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Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéines

Pour l’étude d’une protéine, il faut:

Isoler la protéine responsable d’une fonctionfractionnement cellulaire, ultracentrifugation, purification, caractérisation, dosage…

Analyser la composition chimique de la protéinecomposition globale, séquençage, spectrométrie de masse…

Découvrir la structure spatiale de la protéinedichroïsme circulaire, diffraction des rayons X, RMN…

Corréler la structure à la fonction de la protéine


II.1. Isolement de la protéine responsable d’une fonctionII.1.1. Fractionnement cellulaire

Collecter tissus ou secrétions homogénat ou extrait cellulaire

Séparation des composants de l’homogénat centrifugation différentielle

Vitesse de déplacement des particules proportionnelle à- la force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise- la masse de la particule- la différence entre la densité de la particule et celle du solvantet inversement proportionnelle à- la friction avec le milieu en fonction de la taille- à la géométrie des particules.

coefficient de sédimentation s en unités Svedberg (S) 1 S = 1.10-13 s, qui est le rapport entre vitesse de la particule et accélération due à la force centrifuge :s=v/w2r ou s=dr/dt/w2r ou r est la distance à l’axe de rotation, w la vitesse angulaire en rad/sec et t le temps en seconde

La centrifugation


Différents types de centrifugeuse selon les besoins expérimentaux

Et rotors verticaux ou à angle fixe ou à godets mobiles.

centrifugations différentielles



Ultracentrifugation et gradient de densité.

Vitesse de sédimentation

Coefficient de sédimentation S

Séparation selon taille (masse) et forme

Sédimentation àl’équilibre

Séparation selon densité de flottaison

Densité - + ++

Gradient faible5 à 20%

Gradient important20 à 70%


II.1.2. Fractionnement des protéines

Extraction des protéines totales à partir de la fraction subcellulaire isolée.

Broyage, choc osmotique, détergent, French press…

Fractionnement des protéines basé sur leur solubilité dans des solutions salines.

Précipitation dans le sulfate d’ammonium. Séparation surnageant et précipité par centrifugation. Solubilisation du précipité

Dialyse à travers une membrane semi-perméableEliminer les petites molécules. Conditions pH et force ionique


Chromatographie sur colonne composée d’une phase stationnaire solide et d’une phase mobile liquide

Fractions d’élution

Analyses des fractions: dosage des protéines, masse, pI, activité biologique…

temps

4 grands types de chromatographieSéparation selon taille, charge, affinité de liaison ou hydrophobicité


Séparation selon la taille (rayon de Stokes) Tamisage moléculaire ou chromatographie d’exclusion

Taille des pores variable séparation de 500 à 5 x 106 Da

Vo Vi+Vm Vc=Vt+VmVt=Vo+Vi

Kd=Ve-Vo/Vt-Voou plutôtKav=Ve-Vo/Vc-Vo

Ve=volume d’élution pour molécule retardée

Relation linéaire inversement proportionnelle entre log(MM) et Kav


Séparation selon la chargeChromatographie par échange d’ions

Charge globale = somme algébrique des charges des chaînes latérales d’acides aminés

Point isolélectrique (pI): pH où charge globale nulle

pH > pI: charge globale négativepH < pI: charge globale positive

Élution des protéines retenuesGradient de pH Gradient de force ionique

pH < pI molécule chargée +pH > pI molécule chargée -

Échangeur de cations Échangeur d’anions

Molécules + retenues Molécules – retenues

Élution gradient force ionique Élution gradient force ioniquecontre ion Na+ contre ion Cl-

Gradient de pH croissant Gradient de pH décroissant

pI P1<pI P2

Ordre d’élution Ordre d’élutionP1 puis P2 P2 puis P1



Séparation selon l’affinitéChromatographie d’affinité

Haute affinité de certaines protéines pour différents types d’effecteurs biologiques

Effecteurs fixés par covalence sur support inerte

Affinité enzyme-substrat:substrats, analogues, inhibiteurs, coenzymes

Affinité ligand-récepteur:hormones, peptides, analogues peptidiques

Affinité antigène-anticorps: haptènes, antigènes, anticorps

Affinité protéine-acide nucléique:oligonucléotides

Affinité protéine-métal:Nickel, cuivre

Élution des protéines par:Changement de pHForce ionique élevéeCompétition par ligand libre


