CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES Master 2 BCPP Épithéliums structures...
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CELLULES SOUCHES MESENCHYMATEUSES ET MALADIES RESPIRATOIRES
Master 2 BCPPÉpithéliums structures d’interface
Université Paris Diderot
Christine ClericiU700 – CRB3
UFR de Médecine Paris Diderot
MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE
•MSC et greffe tissulaire : régénération des tissus- réparation cardiaque- ostéogénèse imparfaite
• MSC et propriétés immuno-modulatrices - traitement de la GVH- insuffisance rénale - hépatite- diabète
MSC A VISÉE THÉRAPEUTIQUE et PATHOLOGIES PULMONAIRES
• MSC et greffe tissulaire : fusion ou repopulation?- Poumon sain (Krause, 2001)- Fibrose pulmonaire à la bléomycine (Ortiz, 2003; Kotton,
2004)- Poumon radique (Theise, 2002)- Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009)
• MSC et propriétés immuno-modulatrices- Fibrose pulmonaire induite par la bléomycine (Ortiz, 2007) - Fibrose pulmonaire induite par la silice (Lassance, 2009)- Broncho-dysplasie (van Haaften, 2009; Aslam, 2009)
• MSC vecteurs thérapeutiques
MSC et Syndrome de détresse respiratoire aiguë
Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Les Traitements Pharmacologiques Ne Sont Pas Efficaces dans le SDRAEfficaces dans le SDRA
• Glucocorticoids
• Surfactant therapy
• Lisofylline
• Ketoconazole
• Inhaled nitric oxide
• Procysteine
• Neutrophil elastase inhibitor
• Activated Protein C
Quels effets des MSC dans des modèles pré-cliniques de lésions inflammatoires alvéolaires aiguës ?
1. MSC et ALI dans des modèles animaux– Effets de CSM in vivo dans un modèle d’oedème alvéolaire
induit par l’endotoxine chez la souris– Effets des CSM in vivo dans un modèle de VILI chez la souris– Effets des CSM in vivo dans un modèle de pneumopathie
bactérienne
2. MSC et ALI dans un modèle de poumon humain : études in vitro et in vivo
0 10 20 30 40 500
25
50
75
100
Hours
48 h
Sur
viva
l (%
)
PBS (n = 31)MSC (n = 30)
**
**p < 0.01
GUPTA ET AL, J IMMUNOLOGY, 2007
EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND LUNG HISTOLOGY IN MICE AFTER LPS E. COLI
E.Coli
ITprélèvementsMSC
IT
+4H +24/48H0
PBS
Exce
ss L
ung
Wat
er (µ
l)
**p=0.001
0
50
100
150
200
250
MSC
**
MSC
PBS
**p=0.005
BAL
Prot
ein
(mg/
L)
**
0
1
2
3
4
5
MSC REDUCES PULMONARY EDEMA AND BAL PROTEININ MICE AFTER LPS
0 10 20 30 40 500
25
50
75
100
PBS (n = 13)
MSC (n = 11)
hours
48 h
Sur
viva
l (%
)
*
A
0
50
100
150
200
250
300
PBS MSC
48 h
Exc
ess
Lung
Wat
er (µ
l)
*
B
EFFECT OF MSC ON SURVIVAL AND PULMONARY EDEMAIN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA
Gupta et al, unpublished data, 2009
E.Coli 106CFU
IT
prélèvementsMSC
IT
+4H +24/48H0
EFFECT OF MSC ON BACTERIA GROWTHIN MICE AFTER ESTABLISHMENT OF E. COLI PNEUMONIA
Krasnodembskaya, Stem Cells, 2010
MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.
MSC THERAPY ENHANCES THE RESOLUTION OF STRUCTURAL LUNG INJURY FOLLOWING VILI.
Curley G F et al. Thorax 2012;67:496-501
MSC THERAPY MODULATES THE INFLAMMATORY RESPONSE TO VILI.
