hin getestet wurden. Verwendet wurden hierfür das 4-

Hydroxyphenethylbromid sowie das 4-Fluorphenethylbromid. Die nach 5.3.4 und 5.3.5

aufgearbeiteten Proben und Kalibrierstandards wurden gemeinsam in den

Gaschromatographen injiziert. Kalibrierkurven wurden erstellt, indem der Quotient (Q) der

integrierten Peakflächen der einzelnen Addukte und des internen Standards gebildet und

gegen die zudotierte Konzentration im Kalibrierstandard (in pmol/g Globin) aufgetragen

wurde. Die Kalibrierkurven waren bis zu 1000 pmol/g Globin linear. Aus praktischen

Gründen wurde aber im weiteren Verlauf der Probenanalyse auf diesen hohen Bereich der

Kalibrierung verzichtet. Abbildungen 17 und 18 zeigen beispielhaft jeweils eine

Kalibrierkurve des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin deren Berechnung zum einen bezogen

auf den hergestellten internen Standard 4-Hydroxyphenethylbromid-Globin und zum

anderen bezogen auf 4-Fluorphenethylbromid-Globin erfolgte.

2-Hydroxy-2-phenyletylvalin im Blut; ISTD 4-Hydroxyphenethylbromid R(t)= 19.95

y = 0,0023x + 0,0071

R2 = 0,9999

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

0 200 400 600 800 1000 1200

[pmol/g Globin]

Ver

häl

tnis

Q

Abb. 17: Kalibrierkurve des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin bezogen auf 4-Hydroxyphenethylbromid-Globin


58

2-Hydroxy-2-phenyletylvalin im Blut; ISTD 4-Fluorphenethylbromid R(t)= 15.26

y = 0,0049x + 0,0633

R2 = 0,9963

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0 200 400 600 800 1000 1200

[pmol/g Globin]

Ver

häl

tnis

Q

Abb. 18: Kalibrierkurve des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin bezogen auf 4-Fluorphenethylbromid-Globin


59

5.7 Berechnung der Analyseergebnisse

Die Konzentration des ermittelten Hämoglobinadduktes wurde durch die Bildung eines

Quotienten (Q) der jeweiligen Probe bestimmt. Dieser setzt sich zusammen aus der

integrierten Fläche des Analytpeaks und der integrierten Fläche des verwendeten internen

Standards. Anhand der Steigung der erstellten Kalibrierkurve (K) konnte anschließend die

Konzentration (C) der Probe berechnet werden. (Formel C = Q/K)

Der Achsenabschnitt ist begründet durch den physiologischen Adduktgehalts des

Poolglobins, welches für die Kalibrierung eingesetzt wurde und musste nicht für die

Berechnung berücksichtigt werden. Der internationale und nationale Standard gibt vor,

dass der Gehalt des Globinadduktes auf ein Gramm Globin bezogen und als pmol/g Globin

angegeben wird.

5.8 Standardisierung und Qualitätssicherung

Um die Qualität der Analyseergebnisse zu sichern, wurden zwei Präzisionskontrollproben

hergestellt, die in jedem Lauf mit analysiert wurden. Hierzu wurden Poolglobinproben

hergestellt, diese mit jeweils mit 40 pmol (Q40) und 250 pmol (Q250) des Standards dotiert.

Die so hergestellten Poolglobine wurden anschließend bis zur jeweiligen Verwendung bei

-20°C eingefroren.

5.9 Beurteilung des Verfahrens

5.9.1 Präzision in Serie und von Tag zu Tag

Die nach 5.3.2 hergestellten Poolglobinproben wurden zur Bestimmung der Präzision in

Serie verwendet und an sechs, mit 40 und 250 pmol dotierten Proben durchgeführt. Zur

Ermittlung der Präzision von Tag zu Tag wurden die gleichen Kontrollproben, dotiert mit

40 und 250 pmol, an sechs unterschiedlichen Tagen aufgearbeitet, analysiert und ihre

Konzentrationen ermittelt. Die Ergebnisse hierzu sind in der Tab.11 und 12 aufgeführt. Bei

den Ergebnissen der Präzision in Serie (Q40 ) zeigt sich eine höhere Wiederfindungsrate bei

Verwendung des internen Standards HPB im Vergleich zu FPB. Umgekehrt bei den

Ergebnissen zu Q250. Deutlicher zeigt sich dieser Unterschied beim Vergleich der


60

Wiederfindungsraten der Messungen von Tag zu Tag (Q40). Hier liegt die Wiederfindung

bei HPB ungefähr 8 % oberhalb der des FPB

Tab.11: Ergebnisse der Präzision in Serie bezogen auf die internen Standards Standards HPB-G und FPB-G

Probe HPB-G FPB-G

Mittelwert (pmol/g Globin) 39,90 37,55

Stdabw. (pmol/g Globin) 3,31 2,43

Stdabw. (%) 8,29 6,46 Q40 (n=6)

Wiederfindungsrate (%) 99,75 93,87



Stdabw. (%) 4,45 3,95 Q250 (n=6)

Wiederfindungsrate (%) 93,25 100

HPB-G (4-Hydroxyphenetylbromid-Globin), FPB-G (4-Fluorphenethylbromid-Globin), Q (Qualitäts-

kontrolle)

Tab.12: Ergebnisse der Präzision von Tag-zu-Tag bezogen auf die internen Standards Standards HPB-G und FPB-G

Probe HPB-G FPB-G



Stdabw. (%) 12,14 11,09 Q40 (n=6)




Stdabw. (%) 7,43 16,28 Q250 (n=6)


HPB-G (4-Hydroxyphenetylbromid-Globin), FPB-G (4-Fluorphenethylbromid-Globin), Q (Qualitäts-

kontrolle)


61

5.9.2 Richtigkeit

Um die Richtigkeit dieser Methode zu überprüfen wäre ein Referenzmaterial mit

definiertem Adduktgehalt zu untersuchen und über die Erstellung der Kalibrierkurve mit

dem vorgegebenen „Sollwert“ abzugleichen. Ein solches Referenzmaterial stand zum

Zeitpunkt dieser Arbeit nicht zur Verfügung, weshalb die Beurteilung der Richtigkeit

vorliegender Methode nicht abschließend erfolgen konnte. Auch waren die PFPTH-

Derivate der Addukte als Analyte nicht käuflich erhältlich und entstehen erst im Laufe der

Probenverarbeitung aus den Dipeptiden. Die Verluste, die durch die Bearbeitung der

Proben entstanden sind konnten ebenfalls nicht bestimmt werden. Um mögliche Matrix-

bedingter Einflüsse auf die Analyseergebnisse zu ermitteln, wurde die Wiederfindungsrate

anhand unterschiedlicher Individualglobine untersucht.

Hierzu wurden fünf Globine jeweils undotiert und dotiert mit 40 pmol/g Globin analysiert

und hieraus die relative Wiederfindungsraten (WFR) bestimmt. Effekte der Matrix auf das

Ergebnis der Analyse können dadurch abgeschätzt werden. Tabelle 13 fasst diese

Ergebnisse zusammen. In den untersuchten Individualglobinen zeigten sich nur

geringfügige Schwankungen im Vergleich der gefundenen Konzentrationen zu den

dotierten Werten. Trotz unterschiedlicher Matrices konnte bei allen fünf Blutproben eine

Wiederfindung von ca. 99% erreicht werden. Diese minimalen Abweichungen liegen im

Schwankungsbereich der Methode. Ein Matrixeffekt auf das Analyseergebnis konnte auf

Basis dieser Ergebnisse nicht bestätigt werden. Die Richtigkeit und Robustheit der

Methode kann demzufolge als gewährleistet angesehen werden.

Tab.13: Wiederfindungsraten (WFR) in Individualglobinen; Werte kleiner

Nachweisgrenze von 1 pmol/g Globin wurden mit halber Nachweisgrenze berechnet;

alle Angaben in pmol/g Globin

1 2 3 4 5

HPV-

PFPTH HPV-

PFPTH HPV-

PFPTH HPV-

PFPTH HPV-

PFPTH

Leerwert (LW) <1 <1 <1 <1 <1

Dotierung (DT) 40 40 40 40 40

Gefunden 42,73 43,47 41,71 42,46 41,84

WFR (%) 105,51 % 107,33 % 102,99 % 104,84 % 103,31 %

HPV-PFPTH (N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin –Pentafluorphenylthiohydantoin)


62

Nach Abschätzung des Signal-Rausch Verhältnises ergab sich eine Nachweisgrenze von 1

pmol/g Globin. Abbildung 19 zeigt exemplarisch ein Chromatogramm einer

styrolexponierten Person mit einer Adduktkonzentration von 2,3 pmol/g Globin.

16.00 16.50 17.00 17.50 18.00 18.50 19.00 19.50

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

2800

3000

AbundanzIon 322.00 (321.70 to 322.70): 17.D Pentafluorphenylthiohydantoin-Derivat des 2-Hydroxy-2-Phenylethylvalin

Zeit

17.57 17.62

0

Abb. 19: Darstellung eines Chromatogramms einer styrolexponierten Person (2,3

pmol/g Globin)

5.9.3 Methodenspezifische Störeinflüsse

Neben dem zu analysierenden Globin, können besonders andere Proteine das Ergebnis

verfälschen. Deshalb ist vor der Fällung des gewonnenen Erythrozythämolysats darauf zu

achten, dass diese Fremdproteine weitestgehend abgetrennt werden. Besonders

Serumproteine, wie Albumin können die spätere Analyse beeinträchtigen. Das Waschen

der Erythrozyten mit 0,9% Kochsalzlösung sollte sorgfältig und ausreichend geschehen,

bevor anschließend die Isolierung des Globins erfolgt. Waschschritte mit Ethylacetat

sollten ebenfalls so oft durchgeführt werden, bis der Überstand klar und ungefärbt

erscheint. Vom Hersteller nicht vorgeschrieben jedoch empfehlenswert ist die Lagerung

des Formamids bei -20°C. Reines Formamid enthält herstellungsbedingt oft

Verunreinigungen mit Ammoniak oder Aminen. Diese können zur Beeinflussung des pH-

Wertes der Reaktionslösung beitragen, zu unerwünschten Nebenreaktionen führen und

dadurch die Gesamtausbeute aus dem modifizierten Edman-Abbau reduzieren. Die


63

Lagerung bei -20°C hilft weitere, lagerungsbedingte Verunreinigungen zu vermeiden. Mit

dem Gebrauch des hier verwendeten Formamids der Firma USB Biochemicals konnten

bisher gute Erfahrungen gemacht werden. Wie bereits erwähnt sollte die Kalibrierkurve in

gepoolter Globinlösung von Nichtrauchern angesetzt werden. Dies erhöht die Präzision

durch die Reduzierung der Variabilität innerhalb des Versuchsmaterials (Matrix). Die

Dotierung des Dipeptid-Standards in reiner Formamidlösung ohne die vorhandene

Proteinmatrix des Globins führt nicht nur zu großen Störungen in der Chromatographie

sondern auch zu sehr geringen Ausbeuten im Edman-Abbau. Bei der praktischen

Durchführung kann dies unter Umständen das „Auffinden“ des PFPTH-Analyten

erschweren, da diese erst mit Fortschreiten der Aufarbeitung der Blutproben aus den

Dipeptiden gebildet werden. Wie unter 5.5 bereits erwähnt, kann es hilfreich sein dafür

eine undotierte und eine hoch dotierte Probe im Scan-Modus zu analysieren und beide

Chromatogramme miteinander zu vergleichen. Erklärungen für dieses Phänomen sind nicht

bekannt, allerdings könnte ein Erklärungsversuch in der Tatsache liegen, dass das

Vorhandensein von vielen kationischen und anionischen Aminosäureresten einen pH-

puffernden Effekt haben kann. So wäre es vorstellbar, dass die Proteinmatrix des Globins

einen puffernden Effekt auf die Lösung während des Edman-Abbaus hat, für dessen

Reaktion ein neutrales Milieu erforderlich ist.

Störeinflüsse können außerdem hervorgerufen werden durch die Bildung einer gelartigen

Konsistenz des Formamid-Diethylether-Gemisches. Die Proteinmatrix könnte hier als eine

Art Emulgator wirken wodurch keine Phasentrennung mehr möglich ist. Mittels Zugabe

von 75 µl 1 molarer NaOH vor der Extraktion mit Diethylether kann dieses Gelieren

reduziert werden.

