Chapitre I - Techniques séparatives, Laboratoires sur...

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Chapitre I - Techniques séparatives, Laboratoires sur puce et Membranes

poreuses

Chapitre I. Techniques séparatives, Laboratoires sur puce et Membranes poreuses

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Introduction

Les techniques séparatives permettent la purification ou l’analyse d’un mélange via

la séparation de ses constituants (acides aminés, protéines, ions, etc.). Les deux

principales familles de techniques séparatives que sont la chromatographie et

l’électrophorèse ainsi que les équipements couramment utilisés dans les domaines

médical, chimique ou encore pharmaceutique sont présentés dans ce chapitre.

La réduction des volumes des échantillons, l’intégration de systèmes encombrants

et la mise en parallèle des analyses permettant un haut débit d’analyse à de faibles

coûts représentent les principales motivations de la miniaturisation des systèmes

de séparation visant à l’émergence et au développement de microsystèmes dédiés

à la séparation.

La suite de ce chapitre est donc consacrée à un état de l’art concernant ces

microsystèmes déjà commercialisés ainsi que ceux en cours de développement. Les

microsystèmes de tri sont classés en fonction de leurs applications et de leur niveau

d’intégration.

Les laboratoires intégrés sur puce sont constitués par un canal principal ou un

réseau de canaux dont les parois ou la phase stationnaire qu’ils contiennent sont

fonctionnalisées. Les dispositifs présentés sont dédiés à la séparation de composés

contenus dans un échantillon liquide.

Les membranes poreuses, couramment employées pour la préparation (pré-

concentration, purification, etc.) des échantillons, peuvent être intégrées sur puce

mais sont souvent incorporées dans un système d’analyse en ligne.


24

1 Description et principe des techniques

séparatives

1.1 Chromatographie

Au cours d’une séparation par chromatographie, les molécules à séparer sont

entraînées par un liquide appelé phase mobile sous l’action d’une pression

hydrostatique. Elles interagissent ou au contraire n’interagissent pas avec un

support fixe appelé phase stationnaire constituée, en général, par des microsphères

de silice poreuse. La séparation des composés dépend de leur temps de rétention

sur la phase stationnaire. Les différents types de chromatographie sont classées

dans le Tableau 1 en fonction des paramètres physico-chimiques sur lesquels ils

reposent. On note que plusieurs de ces paramètres peuvent influencer la séparation

de manière simultanée.

Paramètres Types de chromatographie

La charge électrique Echange d’ions Le volume Exclusion, gel de filtration Présence de ligands permettant l’établissement de liaisons spécifiques

Affinité

La polarité et/ou l’hydrophobicité Phase normale / Phase inverse

Tableau 1. Classification des types de chromatographie.

La chromatographie d’échange d’ions repose sur les interactions électrostatiques

entre des groupements ionisables à surface de la phase stationnaire et des

molécules ionisées en solution dans la phase mobile.

La chromatographie d’exclusion permet la séparation de molécules de volumes

différents. Les molécules dont le volume est supérieur à celui des pores des

micro-sphères de la phase stationnaire ne peuvent y pénétrer et sont rapidement

éluées (elles sont exclues) tandis que celles dont le volumes est inférieur y

pénètrent et y subissent des frottements qui les retardent.

Le greffage de longues chaînes carbonées confère à la phase stationnaire un

caractère très hydrophobe caractéristique de la chromatographie à polarité de

phase inversée (ou par phase inverse / reverse phase). Les molécules hydrophobes

en solution dans une phase mobile polaire (donc très peu hydrophobe) établissant

des interactions hydrophobes avec la phase stationnaire sont ainsi retenues dans la


25

colonne. Pour sa facilité de mise en œuvre et sa sélectivité, cette technique est très

utilisée pour la séparation de composés organiques.

Enfin, la chromatographie par affinité est la plus sélective mais c’est aussi la plus

délicate à mettre en œuvre. Elle repose sur la reconnaissance spécifique entre une

molécule du mélange à séparer et une molécule greffée sur la phase stationnaire,

appelé ligand.

Les colonnes utilisées en chromatographie liquide possèdent un diamètre interne

compris entre 2 et 50 mm. Les colonnes les plus couramment utilisées en

chromatographie analytique ont un diamètre de 4.6 mm pour une longueur

comprise entre 10 et 300 mm. Elles sont typiquement remplies de microsphères de

silice de 3 µm à 15 µm de diamètre. Ces billes de silice sont le plus souvent

poreuses avec une taille de pores comprise entre 5 et 30 nm. Les chimies de

surface disponibles vont des groupements carbonés (C18) aux groupements amino

(NH2), en passant par les groupements échangeurs d’ions (SO3-, N(CH3)3

+, etc.)

Plus récemment, en réponse à un besoin d’augmentation des performances des

colonnes, la micro-LC (micro liquid chromatography) s’est développée. La réduction

de la taille des colonnes entraîne une forte augmentation de la sensibilité (à masse

égale d’échantillon injectée), une diminution de la quantité de solvants organiques

utilisée et une diminution de la longueur de séparation. La société G&T Septech's7,

spécialisée dans le domaine de la micro-HPLC (High Performance Liquid

Chromatography), commercialise des colonnes dont le diamètre interne varie entre

75 µm et 1 mm. Ces colonnes sont remplies de microsphères de silice de 3.5 ou 5

µm de diamètre ayant une taille de pores comprise entre 10 et 30 nm.

7 www.gtseptech.no/english/home.html


26

1.2 Techniques électrophorétiques

On recense un grand nombre de techniques électrophorétiques : l’électrophorèse

sur acétate de cellulose et sur gel (polyacrylamide, agarose), l’électrophorèse

bidimensionnelle sur gel et, plus récemment, l’électrophorèse capillaire.