Curley G F et al. Thorax 2012;67:496-501
Lee JW et al, PNAS, 2009
EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN
1 h
- Right or left lung selected, surgical preparation- Begin perfusion without blood
1 h 4 h
- Lung Temp 36°C-Apply 10 cm H20 CPAP (95% O2 & 5% CO2 )
- Measure AFC over 1 h in RUL (Control)
- If AFC >10%/h in RUL,
Add 100 ml Fresh Whole Blood to Perfusate
Instill 0.1 mg/kg of endotoxin into the airspaces
of the RML
- Measure AFC over 1 h in RML (endotoxin)
Instill 5 x 10 allogeneic human mesenchymal stem cells or MSC conditioned medium to RML
6
1 h
EFFECT OF MSC ON HUMAN LUNG INJURY INDUCED BY ENDOTOXIN
ControlLung Lobe
LPSLung Lobe
LPS + MSCLung Lobe
LPS + MSC CM Lung Lobe
8 ± 5 x 10 cells 6
25 ± 25 x 10 cells 6 13 ± 11 x 10 cells
66 ± 5 x 10 cells
6
Absolute Neutrophil Counts
P < 0.003
Lee, PNAS, 2009
Control LPS LPS + MSC
En
do
thel
ial
Per
mea
bil
ity
(%
)
LPS + MSC CM
0
5
10
15
††
*
Control LPS LPS + MSC
Wed
/Dry
Rat
io
LPS + MSC CM
3
6
9*
* †
†
A B
EFFECT OF MSC ON ENDOTHELIAL PERMEABILITY AND PULMONARY EDEMA IN HUMAN LUNG INJURED BY LPS
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
• Engraftment
• Immunomodulation
• Alveolar fluid clearance
• Lung protein permeability
• Antibacterial properties
No, < 5%, Gupta et al., 2007
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ALI IN MICE :IMMUNOMODULATION
• No cell contact : MSC secretion of soluble factors – modulation by the inflammatory environment?
• Cell-cell contact : Interaction with other inflammatory cells, leukocytes, macrophages….
• Candidate mediators released or induced by MSC- TGF-- TNFinduced protein (TSG 6)- PGE2
- IL-10- IL-1ra …..
MSC
PBS
MIP
-2 B
AL (p
g/m
l)
TNF-
α BA
L (p
g/m
l)
MSC
PBS
**
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMUNOMODULATION
Gupta et al., 2007
ALI - endotoxin ALI Pneumonia E. Coli
Krasnodembskaya, 2010
PBS MSC
8 h
BA
L IL
-10
(pg/
ml) *
0
10
20
30
40
PBS MSC0
200
400
600
800
24 h
BA
L IL
-10
(pg/
ml)
24 h
Pla
sma
IL-1
0 (p
g/m
l)
PBS MSC0
1500
3000
4500
6000
7500
9000 *
MSC Upregulate Production of anti-inflammatory cytokines inEndotoxin Induced Lung Injury in Mice
Nemeth et al, Nat Med, 2009 (ALI dans un modèle de sepsis par LC)
Nemeth et al. Nat Med,2009
MSC IMPROVED ALI IN MICE: IMMODULATION BY CELL-CELL INTERACTION
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
• Engraftment
• Immunomodulation +++
• Alveolar fluid clearance
• Lung protein permeability
• Antibacterial properties
Alv
eola
r F
luid
Cle
aran
ce (
%/h
)
Control MSC MSC CM0
10
20
30
Normal Lung Fibroblasts
**
† †
LPS* P<0.0001 vs. Control
† P<0.0001 vs. LPS (0.1 mg/kg)
MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN HUMAN LUNG: ALVEOLAR FLUID CLEARANCE
MSC induced increase in Na-dependent AFC
Alv
eola
r F
luid
Cle
aran
ce (
%/h
)
+ MSC CM + MSC CM+ 5 x 10 M Amiloride
LPS
-4
0
10
20
30
*
Data as mean ± SD, * P < 0.05 Lee JW et al, PNAS, 2009
64 kDa
ENaC Apical Membrane
0
40
80
120
% o
f C
ontr
ol
+ MSCControl
Cytomix 50 ng/ml
*
Cytomix 50 ng/ml
Control
+MSC
* †
0
40
80
120
*
85 kDa
GAPDH
* * †
*
ENaC Total Cell Lysis
% o
f C
ontr
ol
†
†
Quels facteurs paracrines susceptibles d’améliorer la clairance alvéolaire ?