„Fronting“-Erscheinungen im Chromatogramm lassen Rückschlüsse auf Verschmutzungen

im Bereich des Injektionssystems oder am Beginn der analytischen Säule zu. Mit dem

Wechsel des Liners bzw. dem Kürzen der Säule können diese Erscheinungen oftmals

behoben werden (Schettgen, 2006). Um Reinigungsrückstände in den zu verwendenen

Probengläschen und damit potentielle Störsubstanzen in den Proben zu vermeiden,

empfiehlt es sich diese nur als einmal-Gläser zu verwenden oder vor Gebrauch mit Aceton

mehrfach durchzuspülen, zu trocknen und anschließend in aqua bidest für 60 min

auszukochen.


64

5.10 Diskussion der Methode

Mit der in dieser Arbeit beschriebenen Methode ließ sich das Addukt des Styrols N-(2-

Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin am N-terminalen Valin des Hämoglobins empfindlich und

reproduzierbar nachweisen. Durch den käuflich erwerbbaren Dipeptidstandard liegt eine

Standardsubstanz vor, die nicht nur eine hohe Reinheit aufweist, sondern auch den

kompletten Aufarbeitungsprozess mit durchläuft. Ähnliches gilt auch für die hergestellten

hier verwendeten internen Standards. Diese durchlaufen ebenfalls den gesamten

Aufarbeitungsprozess. Verluste von Probenmaterial während der Probenaufarbeitung und

Analytik selbst (bspw. durch Verdünnungseffekte, unvollständige Extraktionen oder

instrumentelle Unterschiede) können durch den internen Standard ausgeglichen werden. Im

Zuge der Präzision wurden in dieser Arbeit zwei interne Standards (HPB-G, FPB-G)

getestet. Bezüglich der sehr aufwendigen Probenaufarbeitung können die Ergebnisse der

Präzision (5.9.1) als sehr gut bezeichnet werden. Die Wiederfindungsraten von HPB-G Q40

waren in der Präzision in Serie als auch von Tag zu Tag oberhalb derer von FPB-G. Bei

Q250 wurden demgegenüber mit FPB-G bessere Werte erreicht (Tab.12). Da jedoch eher

von kleinen Expositionskonzentrationen ausgegangen werden musste, wurde bei weiteren

Messungen innerhalb dieser Arbeit HPB-G als interner Standard verwendet. Ein weiterer

Vorteil von HPB-G ist das Vorhandensein der Hydroxygruppe am Phenylring. Dadurch ist

gewährleistet, dass dieses Molekül auch den abschließenden Acetylierungsschritt bei der

Probenaufarbeitung mit durchlaufen kann. Aufarbeitungsbedingte Verluste oder

Reaktionsträgheiten von Probenmaterial speziell in diesem Schritt können durch diesen

internen Standard wesentlich besser kompensiert werden als über FPB-G, welches nur den

potentiellen Probenverlust bis zum Zeitpunkt vor der Acetylierung wiedergeben kann.

Um die Richtigkeit der Methode zu prüfen, wurden Wiederfindungsversuche durchgeführt.

Dazu wurden Dotierungen von Globin unterschiedlicher Matrices hergestellt und

gemeinsam mit der jeweiligen undotierten Probe aufgearbeitet. Die relativen

Wiederfindungsraten zwischen 102,99 % und 107,33 % konnte als sehr gut und damit ein

Matrixeffekt als marginal bezeichnet werden. Die verwendete Methode stellte bezogen auf

die Präzisions- und Wiederfindungsdaten als sehr robust dar. Im weiteren Verlauf der

Arbeit wurde anhand dieser Methode ein Biomonitoring von belasteten Personengruppen

durchgeführt (s. Kap.7).

Analytik der aromatischen Carbonsäuren

65

6 Analytik der aromatischen Carbonsäuren

Die hier beschriebene Analytik wird seit mehreren Jahren am Institut für Arbeitsmedizin

und Sozialmedizin der RWTH Aachen angewendet. Das Prinzip dieser Methode basiert

ursprünglich auf dem in der DFG Methodensammlung zu „Analysen in biologischem

Material“ aufgenommenen Verfahren von Lewalter und Schucht (Lewalter, 1984). Im

Rahmen von erfolgreichen Teilnahmen an Ringversuchen wird diese Methode qualitativ

und quantitativ jährlich bestätigt. Zu diesem Verfahren werden im Folgenden Ergänzungen

bzw. Abwandlungen beschrieben.


Die sich im (mit Essigsäure angesäuerten) Harn befindlichen aromatischen Carbonsäuren

Mandelsäure (MA) und Phenylglyoxylsäure (PGA) wurden mit Diethylether extrahiert. Als

interner Standard wurde die 3-Chlor-4-hydroxybenzoesäure verwendet. Der aus der

eingeengten Etherphase gewonnene Rückstand wurde in einem Milliliter der mobilen

Phase gelöst, die beiden Metabolite durch HPLC getrennt und mittels UV detektiert. Die

zur Kalibrierung benötigten wässrigen Standards wurden parallel mit den zu bestimmenden

Proben aufgearbeitet und analysiert. Deren Peakflächen wurden anschließend auf die des

internen Standards bezogen und der erhaltene Quotient als Funktion der dotierten

aromatischen Carbonsäuren zur Kalibrierkurve aufgetragen.

6.2 Geräte, Chemikalien und Lösungen

6.3 Geräte

HPLC-System mit UV-Detektor (L-7400), Autosampler (L-7200) und Pumpe (L-7100),

Interface (D-7000) (Merck-Hitachi)

Chromatographische Säule: HyPurity C18; 250 x 4,6 mm; Teilchendurchmesser 5 µm

(Thermo Electron Corporation)



66

1,8 ml Schraubgläser mit dazugehörigen PTFE-kaschierten Septen und Schraubkappen

(Macherey-Nagel)

Schraubgläschen mit teflonkaschierten Gummisepten und Schraubdeckel (5 und 20 ml)

(Macherey-Nagel)

Verschlusszange (Macherey-Nagel)

pH-Meter mit Einstabmesskette (Mettler-Toledo)

Mikroliterpipetten, verstellbar 10-100 (100- 1000) µl (Eppendorf)

Erlenmeyerkolben 10, 25, 50 1000, 2000-ml (Brand)



Labor „Blaukopfflaschen“ 1 und 2 Liter (Schott)

Ultraschallgerät (Bandelin Sonnorex RK510)

Wasserbad (Memmert)

Probenschüttler (Kottermann 4020)

Reacti-Vap III Evaporatorstation (Pierce)

Urin-Kunsstoffbehälter (Sarstedt)

6.4 Chemikalien

Sofern keine weiteren Angaben gemacht werden, wurden alle benannten Chemikalien in

der Reinheit von mindestens p.a.-Qualität verwendet.

Essigsäure (100%) (Merck)

Methanol Suprasolv (Merck)

Trikaliumphosphattrihydrat (K3PO4 x 3H2O) (Merck)

Salzsäure, 37% (HCL) (Merck)

Diethylether (Merck)

Phenylglyoxylsäure (PGA) (Fluka)

DL-Mandelsäure (MA) (Merck)

3-Chlor-4-hydroxybenzoesäure (Sigma-Aldrich)


Phosphorsäure konz. (H3PO4) (Merck)

Methanol (Merck)


67

6.5 Lösungen

Phosphatpuffer 0,01 M

5,33 g K3PO4 x 3H2O wurden in 2 Liter aqua bidest gelöst und anschließend 3,25 ml

H3PO4 hinzugegeben und der pH-Wert auf 3.0 eingestellt. Zur Vermeidung von Blasen im

Puffer, wurde dieser in der Folge für 30 Minuten in das Ultraschallbad gestellt.

Laufmittel A

Phosphatpuffer 0,01 M und Methanol wurden im Verhältnis 4:1 gemischt

Laufmittel B

Methanol/H2O im Verhältnis 1:1

Spülphase

Methanol/Wasser im Verhältnis 1:1

Interner Standard

100 mg 3-Chlor-4-hydroxybenzoesäure wurden in 5 ml Ethanol gelöst und mit aqua bidest

auf 50 ml aufgefüllt (2g/L). Bei schlechter Löslichkeit, konnte der Standard durch leichtes

Erwärmen im Ultraschallbad zur Lösung gebracht werden.

Stammlösung für Kalibrierstandards

100 mg Mandelsäure und 100 mg Phenylglyoxylsäure wurden in 2,5 ml Methanol

vollständig gelöst (erwärmen u. Ultraschall) und mit aqua bidest auf 10 ml aufgefüllt

(10g/L).


68

Kalibrierstandards

Die Kalibrierstandards wurden in aqua bidest nach folgendem Pipettierschema angesetzt:

Tab.14: Pipettierschema für die Kalibrierkurve MA und PGA

Stammlösung Endvolumen Konzentration

Standard

[µl] [ml] [mg/L]

0 50 0

25 50 5

50 50 10

125 50 25

250 50 50

375 50 75

500 50 100

1000 50 200

Zusätzlich wurde noch eine Qualitätskontrolle (35 mg/L) (Q35) in gepooltem Urin von vier

Personen der Allgemeinbevölkerung angesetzt und parallel mit den Proben und den

Kalibrierpunkten verarbeitet.

6.6 Probennahme und Probenaufarbeitung

Die Urinproben (Mittelstrahl) wurden in verschließbaren dafür vorgesehenen

Kunststoffbehältern gesammelt, mit 1 ml Essigsäure/100 ml Harn angesäuert und

unverzüglich bis zur Benutzung bei -20 °C gelagert.

6.6.1 Probenaufbereitung

1 ml des gewonnenen Harns bzw. Wassers (Probe, Standard oder Leerwert) wurden in ein

20-ml Schraubglas vorgelegt und dazu 100 µl der hergestellten Lösung des internen

Standards pipettiert. Anschließend wurden 50 µl 37 % HCL und 5 ml Diethylether

zugegeben. Das Schraubglas wurde verschlossen und für 10 Minuten auf dem

Probenschüttler gelegt. Es folgte ein Zentrifugationsschritt für ebenfalls 10 Minuten bei

1083 g. Die obere Etherphase wurde anschließend entnommen und in ein 5 ml Schraubglas

überführt.


69

Im Folgenden wurde der Ether unter leichtem Stickstoffstrom bis zur Trockene eingeengt.

Der Rückstand wurde abschließend in 1 ml Laufmittel A aufgenommen, in 1,8 ml

Schraubgläschen überführt und verschlossen. 10 µl wurden in die HPLC injiziert.

6.7 Gaschromatographische Arbeitsbedingungen

Säule: HyPurity C18; 250 x 4,6 mm, Teilchendurchmesser 5 µm

(Thermo Electron Corporation)

Säulentemperatur: 30°C

Trennprinzip: Reversed phase

Detektor: UV-Detektor (L-7400); 252 nm (PGA); 220 nm (MA)

Flussgeschwindigkeit: 0,9 ml/min (constant flow)

Laufmittel A: 0,01 M Phosphatpuffer:MeOH 4:1

Laufmittel B: MeOH/H2O (1:1)

Druck: ~ 163 bar


70

6.8 Analytische Betimmung

10 µl des in 1 ml Rückstand aufgenommenen Analyten wurden in den

Hochdruckflüssigkeitschromatographen injiziert.

Tab.15: Gradientenprogramm zur Bestimmung der aromatischen Carbonsäuren

Zeit (min) Laufmittel A (%) Laufmittel B (%) Flussgeschwindigkeit

(ml/min)

0,0

24,5

100,0

100,0

0,0

0,0

0,9

0,9

30,0 20,0 80,0 0,9

38,0 20,0 80,0 0,9

39,0 0,0 100,0 0,9

44,0 0,0 100,0 0,9

45,0 100,0 0,0 0,9

48,0 100,0 0,0 0,9

6.9 Kalibrierung und Berechnung der Analyseergebnisse

Die hergestellten Vergleichsstandards als auch die Qualitätskontrolle (Q35) wurden parallel

mit den zu untersuchenden Proben aufgearbeitet und im selben HPLC-Lauf mit analysiert.

Die jeweiligen Retentionszeiten lagen für PGA bei R (t) ~7,13 min und für MA bei R (t)

~9,57 min Diese Retentionszeiten können nur als Anhaltspunkt dienen und abhängig von

der Trennleistung der verwendeten Kapillarsäule Schwankungen unterliegen. Die

Berechnung der Analyseergebnisse erfolgte analog zu Kapitel 5.7.