Les techniques séparatives de type électrodynamique permettent la séparation de

molécules chargées : protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques ou

encore nucléotides et, dans certaines conditions, (emploi de micelles de détergents

ioniques) la séparation de molécules non ioniques.

Le liquide est mis en mouvement sous l’action d’un champ électrique. La dispersion

des bandes d’échantillon est alors très faible ce qui représente un avantage certain

par rapport à la chromatographie (Figure 1).

Temps

A

Temps

A

a) b)

Figure 1. Fronts d’écoulement et diagrammes d’élution en fonction du type d’écoulement :

a) hydrodynamique, dispersion de la bande d’échantillon : pic large, et

b) électrodynamique, bande d’échantillon non dispersée : pic étroit.

Les deux effets électrodynamiques régissant la séparation des molécules dans les

systèmes d’électrophorèse ainsi que les deux techniques électrophorétiques les plus

récentes que sont l’électrophorèse et l’électro-chromatographie capillaires sont

présentées dans les paragraphes suivants.


27

1.2.1 Les deux effets électrodynamiques

1.2.1.1 Flux électro-osmotique

La présence d’un électrolyte dans un capillaire constitué par un diélectrique

entraîne l’apparition de charges fixes à la surface de celui-ci et la réorganisation des

charges mobiles du liquide qui forment une double couche dite de Debye-Huckel. La

première couche est liée au solide par interaction électrostatique entre la surface

chargée et un film moléculaire constitué de contre-ions. Elle porte le nom de

« couche de Stern ». La seconde couche est diffuse et sa structure dépend d’un

équilibre statistique entre l’agitation thermique et les forces électrostatiques. La

génération d’un flux électro-osmotique a lieu lorsque l’on applique un potentiel à un

fluide confiné entre des parois en présence d’une double couche établie. Sous l’effet

de forces de Coulomb, la double couche est mise en mouvement et entraîne le

fluide tout entier sous l’action des forces visqueuses.

1.2.1.2 Migration électrophorètique

C’est le phénomène de mise en mouvement d’objets chargés distribués dans une

solution sous l’action d’un champ électrique. La séparation s’effectue suivant la

valeur du rapport charge sur taille des molécules à séparer.

1.2.2 Electrophorèse capillaire

L’électrophorèse capillaire ou CE (capillary electrophoresis) est une technique très

répandue dans le domaine de la séparation car les conditions de séparation

nécessaires sont particulièrement adaptées à l’analyse de petits volumes en un

temps court (par rapport aux systèmes traditionnels).

Un champ électrique est imposé le long d’un capillaire par deux électrodes

plongeant dans des réservoirs externes. Ce champ a pour effet d’induire un

écoulement électro-osmotique entraînant un déplacement du fluide et de provoquer

la migration des particules chargées. Dans un système d’électrophorèse capillaire,

le flux électro-osmotique est généralement assez important pour que toutes les


28

molécules se déplacent dans le même sens mais à des vitesses différentes selon

leur rapport charge sur taille. On l’emploie couramment aujourd’hui pour le

génotypage, les tests de paternité, ou encore l’identification des OGM [1].

1.2.3 Electro-chromatographie capillaire

Le domaine d’application des systèmes électrophorétiques peut être étendu grâce

au couplage de l’électrophorèse capillaire et de la chromatographie liquide : c’est

l’électro-chromatographie capillaire ou CEC (Capillary Electro Chromatography).

Ainsi la séparation de composés neutres est rendue possible. Les phases

stationnaires introduites dans le canal d’électrophorèse peuvent être de plusieurs

types : monolithiques ou bien constituées par la structuration et/ou la

fonctionnalisation chimique des parois du capillaire.

Les matrices monolithiques polymère sont obtenues par polymérisation dans le

capillaire d’un mélange de monomères dont la composition permet d’ajuster la

porosité, la surface spécifique et la taille des pores. A la fin des années 90,

l’initiation de la polymérisation par insolation UV permet de définir des zones de

polymérisation précises ce qui rend la méthode plus flexible et permet la définition

de motifs précis par photo masquage [2].

Les phases stationnaires à base de silice sont réalisées par procédé sol gel [2, 3

et 4]. Cette technique permet de fabriquer des phases monolithiques à partir d’une

solution précurseur à base d'alkoxydes de formule M(OR)n où M est un métal ou le

silicium et R un groupement organique alkyle CnH2n+1. La phase stationnaire étant

généralement solidifiée in situ par traitement thermique, ceci engendre des

difficultés de résolution spatiale. J.-R. Chen et al. [5] ont résolu ce problème en

ajoutant au mélange précurseur un composé photosensible permettant la

localisation de la réaction par une étape d’insolation.

L’électro-chromatographie en capillaire ouvert, plus couramment appelée OTEC

pour Open Tubular Electro-Chromatography, repose sur l’augmentation et/ou la

fonctionnalisation de la surface des capillaires par une structuration de leur surface

interne et/ou un traitement chimique pendant ou après la structuration. Ceci peut

être réalisé par gravure de la paroi interne du capillaire à l’aide d’une solution

basique [6, 7 et 8] ou par création d’une couche de silice sur la surface interne du

capillaire par la technique sol gel [9, 10].


29

2 Laboratoires sur puce dédiés à la séparation

2.1 Influence de la miniaturisation sur les

performances de la séparation

Le fait que la miniaturisation permette l’utilisation de champs électriques intenses8

et la réduction des temps d’analyse tout en gardant une efficacité élevée est un

moteur pour le développement de microsystèmes séparatifs mettant à profit les

phénomènes électrodynamiques [1].

