Centro di Procreazione Medicalmente Assistita - Centro Aster · Anomalie della testa: Piriforme...
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Centro di Procreazione Centro di Procreazione Medicalmente AssistitaMedicalmente Assistita
Diagnostica e Terapia in LaboratorioDiagnostica e Terapia in Laboratorio
Dr. Giovanni Dr. Giovanni BracchittaBracchitta
Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia Ruolo del laboratorio di Fisiopatologia della Riproduzione nella diagnosi e terapia della Riproduzione nella diagnosi e terapia
delldell’’ infertilitinfertilit àà di coppiadi coppia
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
P.M.A. di I livello (slow P.M.A. di I livello (slow techtech))
I.V.F. I.V.F. II e III livello (High II e III livello (High TechTech))
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
L’esame seminale non è un’analisi con una lista di variabili, ma un
insieme di variabili che vanno lette in maniera assolutamente integrata.
esame chimico – fisico
concentrazione nemaspermica
motilità nemaspermica
vitalità nemaspermica
morfologia nemaspermica
longevità nemaspermica
SpermiogrammaSpermiogrammadi I livellodi I livello
Liquido seminaleLiquido seminale (fluido biologico)
Frazione corpuscolatacomponente nemaspermica
componente non nemaspermica
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Frazione liquida:
plasma seminale
Plasma seminalePlasma seminale
Secreto prostatico:15% - 30% dell’eiaculato, biancastro, pH acido
Ac. citrico, Zn, γ glutamiltranspeptidasi, fosfatasi acida.
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Secreto vescicolare:50 - 80% dell’eiaculato, giallastro, pH basico, vischioso
Fruttosio, prostaglandine
Secreto epididimario:Funzione di trasporto
L - Carnitina, glicerosforil colina, alfa glucosidasi neutra
ValutazioniValutazioni
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Macroscopiche:caratteristiche reologiche dell’eiaculato.
Microscopiche:caratteristiche degli spermatozoi,
caratteristiche delle cellule germinali immature
caratteristiche delle cellule non nemaspermiche
CaratteristicheCaratteristiche reologichereologicheAspetto: - normale (grigio opalescente)
- acquoso (trasparente)
- ematico (rossastro)
- lattescente(biancastro)
- pioide (giallastro – pazienti con ittero – assunzione di vitamine)
Coagulazione:fisiologica, avviene ad opera di enzimi provenienti
dalle vescicole seminali ((vesciculasivesciculasi).).
Liquefazione:- regolare: se completa dopo 10’ - 60’, ad opera di enzimi prostatici.
- irregolare: se presenta zone di mancata fluidificazione.
Viscosità:- normale: il liquido si stacca goccia dopo goccia.
- aumentata:si crea continuità tra le gocce > 2 cm = filanza.
- diminuita: il liquido appare diluito, correla con l’aspetto acquoso.
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
pH: normale >7.27.2< 7 = si associa a patologia ostruttiva o a ipotrofie
congenite o acquisite delle vescicole seminali.
> 8 = si associa a flogosi.
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Volume: normale >2 ml2 ml
Valutazione componente cellulareValutazione componente cellularenemaspermicanemaspermica
Concentrazione: normale> 20 milioni/ml> 20 milioni/mlNumero totale: normale> 40 milioni> 40 milioniMotilità: sommatoria di un movimento oscillatorio lungo l’asse ideale che passa
per il centro della testa e uno rotatorio attorno a questo asse.
A = rapida progressiva ( > 40 µm/sec )
B = lenta progressiva
C = discinetica
D = immobili
Normale:Normale: A + B > 50%> 50%A > 25%> 25%
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Morfologia: il maschio umano, insieme a qualche primato è l’unico
tra i mammiferi ad avere un grado così elevato di
eterogeneità e pleiomorfismo dei suoi gameti.