Abbildung 20 zeigt zwei exemplarische Kalibrierkurven zur Berechnung der

Konzentrationen von Phenylglyoxylsäure (oben) und Mandelsäure (unten), die für jede

Probenaufarbeitungsreihe parallel mit erstellt wurde. Abbildung 21 zeigt zwei

Chromatogramme der aromatischen Carbonsäuren. Chromatogramm „A“ zeigt die

jewiligen Peaks von MA und PGA der Kalibrierdotierung von 25 mg/L und dem internen

Standard mit ihren jeweiligen Retentionszeiten. Im unteren Chromatogramm „B“ sind die

gleichen Peaks in einer Realprobe einer nicht beruflich belasteten Person gekennzeichnet.


71

Abb. 20: Kalibrierkurve für Phenylglyoxylsäure (oben) und Mandelsäure (unten),

“area under curve” (AUC), interner Standard (IS), Mandelsäure (MA),

Phenylglyoxylsäure (PGA)

Kalibrierkurve PGA

y = 0,0046x

R2 = 0,9976

0,000000,100000,200000,300000,400000,500000,600000,700000,800000,900001,00000

0 50 100 150 200 250

[PGA] mg/L

AU

C P

GA

/IS

Kalibrierkurve MA

y = 0,0015x + 0,0003

R2 = 0,999

0,00000

0,05000

0,10000

0,15000

0,20000

0,25000

0,30000

0,35000

0 50 100 150 200 250

[MA] mg/L

AU

C M

A/IS


72

MAPGA IS

MAPGA

A

B

Abb. 21: Darstellung zweier exemplarischer Chromatogramme der Analytik von

Phenylglyoxylsäure (PGA) und Mandelsäure (MA). A: Chromatogramm mit

dotierten Standards von 25 mg/L B: Darstellung einer Realprobe ohne berufliche

Exposition mit Styrol (2,5 mg/L MA_PGA); IS (interner Standard 3-Chlor-4-

hydroxybenzoesäure)

Humanbiomonitoring belasteter Personengruppen und der Allgemeinbevölkerung

73

7 Humanbiomonitoring belasteter Personengruppen

und der Allgemeinbevölkerung

7.1 Kollektivbeschreibung

7.1.1 Beruflich belastete Personengruppen

Für die Durchführung des biochemischen Effektmonitorings anhand der in unserem Institut

angepassten und etablierten Methoden, erklärten sich zwei styrolverarbeitende Firmen

(GfPI ) dazu bereit ein Biomonitoring ihrer Mitarbeiter durchführen zu lassen und die

gewonnenen Ergebnisse für die vorliegende Arbeit in anonymer Form weiterzuverwenden.

Während in der ersten Firma (Fa.1) die Nutzung von Styrol-basierten Harzen

kontinuierlich durchgeführt wurde, ist in der zweiten Firma (Fa.2) Styrol zum Zeitpunkt

der Probennahme nach längerem wirtschaftlich bedingtem Produktionsstop erst seit 6

Wochen verarbeitet worden (Probennahme nach 6 Wochen Exposition). Durch

produktionsspezifische Unterschiede ergaben sich dennoch in Firma 1 potentiell weniger

hohe Expositionen als in Firma 2. Zur analytischen Bestimmung der Konzentrationen der

Mercaptursäuren als auch der aromatischen Carbonsäuren und Cotinin im Urin und der

Hämoglobinaddukte im Blut, wurden von den Mitarbeitern vor Ort jeweils vor ihrer

Schicht (VS) als auch nach ihrer Schicht (NS; Δt~8h) Urin sowie zu Beginn ihrer Tätigkeit

eine Vollblutprobe gewonnen. Die Teilnahme am Biomonitoring setzte eine vorab vom

Mitarbeiter zu unterschreibende Probandeninformation „Biomonitoring-Styrol“ als auch

eine Einwilligungserklärung voraus (s. Anlage), wodurch vor Ort einige Probanden nicht

mehr mit in das Humanbiomonitoring mit eingeschlossen werden konnten. Insgesamt

konnten in Fa.1 sieben und in Fa.2 29 Probanden für die Teilnahme gewonnen werden.

Alle Probanden waren Männer im Alter zwischen 26 und 60 Jahren mit einem

Altersmedian von 50 (Fa.1) und im Alter zwischen 21 und 61 mit einem Altersmedian von

46 (Fa.2). Die Tätigkeitsjahre lagen im Median bei 9 Jahren (Fa.1) und 10 Jahren (Fa.2).

Bei allen 35 Personen bestand der Verdacht einer potentiellen Belastung mit Styrol als

Copolymer durch firmenspezifische Arbeiten mit Vinylesterharzen. Die Bestimmungen der

einzelnen Metabolite erfolgten analog beschriebener Methoden.


74

7.1.2 Kontrollkollektiv der Allgemeinbevölkerung

Über die berufliche Belastung mit Styrol hinaus stellte sich die Frage nach

umweltbedingten Styrolbelastungen in einem Kontrollkollektiv (Kon) bestehend aus

Probanden der Allgemeinbevölkerung. Es wurden hierzu 18 Personen untersucht, bei

denen eine beruflich bedingte Styrolexposition nicht zu erwarten war. Eine unterschriebene

Information als auch eine Einverständniserklärung war auch hier die Voraussetzung um an

dem Humanbiomonitoring teilzunehmen. Pro Person wurden sowohl eine Urinprobe als

auch eine Vollblutprobe akquiriert und diese anschließend sofort bis zur Lagerung bei

-20°C aufgearbeitet. Da bei diesen Personengruppen kein Schichtsystem bestand, wurde

hier jeweils ein Wert für den jeweiligen Metaboliten erhoben. Alle Probanden waren

Männer im Alter zwischen 21 und 79 Jahren mit einem Altersmedian von 44. Unter ihnen

befanden sich acht Raucher und zehn Nichtraucher.

7.1.3 Auswertung

Die statistische Auswertung und Berechnung der Ergebnisse wurde mit Microsoft Excel

Office 2003 (Microsoft, 1985-2003) und Polar Engineering PASW Statistics 18 (IBM,

1993-2007) durchgeführt. Der Vergleich der Metabolitkonzentrationen von Vorschicht zu

Nachschicht innerhalb einer Firma wurde mittels Wilcoxon Rangsummentest für

abhängige und analog die Vergleiche zum Kontrollkollektiv der Allgemeinbevölkerung

mittels Wilcoxon Rangsummentest für unabhängige Stichproben durchgeführt. Als

signifikant wurde p < 0,05 (*) und p < 0,01 (**) angenommen. Die Beziehungen der

einzelnen VS/NS Metabolite zueinander wurden mittels zweiseitiger Spearman Korrelation

untersucht. Da in der Gruppe der Unbelasteten keine Schichtsysteme vorhanden waren,

wurden die Korrelationen im Kontrollkollektiv unabhängig von dem Kollektiv der zuvor

zusammengefassten Firmenmitarbeiter bestimmt. Die Bewertung des

Korrelationskoeffizienten (r) wurde anhand folgender Einstufung vorgenommen (Sachs &

Hedderich, 2006).


75

0,0 ≤ r ≤ 0,2: kein bis geringer Zusammenhang

0,2 ≤ r ≤ 0,5: schwacher bis mäßiger Zusammenhang

0,5 ≤ r ≤ 0,8: deutlicher Zusammenhang

0,8 ≤ r ≤ 1,0: hoher bis perfekter Zusammenhang

Für die Definition von Ausreißerwerten (○) wurde ein Interquartilsabstand (englisch IQR

interquartile range) von 1,5 – 3 IQR’s ab Boxende angenommen. Extremwerte (◊) lagen

per Definition oberhalb von 3 IQR’s ab Boxende.

Mittels hierarchisch linearer Regression wurde überprüft, ob die Konzentrationen der

einzelnen Metabolite (VS/NS Mercaptursäuren, VS/NS aromatische Carbonsäuren und

Hämoglobinaddukte) mit der Zugehörigkeit zu der exponierten Gruppe (Fa.1, Fa.2) vs. des

Kontrollkollektivs zu erklären sind. Hierfür wurde die Gruppenzugehörigkeit mittels

Dummy-Codierung in die Variable „Gruppe“ (0 = Kontrollkollektiv, 1 = Firmenkollektiv)

vorgenommen. Für die Durchführung der Regression wurden im ersten Schritt die

Kontrollvariablen Alter und Cotinin in das Regressionsmodell aufgenommen. Im zweiten

Schritt wurde die Gruppenvariable hinzugefügt.

Die Einstufung des Raucherstatus erfolgte anhand eigener Angaben der Probanden als auch

durch die Bestimmung von Cotinin, wobei der Cotininwert auschlaggebend war. Bei einem

cut-off von 100 µg/L wurden Nichtraucher von Rauchern unterschieden. Ein Auszug der

Fragen aus dem Fragebogen zur Ermittlung des Raucherstatus und des Alters ist im

Anhang dargestellt.


76

7.2 Ergebnisse des Humanbiomonitorings

Die Ergebnisse des biochemischen Effektmonitorings der untersuchten Kollektive für alle

untersuchten Metabolite sind in Tabelle 16 zusammengefasst. Hier wird deutlich, dass bei

allen drei Gruppen (Fa.1, Fa.2 und Allgemeinbevölkerung) Styrol-assoziierte Biomarker

nachgewiesen werden konnten.

Bei den Konzentrationen der aromatischen Carbonsäuren konnte zwischen den

Vorschichtwerten (VS-MA_PGA) und Nachschichtwerten (NS-MA_PGA) ein deutlicher

Anstieg beobachtet werden. Die MA_PGA Werte der Vorschicht lagen im Median für Fa.1

bei 39,98 mg/g und für Fa.2 bei 54,48 mg/g und damit fast um eine Zehnerpotenz oberhalb

des Medians des Kontrollkollektivs (6,63 mg/g). Der biologische Arbeitsplatztoleranzwert

für MA_PGA (die Summe der Werte der Mandelsäure und der Phenylglyoxylsäure); (600

mg/g Kreatinin) (DFG, 2009) wurde in Fa.1 in den Vor- und Nachschichtproben

unterschritten, während in der Nachschicht der Fa.2 dieser Wert in Einzelproben

überschritten wurde.

Die Konzentrationen der Hämoglobinaddukte lagen im Bereich von <1 – 2,76 pmol/g

Globin bei Fa.1 und zwischen <1 – 3,45 pmol/g Globin bei Fa.2. Werte die unterhalb der

Nachweisgrenze von 1 pmol/g Globin lagen, wurden für die weiteren Berechnungen auf

die halbe Nachweisgrenze (0,5 pmol/g Globin) gesetzt. Alle Probanden des

Kontrollkollektivs lagen unterhalb von 1 pmol. Der Maximalwert in der Fa.1 betrug das

6-fache, der in Fa.2 das 7-fache des Wertes der unbelasteten Personengruppe.

Bei der Beobachtung der Vorschicht- und Nachschichtwerte der PHEMAs konnte ebenfalls

ein Anstieg der Konzentrationen von VS zu NS im Median beobachtet werden (Tab.16).

Die Medianwerte der Fa.1 betrug dabei im Vergleich zum Kontrollkollektiv das 60-fache

(VS) bzw. das 101-fache (NS) und die der Fa.2 das 83-fache (VS) bzw. 251-fache (NS) des

Medianwertes der Kontrollen von 0,39 µg/g Kreatinin. Beim Vergleich der

Schichtmediane der Firmen lag der Vorschichtmedian der Fa.2 bei dem 1,4-fachen Wert

der Fa.1 und im Nachschichtmedian 2,5-fach oberhalb des Medians der Fa.1.

Die Cotininwerte, die zur Einstufung des Raucherstatus verwendet wurden, lagen zwischen

2,75 – 1945,74 µg/L (Fa.1), 2,98 – 3102,01 µg/L (Fa.2) und 3,10 – 3026,80 µg/L

(Kontrollkollektiv) (Tab.16).

Insgesamt zeigten sich die höchsten Konzentrationen bei den aromatischen Carbonsäuren

(Bereich: mg/L). Weniger hohe Konzentrationen konnten bei den Mercaptursäuren


77

(Bereich: µg/L) und die kleinsten Konzentrationen bei den Hämoglobinaddukten

nachgewiesen werden (Bereich: pmol/g Globin ≙ ng/L).