Séparation selon l’hydrophobicitéChromatographie d’adsorption en phase inversée

Interactions hydrophobes entre molécules et phase stationnaire

Phase stationnaire apolaire:silice greffée de chaînes de 2 à 18 atomes de carbone

Phase mobile polaire

Élution par gradient de polarité

Adaptée à la séparation de lipides, acides aminés et peptidesS’applique en chromatographie liquide haute performance (HPLC)


II.1.3. Dosages des protéines

Mesures physiquesDO= εlc à 280nm

Principalement lié à l’absorption de trp et de tyr

Mesures colorimétriquesBiuret, Lowry, Bradford…

Mesures liées à l’activité biologiqueactivités enzymatiques…

La Spectrophotométrie: principe et applications.


Le spectre électromagnétique

Spectrophotométrie ou spectrométrie optique: méthode d’analyse physico-chimique qui permet de déterminer qualitativement et quantitativement des ions ou des molécules dans une solution. Basée sur la propriété des ions ou des molécules de pouvoir passer de l’état fondamental à un état excité par absorption d’un rayonnement de longueur d’onde adéquate.

σ =1/λ=ν/c

E=hc/λh= constante de Planck= 6,626x10-34Jxs

ΔE =hc/λ

État excité

ΔEÉtat fondamental

Principe de la spectrophotométrie


Le spectrophotomètre

Absorbance et loi de Beer-Lambert

I=Iox10-elc


• Une espèce chimique caractérisée par son spectre d’absorption. • Positions des pics d’absorption caractéristiques d’un ion, d’un atome, d’une molécule ou d’un groupement particulier d’atomes. • L’analyse des spectres d’absorption détermine la nature de l’espèce chimique (analyse qualitative). • Spectre d’absorption = «l’empreinte digitale » de la substance.

Chromophores élémentaires

L’absorption utilisée comme méthode d’identification

max (nm) max (L.mol-1.cm-1)

> C = C < (alcène) - C C - (alcyne) > C = O (cétone) - CH = O (aldéhyde) - COOH (acide) - COCl (chlorure d'acide) - CONH2 (amide) - COOR (ester) - NO2 (nitro) - N = N - (azométhane)

173* 178* 290 279 208 220 220 211 214 338

10000 2000 16 15 32 100 63 57 17 4

Chromophore: groupe insaturé, responsable de l'absorption.Auxochrome: groupe saturé, qui par son effet sur un groupe chromophore modifie l'absorption de ce chromophore.Effet bathochrome: déplacement d'un maximum d'absorption vers de plus grandes longueurs d'onde. Effet hypochrome: déplacement d'un maximum d'absorption vers de plus faibles longueurs d'onde.


Chromophores max max Remarques

Chromophores conjugués

>C=C-C=C< (linéaire) 220 30000

>C=C-C=O (dans un cycle) 244 10000

Acides nucléiques

Adénosine 260 15000

Guanosine 255 14000

Thymidine 265 10000

Cytidine 270 9000 sensible au pH

ADN double brin 260 1U.D.O.=50 g/ml

ADN simple brin 260 1U.D.O.= 33 g/ml

ARN 260 1U.D.O.= 40 g/ml

Protéines

Liaison peptidique 190 4-8000 sensible à la conformation

Pont disulfure 250 300

Phénylalanine 257 200

Tyrosine 275 1400 sensible au pH

Tryptophane 280 5600

Coenzymes, hèmes...

Flavine (FMN,FAD) 450 12700 déshydrogénases

NADH, NADPH 338 6400 déshydrogénases

Pyridoxal 390-500 6000 transaminases, décarboxylases

Hème II bande 550 27700

Hème II bande Soret 400 120000 (--> couleur rouge)

Cis-rétinal 498 4200 rhodopsine

Chlorophylle A 660-680 10000 (--> couleur verte)

(1)-La substance à doser possède un pic d'absorption caractéristique dans le visible (substance colorée) ou dans l'UV: dosage direct.