En ce qui concerne la chromatographie, malgré les avantages évidents de la

miniaturisation (traitement de petits volumes, intégration, diminution de la quantité

de solvants organiques, parallélisation des analyses), celle-ci n’améliore pas les

performances analytiques de ces dispositifs. En effet, l’efficacité d’un système

chromatographique se caractérise par un nombre N, appelé nombre de plateau

théorique. Une estimation de ce nombre est donnée par P. Tabeling [1] :

2bDtN R≈ où tR est le temps de rétention, D, le coefficient de diffusion moléculaire

pour l’espèce concernée, et b une taille typique de pore ou d’espace entre grains. A

temps de rétention fixé, la miniaturisation n’entraîne donc pas de gain en efficacité.

2.2 Choix du matériau ou matériau de choix ?

Depuis plus de deux décennies, l’évolution des techniques de micro et nano

fabrication a ouvert la voie au développement de réseaux micro et nanofluidiques

interconnectés de plus en plus complexes. Trois principales catégories

d’applications ont engendré ce développement rapide:

Les systèmes de micro analyse pour la purification, la séparation, ou

encore l’identification. Ce concept de µTAS (micro Total Analysis

System) a été inventé par Andreas Manz et al. au début des années 90

[11],

Les microréacteurs pour la synthèse chimique,

8 Sous réserve de dissipation de l’effet joule


30

Et depuis cette dernière décennie, des outils microfluidiques divers sont dédiés

aux applications biologiques, biotechnologiques et biomédicales qui vont de

l’étude comportemental d’une cellule unique au « screening » des conditions

optimums pour la cristallisation d’une protéine.

Historiquement, les premiers systèmes microfluidiques furent réalisés sur silicium à

partir des techniques de fabrication développées dans l’industrie des semi-

conducteurs pour la réalisation de systèmes électromécaniques appelés MEMS

(Micro Electro Mechanical Systems) [12]. Le verre, le pyrex et le quartz sont

également utilisés depuis longtemps du fait de leur inertie chimique et de leur

transparence.

Cependant ces techniques sont de haute technologie et demeurent assez

coûteuses, ce qui a entraîné plus récemment l’utilisation d’autres techniques de

fabrications collectives et peu coûteuses par moulage ou emboutissage à chaud et

par conséquent l’essor des microsystèmes basés sur des polymères (PDMS9, résine

SU-8 [13], PMMA10) [14].

D’une manière générale aucun matériau n’est idéal, et un choix s’impose par

rapport aux propriétés du matériau qui doivent être compatibles avec les critères

imposés par les conditions expérimentales. Les propriétés peuvent être classées

ainsi :

La compatibilité avec les conditions d’expérience (pression, température, etc.), le

milieu (pH, T°, etc.), la chimie de surface et les molécules biologiques ;

Les propriétés de la surface : rugosité, potentiel zêta, mouillabilité, bio adhésion ;

Les propriétés physiques : rigidité, transparence, expansion thermique,

perméabilité ;

La capacité d’intégration avec d’autres matériaux.

La majorité des laboratoires sur puce ont une base verre, pyrex ou quartz qui sont

des matériaux dont les techniques de mise en forme et la chimie de surface sont

bien maîtrisées. Ce sont de bons candidats pour les microsystèmes fluidiques car

outre leur excellente inertie chimique et leur transparence, leur surface est

naturellement chargée, ce qui en fait des matériaux adaptés à des applications

basées sur l’utilisation d’un flux électro-osmotique. Leur structuration est

généralement réalisée par gravure humide dans une solution à base d’acide

9 Poly(diméthylsiloxane) 10 Poly(methylmethacrylate)


31

fluorhydrique. On note que cette gravure étant isotrope, elle ne permet pas de

réaliser des motifs avec un fort facteur de forme.

Les microsystèmes fluidiques polymères profitent des propriétés des élastomères

qui permettent l’intégration de valves et de pompes péristaltiques pour obtenir des

systèmes très intégrés (VLSI —Very Large Scale Integration [15]). Cependant,

malgré leur facilité de fabrication et la grande diversité des réseaux réalisables, les

microsystèmes fluidiques polymères ne sont pas compatibles avec la plupart des

solvants non aqueux et sont sensibles à la température (température de

fonctionnement max ≈ 150°C).

Enfin, le silicium permet l’intégration d’un microsystème fluidique sur la même puce

qu’un circuit intégré et permet ainsi la cohabitation entre les fonctions de

séparation, de détection (ex. : détecteur thermique), de contrôle des écoulements

(ex. : débitmètre) et des fonctions électroniques de post traitement des données. Il

est mécaniquement très stable en température et a une bonne compatibilité

chimique (inertie) [16]. De plus, la micro- et nanostructuration du silicium par

photolithographie / gravure permet une fabrication collective des dispositifs. Le

principal handicap du silicium pour son utilisation massive dans les Lab-on-chip est

sa conductivité élevée qui ne permet pas son utilisation sans isolation spécifique

dans les systèmes basés sur un écoulement électrodynamique.

2.3 Dispositifs pour la séparation

2.3.1 Microsystèmes industrialisés

2.3.1.1 Puces microfluidiques

Les sociétés Microfluidic ChipShop11, Micronit12 ou encore microTEC13, proposent

des puces microfluidiques afin de répondre aux besoins spécifiques de certains

laboratoires ou industries dans le domaine de la biologie ou de la chimie. Ainsi, elles

commercialisent des produits au design standard ou personnalisé. Ces puces sont

disponibles sur plusieurs matériaux tels que le verre ou le quartz chez Micronit

11 www.microfluidicchipshop.de 12 www.micronit.com 13 www.microtec-d.com


32

(Figure 2), le PMMA, le Zeonex, le PC (Polycarbonate) et d’autres polymères chez

Microfluidic ChipShop et microTEC. Ces puces sont éventuellement disponibles avec

des connectiques microfluidiques spécifiques et/ou des électrodes intégrées et leur

prix vont de 50 €/unité à 180 €/unité (Microfluidic ChipShop).