Da sich in der linearen Regression (Tab.19-25) keine signifikante Ausprägung von Cotinin

auf die Konzentration der Mercaptursäuren und aromatischen Carbonsäuren beim beruflich

exponierten Kollektiv zeigte, wurde für dieses Kollektiv auf eine tabellarische Darstellung

von Rauchern und Nichtraucher verzichtet. Tabelle 17 zeigt das Kontrollkollektiv der

Allgemeinbevölkerung unterteilt in Raucher und Nichtraucher. Raucher zeigten im Median

mehr als ein Vierfaches der Konzentrationen der aromatischen Carbonsäuren im Vergleich

zu den Nichtrauchern. Die Konzentrationen der Mercaptursäuren lagen bei den

Nichtrauchern im Gegensatz zu denen der Raucher (0,74 µg/g Kreatinin) im Median

unterhalb der Nachweisgrenze. Hämoglobin Adduktkonzentrationen lagen bei beiden

Gruppen unterhalb der Nachweisgrenze.

Hum

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bela

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78

Tab

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99,9

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,93

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0,87

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21

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Fir

ma

1 (n

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)

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60 –

148

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3,70

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87,0

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1 –

2,7

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11 –

172

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57 –

194

5,74

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ian

32,2

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= 2

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414

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659,

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302

6,80

Hum

anbi

omon

itor

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bela

stet

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79

Tab

.17:

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84

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– 22

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52 -

302

6,80


80

Abbildungen 22 bis 26 zeigen Boxplot-Diagramme der Vergleiche der jeweiligen

Metaboliten in der Vor- und Nachschicht innerhalb einer Firma als auch im Vergleich zum

entsprechenden Metaboliten des Kontrollkollektivs.

Es fanden sich signifikante Unterschiede (s. Kap. 7.1.3.) der PHEMA Konzentrationen

beim innerbetrieblichen Vergleich von VS zu NS (*) als auch im Vergleich der VS und der

NS-Werte zu den Werten der Kontrollen (**) (Abb.22). Bei der Gegenüberstellung der

Mercaptursäurenkonzentrationen in der VS und der NS zeigten sich ebenfalls signifikante

(**) Unterschiede bei Fa.2. Auch gegenüber den Konzentrationen der Referenzgruppe

unterschieden sich die Werte aus VS und NS der Firmen jeweils signifikant (**) (Abb.23).

Die VS und NS Werte der aromatischen Carbonsäuren der Fa.1 zeigten wesentliche

Unterschiede (*) zu den Werten der Kontrollen. Im innerbetrieblichen Vergleich von VS

zu NS konnten die Werte ebenfalls als signifikant angesehen werden (*). Im Gegensatz zu

den PHEMA Werten der Kontrollen, wurden hier drei Extremwerte beobachtet (Abb.24).

Beide Schichtwerte (VS, NS) der Carbonsäuren zeigten einen deutlichen Unterschied (**)

zur Gruppe der nicht-Exponierten und auch die Schichwerte untereinander konnten

signifikant (**) voneinander unterschieden werden (Abb.25).

In beiden Fällen (Fa.1, Fa.2) ergaben sich signifikante Unterschiede der

Hämoglobinadduktkonzentrationen beim Vergleich der exponierten Firmenarbeiter mit den

unbelasteten Probanden (Abb.26).


81

Abb. 22: Vergleich des Metaboliten PHEMA (VS, NS) innerhalb Fa.1 und mit der

Kontrollgruppe (◊ = Extremwerte ○ = Ausreißer; p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**) )

Abb. 23: Vergleich des Metaboliten PHEMA (VS, NS) innerhalb Fa.2 und mit der


Firma 1 KontrollenFirma 2

****

*


****

**


82

Abb. 24: Vergleich des Metaboliten MA_PGA (VS,NS) innerhalb Fa.1 und mit der


Abb. 25: Vergleich des Metaboliten MA_PGA (VS,NS) innerhalb Fa.2 und mit der



**

*


****

**


83

Abb. 26: Vergleich der Hämoglobinaddukte mit der Kontrollgruppe (◊ =

Extremwerte ○ = Ausreißer, p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**))

Tabelle 18 zeigt die jeweils berechneten Korrelationskoeffizienten (R) der Metabolite

Vorschicht PHEMA_Krea (µg/g), Nachschicht PHEMA_Krea (µg/g), Vorschicht

MA_PGA_Krea (mg/g), Nachschicht MA_PGA_Krea (mg/g), Hb-Addukte (pmol/g) und

Cotinin (µ/L) untereinander.

Hb-Addukte (pmol/g)

Firma 1 Firma 2 Kontrollen

**

**


84

Tab.18: Korrelation zwischen den verschiedenen Biomarkern der Styrolexposition

nach Spearman (zweiseitig), Korrelationskoeffizient (r), p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**),

keine signifikante Korrelation (kk)

Metabolit Vorschicht PHEMA (µg/g)

Nachschicht PHEMA (µg/g)

Hb-Addukte (pmol/g)

Vorschicht MA_PGA

(mg/g)

Nachschicht MA_PGA

(mg/g)

Nachschicht PHEMA_Krea (µg/g) r=0,853** - - - -

Hb-Addukte (pmol/g) r=0,388* r=0,362* - -

Vorschicht MA_PGA_Krea (mg/g) r=0,450** r=0,331* r=,638** - -

Nachschicht MA_PGA_Krea (mg/g) kk kk r=0,526** r=0,798** -

Cotinin (µg/L) kk kk kk kk kk

Eine signifikant hohe Korrelation zeigte sich zwischen den Vorschichtwerten der

Mercaptursäuren und ihren Nachschichtwerten (r=0,853**). Die Werte lagen eng entlang

der Regressionsgeraden (Abb.27). Eine signifikant mäßge Korrelation konnte zwischen VS

PHEMA und den Addukten des Hämoglobins beobachtet werden (r=0,388*). Zwei

Ausreißer zeigten sich bei 290 und 400 µg/g Krea der Mercaptursäuren (Abb.28). Bei den

Konzentrationen der Vorschichtmetabolite der Mercaptursäuren und der aromatischen

Carbonsäuren gab es eine signifikant mäßige Korrelation (r=0,450**). Ein Extremwert

erschien knapp oberhalb von 400 mg/g Kreatinin MA_PGA. Die Werte lagen hier

großräumiger verteilt und nicht so eng beisammen (Abb.29) wie es bspw. in Abbildung 27

zu sehen ist. Eine Tendenz, dass mit steigender Konzentration der aromatischen

Carbonsäuren auch die Konzentration der Mercaptursäuren steigt ist zu sehen. Die

Nachschicht Werte der Mercaptursäuren zeigten eine vergleichsweise mäßige Korrelation

(r=0,362*) mit den Hämoglobinaddukten (Abb.30) wie schon bei PHEMA VS-Werten in

Abbildung 28 zu beobachten war. Im Streudiagramm zeigten sich zwei Extremwerte.

Signifikante Korrelation zeigten sich zwischen NS PHEMA und VS MA_PGA (Tab.18)

allerdings korrelieren die Werte nur schwach (r=0,331*) im Vergleich zu den beiden VS-

Werten (Abb.29).


85

Eine Signifikanz mit deutlicher Korrelation war beim Vergleich der aromatischen

Carbonsäuren in der Vorschicht mit den Addukten des Hämoglobins zu beobachten

(r=0,638**) (Abb.31), ebenso im Vergleich mit den Nachschichtwerten der Carbonsäuren

(Abb.32). Beide Korrelationen weisen auf einen linearen Zusammenhang hin, hier

allerdings mit einem gerinfügig niedrigeren Korrelationskoeffizienten bei den

Nachschichtwerten (r=0,526**). Wird die Relation ohne die Wertepaare, für die eine

Adduktkonzentration von 0,5 pmol/g Globin vorliegt, durchgeführt, ergab sich aus VS

MA_PGA zu HbA ein Korrelationskoeffizient von r = 0,631* und für NS MA_PGA zu

HbA ein Korrelationskoefizient von r= 0,883**.

Die gleichen Tendenzen konnten auch für die PHEMA VS- und NS-Korrelation mit HbA

beobachtet werden (VS:HbA: r = 0,311; NS:HbA: r = 0,420).

Eine hochsignifikante Korrelation fand sich zwischen den Werten der MA_PGA

Vorschicht und Nachschicht (r=0,798**). Ein deutlich linearer Zusammenhang ist gut

erkennbar (Abb.33).

Keine signifikanten Korrelationen wurden zwischen den Nachschichtwerten der

Carbonsäuren und denen der Vor- und Nachschicht der Mercaptursäuren nachgewiesen.

Außerdem bestanden keine signifikanten Korrelationen zwischen Cotinin und allen

anderen Metaboliten (Tab.18).

Zwischen den Styrol- Metabolitkonzentrationen des Kontrollkollektivs konnten keine

signifikanten Korrelationen beobachtet werden, jedoch ein mäßiger Zusammenhang

zwischen MA_PGA und PHEMA (r= 0,406). Zwischen dem Metaboliten Cotinin, der beim

Rauchen entsteht, konnte allerdings ein signifikanter, deutlicher Zusammenhang mit den

Konzentrationen der aromatischen Carbonsäuren festgestellt werden (r=0,513*) (Abb.34).


86

Abb. 27: Darstellung des Streudiagramms NS PHEMA– VS PHEMA (µg/g Krea),

r=0,853**

Abb. 28: Darstellung des Streudiagramms VS PHEMA (µg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,388*


87

Abb. 29: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA (mg/g Krea) – VS PHEMA

(µg/g Krea), r=0,450**

Abb. 30: Darstellung des Streudiagramms NS PHEMA (µg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,362**


88

Abb. 31: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA (mg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,638**

Abb. 32: Darstellung des Streudiagramms NS MA_PGA (mg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,526**


89

Abb. 33: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA – NS MA_PGA (mg/g Krea),

r=0,798**

Abb. 34: Darstellung des Streudiagramms Cotinin – MA_PGA (mg/g Krea), r=0,513*


90

Inferenzstatistische Auswertung

Die Tabellen 19-23 zeigen die Ergebnisse der Regressionen für das gesamte Kollektiv.

Folgende Parameter wurden über die Regressionen berechnet: ß (standardisiertes

Regressionsgewicht), SE (Standardfehler), t (T-Wert), F (F-Wert), ΔR2 (inkrementelle

Varianzaufklärung), R2 (Determinationskoeffizient).

Die Gruppenzugehörigkeit als Maß für die beruflich bedingte Exposition mit Styrol hatte

bis auf die Variable der VS MA_PGA (Tab.22) durchweg einen signifikanten positiven

Einfluss auf die Ausprägung der Konzentrationen der einzelnen Metaboliten (PHEMA VS:

Beta = 0,37, t = 2,74** PHEMA NS: Beta = 0,43, t = 3,26** ; HbA: Beta = 0,38 ,

t =2,75**; MA_PGA VS: Beta = 0,14; t = 0,98; MA_PGA NS: Beta = 0,39, t = 3,01**).

Die Kontrollvariablen Alter und Cotinin lieferten keinen signifikanten Erklärungsbeitrag

für die Ausprägung der Metaboliten.

Da Styrol erwiesenermaßen in kleinen Mengen im Tabakrauch vorkommt, wurde hier das

Kollektiv der Kontrollgruppen zusätzlich alleine einer linearen Regression unterzogen.

Hier zeigte sich eine signifikante Ausprägung der Variablen „Cotinin“ (PHEMA: Beta =

0,56; t = 2,63* ; MA_PGA: Beta = 0,70, t = 3,75**) gegenüber den Metaboliten, jedoch

nicht bei der Variable „Alter“ (Tab.24, 25). Da bei den Kontrollen die Hämoglobinaddukt-

Konzentrationen alle <1 pmol/g Globin waren, wurde die lineare Korrelation für das

Kontrollkollektiv nicht durchgeführt.


