ホタテガイ中腸腺に蓄積したカドミウムに関する研究...道衛研所報 第45集(1995) ホタテガイ中腸腺に蓄積したカドミウムに関する研究
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細胞内でレアメタルを高蓄積する 大腸菌の作製とその応用
法政大学 生命科学部 生命機能学科 准教授 山本 兼由
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従来技術とその問題点 レアメタルの獲得は、 レアメタル含有資源から物理・化学的分離法 で行われる。 資源に大きく依存。 →新しい鉱山の開発、リサイクルなどの改善 分離は金属種で異なる工程で環境負荷が大。 →低環境負荷の工程開発など、の改善
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 資源に依存しない根本的な技術改変が必要。 <新技術の特徴> • 濃縮されたレアメタルは、簡単に比較的高い純度で回収が可能
• バイオテクノロジーによる低環境負荷技術
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新技術の概要ー基礎研究から産業へー <基礎研究> 大腸菌の金属ストレス応答システムの理解
大腸菌
細菌本来の機能を 総合的に強化した 生物素子を開発 (ゲノム育種)
<産業への応用> 高濃度金属イオンを蓄積する細菌細胞などの創出
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基礎研究ー生物の金属恒常性ー
□Major elements
H, C, N, O, P, S
Na, Mg, K, Ca
□Transition elements
V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn
Mo, W
Wackett et al., (2004) AEM
<生物に必須な元素>
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基礎研究ー金属ストレス応答機構ー
大腸菌の各金属に対する応答ネットワークをゲノムワイドに解析 →大腸菌の金属ストレス応答を細胞システムと理解
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基礎研究ー大腸菌ゲノム発現の解析ー Comprehensive analyses for metal responses
・Molecular function of TF
□Specific DNA sequence recognized by TF
・Whole gene expression profile
□Transcriptome analysis using DNA array
Genomic analyses for molecular function of TF
・Identification of the binding sites of TF in genome
(1)in vitro □Genomic SELEX
(2)in vivo □ChIP-chip
・Transcriptional assay in vivo for putative targets
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基礎研究ートランスクリプトームー
+ Metal No addition
E. coli W3110 culture in LB medium
Preparation of total RNAs
Labeling cDNA with Cy3 or Cy5
Hybridization onto DNA chip
Mid-log phase
Level of Expression (No-addition)
Leve
l of
Exp
ress
ion
(C
oppe
r-ad
dition)
5 min Up-regulated genes
Down-regulated genes
copA
cusA
cusC
Yamamoto & Ishihama, (2002) Mol. Microbiol.
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基礎研究ーGenomic SELEXー Fragmentation of genome
DNA cloning & DNA sequencing
Binding of His tagged TF to DNA*
Isolation of ModE-DNA complex by Ni-NTA affinity chromatography*
Amplification of DNA by PCR
Repeat(SELEX cycles)
Amplification of genomic fragments
Construction of genomic library (pBR322ベクター)
Purification of DNA bound by ModE
Mapping in E. coli genome
*For ModE, with 1 mM Na2MoO4 For BasR, KdpE & ZraR, with 10 mM Acetylphosphate
Hybridization onto a tiling array
Mapping in E. coli genome
ゲノム ライブラリー
ModE (3 cycles)
BasR (3 cycles)
KdpE (3 cycles)
ZraR (2 cycles)
310 bp
234 bp
SELEX-clos SELEX-chip
Ogasawara et al. (2012) Microbiology, Kurata et al. (2013) J. Bacteriol.
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基礎研究ーChIP-chipー
0.2 mM Mn2+ 0.1 mM EDTA
E. coli BW25113 culture in LB medium
Labeling DNA with Cy3 or Cy5
Hybridization onto a tiling array
Mid-log phase (OD600 = 0.3~0.4)
Cross-linking by formaldehyde
Lysis by lysozyme
Fragmentation of genome by sonication
Preparation of MntR-DNA by anti-MntR
Purification of DNA from MntR-DNA complex
dps
mntR
yebN
mntH
ATTAAGTATAGCACCGGCTATGTGTT TACAGATATAGCACAGGCTATATTAT ACTAAACATAGCTTTGGCTAAATTCA ATCAGACATAGCTTAGGCTATATTAC ATGAAACATAGCAAAGGCTATGTTTT
dps mntR/rybA
yebN
mntH/nupC
Yamamoto et al. (2011) J. Bacteriol.