(2)-La substance à doser ne possède pas de pic d'absorption caractéristique: dosage indirect après réalisation d’une réaction colorée:.


L’absorption utilisée comme méthode de dosage

Caractéristiques d’une bonne méthode de dosage

Spécificité – solubilité – stabilité – proportionnalité – sensibilité

1er cas: on connaît ε de la substance à doser: on mesure A et on calcule [C]

2ème cas: on ne connaît pas ε: on réalise une gamme étalon et une courbe d’étalonnage A=f([C])


Application au dosage des protéines

Méthodes de dosage utilisent des propriétés des acides aminés

• Absorption à 280 nm: tryptophane, tyrosine, phénylalanine

• Méthode du biuret: formation d’un complexe pourpre entre le réactif de biuret et deux liaisons peptidiques consécutives en présence de Cu en milieu alcalin.

• Méthode de Lowry: combine une réaction au biuret et une réaction au réactif de Folin-Ciocalteu qui réagit avec tyrosine: coloration bleue

• Méthode au bleu de Coomassie: adsorption du bleu de Coomassiequi réagit avec AA basiques et avec acides aminés hydrophobes. Transfert du pic d’absorption, passe du rouge au bleu

•Méthode à l’acide bicinchonique: réagit avec liaisons peptidiques et Cu: complexe pourpre


Chromatographie échangeuse d’ions

Chromatographie gel filtration

Chromatographie d’affinité

n° fraction

Schéma de purification d’une enzyme

Absorbance à 280 nmGradient de force ionique

Activité enzymatique spécifique

n° fraction

n° fraction


Bilan de purification d’une enzyme

Étape Protéines totales

(mg)

Activité totale

(U)

Activité spécifique

(U/mg protéines)

Facteur de purification

Rendement

(%)

Homogénat initial 600 6000 10.0 100 Surnageant 150 3750 25.0 2.5 63 Fraction 20-50% sat. (NH4)2SO4

40 2500 62.5 6.3 42

Chromatographie d'échange ionique 8 2000 250.0 25.0 33

Taux de purification: activité spécifique finale/activité spécifique initiale

Rendement de purification: activité totale finale/activité totale initiale, en %


II.1.4. Analyse des protéines par électrophorèse

Anode

Echantilloncathode

tampon

Gel entre 2 plaques de verre

Cuve en plastique

tampon

Gel: tamis moléculaire

Séparation des molécules en fonction de la charge et de la masse

Déplacement de molécules chargées sous l’effet d’un champ électrique.

Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéinesÉlectrophorèse monodimensionnelle

condition native ou condition dénaturante

Sodium dodécyl sulfate ou SDS: CH3-(CH2)11-O-SO3- Na+

Mercaptoéthanol: OH-CH2-CH2-SH

Protéine native Protéine dénaturée- SDS- β-SH

+ SDS- β-SH

+ SDS+ β-SH

Après électrophorèse et révélation

Charge et masse

Masseglobale

Masse de chaque chaîne

100 kDa

40 kDa

15 kDa

Cathode -

Anode + 1 2 3 4 5


Électrophorèse bidimensionnelle

1ère dimensionIEF

2ème dimensionSDS-PAGE

- +

Gradient de pH10 4

- +

Séparation en fonction du pI

Séparation en fonction de la masse


Détection immuno-électrophorétique ou Western blot

RECONNAISSANCE SPÉCIFIQUE PAR ANTICORPS APRES ELECTROPHORESE

Electrotransfert des protéines du gel sur membrane de nitrocellulose


Détection immuno-électrophorétique ou Western blot

Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéinesII.1.5. Détermination de la masse molaire

Chromatographie d’exclusion

Électrophorèse SDS

Sédimentation à l’équilibre

Spectrométrie de masse

Estimation

Plus rigoureuse


(m/q)

+

+

+

Utilisée pour déterminer la masse de protéines et de peptidespour déterminer la séquence de petits peptidespour identifier une modification de la séquence due à une mutation

Spectrométrie de masse

Très précise300 Da à 300 kDaNécessite peu de matériel

II.2. Analyse de la composition chimique d’une protéine


II.2.1. Composition globale

Echantillon protéique

Hydrolyse acideHCL 6N, 110°C, 16-72h

Mélange d’acides aminés

Séparation par échangeuse d’ion

Révélation par ninhydrine

Détecteur

Modification chimique (PTCaa)