91

Tab.19: Lineare Regression auf PHEMA VS: Firmenkollektiv (Model 1)

Kontrollkollektiv (Model 2)

Variable Model 1 Model 2

SE t SE t

Stufe 1 ΔR2= 0,00 ΔR2= 0,00

Alter 0,02 0,98 0,14 0,03 0,92 0,21

Cotinin 0,06 0,01 0,42 0,02 0,01 0,11

Stufe 2 ΔR2= 0,14

Gruppe 0,37 25,24 2,74**

korrigiertes R2= 0,00 korrigiertes R2= 0,09

F (2,50) = 0.09 F (3,50) = 2.57

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**) Tab.20: Lineare Regression auf PHEMA NS: Firmenkollektiv (Model 1)



SE t SE t

Stufe 1 ΔR2= 0,00 ΔR2= 0,00

Alter -0,02 1,65 -0,15 -0,01 1,50 -0,10

Cotinin 0,04 0,02 0,26 -0,02 0,02 -0,11

Stufe 2 ΔR2= 0,18

Gruppe 0,43 41,31 3,26**


F (2,50) = 0,05 F (3,50) = 3,59

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**)


92

Tab.21: Lineare Regression auf HbA: Firmenkollektiv (Model 1) Kontrollkollektiv

(Model 2)


SE t SE t

Stufe 1 ΔR2= 0,00 ΔR2= 0,00

Alter 0,06 0,01 0,43 0,07 0,01 0,51

Cotinin 0,01 0,00 0,04 -0,04 0,00 -0,29

Stufe 2 ΔR2= 0,14

Gruppe 0,38 0,20 2,75**


F (2,49) = 0,09 F (3,49) = 2,60

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**) Tab.22: Lineare Regression auf VS MA-PGA: Firmenkollektiv (Model 1)



SE t SE t

Stufe 1 ΔR2= 0,05 ΔR2= 0,05

Alter 0,07 3,26 0,47 0,07 3,26 0,49

Cotinin 0,23 0,04 1,64 0,22 0,04 1,54

Stufe 2 ΔR2= 0,19

Gruppe 0,14 89,75 0,98


F (2,50) = 1,40 F (3,50) = 1,25

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**)


93

Tab.23: Lineare Regression auf NS MA-PGA: Firmenkollektiv (Model 1)



SE t SE t

Stufe 1 ΔR2= 0,06 ΔR2= 0,06

Alter 0,05 2,00 0,35 0,06 1,81 0,44

Cotinin 0,24 0,02 1,70 0,19 0,02 1,46

Stufe 2 ΔR2= 0,15

Gruppe 0,39 49,63 3,01**


F (2,50) = 1,46 F (3,50) = 4,15

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**) Tab.24: Lineare Regression PHEMA Gruppe Kontrollkollektiv

Variable SE t

ΔR2= 0,33

Alter 0,25 0,01 1,16

Cotinin 0,56 0,00 2,63*

korrigiertes R2= 0,25

F (2,17) = 3,77

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**) Tab.25: Lineare Regression MA_PGA Gruppe Kontrollkollektiv

p< 0,05 (*) und p< 0,01 (**)

Variable SE t

ΔR2= 0,49

Alter 0,19 0,71 1,00

Cotinin 0,70 0,01 3,75**

korrigiertes R2= 0,42

F (2,17) = 7,14

Diskussion des Humanbiomonitorings

94

8 Diskussion des Humanbiomonitorings

Mittels der vorgestellten validierten Methoden war es möglich ein Humanbiomonitoring

styrolexponierter Personengruppen durchzuführen. Zur Untersuchung der zwei

Firmenkollektive als auch des Kontrollkollektivs dienten drei Marker-Metabolite des

Styrolstoffwechsels. Neben den in der Routine des Dosismonitorings verwendeten

aromatischen Carbonsäuren, Mandelsäure und Phenylglyoxylsäure, dienten darüber hinaus

die Bestimmung der Mercaptursäuren als auch die der Hämoglobinaddukte einer

Charakterisierung der Exposition. Für die aromatischen Carbonsäuren wurden von allen

Metaboliten die höchsten gemessenen Werte bestimmt. Während hier Mengen im Bereich

von mg/g Kreatinin vorlagen, befanden sich Werte der Mercaptursäuren um den Faktor

1000 unterhalb dieser Mengen (µg/g Kreatinin). Die kleinsten Mengen eines Metaboliten

wurden bei den Hämaglobinaddukten gemessen (Tab.16). Diese Ergebnisse unterstreichen

die bisherige Erkenntnis, dass der Weg des Styroloxids bevorzugt über die Umwandlung

von Styrolglykol hin zu den aromatischen Carbonsäuren führt und diese 95% (Bardodej &

Bardodejova, 1970) der gesamten aufgenommenen Styrolmenge repräsentieren.

Messungen der aromatischen Carbonsäurenkonzentrationen mittels HPLC im Urin gehören

daher zu den Standardmessungen des Styrol-bedingten Dosismonitorings (Kivisto et al,

1993; Laffon et al, 2001; Teixeira et al, 2010).

Der biologische Grenzwert des Styrols (abgeleitet aus dem BAT Wert) liegt bei 600 mg

Mandelsäure plus Phenylglyoxylsäure pro g Kreatinin (DFG, 2009). Dieser Wert wurde

innerhalb des Kollektivs der Firma 2 im Nachschichturin überschritten. Die Datenlage zu

Konzentrationen der aromatischen Carbonsäuren bei Menschen der Allgemeinbevölkerung

mit keiner beruflich bedingten Styrolexposition ist nicht sehr groß. Manini et al. gaben eine

obere Spannbreite von 2,56 – 3,38 mg/g Kreatinin für die Summe aus MA und PGA an

(Manini et al, 2004). Die Spannbreite bei den Konzentrationen des hier untersuchten

Kontrollkollektivs liegt zum Teil oberhalb dieser Konzentrationen. Dieser Unterscheid

könnte durch private, nicht-beruflich bedingte Exposition erklärt werden. Confounder

(Störfaktor) kann hierbei Ethylbenzol sein. Diese farblose Flüssigkeit wird häufig als

Antiklopfmittel in Motorenkraftstoffen zugefügt. Zudem findet es grosse Verwendung als

Lösemittelersatz des Benzols für Farben und Anstrichmittel und ist in einer Vielzahl von

Bodenbelägen enthalten (Knecht et al, 2000). Sie wird wie Styrol innerhalb ihres

Metabolismus zu Mandelsäure und Phenylglyoxylsäure umgewandelt und könnte dadurch

die Spezifität mindern (Schaller, 1976).


95

Trotz dieses zusätzlichen Bias konnten sowohl die Vorschichtwerte von Fa.1 (p< 0,05) als

auch die der Fa.2 (p<0,01) signifikant von den Werten des unbelasteten Kontrollkollektivs

unterschieden werden (s. Abb. 24, 25). Dies zeigten die deutlichen durch Styrol bedingten

Belastungen auf Seiten der Firmenmitarbeiter, die auch im Vorschichturin messbare

Konzentrationen von MA und PGA aufwiesen. Die erhöhten Konzentrationen im

Vorschichturin können durch ihre Halbwertszeit von ca. 4 – 9 h erklärt werden (Triebig et

al, 1989; Wigaeus et al, 1984). Im Gegensatz zu den aromatischen Carbonsäuren MA und

PGA wird angenommen, dass die Phenylhydroxyethyl-Mercaptursäuren des Styrols nur zu

weniger als 1% über den Urin ausgeschieden werden (Norström et al, 1992). Trotz dieser

vergleichbar kleinen Mengen und der daraus resultierenden Anforderungen an eine

sensitive Methodik gelten sie nach derzeitigem Stand als substanzspezifischer (Manini et

al, 2003) als die Carbonsäuren. Daher wäre eine routinemäßige Mitbestimmung der

Mercaptursäuren im Humanbiomonitoring, sowie eine Verbesserung und Entwicklung

neuer Analysemethoden gefordert (Ghittori et al, 1997). Zur Konzentrationsbestimmung

wurde in dieser Untersuchung die Summe der PHEMAs (PHEMA1 und 2) berechnet. Dies

kann, analog zu der Summierung der aromatischen Carbonsäuren (MA+PGA) (Laffon et

al, 2001) zur Reduzierung potentieller individueller Unterschiede in der

Umbaugeschwindigkeit von Mandelsäure zu Phenylglyoxylsäure, Abweichungen in der

PHEMA Zusammensetzung reduzieren.

In allen Kollektiven konnten PHEMAs zu jedem Zeitpunkt nachgewiesen werden. Ähnlich

wie bei den aromatischen Carbonsäuren wurden auch bei der Analyse der Mercaptursäuren

diese bereits in den Vorschichturinen gefunden. Generell waren die Konzentrationen der

Mercaptursäuren im Vorschichturin ebenfalls signifikant höher als bei den Kontrollen

(Fa.1 p<0,05 , Fa.2 p<0,01). Das kann ein Indiz dafür sein, dass der Abbau des durch die

Exposition vorhandenen Styrols im Körper zum Zeitpunkt des erneuten Arbeitsbeginns

noch nicht vollständig geschehen ist (van Sittert et al, 2000b). Nach einer Unterbrechung

der Arbeit von mindestens 10 Stunden konnten noch Mercaptursäuren im Urin festgestellt

werden. Hintergrundkonzentrationen einer Kurzzeitexposition bei Nichtrauchern konnten

bereits 2-4 Stunden nach Exposition nachgewiesen werden.

Die Kontrollwerte der nicht exponierten Personengruppen sind im Median vergleichbar mit

anderen, unbelasteten Personengruppen aus der Literatur (Reska et al, 2010). Die

Extremwerte des Kontrollkollektivs bei MA_PGA und PHEMA (s. Spannbreite, Tab.16)

resultieren von drei Personen und lassen auf einen möglichen starken Einfluss von


96

Konfoundern schließen. Einer der Probanden hatte den höchsten Wert bei den

Mercaptursäuren allerdings nur den drittgrößten bei den Carbonsäuren. Dies könnte

interpretiert werden als eine durch Konfounder verursachte Konzentration auf Seiten der

Carbonsäuren, jedoch ebenfalls eine Exposition gegenüber Styrol selbst, bedingt durch den

hohen Wert der sehr spezifischen Mercaptursäuren. In der Tat stellte sich bei dieser Person

erst nach Metabolitanalyse heraus, dass sie beruflich als Maler/Lackierer arbeitet, was

durchaus zu Styrolexpositionen einerseits und Ethylbenzolbelastungen andererseits führen

kann. Die beiden weiteren Probanden zeigten Werte, die im Bereich der bereits

publizierten Spannbreite nicht beruflich exponierter Personen lagen (Reska et al, 2010).

Beide lagen um das 3,7-fache bzw. 2,5-fache unterhalb des Höchstwertes (3,75 µg/g

Kreatinin) (Tab.16). Die parallel hohen Werte von MA_PGA könnten demzufolge eine

Konfounder vermittelte Ursache haben. Maestri et al. berichteten über urinständige mittlere

NS gesamt-PHEMA Konzentrationen von 1880 µg/g Kreatinin. Untersucht wurden hier 25

Arbeiter der glasfaserverstärkenden Plastikindustrie (Maestri et al, 1997). NS

Gesamtkonzentration von 474 µg/g Kreatinin im Mittelwert (VS=255,7) fanden Manini et

al. in einem Kollektiv von 56 Arbeitern der GfPI (Manini et al, 2000). In einer weiteren

Arbeit untersuchten Fustinoni et al. 13 Mitarbeiter der GfPI und stellten NS gesamt-

PHEMA Konzentrationen zwischen 39,4 – 3464 µg/g Kreatinin (VS= 2,9 – 653) mit einem

Median von 262 µg/g Kreatinin (VS= 105) fest. Die selbe Arbeitsgruppe untersuchte auch

ein Kollektiv aus der Lackproduktion und stellten dort NS Konzentrationen zwischen 3,2 –

559 (VS= <1,6 – 387,8) µg/g Kreatinin mit einem Median von 206 µg/g Kreatinin (VS =

93) fest (Fustinoni et al, 2008).

Die Spannbreiten der in der vorliegenden Arbeit ermittelten Konzentrationen, sowohl der

gesamt Vorschicht- als auch der Nachschicht (Tab.16), kongruieren sehr gut mit den oben

beschriebenen Werten der internationalen Literatur.

In beiden untersuchten Firmenkollektiven konnte das Vorkommen von

Hämoglobinaddukten nachgewiesen werden. Im Kollektiv unbelasteter Personengruppen

lagen demgegenüber alle Werte unterhalb der Nachweisgrenze von 1 pmol/g Globin

(Tab.16). Hier konnte ein signifikanter Unterschied (p<0,01) im Vergleich der

Adduktkonzentrationen zwischen den Kontrollen mit denen beider Firmen festgestellt

werden (Abb. 26). Die Ergebnisse können so interpretiert werden, dass es bei bestimmten

Arbeitern eine längerfristige, kontinuierliche Belastung gegeben haben muss, die jenseits

einer akuten, kurzfristigen Exposition lag und mittels der Kurzzeitparameter MA_PGA

sowie PHEMAs nachgewiesen werden kann. Der Median der Messwerte (MA_PGA und


97

PHEMA) von Fa.1 lag unterhalb des Medians der Messwerte in Fa.2, obwohl die Werte

von Fa.2 nur eine Exposition von 6 Wochen repräsentieren. Die ebenfalls höheren NS-

Werte von Mercaptursäuren und aromatischen Carbonsäuren in Fa.2 gegenüber den

Werten der Fa.1, lassen die Vermutung zu, dass die Belastung in Fa.2 generell höher war

und eher nicht als ein Hauptresultat einer Suszeptibilität zu verstehen ist.