• Diminution des cytokines pro-inflammatoires et augmentation des cytokines anti-inflammatoires dans le modèle ALI souris mais pas dans le modèle poumon humain.
• Sécrétion de facteurs de croissance, KGF, angiopoietine-1 qui sont connus pour réduire les lésions pulmonaires dans les œdèmes lésionnels : bléomycine, VILI, hyperoxie, HCl, pneumopathie bactérienne.
MSC sécrètent des facteurs de croissance
150
0
50
100
200
250
co
nce
ntr
atio
n (
pg
/ml)
Control
Cytomix
*
co
nce
ntr
atio
n (
pg
/ml)
Control
Cytomix +3%O2
*
KGF Angiopoietin-1
Alv
eola
r F
luid
Cle
aran
ce (
%/h
r)
* P<0.001 vs. Control
P<0.03 vs. LPS (0.1 mg/kg)
Control LPS LPS + CM MSC
LPS + CM MSC (KGF siRNA)
*
, #
# P<0.01 vs. LPS + CM MSC (KGF siRNA)
0
10
20
30
+ rhKGF (100ng)
*,
MSC IMPROVED ALVEOLAR FLUID CLEARANCE IN HUMAN LUNG: ROLE OF KGF
Mécanismes responsables de la restauration de la clairance alvéolaire par le KGF
1. Effet mitogène sur les cellules alvéolaires de type II, augmentant la capacité de transport de l’épithélium
2. Effet cytoprotecteur du KGF diminuant la perméabilité paracellulaire et/ou l’apoptose des cellules épithéliales
3. Le KGF pourrait augmenter la transcription des protéines impliquées dans le transport alvéolaire du sodium: ENaC & NaKATPase -
4. Le KGF pourrait augmenter l’adressage des canaux de type ENaC à la membrane apicale des cellules, un processus rapide déjà observé après stimulation de l’AMP cyclique en hypoxie (J Biol Chem, 2002)
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
• Engraftment
• Immunomodulation +++
• Alveolar fluid clearance ++
• Lung protein permeability
• Antibacterial properties
Upper compartment
lower compartment
Upper compartment
Lower compartment
131I-albumin
Human Alveolar Epithelial Type II Cells
0.4 M Microporous membrane
Allogeneic HumanMesenchymal Stem Cells
MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY
Control + MSC
Cytomix
Per
mea
bili
ty (
%/2
4 h)
+ Fibroblast
*
A
*
MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY : EPITHELIAL PERMEABILITY
Per
mea
bil
ity
(%/2
4 h
)
Control + MSC KGF + MSC(KGF siRNA)
KGF+Ang-1
*
* *, *, *
Cytomix 50 ng/ml
Absence d’effet du KGF sur la perméabilité épithéliale
Per
mea
bili
ty (
%/2
4 h
)
Control + MSC
Cytomix 50 ng/ml
0
5
10
15
+ rhAng1 + MSC(Ang1 siRNA)
*
*
#
ROLE OF ANGIOPOIETIN-1
Fang et al. , J. Biol. Chem., 2010, 285, 26211
• Les MSC sécrètent l’angiopoietin-1
• Facteur de croissance vasculo-protecteur
• MSC transfectées avec AP-1 diminution des lésions vasculaires et des lésions pulmonaires modèle ALI souris (Mei et al., 2008)
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
• Engraftment -No
• Immunomodulation -Yes
• Alveolar fluid clearance -Yes
• Lung protein permeability - Yes
• Antibacterial properties ?
