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細胞性粘菌由来の生物活性物質をリード化合物とした

新規抗がん剤と 抗トリパノソーマ原虫剤の開発

群馬大学 生体調節研究所 遺伝子情報分野

准教授 久保原 禅

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本日のプレゼンのメニュー

１．土壌微生物「細胞性粘菌」とは？

２．粘菌の分化誘導因子DIFとは？

３．DIF誘導体が有する抗腫瘍活性と抗がん剤の開発

４．DIF誘導体が有する抗トリパノソーマ原虫活性と

抗トリパノソーマ原虫剤の開発

５．本技術に関する説明（まとめ）

従来技術とその問題点、新技術の特徴・従来技術との比較、

想定される用途、想定される用途、実用化に向けた課題、

企業への期待、本技術の知財権、問い合わせ先

3

本技術開発の背景１：粘菌は創薬資源

細胞性粘菌は、

・単純なLife cycleを示し、取り扱いや育生が簡単．

・ハプロイド生物のため遺伝子操作/破壊も容易．

→ 細胞生物学・発生生物学の優れたモデル生物として

世界中で研究されている．

柄

胞子塊

粘菌の子実体

新しい視点での粘菌研究：細胞性粘菌類は進化的にユニークな微生物群！

分類学的にはカビ/キノコ類（真菌類：創薬資源）と異なる「界」に属する！

私たちは「細胞性粘菌類＝新たな創薬資源」と考え 新しい薬剤開発に関する研究を推進！

背景

4

・DIF-1も抗腫瘍活性(増殖抑制/分化誘導活性)を有することを発見！

→ DIF-1の作用機序解析＆より有効な誘導体(抗がん剤)の開発を開始

(Asahi et al. BBRC. 1995; Kubohara et al. FEBS Lett. 1995; Kubohara, BBRC. 1997)

本技術開発の背景２：粘菌の因子DIF-1の有する抗腫瘍活性

背景

細胞性粘菌D. discoideumの 柄細胞分化誘導因子

In vitro differentiation system を利用して単離・同定

(Morris et al. 1987. Nature)

DIF-1

真菌Chaetomium由来の 抗腫瘍因子（抗がん剤候補物質） In vitroでマウス白血病細胞の

増殖を抑制し、 細胞分化を誘導する物質

(Oka et al. 1985. J. Antibiot.)

Differanisole A

5

DIF-1

DIF-1(-2)

DIF-1(-1)

DIF-1(+1)

DIF-1(+2)

Et-DIF-1

Bu-DIF-1

Br-DIF-1

I-DIF-1

CP-DIF-1

Ph-DIF-1

DIF-1(CP)

DIF-1(3M)

Et-DIF-3

Bu-DIF-3

Br-DIF-3

I-DIF-3

CP-DIF-3

Ph-DIF-3

DIF-3

DIF-3 (-2)

DIF-3 (-1)

DIF-3 (+1)

DIF-3 (+2)

DIF-3 (CP)

DIF-3(3M)

THPH

TH-DIF-1

TM-DIF-1

TH-DIF-3

DIF誘導体を用いた 化学構造-活性相関解析

強い増殖阻害活性を 有するDIF誘導体

(Kubohara, EJP. 1999; Gokan et al. Biochem. Pharmacol. 2005)

抗がん剤

粘菌の分化誘導因子

6

増殖阻害（G1/0 arrest） 分化誘導・分化促進

Apoptosis (high conc.)誘導

Bu-DIF-3

CP-DIF-3

有望なDIF誘導体

しかし、がん細胞の浸潤・転移に対するDIFの効果は未検討だった！

→ そこで、がん細胞の遊走（浸潤・転移）に対するDIFの効果を検討した。 〜 未発表データ 〜

哺乳類細胞におけるDIFの作用メカニズム

（数秒〜数分） （数分〜数十分） （数十分〜数時間）

[Ca2+]i

PDE1

[cAMP]i

DIF

ERK Akt/PKB GSK3β DYRK1B STAT3 etc.

Cyclin D

pRBリン酸化 etc.

? Kubohara, BBRC. 1997 Kubohara, Eur. J. Phamacol. 1999 Miwa et al. Circ. Res. 2000 Kanai et al. Oncogene. 2003 Takahashi-Yanaga et al. JBC. 2003 Akaishi et al. Eur. J. Pharmcol. 2004 Shimizu et al. Cancer Res. 2004 他

抗がん剤

7

LPA（リゾフォスファチジン酸）によるマウス骨肉腫LM8細胞の遊走アッセイ

がん細胞の遊走（浸潤・転移）に対するDIF誘導体の効果

± LPA（下部wellに添加） ± DIF（上部 & 下部wellsに添加）

Serum-straved LM8細胞

コラーゲンコートした ポアフィルター

４時間後

LPAによって誘導された細胞が フィルターの下に遊走してくる → フィルター下部の細胞をカウント

この系（実際にはボイデンチャンバーを使用）を用いて LM8細胞の遊走を定量化し、DIFの効果を検討した。

抗がん剤

8

抗がん剤

詳細なデータは当日お示しします。

DIF-1

Br-DIF-1

Br-DIF-3

DIF-3(+1) DIF-3(+2)