Figure 2. Puce microfluidique sur verre commercialisée par Micronit.

2.3.1.2 Laboratoires sur puce

L’industrie des laboratoires sur puce se développe depuis une dizaine d’année avec

l’objectif de miniaturiser les procédures de laboratoire des compagnies

pharmaceutiques et de biotechnologie [17]. La première application est le

remplacement de l’électrophorèse sur gel polyacrylamide pour la séparation de

protéines ou d’ADN. Plus récemment, les recherches de nouveaux médicaments et

sur le génotype ont engendré le développement de puces permettant des analyses

cellulaires et enzymatiques ou la préparation, la séparation et la détection

d’échantillons d’ADN.

La division microfluidique de STMicroelectronics14 a développé une puce à ADN en

technologie silicium / verre (Figure 3) ainsi qu’un analyseur adapté (injection

échantillon, détection optique, etc.) faisant l’interface avec l’utilisateur. La puce

contient un système d’amplification de l’ADN constitué de 12 canaux, gravés dans

le silicium, chauffés par des résistances. L’ADN amplifié est ensuite dirigé vers une

zone de détection comprenant plusieurs sondes greffées avec des fragments d’ADN

à détecter. La lecture de la puce est effectuée par mesure de la fluorescence des

sondes. Le rendement global d’amplification PCR de cette puce est équivalent à

celui des tubes réactifs traditionnels.

14 www.st.com/stonline/products/technologies/labonchip/labonchip.htm


33

Figure 3. Laboratoire sur puce dédié à

l’amplification et à la détection d’ADN fabriqué

par STMicroelectronics.

Figure 4. Le laboratoire sur puce

« LabChip® » fabriqué par Agilent.

Agilent Technologies15 est une société spécialisée dans la mesure dans les

domaines des sciences du vivant et de l’analyse chimique. Elle développe des

solutions innovantes dans le domaine des laboratoires sur puce et des analyseurs

associés. Des laboratoires sur puce pour la séparation électrophorétique de protéine

et d’ADN ont été développés en collaboration avec la société Caliper Technologies

(conception de systèmes microfluidiques sur quartz). Concernant la séparation de

protéines, le « 2100 Bioanalyser » associé au « Protein 200 LabChip® kit » (Figure

4) permet de séparer un échantillon de 4 µL contenant 10 protéines dont la masse

moléculaire se situe entre 14 et 200 kD en moins de 30 min. La résolution en taille

de la séparation est de l’ordre de 10%16 et la sensibilité est comprise entre 20 et

2000 ng.µL-1 de BSA17 en solution dans un tampon salin. En comparaison, un

système d’électrophorèse 2D sur gel polyacrylamide donne la même séparation en

100 minutes sous 125 V avec la même résolution en taille.

Figure 5. Laboratoire sur puce de type

« HPLC » commercialisé par Agilent

Technologies.

Figure 6. Schéma de principe du laboratoire

sur puce HPLC commercialisé par Agilent

Technologies.

15 www.chem.agilent.com/Scripts/PCol.asp?lPage=50 16 Deux protéines dont les masses ont un écart d’au moins 10% possèdent des pics distincts 17 Bovine Serum Albumin


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Le premier laboratoire sur puce basé sur le principe de chromatographie liquide

haute performance couplée avec une analyse par spectrométrie de masse a été mis

sur le marché en mars 2005 par Agilent Technologies (Figure 5). Il s’agit du

« 1200 Series HPLC-Chip/MS system ». Celui-ci est fabriqué en polymère et

contient une colonne de chromatographie échangeuse d’ion, une colonne

d’enrichissement de l’échantillon (préconcentration) et une colonne de séparation

directement terminée par une pointe « d’électro-spray » intégrée sur la puce pour

l’analyse en spectrométrie de masse (Figure 6). Les colonnes sont remplies de

billes de silice ou de carbone. Les dimensions typiques de la colonne de séparation

sont : 50 µm de profondeur sur 75 à 250 µm de largeur pour une longueur

comprise entre 43 et 150 mm. La séparation de 21 peptides contenus dans un

échantillon de sérum humain traité par une enzyme digestive ayant pour cible la

protéine précurseur de l’alpha 2 macroglobuline a été réalisée. La colonne

échangeuse d’ion permet de retenir les six protéines très abondantes du sérum :

HSA, IgG, IgA, haptoglobine, transferrine et antitrypsine qui font écran lors de

l’analyse des peptides. La colonne d’enrichissement permet de concentrer les

fragments peptidiques peu nombreux dans l’échantillon. Enfin, la colonne de

séparation analytique assure la séparation des 21 peptides.

La société Biosite18 commercialise des systèmes permettant au corps médical de

faire un diagnostic en moins de 15 minutes à partir d’une goutte de sang ou d’urine

prélevée sur un malade (Figure 7). Selon le laboratoire sur puce utilisé, le test

immunologique diffère et peut permettre de détecter les symptômes d’une crise

cardiaque (détection de trois protéines myocardes) ou la présence de drogues chez

le patient.

Figure 7. Triage® Cardiac Panel fabriqué par la société Biosite constitué d’un analyseur et

d’un laboratoire sur puce indépendant.

18 www.biosite.com


35

De nombreux dispositifs sont également développés dans le cadre de la recherche

en laboratoire avec la mise au point de nouveaux matériaux (polymères, sol gel,

matériaux micro-structurés), fonctionnalisations de surface et méthodes de

compaction pour la réalisation de phases stationnaires plus performantes.