Normalità: > 30%> 30% di forme normali
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Anomalie della testa: AcefaliaAcefaliaMacrocefaliaMacrocefaliaMicrocefaliaMicrocefaliaAmorfaAmorfaA puntaA punta
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Anomalie della testa: PiriformePiriformeVacuolataVacuolataA pallaA pallaDoppia Doppia NucleoNucleodecondensato decondensato AcrosomaAcrosomaridottoridotto
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Anomalie del collo: AngolatoAngolatoSpessoSpessoInserzione asimmetricaInserzione asimmetricaResiduoResiduocitoplasmaticocitoplasmatico
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Anomalie della coda: AngolataAngolataMozza Mozza Rigonfia Rigonfia DoppiaDoppiaAssenteAssenteArrotolataArrotolata
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Cellule germinali immature: Spermatogoni (rari)Spermatociti ISpermatociti II (rari)Spermatidi
Normali: < 10% popolazione< 10% popolazionenemaspermicanemaspermica
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Componente non nemaspermica:
Leucociti < 1 milione/mlLeucociti < 1 milione/mlEmazieEmazieCellule epitelialiCellule epitelialiElementoElementotetranucleatotetranucleato (linea germinale)(linea germinale)
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
VitalitVitalit àà: > 50% vivi: > 50% vivi
Agglutinazioni non specifiche ed aggregatiAgglutinazioni non specifiche ed aggregati
DiagnosticaDiagnosticaSpecialisticaSpecialistica
Valori normali ? Riferimento
Unità WHO 1987
WHO 1999
WHO 2001
Volume ml ≥≥≥≥ 2.0 ≥≥≥≥ 2.0 ≥≥≥≥ 2.0
pH 1-14 7.2 – 8 7.2 – 8 >>>> 7.2
Concentrazione mil/ml ≥≥≥≥ 20 ≥≥≥≥ 20 ≥≥≥≥ 20
Spz Totali mil/eiac ≥≥≥≥ 40 ≥≥≥≥ 40 ≥≥≥≥ 40
Motilità % classe a ≥≥≥≥ 25 ≥≥≥≥ 25 ≥≥≥≥ 25
Motilità % classe a+b ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50
Morfologia % normali ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 30 (?) (?) ≥≥≥≥≥≥≥≥ 1515
Vitalità % dei vivi ≥≥≥≥ 75 ≥≥≥≥ 50 ≥≥≥≥ 50
Leucociti mil/ml <<<< 1.0 <<<< 1.0 <<<< 1.0
Immunobead % spz - sfere <<<< 10 <<<< 50 <<<< 50
Mar test % spz - emz <<<< 10 <<<< 50 <<<< 50
WHO 1992
≥≥≥≥ 2.0
7.2 – 8
≥≥≥≥ 20
≥≥≥≥ 40
<<<< 1.0
≥≥≥≥ 75
≥≥≥≥ 30
≥≥≥≥ 50
≥≥≥≥ 0.0
<<<< 10
≥≥≥≥ 25
Anamnesi: Professione: Astinenza:Volume: pH: Fluidificazione:Viscosità: Filanza: Odore:Agglomerati: Agglutinazioni: Cellule epiteliali: Batteri: Tricomonas: Eritrociti:
Valutazione post liquefazione a 60Valutazione post liquefazione a 60’’
Numero di spermatozoi totali:Numero di spermatozoi totali per eiaculato:Numero spermatozoi mobili progressivi:Numero spermatozoi mobili progressivi per eiaculato:Cellule germinali immature:Leucociti:
Valutazione motilitValutazione motilitàà a 35a 35°°CC% Spermatozoi Immobili Mobili totali Mobili progressiviMotilità tipo: D A +B + C A + B1^ ora2^ ora4^ oraVitalità: eosina test - swelling testMorfologia: % normali %anormali - Anomalie testa % - collo % - coda %
Conclusioni:Conclusioni:
Terminologia delle principali alterazioni seminaliTerminologia delle principali alterazioni seminali
Normozoospermia:Normozoospermia: eiaculato normale
Oligozoospermia: concentr. Spz inferiore ai parametri di rif.
Astenozoospermia: motilità inferiore ai valori di riferimento
Teratozoospermia: morfologia inferiore ai valori di riferimento
Oligoastenoterato… alterazione di tutte le tre variabili
Azoospermia: assenza di spermatozoi nell’eiaculato
Aspermia: assenza di eiaculato
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
ImmunologiaImmunologia
Gli spz. sono altamente antigenici e normalmente isolati tramite la
barriera ematotesticolare. L’interruzione di questa barriera anatomica
e funzionale nei tubuli seminiferi può portare alla formazione di
anticorpi.