Um die innere Belastung einer Styrolexposition zu ermitteln wurden von anderen Gruppen

Hämoglobinaddukte des N-terminalen Valins bestimmt. So wiesen Christakopoulos et al.

Adduktwerte von 15-52 pmol/g Globin bei 17 Arbeitern der GfPI nach (Christakopoulos et

al, 1993). Hier waren allerdings extrem hohe Belastungen mit 300 mg/m³ Styrol gegeben

(AGW=86 mg/m³). Bei einem Detektionslimit von 10 pmol/g Globin untersuchten Severi

et al. 52 Arbeiter mit geringen Styrolexpositionen (31mg/m³) und konnten hier keine

Addukte nachweisen (Severi et al, 1994). Teixeira et al. berichteten von einer medianen

Konzentration von 5,78 pmol/g Globin in einem Kollektiv von 57 Arbeitern der GfPI mit

einer 2,5-fach niedrigeren Belastung (~ 120 mg/m³) im Vergleich zur Studie von

Christakopoulos et al. (Teixeira et al, 2008). Für die untersuchten Kollektive lagen keine

Luftmesswerte vor. Vergleicht man jedoch die Mediane der HbA-Val der neuesten Arbeit

auf diesem Gebiet, mit den hier gemessenen, ergäbe sich ein Verhältnis, welches auf eine

durchschnittliche Belastung mit 15 mg/m³ (Fa.1) und 10 mg/m³ (Fa.2) schließen lässt

(Teixeira et al, 2008). Dies sind allerdings rein geschätzte Werte und erlauben keine

Rückschlüsse auf akute Spitzenbelastungswerte.

Die Werte des hier untersuchten Kontrollkollektivs der Allgemeinbevölkerung lagen

erwartungsgemäß alle unterhalb 1 pmol/g Globin.

Der generelle Trend einer stärkeren Exposition in Fa.2 gegenüber Fa.1 zeigt sich auch in

den höheren Werten der Adduktkonzentrationen. Die Adduktwerte der Mitarbeiter in Fa.2

wären mit großer Wahrscheinlichkeit höher ausgefallen, wenn anstelle einer 6-wöchigen

eine 12-wöchige Exposition möglich gewesen und damit ein Expositionszeitraum

abgedeckt wäre, der die Lebenszeit des Hämoglobins widerspiegelt. Ab einer Exposition

von mehr als 120 Tagen wird ein steady state der HbA Konzentration erreicht und es

herrscht ein Gleichgewicht zwischen dem turn over der Erythrozyten und ihrer

Neubildung. Die individuelle maximale Konzentration ist demnach erst nach Ablauf von

120 Tagen ermittelbar.

Andere Autoren führten Messungen von Addukten der Cystein-Seitenketten und der

Carbonsäurereste des Albumins durch (Fustinoni et al, 1998; Yeowell-O'Connell et al,

1996). Etwa 5,2 % der Hb-Addukte in vitro bilden Addukte am endständigen Valin


98

(Phillips & Farmer, 1994). Dennoch stellen Hämoglobinaddukte repräsentativere Surrogate

einer Adduktbildung auf Ebene der DNA dar als die Bildung von Albumin Addukten. Das

in den Blutgefäßen zirkulierende Albumin ist frei zugänglich und damit angreifbar. Somit

kann viel leichter mit Albumin ein Addukt gebildet werden, als es mit Hämoglobin

möglich ist, welches zusätzlich von der Erythrozytenmembran geschützt wird und dadurch

den Zugang seitens des Epoxides erschwert. Dies kann dazu führen, dass sich beim

direkten Vergleich mehr Albuminaddukte als Hämoglobinaddukte nachweisen lassen und

somit die Anforderungen an die Sensitivität der Messgeräte bzgl. der Detektierbarkeit eines

Albuminaddukts sinken. Der Weg vom Epoxid zum Hämoglobinaddukt hingegen ist, wie

oben beschrieben, komplexer, da das Styroloxid zunächst die Erythrozytmembran

passieren muss. Im Inneren des Erythrozyten triff das Epoxid auf hohe Konzentrationen

von Glutathion, so dass eine Konkurrenzreaktion zwischen einer Bindung des Epoxids an

das Hämoglobin und Glutathion entsteht. Da die DNA Adduktbildung ebenfalls erst mit

der Fähigkeit des Passierens einer Membran (Bader et al, 1994), der Kernmembran,

verbunden ist, ähneln Hämoglobinaddukte in ihrem Entstehungsmechanismus eher den

DNA-Addukten und können dadurch wesentlich mehr zu einer Risikobeurteilung und der

Einschätzung eines kanzerogenen Potentials beisteuern, als es bei den Albumin-Addukten

der Fall ist. Darüber hinaus besitzt das Hämoglobinaddukt eine Lebensdauer von 120

Tagen. Das Albumin dagegen besitzt nur eine Lebensdauer von ca. 60 Tagen und wird im

Gegensatz zum Hämoglobin durch eine Alkylierung in seiner Lebensdauer beeinträchtigt

(Ehrenberg & Osterman-Golkar, 1980; Granath et al, 1992).

Die hochsignifikanten Korrelationen zwischen den Vor- und Nachschichtwerten der

aromatischen Carbonsäuren sowie der Mercaptursäuren lassen für den Nachweiszeitraum

beider Metabolite auf eine individuelle gleichbleibende Kurzzeitbelastung schließen

(Abb.27, 33). Mäßige bis keine Signifikanz zeigten alle Korrelationen mit den

Mercaptursäuren. Hier könnten GSTM1- Polymorphismen eine beeinflussende Wirkung

auf die urinständigen Konzentrationen der Mercaptursäuren gehabt haben (De Palma et al,

2001; Haufroid et al, 2001), was folglich die Effektstärke einer Korrelation mindern kann

(Tab.18). Eine Genotypisierung der GSTM1 wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht

durchgeführt. Bei den geplanten fortführenden Untersuchungen am beschriebenen

Kollektiv werden diese Typisierungen mit eingeschlossen.

Hier stand zunächst die Etablierung einer effizienten Methode zur Messung der

Mercaptursäuren im Vordergrund deren Anwendung es ermöglichte, styrolspezifische


99

Metabolitkonzentrationen bei exponierten sowie nicht exponierten Personen zu

identifizieren (Tab.16 und 17).

Es konnten signifikante Korrelationen der aromatischen Carbonsäuren in Vor- und

Nachschicht mit den Hb-Addukten festgestellt werden. Hier ist folglich von weitgehend

individuell gleichbleibenden Expositionsbedingungen der vorhergegangenen 6 bzw. 12

Wochen im jeweiligen Betrieb auszugehen. Somit kann das Hämoglobinaddukt als

korrelierender Langzeitmarker zu den Kurzzeitmarkern der aromatischen Carbonsäuren

angesehen werden.

Mit Hilfe der hierarchisch linearen Regression konnte gezeigt werden, dass die

Konzentrationen der einzelnen gemessenen Metabolite signifikant von der Zugehörigkeit

zur Gruppe „Firmenkollektiv“ bzw. „Kontrollkollektiv“ abhängig sind (Tab.19-23).

Demnach hat die berufsnahe Styrolexposition einen eindeutigen Einfluss auf die

Metabolitkonzentration. Lediglich bei den Vorschichtwerten der aromatischen

Carbonsäuren ließ sich die Metabolitkonzentration nicht über die Zugehörigkeit zur

Gruppe definieren. Die in diesem Zusammenhang lineare Regression mit den potentiellen

Einflussvariablen „Alter“ und „Cotinin“ , bei der nur das Kontrollkollektiv einbezogen

wurde, zeigte für die aromatischen Carbonsäuren einen hochsignifikanten Einfluss des

Rauchens auf die Konzentration dieser Metabolite (Tab.25). Dieser Einfluss konnte

insgesamt nur bei nicht-berufsbedingter Exposition (Tab.25) bzw. bei den

Vorschichtwerten (Tab.22) gefunden werden. Dies könnte damit erklärt werden, dass die

Carbonsäuren in der arbeitsfreien Zeit bereits soweit abgebaut wurden, dass der Effekt des

Rauchens nun einen signifikanten Beitrag zur Gesamtkonzentration liefert. Die Vermutung

von Rappaport et al., dass Zigarettenrauchen einen Beitrag zur Hintergrundbelastung mit

Styroloxid liefert, kann dazu eine weitere Erklärung bieten (Rappaport et al, 1996). Im

Kontrollkollektiv konnte ebenfalls ein hoch signifikanter Einfluss der Variable Cotinin auf

die Konzentration der Mercaptursäuren beobachtet werden (Tab.24). In der Regression mit

beiden Gruppen kam dieser Einfluss nicht zum tragen (Tab.19).

Der Einfluss des Rauchens auf das Biomarkerlevel beider Metabolite wurde auch in

anderen Arbeiten untersucht (Fustinoni et al, 2008; Reska et al, 2010). Fustinoni et al.

klärten den Raucherstatus jedoch nicht über die Bestimmung des Metaboliten Cotinin

sondern mittels Fragebogen. (Fustinoni et al, 2008). Weiterhin wurde in dieser Arbeit keine

Aufspaltung der linearen Korrelation auf das Kollektiv der Kontrollgruppe gemacht,

sondern nur das gesamte Kollektiv untersucht. Es empfiehlt sich nicht nur eine Befragung

durchzuführen, sondern zusätzlich die analytische Cotininbestimmung. Eine Befragung


100

unterliegt den subjektiven Angaben und Tendenzen zu sozial erwünschten Antworten

durch die Probanden. Mit Hilfe der analytischen Cotininbestimmung können diese

Fehlerquellen objektiv ausgeschlossen und Fehlinterpretationen der Ergebnisse vermieden

werden. Teixeira et al. konnte keinen durch das Rauchen verursachten Effekt auf die

Carbonsäuren beobachten, jedoch einen Effekt auf die Konzentration der

Hämoglobinaddukte. Dies kann darauf zurückzuführen sein, das die Nachweisgrenze zur

Detektion der Carbonsäuren sehr hoch war (14 mg/g Kreatinin); knapp unter dem in dieser

Arbeit ermittelten Median der Raucher im Kollektiv der Allgemeinbevölkerung (18,2 mg/g

Kreatinin) (s. Tab 17). Weiterhin wurde der Raucherstatus ebenfalls nur über einen

Fragebogen abgeklärt (Teixeira et al, 2008). Erwartungsgemäß müsste sich ein Effekt auf

Seiten der Hämoglobinaddukte als Langzeitmarker auch auf Seiten der Carbonsäuren

zeigen, es sei denn, die Probanden haben zur Zeit der Probennahme und innerhalb des

Nachweiszeitraums von Cotinin nicht geraucht. Signifikante altersbedingte Effekte

konnten in dieser Arbeit nicht beobachtet werden. Zwar zeigen die beiden -Werte des

Alters im Kontrollkollektiv höhere Ausprägungen als mit Hinzunahme der Gruppe des

exponierten Kollektivs (Tab.24 und 25) jedoch ohne eine Signifikanz. Es könnte einen

marginalen Einfluss der Variablen „Alter“ bei Nichtexponierten geben. Dieser wurde aber

in der Literatur im Zusammenhang mit Styrol bisher nicht als signifikant beschrieben.

Zusammenfassung

101

9 Zusammenfassung

Schadstoffbelastungen am Arbeitsplatz zu detektieren und somit frühzeitig und präventiv

Gesundheitsrisiken vorzubeugen ist von immenser Bedeutung. Insbesondere Gefahrstoffe

mit neurotoxischem oder kanzerogenem Potential bedürfen dabei größter Aufmerksamkeit.

Letztere zeichnen sich durch ihre hohe Reaktivität aus. Diese ist bereits vor der Aufnahme

in den Körper vorhanden oder wird durch metabolische Aktivierung hervorgerufen. In

Folge einer kovalenten Bindung dieser hochreaktiven Moleküle an die Nukleotide der

DNA können erste Schritte einer Kanzerogenese eingeleitet werden.

Im Rahmen einer Expositionsprüfung wird heutzutage oft ein Ambientmonitoring

durchgeführt, bei dem die Schadstoffkonzentration in der Luft am Arbeitsplatz bestimmt

wird. Diese Messungen liefern jedoch keine Informationen über die tatsächliche

Konzentration des Stoffes im Körper und obliegen häufig Störeffekten. In diesem

Zusammenhang kommt dem Biologischen Monitoring eine besondere Bedeutung zu.