L’émergence d’une technique de tri innovante, conséquence de la diminution des

dimensions des laboratoires sur puce, est également présentée dans le paragraphe

suivant.

2.3.2 Dispositifs en développement

2.3.2.1 Chromatographie sur puce

La chromatographie liquide sur puce n’est pas un domaine riche en publications en

partie car la compaction externe de la phase stationnaire est un procédé laborieux

(haute pression), non collectif et consommateur de temps. On recense néanmoins

quelques solutions originales pour la compaction des phases stationnaires [18, 19]

ou encore des méthodes alternatives pour éviter les problèmes liés à l’injection

d’une phase stationnaire. Ainsi, on trouve des systèmes dont la phase stationnaire

est un monolithe à base polymère injecté dans le canal [20, 21]. Il existe

également des systèmes chromatographiques dans des canaux ouverts [22, 23] ou

dont les parois sont recouvertes par une phase stationnaire [24], ou encore dans

des canaux constitués par un réseau de microcanaux [25, 26].

La fabrication de phases stationnaires continues dites monolithiques pour la

chromatographie ou l’électro-chromatographie est réalisée par polymérisation d’une

solution de monomères ou réaction sol gel in situ dans un canal de séparation.

Plusieurs travaux rendent compte de l’utilisation de ces phases stationnaires [27].

Par exemple, Björkman et al. réalisent la séparation d’un échantillon de quatre

protéines acides de concentration 0.5 mg.mL-1 au sein de canaux (dimensions :

long. = 4 cm, larg. = 100 µm, prof. = 40 µm) en diamant contenant une phase

polymérisée incluant des groupements échangeurs d’anions [20]. Lors de la

séparation, la pression appliquée est de 9 bars et le débit de la phase mobile est de

0.1 µL.h-1. Un monolithe de méthacrylate après injection et polymérisation dans un

canal en polymère fabriqué par emboutissage à chaud peut également jouer le rôle

de phase stationnaire (Figure 8) [21]. Le canal permet la séparation de trois


36

protéines de concentration 6 pmol.µL-1 (BSA, myoglobine et cytochrome C) après

leur digestion enzymatique.

Figure 8. Image MEB d'un monolithe au sein d'un canal polymère [21]

L’intégration sur puce de phases stationnaires compactées est confrontée au

problème de tassement de celle-ci. L’équipe du professeur Quing He de l’institut de

technologie de Californie (CALTECH) développe néanmoins des solutions

technologiques intéressantes pour palier cette difficulté. Les canaux

silicium / polymère qu’il réalise sont représentés sur la Figure 9. Deux méthodes

sont utilisées pour la compaction. La première consiste en l’injection haute pression

(14 bars) d’une phase stationnaire constituée de billes de silice poreuse de 7 µm de

diamètre fonctionnalisées par des groupements échangeurs d’anions [18]. Cette

phase stationnaire est immobilisée dans le canal qui présente des rétrécissements

de taille inférieure à celle des billes de silice. Le dispositif final est représenté sur la

Figure 10. Un échantillon de 4 nL contenant sept anions est séparé en moins de

3 minutes dans ce canal de 8 mm de longueur, 100 µm de largeur et 25 µm de

profondeur. Dans la deuxième méthode, les billes de silice poreuse de diamètre

5 µm, fonctionnalisées en C18, sont en solution dans une résine déposée à la

tournette lors de la fabrication du canal. Après fermeture du canal et dissolution de

la résine, une pression de 1 bar suffit à compacter correctement la phase

stationnaire. Un échantillon de 1 µL contenant les peptides issus de la digestion de

cytochrome C de concentration 0,1 µM est séparé en une dizaine de minutes dans

un canal de 2,7 mm de longueur (longueur contenant la phase compactée), 100 µm

de largeur et 26 µm de profondeur.


37

Figure 9. Vue schématique d'un canal

avant injection de phase compactée [18].

Figure 10. Colonne chromatographique sur

puce contenant une phase stationnaire de

billes de silice compactées [18].

La surface interne du canal peut également être recouverte de particules qui jouent

le rôle de phase stationnaire. Par exemple, l’adsorption de particules de latex

fonctionnalisées par des groupements ammonium quaternaires (groupements

cationiques) permet la séparation d’ions par chromatographie ionique dans un canal

gravé sur silicium et fermé avec une plaque de pyrex [24]. Un échantillon de 20 nL

contenant quatre ions est ainsi trié en quelques minutes avec un débit de

150 nL.min-1 dans un canal de 23 cm de longueur, 200 µm de largeur et 3,6 µm de

profondeur.

B. He et al. développent un nouveau type de phase stationnaire basée sur la micro-

structuration en volume d’un canal de séparation : cette structure est appelée

COMOSS pour Collocated Monolith Support Structure [26]. La section du canal se

divise en un grand nombre de canaux de plus faibles dimensions. Un autre exemple

de dispositif semblable est constitué par un réseau de canaux gravés dans le

silicium avec un fort facteur d’aspect (largeur de 50 µm, profondeur de 250 µm et

longueur de 3 cm) [25]. Ces canaux sont silanisés puis fonctionnalisés avec des

molécules échangeuses d’ions pour une utilisation en chromatographie ionique. La

séparation d’un échantillon de 20 nL contenant trois sels d’ammonium (KBr, KCl et

K2SO4) est réalisée en moins de 6 min avec un débit de 10 µL.min-1.