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ゲノム育種(1)
Time (hours)
Grow
th (
OD
600
nm
) マンガン取り込みポンプ遺伝子高発現 マンガン結合タンパク質遺伝子高発現
マンガン高蓄積大腸菌細胞のゲノム育種
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ゲノム育種(2) システイン合成酵素高発現 大腸菌細胞のゲノム育種
Yamamoto et al., (2011) FEMS Microbiol. Lett.
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レアメタルを高蓄積する大腸菌
レアメタル特異的取り込み能の強化 レアメタル特異的結合能の強化
レアメタル高蓄積大腸菌 〜5 mg/L(細胞容積)
〜0.5 mg/L(細胞容積)
ゲノム育種 X 10
大腸菌の金属輸送と結合システムの強化で細胞内高蓄積を可能
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高蓄積大腸菌からのレアメタル回収
大腸菌回収・破砕 レアメタル結合 タンパク質精製 タンパク質の除去
他の無機物・有機物とを分離して、抽出が可能
ワンステップの工程でタンパク質精製を可能
大腸菌内高蓄積レアメタルは、容易に高純度で回収が可能
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本技術の汎用性ー輸送システムー
大腸菌には各金属特異的な輸送システムが存在する
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本技術の汎用性ー金属結合因子ー
大腸菌には各金属特異的な認識(結合)システムが存在する
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想定される用途(1) • 海水などの水域からのレアメタル回収
海水
淡水
連続培養装置
省エネルギー工程
水域環境の すべてが資源
高純度 本技術により、海水を資源とした新しいレアメタル回収技術を構築
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想定される用途(2) • 金属による汚染環境の浄化
金属汚染海水 淡水
除染水
本技術により、金属汚染の除染技術を低環境負荷型技術として構築
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想定される用途(3) • 金属を補因子とする有用酵素精製
金属因子を配位した機能性酵素
大腸菌回収 破砕
酵素精製 大腸菌で大量合成される有用酵素
本技術により、金属配位型機能性有用酵素の生産を効率化
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実用化に向けた課題 • 現在、金属を高蓄積する微生物のゲノム育種技術は確立し、実際にレアメタル高蓄積大腸菌を取得済み。
• 今後、実用における汎用性をもたせるために、各種ストレス耐性能付加と高蓄積能の向上を検討。また、細胞内の高蓄積金属の回収を検証中。
• しかし、実用に目指す大量培養装置での適正化は未着手。
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企業への期待 • 未解決の大量培養装置を用いた検討については、発酵による物質生産の技術により克服できると考えている。
• 微生物の連続大量培養技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、金属など無機化学関連の企業などが、バイオ分野への展開を考えている場合に、広い汎用性をもつ本技術のによる導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
•発明の名称 :組換え微生物 •出願番号 :特願2013-102752 •出願人 :法政大学 •発明者 :山本 兼由
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産学連携の経歴 • 2005年-2006年 味の素(株)と受託研究 (バクテリアの金属応答ゲノム発現制御機構解析 と物質生産への応用) • 2007年-2011年 味の素(株)と共同研究 (バクテリアのシステイン応答に関する解析 と物質生産への応用) • 2011年 JST 研究成果最適展開支援プログラム ・探索タイプ事業に採択 • 2013年 JST 研究成果最適展開支援プログラム ・探索タイプ事業に採択
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お問い合わせ先 法政大学 研究開発センター 産学連携コーディネーター 中江 博之 TEL 042-387 - 6501 FAX 042-387 - 6335 e-mail [email protected]