Et-DIF-3 Bu-DIF-3

DIF-3

注目すべきDIF誘導体の化学構造

抗がん剤

抗トリパノソーマ剤

トリパノソーマ T. cruzi の生活環

・T. cruzi は南米シャーガス病を引き起こす原虫で、中南米では1600万人以上が感染し、毎年、数万人の死者を出している。 ・T. cruziは、サシガメ（媒介昆虫）体内で増殖し、サシガメに咬まれることでヒトに感染する。ヒト体内では「血流型（血液中に

存在し体内を巡る）」、「細胞内型（細胞内部に侵入し、増殖する）」の２つの発育ステージを示す。 ・感染初期には、刺咬(しこう)部の硬結（組織の硬化）、眼瞼浮腫（まぶたのむくみ）、発熱、肝脾腫（肝臓と脾臓の肥大） 等を

呈し、ほとんどの成人は慢性期に移行する。 ・慢性期の症状としては、心筋炎（心筋の炎症）、巨大食道、巨大結腸などであり、十数年という長い経過を経て、ある日突然、

心臓発作で死亡する。 ・既存薬は存在するものの、有効な治療法は確立されていない。→ 社会のグローバル化に伴い、シャーガス病が日本にも進

出する可能性は否定できない

血液中の原虫

ヒトHT1080細胞 （ホスト細胞）

トリパノソーマ T. cruzi 細胞を適宜処理をして、 顕微鏡観察によって感染率と、ホスト細胞内のトリパノソーマ原虫数を調べる。 3日間培養

培養液中に DIFを添加

抗トリパノソーマ剤

トリパノソーマ T. cruzi のホストへの感染率と増殖のアッセイ系

このアッセイ系を利用して、DIF誘導体の抗トリパノソーマ活性を検討した

TH-DIF-3

Et-DIF-3 Bu-DIF-3

CP-DIF-3 Ph-DIF-3

0

20

40

60

80

0 2 4 6 8

10 12 14 16

感染

率 (%

)

ホス

ト細

胞内

のT.

cru

zi 数

TH-D

IF-3

Et-D

IF-3

Bu-

DIF

-3

CP

-DIF

-3

Ph-

DIF

-3

Con

trol

DIF

-3

TH-D

IF-3

Et-D

IF-3

Bu-

DIF

-3

CP

-DIF

-3

Ph-

DIF

-3

Con

trol

DIF

-3

** **

** **

**

** ** ** ** **

DIF-3

T. cruzi のホストへの感染率と増殖に対するDIF誘導体 (10 µM) の効果(1)

抗トリパノソーマ剤

(Nakajima-Shimada et al. Biochem. Pharmacl. 2013)

DIF-3(–2)

DIF-3(–1)

DIF-3(+1)

DIF-3(+2)

DIF-3(3M)

DIF-3(CP)

0

20

40

60

80

100

0

16

2 4 6 8

10 12 14

感染

率 (%

)

ホス

ト内

のT.

cru

zi 数

Con

trol

DIF

-3

DIF

-3(–

2)

DIF

-3(–

1)

DIF

-3(+

1)

DIF

-3(+

2)

DIF

-3(3

M)

DIF

-3(C

P)

Con

trol

DIF

-3

DIF

-3(–

2)

DIF

-3(–

1)

DIF

-3(+

1)

DIF

-3(+

2)

DIF

-3(3

M)

DIF

-3(C

P)

**

** **

*

** ** ** **

T. cruzi のホストへの感染率と増殖に対するDIF誘導体 (10 µM) の効果(2)

抗トリパノソーマ剤

(Nakajima-Shimada et al. Biochem. Pharmacl. 2013)

DIF-3

Compounds

DIF-3(+1)

DIF-3(+2)

Et-DIF-3

Bu-DIF-3

CP-DIF-3

Ph-DIF-3

IC50 (µM) vs T. cruzi

感染阻害 増殖阻害 IC50 and LD50 (µM) vs ホスト細胞

3.76

2.85

1.90

1.27

1.48

1.95

3.55

3.95

1.75

1.30

0.73

0.72

1.30

3.35

52.0

23.0

13.2

13.2

7.5

8.8

10.9

>100

>100

>100

100

100

75

>100

増殖阻害 細胞毒性

・LD50 は、DIF存在下での培地中のLactate dehydrogenase (LDH) 活性を測定することで算出. ・Selectivity index is the ratio of LD50 (HT1080 toxicity)/IC50 (T. cruzi growth).