La miniaturisation a donné lieu à l’apparition d’un nouveau type de

chromatographie basée sur les propriétés d’écoulement des fluides et de diffusion

des molécules dans des canaux ouverts de taille micrométrique. La

« chromatographie hydrodynamique » repose sur le fait que les « grosses

particules » circulent dans la partie centrale du canal, tandis que les « petites

particules » explorent en moyenne la totalité de la section. Il s’en suit que les

petites sont éluées moins vite que les plus grosses. Ainsi, M. T. Blom et al. [23]

réalisent la séparation de fluorescéine d’un diamètre de l’ordre du nm et de


38

particules fluorescentes de 26 nm de diamètre dans des canaux de 0,5 mm de

largeur, de 1 µm de profondeur et de 8 cm de longueur.

2.3.2.2 Electrophorèse sur puce

L’électrophorèse est le mode de séparation le plus utilisé pour la séparation de

mélanges sur puce (molécules organiques ou biologiques). L’électrophorèse sur

puce est réalisée dans des canaux dont la section est ouverte, selon les mêmes

principes de tri que pour l’électrophorèse capillaire.

La plupart des laboratoires sur puce utilisant le principe de l’électrophorèse sont

réalisés sur quartz [28], verre [29, 30], ou polymères (ex. : PMMA [31]) [32]. Le

principe de séparation par électrophorèse étant déjà bien maîtrisé avec

l’électrophorèse capillaire (CE), les efforts de recherche sont orientés vers

l’adaptation des techniques séparatives fonctionnant sur CE mais aussi vers

l’intégration de systèmes de détection [29].

Un exemple de miniaturisation et d’intégration est présenté par A. R. Stettler et al.

dont l’objectif est d’étudier les interactions entre un ligand et un substrat par

électrophorèse par affinité [30]. L’expérience est réalisée dans des canaux semi-

circulaires sur verre de largeur 50 µm, de profondeur 20 µm et de longueur 2,5 cm.

La migration électrophorétique des composés est comparable pour un canal et un

capillaire de silice dont la longueur est 20 fois plus grande que celle du canal.

Quant au silicium, il possède une faible résistivité comprise entre 10-3 et 103 Ω.cm

(selon le dopage) si on la compare à celle du verre (1016 Ω.cm), du quartz, ou

encore des polymères. Une séparation dont la force motrice est une différence de

potentiel n’est pas envisageable sans isolation de ce substrat par rapport au canal

de séparation. J. Cheng et al. réalisent le premier canal sur silicium isolé par une

couche de 2 µm d’épaisseur d’oxyde thermique [33]. Les électrophérogrammes

d’analyse d’échantillons d’ADN après PCR obtenus par CE et électrophorèse sur

puce sont comparables et valident l’utilisation de puce silicium / verre comme

support électrophorétique. Plus récemment, on trouve dans la littérature de

nouveaux résultats similaires [34, 35].


39

2.3.2.3 Electro-chromatographie sur puce : Phases stationnaires et dispositifs

L’électro-chromatographie, quant à elle, bénéficie à la fois de l’effet des forces

électrodynamiques mais aussi de l’effet d’une phase stationnaire comme en

chromatographie.

La méthode sol gel est utilisée par Jindal et al. [36] pour la fabrication d’une phase

stationnaire dans un canal en quartz. Ce monolithe est constitué par la

polymérisation d’un silane en C4. Les particules obtenues par cette méthode sont

de l’ordre de 5 µm de diamètre et leur porosité est d’environ 30 nm. Une tension

assez basse (0-3 kV) permet la séparation de 3 peptides (Trp-Ala, Leu-Trp, et Trp-

Trp).

Comme nous l’avons vu au paragraphe 2.3.2, la phase stationnaire peut être

constituée par micro / nanostructuration des matériaux. Le remplissage de la

totalité de la section du canal par des nano-piliers réalisés par emboutissage à

chaud ou par nano-impression de matériaux polymères (PMGI, PMMA) représente

une solution originale basée sur l’utilisation de matériaux plastiques [37].

Plusieurs travaux sont également à répertorier dans le domaine de l’électro-

chromatographie en canaux « ouverts » (OChEC pour Open channel electro-

chromatography), c'est-à-dire où la phase stationnaire ne remplie pas toute la

section du canal. Elle peut alors être constituée par le dépôt d’une couche

spécifique ou par micro / nanostructuration des parois.

L’injection d’une solution sol gel permet l’augmentation de la surface spécifique et

la fonctionnalisation des parois des canaux. Des canaux de longueur 60 cm et de

profondeur 23 µm sont ainsi réalisés par gravure anisotrope d’un wafer de pyrex

avec HF, fermeture par collage fusion pyrex/pyrex (650°C) et traitement sol gel

avec une solution de silane en C8 [38]. Dans ce canal, la séparation d’un mélange

de trois hydrocarbones polycycliques aromatiques non chargés et non polaires

(naphtalène, phénanthrène, pyrène) donne de meilleurs résultats que celle

effectuée dans un capillaire de 50 µm de diamètre et 40 cm de longueur ayant subit

le même type de fonctionnalisation.

Comme représenté sur la Figure 11, T. Sano et al. intègrent une couche d’alumine

poreuse dont les pores ont un diamètre d’environ 80 nm au sein d’un laboratoire


40

sure puce [39]. La séparation d’un mélange de deux molécules d’ADN, de 28 nm et

105 nm de rayons de giration respectifs, est réalisée sous 150 V en une minute

environ. Les petites molécules sont éluées en seconde position car elles sont plus

souvent piégées par les nano-pores.

Figure 11. Schéma d’un laboratoire sur puce

pour la séparation d’ADN de différentes

dimensions par électro-chromatographie [39].