• Mar test (IgG)• Spermar test screening ( IgG )• IBT diretto ( IgA – IgG)
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
Biochimica del plasma seminale Biochimica del plasma seminale ( presenza, assenza, disfunzione e infezione delle ghiandole accessorie)
Markers prostaticiFosfatasi acidaAcido citricoZinco
Markers epididimarialfa glucosidasi neutracarnitina
Markers vescicolariFruttosio
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
NormaleAssente o
Ridotto
NormalePresentiGiallastroAlcalinoRidotto
Ostruzione dei dotti prostatici
(rara)
Normale (testa)
Ridotti (coda)NormaleNormaleAssenteTrasparenteNormaleNormale
Ostruzione bilaterale
epididimaria
RidottiAumentati
Ridotti o
AssentiAssentiLattescenteAcidoRidotto
Ostruzione o agenesia
bilaterale dei dotti
eiaculatori
Ridotti
(di origine prostatica)
NormaleNormaleAssentiTrasparenteNormaleNormale
Ostruzione bilaterale dei dotti deferenti
NormaleNormaleNormaleAssentiTrasparenteNormaleNormale
Azoospermia secretoria
Marker Epididimari
(Carnitina)
Marker
Prostatici
(Acido Citrico)
Marker
Vescicolare
(Fruttosio)
SpzAspettopHVolume
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
Interazione muco Interazione muco -- semeseme
Studio del muco cervicale
Quantità, viscosità, cellularità, filanza, cristallizzazione, ph
indicazioni circa la capacità di favorire la penetrazione degli spz
Post coital test (test di Sims-Huhnner) (in vivo)
- n° di spz attivi nel muco, motilità, sopravvivenza
Slide test (test di Kurzrok e Miller) (in vitro)
Diagnostica SpecialisticaDiagnostica Specialistica
Studio di funzione Studio di funzione nemaspermicanemaspermica
Test di decondensazione cromatinica
Test di condensazione nucleare (blu di anilina)
Test di eterogeneita cromatinica (arancio di acridina)
Test di capacitazione e R.A.
Studio dell’integrità di membrana LPO-p
Status metabolico (dosaggio dell’ATP)
correlano con la fertilizzazione
SpermiogrammiSpermiogrammi I Livello I Livello Pazienti esaminati: nPazienti esaminati: n°° 380380
2000 - 2002
Normali21%
Anormali79%
NormalitNormalit àà inin SeminologiaSeminologia
-- 2DS N 2DS N +2DS+2DS
50%50%
100%100%
I I parametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epiparametri WHO sono stati ottenuti mediante ampia rilevazione epidemiologica, essi demiologica, essi indicano, non una normalitindicano, non una normalitàà, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale u, ma il limite inferiore probabilistico, al di sopra del quale un n individuo cade nella popolazione dei fertili.individuo cade nella popolazione dei fertili.
Le caratteristiche seminali, definibili come normali in sensoLe caratteristiche seminali, definibili come normali in sensogaussianogaussiano, si discostano di , si discostano di molto dal minimo necessario per fecondaremolto dal minimo necessario per fecondare..
EtEtàà pazientipazienti
2000-2002
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
22 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 50 54 60
Età
%
EtEtàà pazientipazienti
2000-2002
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
22 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 50 54 60
Età
%
50%
Spermiogrammi I Livello range età 32-38
24%
76%
Normali Anormali
Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale Pazienti che non hanno eseguito mai un esame seminale range range 32 32 –– 38 anni38 anni
33%
67%
Si No
Si deduce:Si deduce:
Alta incidenza del fattore maschile
Innalzamento dell’età in cui si decide di volere il primo figlio
Ritardo nell’acquisizione di informazioni circa la propria condizione di
capacità riproduttiva
Si Si concludeconclude::
Un corretto iter diagnostico riduce alle coppie i tempi di attesa per una risposta concreta
Metodiche slow Metodiche slow techtech
Inseminazione Inseminazione intrauterina intrauterina (IUI)(IUI)(selezione nemaspermica e pre-capacitazione)
Valutazione Basale del seme:Almeno 10 milioni Spz totali
50% dotati di motilità rapida progressiva
30% dotati di morfologia normale
Valutazione Post-Trattamento
Volume: 0,1 – 0,5 ml
2-5 milioni di Spz con motilità rapida progressiva.