Selectivity Index

>25.3

>57.1

>76.9

137.0

138.9

57.7

>29.9

抗トリパノソーマ剤

(Nakajima-Shimada et al. Biochem. Pharmacl. 2013)

T. cruzi 活性に対するDIF誘導体の効果（まとめ）

Bu-DIF-3は、もっとも強い抗トリパノソーマ活性を示した！

→ DIF-3とBu-DIF-3について、in vivoでの薬効を検討

× 103

10 50 (mg/kg)

血中

T. c

ruzi

細胞

数 (個

数/m

L)

0

5

10

15

20

25

Control BZL DIF-3 Bu-DIF-3

T. cruzi 感染させたマウスにおけるDIF誘導体の薬効

抗トリパノソーマ剤

T. cruzi を感染させたマウス腹腔内にBZL (10 mg/kg), or DIF-3 or Bu-DIF-3 (50 mg/kg)を投与（一群４匹） ↓

２週間後の血中T. cruzi 数を測定

既存薬BZLとBu-DIF-3は、マウス血中T. cruzi 数を有意に減少させた！

DIFは顕著な毒性を示さず、マウスは元気に生存した。

BZLとDIFの作用機序が異なることは、in vitroの実験で示唆されている。

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DIF-1

DIF-1(-2)

DIF-1(-1)

DIF-1(+1)

DIF-1(+2)

Et-DIF-1

Bu-DIF-1

Br-DIF-1

I-DIF-1

CP-DIF-1

Ph-DIF-1

DIF-1(CP)

DIF-1(3M)

Et-DIF-3

Bu-DIF-3

Br-DIF-3

I-DIF-3

CP-DIF-3

Ph-DIF-3

DIF-3

DIF-3 (-2)

DIF-3 (-1)

DIF-3 (+1)

DIF-3 (+2)

DIF-3 (CP)

DIF-3(3M)

THPH

TH-DIF-1

TM-DIF-1

TH-DIF-3

まとめ

抗腫瘍活性

抗トリパノソーマ活性

DIFをリード化合物とした抗がん剤、抗トリパノソーマ剤の開発を目指す！

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従来技術とその問題点

既に実用化されているシャーガス病治療薬には、Benzinidazole、Nifurtimoxなどがあるが、これらは ①急性期のみある程度有効で慢性期には無効であること、②耐性虫の出現や、③強い副作用等の問題があり、より有効な治療薬の開発が望まれている。

・抗がん剤に関して

・抗トリパノソーマ原虫剤に関して

既に実用化されている抗がん剤は多数あるが、 ①既存薬の多くはがん細胞の増殖阻害剤であり、 がんの浸潤/転移を阻止することは難しいうえ、

②下痢や脱毛等の副作用の問題があり、より有効な治療薬の開発が望まれている。

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新技術の特徴・従来技術との比較

• 従来技術の問題点であった「がんの浸潤・転移」を阻害する新規抗がん剤のリード化合物を見い出すことができた。

抗がん剤に関して

抗トリパノソーマ剤に関して

• 従来の薬剤では南米シャーガス病（とりわけ、急性期）を治療することは難しい：従来薬とは異なる作用機序の薬剤が望まれた。今回、従来の薬剤とは異なる作用機序を有する新たなリード化合物を見い出すことができた。

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想定される用途

• 本技術により、新たな抗がん剤、あるいは、抗トリパノソーマ剤を開発/提供することが期待される。

• 上記以外に、生命科学実験用の試薬としての利用も期待される。

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実用化に向けた課題 • 現在、「DIF誘導体のin vivoでの薬効・毒性お

よび投与法の詳細の検討」と「DIF誘導体の

作用機序の解析」が、臨床応用のための最大の未解決課題として残っている。

• 今後、新たなDIF誘導体を合成しながら、in vivoでの薬効・毒性検討、および投与法の検討を進める。また、「DIF誘導体の作用機序」についても解析を進める。

• 実用化に向けて、より有効で毒性のない、できれば経口投与可能なDIF誘導体の開発を進める必要がある。

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企業への期待 • 未解決の「DIF誘導体のin vivoでの薬効・毒

性および投与法の詳細の検討」「臨床応用のための各種試験」については、企業の協力が不可欠と考えている。

• 動物実験を実施していただける企業との共同研究を希望。

• また、現在、抗がん剤や抗トリパノソーマ剤を開発、あるいは生産している企業には、DIF誘

導体についても御社の技術をもって検討をお願いしたい。

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本技術に関する知的財産権１

• 発明の名称 ：走化性運動制御剤 • 出願番号 ：特願2010-004319

• 出願人 ：国立大学法人 群馬大学 • 発明者 ：久保原禅、岡島史和、小町麻由

美、桑山秀一、大島吉輝、菊地晴久

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本技術に関する知的財産権２

• 発明の名称 ：抗トリパノソーマ剤およびトリパノソーマ症治療薬

• 出願番号 ：特願2010-163039

• 出願人 ：国立大学法人 群馬大学 • 発明者 ：久保原禅、嶋田淳子

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産学連携の経歴

• 2007年-2008年 JST シーズ発掘試験研究に採択 • 2009年-2010年 JST シーズ発掘試験研究Aに採択 • 2011年-2012年 JST 知財活用促進ハイウェイ 「大学特許価値向上支援」事業に採択 • 2011年-2012年 JST A-STEP探索タイプに採択

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お問い合わせ先

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ＦＡＸ ０２７７－３０－１１７８

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