Hierbei können Marker der inneren Dosis ebenso wie Marker eines Effektes ermittelt

werden und liefern dadurch Informationen, die in ihrer Bedeutung näher am Auftreten

einer potentiellen Gesundheitsbeeinträchtigung liegen, als die der herkömmlichen

Luftmessung. Die Messung verschiedener Endmetabolite innerhalb eines

Stoffmetabolismus liefert dabei ein vollständigeres Abbild der inneren Belastung und

bildet die Basis, das individuelle Risiko besser einschätzen zu können.

Styrol gehört zu einem der wichtigsten Monomere der Plastikindustrie. Expositionen sind

assoziiert mit unterschiedlichsten Gesundheitsgefährdungen. Von der International Agency

for Research on Cancer wurde Styrol als möglich kanzerogen (Gruppe 2B) und sein

direkter Metabolit das Styrol 7-8 Oxid als wahrscheinlich kanzerogen (Gruppe 2A)

eingestuft. Die DFG stufte Styrol in die Kategorie 5 krebsauslösender Stoffe ein.

Vor diesem Hintergrund bestand ein Ziel dieser Arbeit in der Durchführung eines Human

Biomonitorings, bei dem verschiedene Endmetabolite des Styrols im Blut und im Urin

bestimmt werden sollten. Es galt ferner zu untersuchen, ob und in wie weit die einzelnen

Metabolite in ihrer Gemeinsamkeit als Marker der Exposition fungieren können. Zu den

untersuchten Parametern zählten die klassischen Kurzzeit-Parameter des Dosismonitorings

Mandelsäure und Phenyglyoxylsäure. Sie repräsentieren den mittels Epoxidhydrolase

katalysierten Weg des Styrols. Weitere Metabolite waren die Styrol spezifischen

Mercaptursäuren (PHEMA) N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-1-Phenylethyl)-Cystein (PHEMA1)

und N-Acetyl-S-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Cystein (PHEMA2). Diese Kurzzeitmarker

Zusammenfassung

102

resultieren aus einem weiteren Stoffwechselweg der die Detoxifizierung von Styrol mittels

Gluthation-S-transferase einleitet. Als Langzeit-Parameter wurde das Hämoglobinaddukt

N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin bestimmt. Aus der Reaktion des Styrol Epoxids

(Styrol 7-8 Oxid) mit dem endständigen Valin der Hämoglobinseitenkette, entsteht ein

Addukt welches als Surrogat möglicher DNA-Addukte angesehen werden kann. Durch

Reparaturmechanismen bedingte Eliminationen des DNA-Adduktes, machen eine genaue

Quantifizierung hierbei oft nicht möglich. Im Gegensatz dazu unterliegen

Hämoglobinaddukte keinen Reparaturvorgängen und bleiben trotz Alkylierung über ihren

gesamten Lebenszeitraum von ca. 120 Tagen stabil.

Die Vorraussetzung zur Durchführung eines Biomonitorings ist das Vorhandensein von

geeigneten analytischen Methoden. Zwei dieser Methoden galt es im Rahmen dieser Arbeit

zunächst zu erarbeiten und zu validieren.

Die etablierte Methode zur Messung des Hämoglobinadduktes N-(2-Hydroxy-2-

Phenylethyl)-Valin lieferte sehr gute Ergebnisse für die Präzisionen in Serie als auch für

die Präzisionen von Tag zu Tag sowohl bei den niedrig konzentrierten als auch bei den

höher konzentrierten Qualitätskontrollen. Die Wiederfindungsversuche zur Ermittlung des

Einflusses unterschiedlicher Blutmatrices auf das Analyseergebnis, lieferten sehr gute

Wiederfindungsraten, was nicht zuletzt auf den hier verwendeten internen Standard und

des zur Dotierung verwendeten käuflichen Dipeptidstandards zurückzuführen war

(s. Kap.5).

Im Rahmen dieser Arbeit wurde weiterhin eine Methode zur Messung von Styrol

spezifischen Mercaptursäuren erarbeitet und etabliert (Kap.4). Nach derzeitigem

Wissenstand des Autors dieser Arbeit wurde hierbei erstmals mittels Backflushverfahren

gearbeitet und ein isotopenmarkierter interner Standard verwendet - eine Voraussetzung

zur Generierung zuverlässiger quantitativer Ergebnisse. Die Präzisionsversuche sowie die

Wiederfindungsversuche und die der Richtigkeit lieferten sehr gute Ergebnisse.

Die Validierungsergebnisse zeigten, dass beide Methoden als robust angesehen werden

können und geeignet sind, im Rahmen von zukünftigen humanen Biomonitoring Studien

von Styrol Anwendung zu finden.

Im Anschluss an die Erarbeitung der Analysemethodik wurde ein Dosis- und

Effektbiomonitoring an Kollektiven zweier Firmen der styrolverarbeitenden Industrie

durchgeführt. Ein weiteres Kollektiv nicht beruflich exponierter Personen der

Allgemeinbevölkerung fungierte als Kontrolle (Kap. 7).

Zusammenfassung

103

Die höchsten Konzentrationen der hier bestimmten Marker wurden bei den aromatischen

Carbonsäuren Mandelsäure und Phenylglyoxylsäure in allen Kollektiven gemessen. Die

Expositionsbiomarker Mercaptursäuren und die Hämoglobinaddukte konnten ebenfalls

nachgewiesen werden – letztere allerdings nicht im Kollektiv der Allgemeinbevölkerung.

Insgesamt konnten mittels aller gemessenen Parameter die Firmenkollektive signifikant

von dem Kontrollkollektiv unterschieden werden. Signifikante Korrelationen der

Metabolitkonzentrationen untereinander (auch Vor- und Nachschicht) konnten bei beiden

Firmenkollektiven gezeigt werden. Ohne Signifikanz aber dennoch mit einem schwach bis

mäßigen Zusammenhang wurden die Korrelationen zwischen Nachschicht MA_PGA mit

Vor- und Nachschicht PHEMA abgebildet.

Ein signifikanter Einfluss des Rauchens auf die Konzentrationen der aromatischen

Carbonsäuren als auch der Mercaptursäuren konnte bei den Firmenkollektiven nicht, sehr

wohl aber bei den Probanden der Allgemeinbevölkerung beobachtet werden. Ein alters-

bedingter Einfluss sowohl bei den beruflich Exponierten als auch bei Nicht-Exponierten

zeigte sich nicht.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass in dieser Arbeit zwei valide Methoden

etabliert werden konnten und diese im Rahmen eines Dosis- und Effektmonitorings an

zwei Firmenkollektiven Anwendung fanden. Erstmals wurden dabei parallel die beiden

Parameter HbA-Val und PHEMA des Styrols am gleichen Kollektiv bestimmt.

PHEMA Korrelationen mit den übrigen Metaboliten (HbA-Val; MA_PGA) zeigten trotz

eines möglichen GSTM1-Polymorphismus schwach bis mäßige Zusammenhänge. Der

grosse Nutzen der Mercaptursäuren liegt nicht zuletzt in ihrer Spezifität, die gerade bei

Hintergrundbelastungen beruflich nicht belasteter Personen mit Mischexpositionen einen

Nutzen erbringen können (bspw. Styrol vs. Ethylbenzol). Generell liefern sie

Informationen über die metabolische Aktivität der Glutathion S-transferase. Somit können

sie als eine Ergänzung zur Geno- und Phänotypisierung der GSTM1 angesehen werden, die

in weiteren follow-up Studien der untersuchten Firmen implementiert werden und die hier

beobachteten Korrelationseffekte verbessern sollen. Hier können die Mercaptursäuren

eindeutig als ergänzende Marker zu den aromatischen Carbonsäuren angesehen werden.

Die Erfassung der Langzeitparameter der Hämoglobinaddukte stellt ebenfalls einen

weiteren wichtigen Parameter dar, der Hinweise erster genotoxischer Effekte liefern kann.

Konzentrationen von Hämoglobinaddukten konnten bei einzelnen Probanden innerhalb der

Firmenkollektive gemessen werden, was über die Validierung der Methode hinaus deren

Applikabilität im Biomonitoring bestätigen konnte. Hier werden geplante fortführende

Zusammenfassung

104

Untersuchungen, insbesondere beim Kollektiv der Firma 2 nach einer mindestens 12-

wöchigen Dauerexposition erfolgen. Zusätzlich zur relativ aufwendigen

Probenaufarbeitung, ist die Bestimmung der HbA als Routineparameter oft nur in

speziellen Laboren möglich. Dennoch sollten diese Effektmarker möglichst immer

Bestandteil von Expositionserfassungen sein und zumindest zum Standard initialer

betrieblicher Vorsorgeuntersuchungen werden. Nur so können frühzeitig mögliche

genotoxische Effekte bei beruflich bedingten Styrolbelastungen erkannt und präventive

Maßnahmen auf betrieblicher und individueller Ebene eingeleitet werden.

Die etablierten Methoden werden zukünftig in externe Qualitätskontrollen durch

Ringversuche eingebunden und im Human Biomonitoring bei follow-up Studien

untersuchter Kollektive sowie bei weiteren neuen Firmen Anwendung finden.

Abbildungsverzeichnis

105

10 Abbildungsverzeichnis

Abb.1: Styrol Metabolismus mit Hauptstoffwechselwegen

Abb.2: Monitoring von Schadstoffen in der Arbeits- und Umweltmedizin

Abb.3: Mechanismus einer Hämoglobinadduktbildung an das N-terminale

Valin(skizziert) am Beispiel des Epoxids Styrol-7,8-oxid (Quelle:

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:1GZX_Haemoglobin.png?uselang

=de)

Abb.4: Bildung des Thiocarbamoylderivats durch die Reaktion von PFPITC mit der

Aminogruppe des N-terminalen Valins

Abb.5: Zyklisierungsreaktion des Thiocarbamoylderivates und Entstehung eines

Thiazolinderivates unter Abspaltung des Hämoglobinrestes. Umlagerung

des Thiazolinderivates in das Pentafluorphenylthiohydantoinderivat

(Analyten)

Abb.6: Unterschiedliche turn-over Zeiten von Expositionsbiomarkern

Abb.7: Anreicherungsschaltung und Transferschaltung des 6-fach Ventils

Abb.8: Massenspektren von PHEMA1 (oben) und 13C6 PHEMA1 (unten) mit

Ionenzerfällen (rot)

Abb.9: Darstellung zweier Kalibrierkurven

Abb.10: Kalibrierkurven dargestellt in Urin ( ) und Wasser (- - - -)

Abb.11: Exemplarische Darstellung eines Chromatogramms einer Nichtraucher

Urinprobe (Cotinin 4,8µg/L) ohne arbeitsbedingter Styrolexposition und

einer PHEMA Konzentration von 0,4 µg/L

Abb.12: Molekülstruktur des N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Val-Leu-anilid


106

Abb.13: Molekülstruktur des 4-Hydroxyphenetylbromid (HPB) (a), 4-Fluor-

phenethylbromid (FPB) (b) und der daraus hergestellten internen Standards

4-Hydroxyphenetylbromid-Globin sowie 4-Hydroxyphenetylbromid-Globin

Abb.14: Entstehung des N-(2-Hydroxy-2-Phenylethyl)-Valin- PFPTH (Analyten)

Abb.15: Massenspektrum mit Analyt-Fragmenten (rot) des N-(2-Hydroxy-2-

Phenylethyl)-Valin–PFPTH (a), 4-Hydroxyphenetyl-Valin-PFPTH (b), 4-

Fluorphenethyl-Valin–PFPTH (c); Elektronenstossionisation

Abb.16: Chromatogramm einer dotierten Poolglobinprobe (50 pmol)

Abb.17: Kalibrierkurve des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin bezogen auf 4-

Hydroxyphenethylbromid-Globin

Abb.18: Kalibrierkurve des 2-Hydroxy-2-phenylethyl-Valin bezogen auf 4-

Fluorphenethylbromid-Globin

Abb.19: Darstellung eines Chromatogramms einer styrolexponierten Person (2,3

pmol/g Globin)

Abb.20: Kalibrierkurve für Phenylglyoxylsäure (oben) und Mandelsäure (unten),

“area under curve” (AUC), interner Standard (IS), Mandelsäure (MA),

Phenylglyoxylsäure (PGA)