Metodiche High Metodiche High TechTech
I.V.F. classicaI.V.F. classicaRiproduce in vitro le condizioni fisiologiche della fecondazionee dello sviluppo embrionale
Parametri Seminali Minimi richiesti per I.V.F. (dopo trattamento)
• > 1,5 milioni di spermatozoi mobili
• > 30 % normoconformati
I.C.S.I.I.C.S.I. (intra cytoplasmatic sperm injection)
Metodiche High Metodiche High TechTech
Questa tecnica permette di iniettare un solo spz all’interno dell’ovocita.
% di fertilizzazione ovocitaria 50 – 70%
Il rischio di danneggiare irrimediabilmente l’ovocità è del 5%
INDICAZIONI ALLE DIFFERENTI TECNICHE DI PMAIN FUNZIONE DELLA QUALITA’ SEMINALE
NORMOZOOSPERMIA
MODERATA DISPERMIA
SEVERA OAT < 500.000
ASSENZA FERTIL. FIVETAZOOSPERMIE VARIEACINESIASTERILITA’ IMMUN.SPZ CRIOCONSERVATIANOMAL. ULTRASTRUTTURALI
IUI
GIFT
IVF
ICSI
Valutazione Trattamento
Inseminazione (FIVET – ICSI)
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 0Day 0
Recupero ovocitario
Preincubazione
Produzione seme
Preincubazione
InseminationInsemination mediummedium
No GlucosioNo GlucosioFosfatiFosfatiAA non essenzialiAA non essenzialiGlutamminaGlutammina
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 1Day 1
Osservazione avvenuta fecondazione 16-18 ore dall’inseminazione
CrioconservazioneCrioconservazione Sviluppo embrionaleSviluppo embrionale
Transfer Transfer
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 2Day 2
EMBRIONE A 4 CELLULE
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 3Day 3
Stadi I.V.F. Stadi I.V.F. Day 5Day 5--66
EMBRIONE A 8 CELLULE
BLASTOCISTI
Cleavage Cleavage mediummedium
GlucosioGlucosioAA essenzialiAA essenzialiAA non essenzialiAA non essenzialiPiruvato Piruvato vitaminevitamineEDTAEDTA
Microchirurgia embrionaleMicrochirurgia embrionale
Biopsia per diagnosi preimpianto
Metodiche High Metodiche High TechTech
Pitting
Metodiche High Metodiche High TechTech
Microchirurgia embrionaleMicrochirurgia embrionale
Metodiche High Metodiche High TechTech
Assisted HatchingAssisted Hatching
Eccessivo spessore della zona pellucida (> 15 micron)
Mancato impianto a seguito di transfer ripetuti
Alto grado di frammentazione degli embrioniLento timing di segmentazione
Età della paziente > 38 anni
Transfer da scongelamento
Metodiche High Metodiche High TechTech
M.E.S.A.M.E.S.A. (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration)
Azoospermia ostruttiva
Te.S.E.Te.S.E.(Testicolar Sperm Extration)
Ridotta produzione di spz da parte del testicolo
Te.S.A.Te.S.A. (Testicolar Sperm Aspiration)
CrioconservazioneCrioconservazione
Nostra casisticaNostra casistica
%%NN°°Anno 2002Anno 2002
212144Gravidanze on Gravidanze on -- goinggoing
262655Gravidanze clinicheGravidanze cliniche
1001001919Cicli PMA completatiCicli PMA completati
Nostra casisticaNostra casistica
DayDay + 3+ 3
DayDay +1+1
Day Day 00
TimingTiming %%NN°°Anno 2002Anno 2002
93938181Embryo Embryo (6(6--8 8 cellcell))
72,572,58787Zigoti 2 Zigoti 2 pnpn
100100120120Ovociti Ovociti prelevatiprelevati
Grazie per lGrazie per l’’ attenzioneattenzione