3 Membranes poreuses : techniques de

séparation et applications

La distinction entre laboratoire sur puce et membrane poreuse est justifiée par le

fait que les membranes ne sont pas forcément intégrées sur une puce

microfluidique mais sont souvent incorporées (par serrage, collage, etc.) dans un

système d’analyse en ligne et couplées avec une analyse de type

chromatographique ou électrophorétique. L’étude bibliographique proposée ci-

dessous regroupe la présentation des techniques de séparation membranaires et

des exemples d’intégration et/ou de mise en ligne de membranes poreuses.

L’incorporation de membranes dans des systèmes d’analyses complets, miniaturisés

et en ligne, intéresse de nombreux domaines de recherche pour la préparation des

échantillons afin de minimiser la consommation de solvants, d’échantillon, de temps

et la pollution due aux manipulations humaines [40]. En effet, les membranes

possèdent une grande surface interne pour un faible encombrement et permettent

d’éviter les difficultés de préparation rencontrées dans les systèmes d’analyses

d’échantillons standard (compaction et homogénéité de la phase stationnaire).


41

Les membranes sont utilisées pour le tri et la concentration d’échantillons, la

filtration des molécules «polluantes» pour les colonnes chromatographiques

(amélioration de sensibilité), le dessalage de solutions de protéines avant une

analyse par spectrométrie de masse et, plus récemment, comme phase stationnaire

pour la chromatographie par affinité.

Le Tableau 2 présente les quatre principales techniques membranaires pour la

préparation des échantillons : la dialyse, l’électrodialyse, la filtration et l’extraction

membranaire.

Techniques Type de membrane Principe de la

séparation

Force motrice

Dialyse Poreuse

Exclusion stérique Différence de concentration

Electrodialyse Poreuse Exclusion stérique + transport sélectif d’ion

Différence de potentiel

Filtration Poreuse Exclusion stérique Différence de pression

Extraction

membranaire

Poreuse ou non poreuse Différence des coefficients de partage

Différence de concentration

Tableau 2. Type de membrane, principe de séparation et force motrice entraînant le

passage des molécules à travers la membrane en fonction de la techniques de séparation

membranaire (préparation d’ échantillons).

3.1 Dialyse et Electrodialyse

Une unité de dialyse est constituée d’une membrane poreuse et de canaux

accepteur et donneur dans lesquels le flux des liquides est tangent à la membrane

(Figure 12). Le fluide à analyser circule dans le canal donneur et les molécules

dont le diamètre est inférieur à la taille des pores diffusent à travers la membrane

poreuse sous l’action du gradient de concentration entre les deux canaux [41, 42].

La membrane peut être plane ou constituée par une fibre creuse afin d’augmenter

sa surface d’échange. La dialyse est couramment utilisée pour des analyses

biomédicales (ex. : détection de drogues dans le plasma ou le sang, dessalage de

protéines par dialyse en ligne [43]) et alimentaires (ex. : analyse de la composition

d’un lait ou suivie de la fermentation du vin [42]).


42

Échantillon injectédans le canal donneur Canal

accepteur

Membrane poreuse

Échantillon injectédans le canal donneur Canal

accepteur

Membrane poreuse

Figure 12. Schéma de principe d’une unité de dialyse.

L’électrodialyse diffère de la dialyse par le fait que les composants chargés

traversent la membrane non seulement sous l’effet du gradient de concentration

mais aussi de la différence de potentiel entre les canaux donneur et accepteur. A la

séparation par taille s’ajoute alors une séparation en fonction de la charge du

composant à trier. Cette technique est peu utilisée, cependant elle donne de très

bons résultats pour l’analyse de l’eau (acides, amines, bases).

R.S. Foote et al. du laboratoire national d’Oak Ridge utilisent cette technique pour

la préconcentration d’une solution de protéine avant injection dans un canal de

séparation par électrophorèse sur puce (Figure 13) [44]. Une augmentation de

590 fois du signal d’électrophorèse est obtenue pour la protéine β-galactosidase

après une préconcentration de 8 minutes de la solution à analyser. La membrane

en silice poreuse, fabriquée par la méthode sol gel à partir d’une solution à 30% de

silicate de potassium, est intégrée dans le système de séparation.

a) b)

c)

a) b)

c)

Figure 13. a) Schéma d’un dispositif pour la préconcentration et la séparation d’une

solution de protéines par électrophorèse, selon [44], b) Agrandissement de la zone de

préconcentration contenant la membrane en silice poreuse, c) Coupe transversale

schématique de la zone de préconcentration.


43

3.2 Filtration

L’échantillon à traiter et le solvant sont en amont de la membrane et seules les

molécules de tailles inférieures à celle des pores ainsi que le solvant la traversent.

Contrairement aux techniques précédentes, la résistance au transfert de masse

n’est pas seulement due à la membrane mais aussi à la couche des molécules

filtrées qui se forme en amont de celle-ci.

Cette technique est essentiellement utilisée dans le domaine alimentaire pour la

filtration de soupe de fermentation (précurseurs du vin) afin de préparer des

échantillons pour une analyse chromatographique en éliminant les microorganismes

et les macromolécules. Dans la littérature, on note cependant la présence de

systèmes de filtration en ligne des produits de fermentation issus de la fabrication

d’antibiotiques tels que la pénicilline V, précédant une analyse chromatographique

[42].

3.3 Extraction membranaire

L’extraction membranaire est utilisée pour l’extraction et la concentration de

molécules comme alternative aux procédés classiques tels que l’extraction en phase

solide (SPE pour Solid Phase Extraction) et l’extraction en phase liquide (LLE pour

Liquid Liquid Extraction). En SPE classique, la solution contenant les molécules à

analyser passe à travers un sorbant solide, les molécules y sont adsorbées et sont

ensuite éluées (extraction) par un solvant organique. L’extraction et la

concentration de molécules par LLE sont effectuées grâce à l’ajustement du pH, le

choix des solvants ou encore à l’incorporation de réactifs dans le mélange initial.