Abb.21: Darstellung zweier exemplarischer Chromatogramme der Analytik von

Phenylglyoxylsäure (PGA) und Mandelsäure (MA). A: Chromatogramm mit

dotierten Standards von 25 mg/L B: Darstellung einer Realprobe ohne

berufliche Exposition mit Styrol (2,5 mg/L MA_PGA); IS (interner Standard

3-Chlor-4-hydroxybenzoesäure)

Abb.22: Vergleich des Metaboliten PHEMA (VS,NS) innerhalb Fa.1 und mit der

Kontrollgruppe (◊ = Extremwerte ○ = Ausreißer, * Signifikanz auf dem 0,05

Niveau ** Signifikanz auf dem 0,01 Niveau )


107

Abb.23: Vergleich des Metaboliten PHEMA (VS,NS) innerhalb Fa.2 und mit der

Kontrollgruppe Kontrollgruppe (◊ = Extremwerte ○ = Ausreißer, *

Signifikanz auf dem 0,05 Niveau ** Signifikanz auf dem 0,01 Niveau)

Abb.24: Vergleich des Metaboliten MA_PGA (VS,NS) innerhalb Fa.1 und mit der


Niveau ** Signifikanz auf dem 0,01 Niveau)

Abb.25: Vergleich des Metaboliten MA_PGA (VS,NS) innerhalb Fa.2 und mit der


Niveau ** Signifikanz auf dem 0,01 Niveau)

Abb.26: Vergleich der Hämoglobinaddukte mit der Kontrollgruppe Kontrollgruppe

(◊ = Extremwerte ○ = Ausreißer, * Signifikanz auf dem 0,05 Niveau **

Signifikanz auf dem 0,01 Niveau)

Abb.27: Darstellung des Streudiagramms NS PHEMA– VS PHEMA (µg/g Krea),

r=0,853**

Abb.28: Darstellung des Streudiagramms VS PHEMA (µg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,388*

Abb.29: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA (mg/g Krea) – VS PHEMA

(µg/g Krea), r=0,450**

Abb.30: Darstellung des Streudiagramms NS PHEMA (µg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,362**

Abb.31: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA (mg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,638**

Abb.32: Darstellung des Streudiagramms NS MA_PGA (mg/g Krea) – HbA (pmol/g

Globin), r=0,526**

Abb.33: Darstellung des Streudiagramms VS MA_PGA – NS MA_PGA (mg/g

Krea), r=0,798**


108

Abb.34: Darstellung des Streudiagramms Cotinin – MA_PGA (mg/g Krea), r=0,513*

Tabellenverzeichnis

109

11 Tabellenverzeichnis

Tab.1: Die Stoffeigenschaften des Styrols


Tab.3: Programm der Gradientenpumpe

Tab.4: RT, Ionenübergänge (Q1,Q3), DP, EP, FP, CE und CXP der markierten und

nicht markierten PHEMAs

Tab.5: Ergebnisse der Präzision in Serie und von Tag zu Tag

Tab.6: Bestimmung der Richtigkeit in sieben verschiedenen Urinproben

Tab.7: Stabilitäten der Qualitätskontrollen Q3, Q30, QRea

Tab.8: Ergebnisse des Biomonitorings von Personen der Allgemeinbevölkerung


Tab.10: Darstellung der Retentionszeiten und detektierten Ionenspuren der Analyte

Tab.11: Ergebnisse der Präzision in Serie der internen Standards HPB und FPB

Tab.12: Ergebnisse der Präzision von Tag-zu-Tag der internen Standards HPB und

FPB

Tab.13: Wiederfindungsraten (WFR) in Individualglobinen; Werte kleiner

Nachweisgrenze von 1 pmol/g Globin werden mit halber Nachweisgrenze

berechnet; alle Angaben in pmol/g Globin

Tab.14: Pipettierschema für die Kalibrierkurve MA und PGA

Tab.15: Gradientenprogramm zur Bestimmung der aromatischen Carbonsäuren

Tab.16: Median, Standardabweichung und Spannbreite der gemessenen Metabolite

Tab.17: Unterteilung der Metabolitkonzentrationen der Kontrollen in Nichtraucher

(NR) und Raucher (R)

Tabellenverzeichnis

110

Tab.18: Korrelation zwischen den verschiedenen Biomarkern der Styrolexposition

nach Spearman (zweiseitig), Korrelationskoeffizient (r), p< 0,05 (*) und

p<0,01 (**), keine signifikante Korrelation (kk)

Tab.19: Lineare Regression auf PHEMA VS: Firmenkollektiv Kontrollkollektiv

Tab.20: Lineare Regression auf PHEMA NS Firmenkollektiv Kontrollkollektiv

Tab.21: Lineare Regression auf HbA: Firmenkollektiv Kontrollkollektiv

Tab.22: Lineare Regression auf VS MA-PGA: Firmenkollektiv Kontrollkollektiv

Tab.23: Lineare Regression auf NS MA-PGA: Firmenkollektiv Kontrollkollektiv

Tab.24: Lineare Regression PHEMA Gruppe 0

Tab.25: Lineare Regression MA_PGA Gruppe 0

Literaturverzeichnis

111

12 Literaturverzeichnis

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Anhang

121

13 Anhang

13.1 Information und Einverständniserklärung für Probanden

UNIVERSITÄTSKLINIKUM - RHEINISCH-WESTFÄLISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE AACHEN

Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin

Ambulanz Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kraus

Pauwelsstraße 30 52074 Aachen Tel. +49-(0)241-80 80410 Fax: +49-(0)241-80 82086

Information für Teilnehmer „Biomonitoring“

Sehr geehrte Teilnehmerin, sehr geehrter Teilnehmer, innerhalb Ihrer beruflichen Tätigkeit haben Sie häufig Kontakt zu Styrol. Die Chemikalie Styrol ist eine farblose, süßlich riechende Flüssigkeit und findet besonders in der kunststoffherstellenden und kunststoffverarbeitenden Industrie große Verwendung. Durch Einatmen kann Styrol aus der Luft in den Körper gelangen. Dort wird der Großteil normalerweise in eine für den Körper besser weiterzuverarbeitende Form umgewandelt und verlässt diesen zusammen mit dem Urin. Ein kleinerer Teil verbleibt im Blut und kann über einen wesentlich längeren Zeitraum nachgewiesen werden als im Urin. Styrol im Blut dient daher als Langzeitparameter und kann uns im Gegensatz zu Raumluftmessungen einen viel größeren Einblick über das tatsächliche Vorkommen von Styrol im Körper geben. Ziel der vom Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin der RWTH Aachen (IASA) durchgeführten Vorsorgeuntersuchung ist die Ermittlung der Styrol‐Stoffwechselprodukte im Urin (Mandelsäure, Phenylglyoxylsäure ggf. Mercaptursäuren des Styrols) sowie von Styrol im Blut zur Ermittlung der tatsächlich

Anhang

122

an Ihrem Arbeitsplatz aufgenommenen Menge an Styrol‐Blut‐Verbindungen. Zusätzlich werden ggf. noch Phänotypisierungen der am Styrolmetabolismus beteiligten Enzyme durchgeführt. Bei der Teilnahme an dieser Untersuchung benötigen wir Ihre Unterstützung. Für die Konzentrationsbestimmungen im Blut sowie im Urin benötigen wir von Ihnen sowohl eine Blutprobe als auch eine Urinprobe. Weiterhin erheben wir einige personenbezogene Daten in Form eines Fragebogens. Die Beantwortung der Fragen wird nicht mehr als 10 Minuten Ihrer Zeit in Anspruch nehmen und erfolgt im Anschluss an die Blutabnahme durch eine(n) unserer Ärzte/Arzthelfer(innen).

Die Teilnahme an der Beantwortung sowohl der Fragebögen als auch die Abgabe von Blut – und Urinproben ist ganz und gar freiwillig. Sie können jederzeit und ohne Angabe von Gründen Ihr Einverständnis zur Teilnahme zurücknehmen, ohne dass Ihnen hieraus irgendwelche Nachteile entstehen. Datenerfassung und Datenverarbeitung: Das Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin der RWTH Aachen (IASA) führt als durchführende Stelle die Ermittlung Ihrer personenbezogenen Probandenddaten im Sinne des Datenschutzgesetzes NRW durch. Sie ist somit einzige datenhaltende Stelle und führt eine Anonymisierung Ihrer personenbezogenen Daten mit Hilfe einer Identifikationsnummer (ID)) durch. Das IASA trägt dafür Sorge, dass alle Mitglieder innerhalb des Institutes, die personenidentifizierende Daten einsehen können, zur Einhaltung der Datenschutzbestimmungen verpflichtet werden. Die Datenübermittlung an Dritte, die statistische Auswertung sowie die spätere Veröffentlichung der Ergebnisse erfolgt/erfolgen in anonymisierter Form. Wir bedanken uns sehr für Ihre Mitarbeit! Die mündliche Aufklärung wurde am (Datum) ________________ von (Unterschrift des aufklärenden Arztes) (Name Arzt in Druckschrift)

Anhang

123

13.2 Fragebogen für Probanden

UNIVERSITÄTSKLINIKUM - RHEINISCH-WESTFÄLISCHE TECHNISCHE HOCHSCHULE AACHEN

Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin

Ambulanz Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. T. Kraus

Pauwelsstraße 30 52074 Aachen Tel. +49-(0)241-80 80410 Fax: +49-(0)241-80 82086

Fragebogen für Teilnehmer „Biomonitoring“

Vorname: _____________ Nachname: _____________ Geburtsdatum: _______________ Gewicht: _______________ Größe (cm): _______________ Teilnehmer ID: Datum: _________ Firma: ______________

Ihre Antworten, die Sie in diesem Fragebogen geben, fallen unter die ärztliche Schweigepflicht! Ihre Identität wird nicht veröffentlicht oder an Ihren Arbeitgeber weitergegeben. Sie wird anonymisiert und verbleibt alleine beim Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin der RWTH Aachen.

Geschlecht [ ]A männlich [ ]B weiblich

Seit wann arbeiten Sie an Ihrem jetzigen Arbeitsplatz? [ ]a Seit: Monat: _______ Jahr: ________

Haben Sie früher Zigaretten geraucht oder rauchen Sie zurzeit? [ ]A Ich habe noch nie geraucht (bis auf ganz seltenes Probieren) [ ]B Ja, ich habe früher geraucht (seit dem Jahr 19___ ___ bis 19/20___ ___) rauche aber jetzt nicht

mehr; damals durchschnittlich ____ Zigaretten pro Tag [ ]C Ja, ich rauche zur Zeit (seit dem Jahr 19/20___ ___ bis heute) durchschnittlich ____ Zigaretten pro

Tag und habe meine letzte Zigarette vor ____ Stunden geraucht

Anhang

124

13.3 Veröffentlichungen

Paper

Reska M, Ochsmann E, Kraus T, Schettgen T (2010) Accurate quantification of

mercapturic acids of styrene (PHEMAs) in human urine with direct sample injection using

automated column-switching high-performance liquid chromatography coupled with

tandem mass spectrometry. Anal Bioanal Chem 397(8): 3563-3574

Posterbeitrag

Reska, M., Ochsmann, E., Kraus, T., Schettgen, T., Dosis- und biochemisches

Effektmonitoring styrolexponierter Mitarbeiter der Polyesterharz verarbeitenden Industrie.

Posterbeitrag auf der: 51. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Arbeitsmedizin und

Umweltmedizin (DGAUM); März, 9-12, 2011; Heidelberg.

Anhang

125

Lebenslauf:

Persönliche Daten

Name: Marcus Reska

Geburt: 12.07.1977 in Geilenkirchen / Deutschland Nationalität: deutsch

Schulausbildung

1984- 1988 Grundschule in Geilenkirchen 1989- 1991 Bischöfliches Gymnasium St. Ursula in Geilenkirchen 1991- 1995 Städtische Realschule Geilenkirchen (Fachoberschulreife) 1995- 1998 Städtisches Gymnasium Übach – Palenberg (Abitur) 1998- 1999 Zivildienst im St.-Antonius-Hospital in Eschweiler Universitätsausbildung

1999- 2006 Biologiestudium an der RWTH Aachen (Hauptfach: Molekularbiologie/Zellbiologie; Nebenfächer:

Molekulare Medizin, Humanbiologie, Entwicklungsbiologie) Promotion

2007- 2011 Institut für Arbeitsmedizin und Sozialmedizin Aachen (Gruppe„Biomarker“), Prof. Dr. med. T. Kraus

Charakterisierung Styrol exponierter Arbeitnehmer mittels ...

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