1. Les MSC ont-elles un pouvoir antimicrobien: nombre et croissance de bactéries in vitro
2. Les MSC permettent-elles de limiter la croissance et d’augmenter la clairance des bactéries dans un modèle in vivo de pneumonie bactérienne
MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE: ANTIBACTERIAL PROPERTIES
MSC REDUCES BACTERIA COLONY FORMATION in vitro
MSC REDUCES E. Coli COLONY FORMATION in vitro
0
2
4
6
8
PBS MSC MSC+anti-LL 37* Ab
E.
coli
CF
U
(x 1
05 /
ml)
*
Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010
Time (h)0 12 24 36 48
0
25
50
75
100
hMSC n=34
3T3 n=27
PBS n=42
Sur
viva
l (%
)
*
Intravenous hMSC Reduce Mortality & Bacteremia in Mice when Administered 4 hours after Peritoneal Pseudomonas Sepsis
MSC vs 3T3 p = 0.037, MSC vs PBS p = 0.005
01
,00
02
,00
03
,00
04
,00
0
3T3 (21) MSC (18) PBS (22)
Blo
od
Bac
teri
al C
ou
nts
(CF
U/m
l)
MSC vs 3T3 < p 0.01 MSC vs PBS < p 0.01
Samarani et al, 2010
P.a
erug
inos
a in
blo
od
(x
102
cfu/
ml)
Time (h)
0
400
800
0 8 12
MSC3T3PBS
0
10
100
3T3 MSC PBS
,√
P.a
erug
inos
a in
bl
ood
(cfu
/ml)
Severity of Sepsis: the rise in bacterial growth in blood is prevented by MSC treatment
MSC vs 3T3 p 0.0159MSC vs PBS p 0.0161
PBS +anti LL-37 Ab
+IgG102
103
104
105
E.c
oli C
FU
/ m
l in
BA
L
103
104
105
106
E.c
oli C
FU
/ m
l in
LH
PBS +anti LL-37Ab
+ IgG
MSC
MSC
* *
Neutralization of LL-37 Activity Abolishes the Antimicrobial Effect of MSC in vivo
Krasnodembskaya et al., Stem Cells, 2010
3T3 PBSMSC 3T3 PBSMSC
Pha
gocy
tosi
s (%
)
Pha
gocy
tic In
dex
0
10
20
30
40
50
0
50
100
,√
0
RPMI
E.c
oli c
fu (
x 10
6 /m
l)in
incu
batio
n m
ediu
m
1
2
3
4
3T3 PBSMSC
A B
C
,√
,√
Phagocytic activity of mouse peripheral blood monocytes
MSC INCREASES PHAGOCYTIC ACTIVITY OF HOST IMMUNE CELLS
Alternative Activated (Type II) Macrophages
• Critical role in host defense for resolution of inflammation and with a high phagocytic activity against bacteria.
• CD163 (haptoglobin-hemoglobin scavenger receptor) and CD206 (macrophage mannose receptor) are markers of type II macrophages.
• Recent data suggest that CD163 can function as a macrophage receptor for gram positive and gram negative bacteria (Blood, 2009)
• Contrast with TLRs which recognize soluble dissociated microbial components, not intact bacteria.
3T3 MSC PBS
Immunofluorescence for CD163 on the slides of mouse spleen
H&E staining of mouse spleen slides
HYPOTHESIS FOR MSC IMPROVED ACUTE LUNG INJURY IN MICE OR HUMAN LUNGS
• Engraftment -No
• Immunomodulation – augmentation cytokines pro-inflammatoires
• Alveolar fluid clearance – role du KGF
• Lung protein permeability – role de l’angiopoietine
• Antibacterial properties- peptides anti microbiens
• Other mechanisms – microvesicules…..
Therapie cellulaire dans le SDRA?
• Confirmation que les MSC ont un effet bénéfique dans des pathologies respiratoires
• Quels types cellulaires? • Quand les administrer et pendant combien de
temps?• Quelle voie d’administration, IT, IV
Matthay et al. Chest, 2010