Ces deux techniques sont largement répandues mais nécessitent une forte

consommation de solvant et sont difficiles à automatiser et à mettre en ligne.

Un système d’extraction membranaire est constitué de la même manière qu’une

unité de dialyse (membrane et canaux accepteur et donneur). Le passage des

molécules à travers la membrane s’effectue selon leur taille, mais surtout selon les

coefficients de partage (fonction de la composition et de la concentration) des

fluides contenus dans la membrane et les canaux accepteur et donneur.

L’extraction membranaire peut être effectuée sur deux types de membranes :


44

Membranes poreuses :

Elles sont largement utilisées pour la préparation des échantillons en chimie

analytique ou encore pour l’analyse de polluants dans les eaux usées [45] ou les

huiles alimentaires [46] (ex. de polluants : herbicides, ions métalliques, surfactants

anioniques, composés organiques semi volatils). Les membranes couramment

utilisées pour l’extraction membranaire sont à base de polymères et sont

généralement hydrophobes, c’est à dire perméables aux solvants organiques mais

imperméables à l’eau.

Membranes non poreuses :

Elles sont généralement à base de gomme de silicone. Dans le cas d’une utilisation

avec un solvant organique, le polymère gonfle et se gorge de solvant, ce qui revient

à une séparation sur membrane poreuse. Sachant que le coefficient de diffusion

dans les polymères est moins élevé que dans les liquides, le transfert de masse et

donc l’extraction sont plus lents dans ce type de système.

Une membrane composite constituée d’un corps de polypropylène micro-poreux

d’épaisseur 20 µm et d’une couche de siloxane d’épaisseur 1 µm est développée

pour permettre l’analyse en ligne de composés organiques semi volatils tels que le

phénol, l’alcool benzylique, le nitrobenzène ou encore l’éther de phényle, contenus

dans des eaux usées [45]. L’eau à analyser circule dans le canal donneur tandis

qu’un solvant organique s’écoule dans le canal accepteur.

Le même type de membrane en polypropylène (épais. = 25 µm, ∅pores = 40 nm) est

utilisé pour l’extraction et la concentration en ligne d’herbicides triazines contenus

dans des huiles de tournesol et de maïs [46]. Les phases donneur et accepteur

étant constituées respectivement par une dilution d’huile dans de l’hexane et une

solution aqueuse acide.

3.4 Chromatographie

La chromatographie membranaire est basée sur des interactions spécifiques entre

la phase stationnaire et l’analyte : c’est une chromatographie d’affinité (ou de

pseudo-affinité).


45

Par exemple, l’adsorption de protéines BSA19 dans une membrane polymère en

PVFD20 dont la dimension des pores est de 100 nm permet la séparation chirale de

deux énantiomères21 [47]. De même, le développement d’une membrane poreuse

en polyéthylène (∅pore = 200 nm), fonctionnalisé par greffage de L-acides aminés

est réalisé avec l’objectif de faire une séparation basée sur les interactions pseudo-

bio-spécifiques entre ces L-acides aminés et un groupe de protéines définies [48].

Les membranes polymères imprimées de façon moléculaire (MIP pour Molecularly

Imprinted Polymer) constituent une autre approche pour la séparation de composés

par chromatographie membranaire. Des MIP sont développées pour des

applications de type extraction membranaire et séparation chromatographique par

le groupe de M. Ulbricht de l’université de Duisburg-Essen [49, 50]. Par exemple,

une membrane imprimée par des molécules de rhodamine B (Rh B) est réalisée

pour la concentration d’une solution de cette même molécule. Des molécules de Rh

B sont ajoutées à la solution mère de fabrication de la membrane composée

d’acétate de cellulose et de polysulfone sulfoné. Ces molécules «impriment» la

structure du polymère lors de la polymérisation et sont évacuées lors du rinçage

laissant un site de liaison qui leur est spécifique. Ces membranes ont une surface

spécifique d’environ 18 m².g-1. Le même type de membrane peut être imprimé par

des molécules d’ATP22 et être utilisé pour la séparation d’un mélange de nucléotides

(AMP, ADP, CTP, ATP, etc.).

19 Bovine serum albumin 20 Porous poly(vinylidene fluoride) 21 Molécules images l'une de l'autre dans un miroir mais non superposables. 22 Adénosine triphosphate : molécule utilisée chez les animaux et les plantes pour fournir de l'énergie aux réactions chimiques.


46

Conclusion

Bien que le silicium soit le matériau idéal pour l’intégration des fonctions

électroniques et séparatives sur le même substrat, notre étude bibliographique met

en évidence le fait qu’il est relativement peu utilisé, par rapport au verre, au pyrex

ou encore aux polymères, dans les laboratoires sur puce et les membranes [18, 19

et 33].

L’intégration du silicium poreux dans les laboratoires sur puce apporte de nouvelles

perspectives au développement de dispositifs de séparation sur silicium. A travers

la présentation de ce matériau nanostructuré et des fonctionnalisations de surface

développées, réalisée dans les chapitres suivant, nous mettrons en évidence les

capacités du silicium poreux en termes de séparation et de tri moléculaire

(filtration, chromatographie) et comme isolant électrique (électro-

chromatographie).

Le développement de deux types de microsystèmes fluidiques pour l’intégration du

silicium poreux a été motivé par notre étude bibliographique. Des membranes en

silicium poreux pour une utilisation comme nano-filtres et des microcanaux avec

des parois porosifiées en surface et fonctionnalisées (phase stationnaire) pour une

utilisation comme colonnes de chromatographie ou d’électro-chromatographie sont

les dispositifs sélectionnés pour l’évaluation des capacités de tri / séparation du

silicium poreux.

Annexes

47

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