Séparation par RP-HPLC

Enregistreur et acquisiteur de données


1er cas: Séparation par échangeuse d’ionsRésine sulfonée

Élution par gradient pH

Coloration par ninhydrine

Mesure de l’absorbance

Profil d’élution comparé à celui d’un mélange de standards

C

COH

OH

O

O

Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéines2ème cas:

Réaction avec isothiocyanate de phényle (PITC) à pH9

Formation de dérivés phénylthiocarbamyles(PTCaa)

Séparation par RP-HPLCMesure de l’absorbance à 254 nm

Profil d’élution comparé à celui d’un mélange de PTCaa standards


Problèmes et solutionsAsn (N) et Gln (Q) transformés en Asp (D) et Glu (E)

Trp (W) est détruitdosé après hydrolyse alcaline ou hydrolyse acide en présence d’antioxydant

Cys (C) pas dosableOxydation ou réduction et carboxyméthylation avant hydrolyse acide

Destruction partielle de Ser (S), de Tyr (Y) et Thr (T)Hydrolyse pendant différents temps et extrapolation

Résidu cystine 2 Résidus cystéine

Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéinesComposition globale en acides aminés

II.2.2. Séquençage des protéines


Insuline: 1ère structure primaire déterminée par F. Sanger en 1953 (Nobel, 1955)

Dégradation d’Edman

Séquençage de l’ADN: Maxam et Gilbert; Sanger .

Chapitre II: Stratégies pour l’étude des protéinesSéquençage des protéines

Rupture des liaisons disulfures.

Résidu cystine Deux résidus cystéine

Destruction du tryptophane

Oxydation

Réduction et carboxyméthylation


Dérivé phénylthiohydantoïne (PTH)Identification par chromatographie

Séquençage des protéines par la méthode d’Edman


Standards

1er cycle

2ème cycle

3ème cycle

v

1er cycle I2ème cycle V3ème cycle G


Identification des PTHaa par RP-HPLC

Séquence N-terminale: S ou T ou V, CAGGDIRSGCNGDSGGPLN

Identification de 30 résidus à partir de quelques picomoles

Problèmes: Ambiguïté possible au 1er cycle Grande séquence et bruit de fond




Identification du résidu N-terminal

Séquençage des protéines


Identification du résidu C-terminal


Réaction d’hydrazinolyse

Carboxypeptidase X-Y

CPA Y ≠ Lys, Arg ,Pro

CPB Y = Arg, Lys

CPP Y ≠ Ser, Gly

CPY X et Y non spécifiques

++ NH2-NH2 NH-NH2NH2-CH-C-

R O

H

Méthode enzymatique

Par récurrence, identification des 3 ou 4 derniers acides aminés


Clivage des protéines en petits peptides, purification et séquençage

Clivage chimique


Clivage enzymatique



Obtention de peptides chevauchants pour reconstituer la séquence complète de la protéine.


Séquence nucléotidique

Synthèse de l’ADNc à partir de l’ARNm

Clonage

Séquence nucléotidique, technique de Sanger

Séquence protéique déduite



Séquençage des protéinesLocalisation des ponts disulfure

Ponts intrachaînes Ponts interchaînes

SS

Réduction et carboxyméthylationÉlucidation des séquencesPosition des cystéines.

Avec protéine native coupure de part et d’autre des ponts S-SIsolement des fragments Analyse des séquences

avant

et

après

ouverture des ponts

SHSH SH

SH

SH

SH

SS

SSSS

1

2

4

3

4a 4b

SSSS

12

3

1

2

1a 1bSH SH SH SH



Analyses et comparaisons des séquences

Relations structure/fonctionMise en évidence d’homologie de séquence: signaux de localisation et de maturation

post-traductionnelle (phosphorylation, glycosylation…), domaines fonctionnels, identification d’acides aminés essentiels.

Familles de protéines

PhylogénieConstruction d’arbres phylogénétiques

Séquences d’une même protéine de différentes espèces: évaluation de la marge évolutive de ces espèces.

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